Le bois, ou le xylème secondaire, est le produit de la différenciation des cellules cambiales en cellules vasculaires spécialisées lignifiées telles que les fibres et les éléments de faisceaux. Chez les herbacées de nombreuses évidences ont été rapportées quant à l'implication de facteurs de transcription de type Homéodomaine Leucine Zipper de classe III (HD-Zip III) dans la régulation du développement du xylème primaire. À la lumière de évidences rapportées chez les herbacées l'hypothèse que nous avons voulu tester est que les HD-Zip III de peupliers auraient acquis des fonctions liées au développement du xylème secondaire. Pour tester cette hypothèse, nous avons choisit deux objectifs généraux : Tout d'abord 1) celui de caractériser l'abondance des transcrits de HD-Zip III dans le cambium par rapport à d'autres tissues. Et 2) caractériser de l'effet de la surexpression de HD-Zip DI chez des peupliers transgéniques, PtHB-1 et PtHB-5 respectivement homologues de REVOLUTA et AtHB-8. Ceci est une façon indirecte de lier leur fonction dans le développement vasculaire, s'ils altèrent la differentiation de fibres ou le développement général des tissus vasculaires. À la lumière des résultats, l'analyses d'expression des transcrits de HD-Zip III nous avons conclue qu'ils sont tous présent dans le xylème secondaire en formation (cambium). Néanmoins, un gène se distingue des autres : PtHB-5, qui présente le patron d'expression le plus spécifique au cambium. Finalement, la surexpression du gène PtHB-1 chez des peupliers transgéniques a mit en évidence son implication dans la formation du xylème primaire, par contre cette expérience ne nous a pas permis de conclure à propos de son implication potentielle dans le xylème secondaire.

Les facteurs de transcription sont des protéines spécialisées qui jouent un rôle important dans différents processus biologiques tel que la différenciation, le cycle cellulaire et la tumorigenèse. Ils régulent la transcription des gènes en se fixant sur des séquences d’ADN spécifiques (éléments cis-régulateurs). L’identification de ces éléments est une étape cruciale dans la compréhension des réseaux de régulation des gènes. Avec l’avènement des technologies de séquençage à haut débit, l’identification de tout les éléments fonctionnels dans les génomes, incluant gènes et éléments cis-régulateurs a connu une avancée considérable. Alors qu’on est arrivé à estimer le nombre de gènes chez différentes espèces, l’information sur les éléments qui contrôlent et orchestrent la régulation de ces gènes est encore mal définie. Grace aux techniques de ChIP-chip et de ChIP-séquençage il est possible d’identifier toutes les régions du génome qui sont liées par un facteur de transcription d’intérêt. Plusieurs approches computationnelles ont été développées pour prédire les sites fixés par les facteurs de transcription. Ces approches sont classées en deux catégories principales: les algorithmes énumératifs et probabilistes. Toutefois, plusieurs études ont montré que ces approches génèrent des taux élevés de faux négatifs et de faux positifs ce qui rend difficile l’interprétation des résultats et par conséquent leur validation expérimentale. Dans cette thèse, nous avons ciblé deux objectifs. Le premier objectif a été de développer une nouvelle approche pour la découverte des sites de fixation des facteurs de transcription à l’ADN (SAMD-ChIP) adaptée aux données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage. Notre approche implémente un algorithme hybride qui combine les deux stratégies énumérative et probabiliste, afin d’exploiter les performances de chacune d’entre elles. Notre approche a montré ses performances, comparée aux outils de découvertes de motifs existants sur des jeux de données simulées et des jeux de données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage. SAMD-ChIP présente aussi l’avantage d’exploiter les propriétés de distributions des sites liés par les facteurs de transcription autour du centre des régions liées afin de limiter la prédiction aux motifs qui sont enrichis dans une fenêtre de longueur fixe autour du centre de ces régions. Les facteurs de transcription agissent rarement seuls. Ils forment souvent des complexes pour interagir avec l’ADN pour réguler leurs gènes cibles. Ces interactions impliquent des facteurs de transcription dont les sites de fixation à l’ADN sont localisés proches les uns des autres ou bien médier par des boucles de chromatine. Notre deuxième objectif a été d’exploiter la proximité spatiale des sites liés par les facteurs de transcription dans les régions de ChIP-chip et de ChIP-séquençage pour développer une approche pour la prédiction des motifs composites (motifs composés par deux sites et séparés par un espacement de taille fixe). Nous avons testé ce module pour prédire la co-localisation entre les deux demi-sites ERE qui forment le site ERE, lié par le récepteur des œstrogènes ERα. Ce module a été incorporé à notre outil de découverte de motifs SAMD-ChIP. / Transcription factors (TF) play important roles in various biological processes such as differentiation, cell cycle progression and tumorigenesis. They regulate gene expression by binding to specific DNA sequences (TFBS). Identifying these cis-regulatory elements is a crucial step to understand gene regulatory networks. Technological developments have enhanced DNA sequencing at genomic scale. On the basis of the resulting sequences, computational biologists now attempt to localize the most important functional regions, starting with genes, but also importantly the whole genome characterization of transcription factor binding sites and allow the development of several computational DNA motif discovery tools. Although these various tools are widely used and have been successful at discovering novel motifs, they are not adapted to ChIP-chip and ChIP-sequencing data. The main drawback of these approaches is that most of the predicted motifs represent artifacts due to an inefficient assessment of their enrichment. This thesis is about transcription factor proteins and statistical analysis of their binding sites in ChIP-chip and ChIP-sequencing data. The first objective was to develop a new do novo DNA motif discovery tool adapted to ChIP-chip and ChIP-sequencing data. SAMD-ChIP combines enumerative and stochastic strategies to predict enriched motifs in the vicinity of the ChIP peak summits. Our approach is an automated pipeline that includes motif discovery, motif clustering, motif optimization and finally motif identification using transcription factor (TF) databases. SAMD-ChIP outperforms state-of-the-art motif discovery tools in term of the number of predicted motifs and the prediction of rare and degenerate motifs. In particular, SAMD-ChIP efficiently identifies gapped motifs such as inverted or direct repeats bound by nuclear receptors and composite motifs resulting from the association of different single TF binding sites. The underlying assumption of the second objective is that in regulatory regions, binding sites of interacting transcription factors co-occur more often than expected by chance in the vicinity of the ChIP-peak summits. We proposed an approach to predict transcription factor binding sites co-localization based on the prediction of single motifs by do novo motif discovery tools or by using TFBS models from TF data bases.

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Une cascade de facteurs de transcription composée de SIM1, ARNT2, OTP, BRN2 et SIM2 est requise pour la différenciation des cinq types cellulaires qui peuplent le noyau paraventriculaire (PVN) de l’hypothalamus, un régulateur critique de plusieurs processus physiologiques essentiels à la survie. De plus, l’haploinsuffisance de Sim1 est aussi une cause d’hyperphagie isolée chez la souris et chez l’homme. Nous désirons disséquer le programme développemental du PVN, via une approche intégrative, afin d’identifier de nouveaux gènes qui ont le potentiel de réguler l’homéostasie chez l’individu adulte. Premièrement, nous avons utilisé une approche incluant l’analyse du transcriptome du PVN à différents stades du développement de la souris pour identifier de tels gènes. Nous avons comparé les transcriptomes de l’hypothalamus antérieur chez des embryons de souris Sim1+/+ et Sim1-/- à E12.5 issus de la même portée. De cette manière, nous avons identifié 56 gènes agissant en aval de Sim1 dont 5 facteurs de transcription - Irx3, Sax1, Rxrg, Ror et Neurod6. Nous avons également proposé un modèle de développement à deux couches de l’hypothalamus antérieur. Selon ce modèle, les gènes qui occupent un domaine médial dans la zone du manteau caractérisent des cellules qui peupleront le PVN alors que les gènes qui ont une expression latérale identifient des cellules qui donneront plus tard naissance aux structures ventrolatérales de l’hypothalamus. Nous avons aussi démontré que Sim1 est impliqué à la fois dans la différenciation, la migration et la prolifération des neurones qui peuplent le PVN tout comme Otp. Nous avons également isolé par microdissection au laser le PVN et l’hypothalamus médiobasal chez des souris de type sauvage à E14.5 pour en comparer les transcriptomes. Ceci nous a permis d’identifier 34 facteurs de transcription spécifiques au PVN et 76 facteurs spécifiques à l’hypothalamus médiobasal. Ces gènes représentent des régulateurs potentiels du développement hypothalamique. Deuxièmement, nous avons identifié 3 blocs de séquences au sein de la région 5’ d’Otp qui sont conservés chez l’homme, la souris et le poisson. Nous avons construit un transgène qui est composé d’un fragment de 7 kb contenant ces blocs de séquences et d’un gène rapporteur. L’analyse de 4 lignées de souris a montré que ce transgène est uniquement exprimé dans le PVN en développement. Nous avons généré un deuxième transgène dans lequel le fragment de 7 kb est inséré en amont de l’ADNc de Brn2 ou Sim1 et de Gfp. Nous avons obtenu quatre lignées de souris dans lesquels le profil d’expression de Brn2 et de Gfp reproduit celui d’Otp. Nous étudierons le développement du PVN et la prise alimentaire chez ces souris. En parallèle, nous croisons ces lignées avec les souris déficientes en Sim1 pour déterminer si l’expression de Brn2 permet le développement des cellules du PVN en absence de Sim1. En résumé, nous avons généré le premier transgène qui est exprimé spécifiquement dans le PVN. Ce transgène constitue un outil critique pour la dissection du programme développemental de l’hypothalamus. Troisièmement, nous avons caractérisé le développement de l’hypothalamus antérieur chez l’embryon de poulet qui représente un modèle intéressant pour réaliser des études de perte et de gain de fonction au cours du développement de cette structure. Il faut souligner que le modèle de développement à deux couches de l’hypothalamus antérieur semble être conservé chez l’embryon de poulet où il est aussi possible de classer les gènes selon leur profil d’expression médio-latéral et le devenir des régions qu’ils définissent. Finalement, nous croyons que cette approche intégrative nous permettra d’identifier et de caractériser des régulateurs du développement du PVN qui pourront potentiellement être associés à des pathologies chez l’adulte telles que l’obésité ou l’hypertension. / A cascade of transcription factors composed of SIM1, ARNT2, OTP, BRN2 and SIM2 is required for the differentiation of the five major cell types populating the paraventricular nucleus (PVN) of the hypothalamus, a critical integrator of several homeostatic processes that are required for the survival of vertebrates. Haploinsufficency of Sim1 also causes isolated hyperphagia in mice and humans. The goal of our study is to dissect the developmental program of the PVN using an integrative approach in order to identify new genes that could potentially be implicated in the regulation of homeostasis in adults. First, we used a comparative approach to analyse the PVN transcriptome at different developmental stages in mice embryos in order to identity new genes implicated in PVN development. We compared gene expression in the anterior hypothalamus of E12.5 Sim1-/- and Sim1+/+ littermate embryos using a microarray approach. We identified 56 genes acting downstream of Sim1 including 5 transcription factors - Irx3, Sax1, Rxrg, Ror and Neurod6. We proposed a model for the development of the anterior hypothalamus. In this model, the genes expressed in the medial domain of the mantle layer characterise cells that will form the PVN and genes expressed in the lateral domain identify cells that will give rise to ventrolateral areas of the hypothalamus. We also showed that Sim1, like Otp, is implicated in the differentiation, migration and proliferation of the neurons populating the PVN. Furthermore, we have isolated by laser captured microdissection the PVN and ARC nucleus in wild type mice at E14.5 and compared their transcriptomes. This technique allowed us to identity 34 transcription factors specific to the PVN and 76 factors specific to the ARC. These genes represent potential regulators of hypothalamic development. Second, we identified 3 blocks of sequence in the 5’ region of Otp that are conserved between human, mouse and fish. We constructed a transgene which included a 7 Kb fragment encompassing these sequences followed by a reporter gene. The analysis of 4 mice strains showed that this transgene is specifically expressed in the prospective PVN. We have generated a second transgene in which the 7 Kb fragment is located upstream of the cDNA encoding Brn2 or Sim1 and Gfp. We obtained 4 mice strains in which the Brn2 and Gfp expression pattern is similar to the Otp expression pattern. These mice will be used to study PVN development and food intake. Also, to determine if Brn2 expression only – without Sim1 gene expression - allows the development of PVN cells, we are presently crossing these mice with Sim1 deficient mice. In conclusion, we have generated the first transgene that is specifically expressed in the PVN. This transgene constitutes a critical tool for dissecting the developmental program of the hypothalamus. Third, we have characterised the development of the anterior hypothalamus of chick embryos which represent an interesting model for loss and gain of function experiments during the development of this brain region. Interestingly, our proposed model for the development of the anterior hypothalamus seems to be conserved in chick embryos. As a matter of fact, it is possible to classify genes according to their medio-lateral expression patterns and the outcome of the regions that they are defining. Finally, we believe that this integrative approach will allow us to identify and characterize factors implicated in PVN development. From a clinical point of view, these factors could potentially be associated with pathologies such as obesity or arterial hypertension.

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Les cellules souches pluripotentes induites (iPS) partagent avec les cellules souches embryonnaires la capacité à se différencier en tous les types cellulaires d'un organisme, mais leur obtention ne nécessite pas l'utilisation d'embryons. Elles sont générées par la surexpression de facteurs de transcription embryonnaires au sein de cellules somatiques. Les iPS représentent un outil de choix en biologie fondamentale et appliquée ainsi qu'en médecine régénérative.La plupart des protocoles de génération d'iPS reposent sur un transfert des séquences nucléotidiques codant les facteurs de transcription embryonnaires impliqués dans la mise en place du réseau de pluripotence. Bien qu'efficaces, ces méthodes présentent des problèmes de sécurité majeurs, incompatibles avec une utilisation clinique des iPS générées. La voie la plus rationnelle pour produire des iPS de manière parfaitement sécurisée est d'apporter les facteurs exogènes directement sous leur forme protéique. Des protocoles de reprogrammation par transfert de protéines ont été récemment développés, mais les efficacités associées sont relativement faibles et les protocoles relativement fastidieux.L'objectif de ce projet de thèse était de mettre au point une nouvelle approche de transfert de protéines, sécurisée et simplifiée, pour la génération de cellules souches pluripotentes induites utilisables en clinique. Les cellules à reprogrammer ont été choisies en fonction des applications potentielles des iPS générées : (i) les fibroblastes, faisant référence dans la bibliographie et permettant d'envisager des thérapies autologues avec notamment de nombreuses applications en hématologie ; (ii) les cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon, l'un des matériaux biologiques les plus sûrs, afin de générer des globules rouges in vitro, dans la perspective de répondre aux demandes croissantes en terme de transfusion, en particulier pour les groupes sanguins rares.Nous avons donc comparé les différents vecteurs de transduction de protéines développés par l'équipe TheREx du laboratoire TIMC-IMAG, en termes de facilité de production, d'efficacité de transfert ainsi que sur l'activité des facteurs de transcription associés. Le vecteur sélectionné est une micro-seringue naturelle portée par la bactérie Pseudomonas aeruginosa, capable d'injecter les facteurs Oct4, Sox2, Nanog et Lin28 (facteurs de Thomson) mais aussi c-Myc, directement dans le cytoplasme des cellules cibles, sans étape de purification nécessaire. Les facteurs de transcription injectés sont adressés jusqu'au noyau des cellules en moins de 2h, où ils activent rapidement la transcription des gènes de pluripotence, avec des réponses significatives mesurées dès 24h après injection. Nous avons également mis en évidence le caractère sécurisé et contrôlable du vecteur puisque nous sommes capables d'éliminer complètement les bactéries des cultures grâce à un traitement antibiotique, et ce dès quelques heures après l'injection. Des optimisations des conditions de reprogrammation ont été réalisées en modifiant les principaux paramètres que sont, le choix des facteurs de transcription, la fréquence des injections et le ratio bactéries : cellules.Ainsi, bien que nous ne soyons pas parvenus à générer des iPS à ce jour avec ce système, la micro-seringue naturelle que nous avons développé et optimisé se positionne comme un vecteur de choix pour le transfert de protéines dans l'optique de générer des iPS, en termes d'efficacité de vectorisation et d'induction transcriptionnelle, de sécurité mais aussi de facilité d'utilisation. / Like embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells (iPS) are characterized by their ability to differentiate into any cell type in an organism. However their use doesn't raise the ethical issue linked to the use of embryos. iPS are generated from somatic cells by overexpression of embryonic transcription factors. iPS are thereby very promising in fundamental and applied biology as well as for regenerative medicine.Most of the protocols used to generate iPS are based on the delivery of nucleic acid sequences encoding embryonic transcription factors responsible for the activation of the pluripotency gene network. In spite of their efficiency, these methods are associated with major safety concerns incompatible with clinical applications. The more rational path to safely produce iPS is to deliver the exogenic transcription factors under their protein form. Recently some protocols using protein delivery have been developed to produce iPS. However associated efficiencies are very low and protocols are quite fastidious.The aim of this Ph.D. project was to develop a new efficient and simplified protein delivery method for the safe generation of iPS compatible with clinical applications. Cell sources were selected depending of the final applications of iPS: (i) fibroblasts, extensively used and described in bibliography and allowing autologous therapies with many applications in the field of hematology; (ii) cord blood hematopoietic stem cells, one of the safest biomaterials, with the aim to generate red blood cells in vitro in order to respond to increasing needs for transfusion products, particularly for rare blood types.First, different protein vectors developed by the TheREx team of the TIMC-IMAG laboratory were compared for their efficiency of production and delivery as well as for the activity of associated factors. The selected vector is a natural micro-syringe expressed by Pseudomonas aeruginosa, able to inject the transcription factors Oct4, Sox2, Nanog and Lin28a (Thomson combination) with c-Myc directly into the cytoplasm of target cells, without the need for any purification step. Once injected, transcription factors are addressed to the nucleus in less than 2 hours where they efficiently activate transcription of pluripotency genes, with significant responses observed as early as 24h after injection. We also highlighted the secured and controllable nature of this vector by completely eliminating the bacteria from the cultures in a few hours after injection with an antibiotic treatment. Optimizations of the reprogramming conditions were also made by adjusting many parameters such as the combination of transcription factors, the injection frequency and the bacteria : cell ratio.

Les cellules cancéreuses ayant des propriétés souches, appelées cellules souches cancéreuses (CSCs), sont au sommet de l'organisation hiérarchique des tumeurs et sont soupçonnées d'être responsable des rechutes et de la formation de métastases. Cependant, nous nous sommes demandé comment ces cellules sont-elles capables de supporter le stress métabolique lié à l'oncogène et de croitre dans un environnement nutritif défavorable distinct de celui d'une tumeur établie ? Nous avons mis en évidence dans ce travail le rôle de la réponse aux glucocorticoïdes dans le contrôle de la plasticité mammaire et l'induction d'une plasticité métabolique nécessaire au maintien du potentiel tumorigène des CSCs. Nous avons montré qu'en régulant la reprogrammation cellulaire via l'induction du gène MAFB, les glucocorticoïdes contrôlent le caractère souche des cellules épithéliales malignes en activant la voie de biosynthèse des hexosamines. L'efficacité anabolique de ces cellules est alors augmentée, favorisant le développement de la tumeur et des métastases. Ensemble, nos résultats suggèrent que l'inhibition de l'activité métabolique des glucocorticoïdes pourrait être une stratégie pour éliminer les CSCs et traiter les tumeurs mammaires / Cancer cells with stemness properties - generally designated cancer stem cells (CSCs) - are at the apex of the hierarchical organisation of tumours and are believed to drive tumour recurrence and metastasis formation. However, how they perform these neoplastic activities in a nutritive environment that is distinct from the one in an established tumour is unknown. Here, we unveil the prominent role of glucocorticoid activity in the control of mammary cancer cell plasticity and the induction of metabolic pliancy necessary for the tumorigenic potential of CSCs. By regulating MAFB-dependent cell reprogramming, glucocorticoids control stemness traits in malignant epithelial cells. As an integral part of this regulation, glucocorticoids activate the hexosamine biosynthetic pathway and rewire the metabolism of CSCs. The anabolic efficiency of these cells increases then, fostering tumour and metastasis development. Together, our findings suggest that inhibition of glucocorticoid metabolic activity could be an original strategy for CSC eradication and tumour treatment

L’infection par le rétrovirus complexe T-lymphotrope HTLV-1 (Human T-cell Leukemia Virus type 1), premier rétrovirus humain découvert, touche de 10 à 20 millions de personnes à travers le monde dans des régions endémiques et induit des désordres lymphoprolifératifs de cellules T. Seulement 5 % des personnes infectées développent, après une longue phase asymptomatique, une maladie dont une forme agressive et rapidement mortelle de leucémie nommée ATLL (Adult T-cell Leukaemia/Lymphoma).<p>L’infection par le virus HTLV-1 se caractérise par l’absence de virémie due à la latence du virus dans la majorité des cellules infectées suite à la répression transcriptionnelle de l’expression virale in vivo. Cette latence favorise très probablement le développement tumoral en permettant aux cellules infectées d’échapper à la réponse immunitaire médiée par l’hôte infecté. <p>Au cours de ce travail, nous avons tout d’abord identifié deux nouveaux sites de liaison pour le facteur de transcription Sp1, localisés dans la région R du promoteur LTR du HTLV-1. Nous les avons caractérisés physiquement par des expériences de retard de migration sur gel et avons mis en évidence la liaison de Sp1 au niveau de ces deux sites. Nous avons ensuite déterminé l’affinité de Sp1 pour les différents sites du promoteur du HTLV-1 et avons montré que les sites Sp11 (localisé dans la région U3) et Sp15 (localisé dans la région U5) sont les plus forts. Nous avons étudié l’impact de mutations de tous les sites Sp1 du LTRHTLV-1 sur son activité promotrice en conditions basales et transactivées par Tax dans le contexte d’un vecteur rapporteur épisomal. Nous avons mis en évidence que les sites Sp1 de la région R du LTRHTLV-1 agissent comme répresseurs de la transcription du LTR5’ mais n’ont aucun effet sur l’activité promotrice du LTR3’.<p>Dans une seconde partie de notre travail, nous avons étudié l’implication du cofacteur CTIP2 dans la répression transcriptionnelle du HTLV-1 et avons mis en évidence sa capacité à réprimer la transactivation médiée par Tax des promoteurs (LTR5’ et LTR3’) du HTLV-1 en cellules T-lymphoïdes Jurkat. Nous avons également montré par des expériences d’immunoprécipitation de chromatine, le recrutement de CTIP2 aux promoteurs du HTLV-1 dans une lignée infectée de manière latente par le rétrovirus et son absence dans une lignée productive. A l’inverse, Sp1 est présent dans les deux types de lignées. De plus, nous avons exclus l’implication des sites Sp1 du LTRHTLV-1 dans le recrutement du cofacteur étant donné que CTIP2 réprime toujours la transactivation Tax-dépendante du LTRHTLV-1 muté au niveau de tous les sites Sp1. <p>Finalement, nous avons étudié l’importance des modifications post-traductionnelles de CTIP2 dans son activité de cofacteur transcriptionnel. Nous avons montré que CTIP2 était acétylé par les HATs CBP et p300 et avons identifié 5 sites majeurs d’acétylation. Nous avons mis en évidence l’importance de l’acétylation de la lysine 604 de CTIP2 dans son activité répressive de la transactivation Tax-dépendante des LTRs du HTLV-1.<p>L’ensemble de ces résultats suggère un rôle du corépresseur CTIP2 dans la régulation transcriptionnelle du promoteur du HTLV-1 ainsi qu’un rôle répresseur des sites Sp1 de la région R du LTRHTLV-1 dans la transcription des gènes viraux au départ du LTR5’. La poursuite de ce travail devrait contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires génétiques et épigénétiques impliqués dans la latence et la réactivation transcriptionnelles des promoteurs du HTLV-1.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

In type 1 diabetes (T1D) a combination of genetic predisposition and environmental factors triggers islet inflammation (insulitis) leading to a selective and gradual destruction of the pancreatic beta cells. Beta cells mainly die through apoptosis, triggered at least in part by pro-inflammatory cytokines such as IL-1β, TNF-α and IFN-γ. Recent findings suggest that the mitochondrial pathway of cell death is involved in this death cascade. Array analysis indicated that TNF-α+IFN-γ induces transcription factors such as NF-ĸB, STAT1, and AP-1 in beta cells. We presently aimed to examine the pathway(s) of apoptosis triggered by TNF-α+IFN-γ in beta cells. <p>TNF-α+IFN-γ induces beta cell apoptosis through the intrinsic pathway of cell death. This involved activation of the BH3 only proteins DP5, PUMA and Bim. Knockdown (KD) of either DP5 or PUMA or both led to a partial protection of INS-1E cells (12-20%), while silencing Bim led to about 60% protection against cytokine-induced apoptosis. Bim is transcriptionally induced by activated STAT1. TNF-α+IFN-γ also induces downregulation of Bcl-XL, an anti-apoptotic Bcl-2 gene which inhibits Bim. Knocking down Bcl-XL alone led to increase in apoptosis, but this was prevented by the parallel KD of Bim.<p>The ultimate goal of our research is to protect beta cells from the autoimmune assault. Previous data revealed that JunB inhibits ER stress and apoptosis in beta cells treated with IL-β+IFN-γ. Here, TNF-α+IFN-γ up-regulated the expression of JunB which was downstream of activated NF-ĸB. JunB KD exacerbated TNF-α+IFN-γ induced beta cell death in primary rat beta cells and INS-1E cells. The gene networks affected by JunB were studied by microarray analysis. JunB regulates 20-25% of the cytokine-modified beta cell genes, including the transcription factor ATF3 and Bcl-XL. ATF3 expression was increased in cytokine-treated human islets and in vitro silencing of JunB led to >60% reduction in ATF3 overexpression. We confirmed direct JunB regulation of the ATF3 promoter by its binding to an ATF/CRE site. Silencing of ATF3 aggravated TNF-α+IFN-γ induced cell death in beta cells and led to the downregulation of Bcl-XL expression in INS-1E cells. Pharmacological upregulation of JunB using forskolin led to upregulation of ATF3 and consistent protection of these cells against cytokine-induced cell death, while genetic overexpression of JunB in mice increased ATF3 expression in the pancreatic islets and reversed the pro-apoptotic effects of cytokines on beta cells (±40 % protection). <p>As a whole, our findings indicate that TNF-α+IFN-γ triggers beta cell apoptosis by the upregulation of the pro-apoptotic protein Bim and downregulation of the Bcl-XL protein. These deleterious effects are at least in part antagonized by JunB via activation of ATF3. <p><p>Dans le diabète de type 1 (DT1), la combinaison de facteurs génétiques de prédisposition et de l'environnement déclenche l'inflammation des îlots de Langerhans (insulite) conduisant à une destruction sélective et progressive des cellules bêta du pancréas. Les cellules bêta meurent principalement d’apoptose, déclenchée au moins en partie par les cytokines pro-inflammatoires sécrétées par les cellules immunitaires comme l’IL-β, le TNF-α l’IFN-γ. De récentes découvertes suggèrent que la voie mitochondriale de la mort cellulaire jouerait un rôle dans la mort de ces cellules. L'analyse de réseaux de gène utilisant les biopuces d’ADN indique que l’association TNF-α+IFN-γ induit l’activation de facteurs de transcription tels que NF-ĸB, STAT1 et AP-1 dans la cellule bêta. Dans ce contexte, nous avons cherché à examiner les voies de l'apoptose déclenchées par le TNF-α+IFN-γ dans la cellule bêta. <p>En présence de TNF-α+IFN-γ les cellules bêta meurent par apoptose via la voie intrinsèque. L’activation des protéines pro-apoptotiques « BH3-seulement » dont DP5, PUMA et Bim étaient en cause de cette apoptose. Le « knockdown »1 (KD), de DP5 ou de PUMA, ou des deux en même temps conduit à une protection partielle des cellules INS-1E (12-20%), tandis que le KD de Bim conduit à environ 60% de protection contre l’apoptose induite par cette combinaison de cytokines. La transcription de Bim est induite par STAT1 activé. Parallèlement à la régulation positive de Bim, TNF-α+IFN-γ conduit à la régulation négative de la protéine Bcl-XL. Bcl-XL est une protèine anti-apoptotique de la famille de protèines Bcl-2 qui en general inhibe Bim. Réduire l’expression de Bcl-XL seul induit une augmention de l'apoptose, alors que le KD de Bim et Bcl-XL en parallèle empêche l'apoptose.<p>Le but ultime de notre recherche est de protéger les cellules bêta des agressions autoimmunitaires. Les données antérieures ont révélé que JunB inhibe le stress du réticulum endoplasmique et l'apoptose dans les cellules bêta traitées avec IL-β+IFN-γ. Nous avons observé que TNF-α+IFN-γ induit l'expression de JunB qui se produit en aval de NF-ĸB activé. Il est important de noter que l’inactivation de JunB par des agents interférants de l’ARN (siRNA) exacerbe la mort des cellules primaires bêta de rat et de cellules INS-1E induite par les cytokines. Les réseaux de gènes touchés par JunB ont été étudiés grâce a l'analyse en microréseaux. JunB règule 20-25% des gènes modifiés par des cytokines dans les cellules bêta, y compris le facteur de transcription ATF3 et Bcl-XL. L’expression d’ATF3 est augmenté dans les îlots humains traités avec les cytokines et la répression in vitro de JunB conduit à une réduction de >60% de l’expression d’ATF3. Nous avons confirmé la régulation d’ATF3 par JunB en montrant que JunB est directement lié au promoteur d’ATF3 via le site ATF/CRE. La diminution d’expression d’ATF3 en presence de TNF-α+IFN-γ a aggravé la mort cellulaire induite dans les cellules bêta et a conduit à la régulation négative de l'expression de Bcl-XL dans les cellules INS-1E. L’augmentation pharmacologique de JunB dans les cellules INS-1E par l’utilisation de forskolin a conduit à la régulation positive en aval d’ATF3 et par conséquente à la protection de cellules bêta vis-a-vis de effets indésirables des cytokines. Dans cette optique, la surexpression génétique de JunB dans le modèle Ubi-JunB de souris transgénique a conduit à une surexpression d’ATF3 dans les îlots pancréatiques et a permir d’inverser les effets pro-apoptotiques de cytokines sur la cellule bêta (protection ± 40%).<p>Globalement, ces résultats indiquent que TNF-α+IFN-γ déclenche l'apoptose des cellules bêta par la régulation positive du gène pro-apoptotique Bim et la régulation négative du gène anti-apoptotique Bcl-XL. Ces effets indésirables sont inhibé en partie par JunB via l’activation de ATF3.<p><p>1Pas d’équivalent en français. Signifie la réduction de l’expression d’un gène via utilisation d’un siRNA (agent interférant de l’ARN).<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les cellules dendritiques sont les sentinelles du système immunitaire. Elles sont disséminées dans la plupart des tissus et organes et sont capables de détecter la présence de pathogènes. La perception des signaux de danger se fait notamment grâce à la présence de récepteurs de la famille Toll (TLRs). Deux voies de signalisation, qui reposent sur l'activation des molécules adaptatrices MyD88 ou TRIF, peuvent être induites par l’engagement de ces récepteurs par leur ligand. Ces voies de signalisation mènent à l’activation de différents facteurs de transcription nécessaires à la production de cytokines telles que les membres de la famille de l’interleukine-12 (IL-12).<p>La famille de l’IL-12 comprend quatre cytokines hétérodimériques: l’IL-12 (p35/p40), l’IL-23 (p19/p40), l’IL-27 (p28/EBI3) et l’IL-35 (p35/EBI3). Chacune de ces cytokines possède des fonctions bien définies et parfois complexes qui sont essentielles pour l’établissement des réponses immunes innées et adaptatives mais également pour l'atténuation de ces réponses limitant ainsi les effets délétères causés à l'organisme par des réponses immunes excessives. La régulation transcriptionnelle de ces cytokines est complexe puisque la présence des deux sous-unités est indispensable à leur production par la cellule.<p>Dans le cadre de ce travail, nous avons étudié l'implication de facteurs de transcription de la famille des IRFs dans l’induction des gènes codant pour les sous-unités qui composent les cytokines de la famille de l'IL-12 en réponse à l’engagement des différents TLRs. Le facteur de transcription IRF3 activé en aval de la voie TRIF dépendante joue un rôle crucial dans la production des IFNs de type I et des réponses antivirales. Nos résultats indiquent que ce facteur est également directement impliqué dans l'activation des gènes codant pour les sous-unités p35 et p28. Par contre, ce facteur ne participe pas au contrôle de l'expression de l'IL-12/23p40, l’IL-23p19 et d'EBI3. Nos observations indiquent qu’IRF3 coopère avec d'autres membres de la famille des IRFs. En effet, IRF1 permet l'expression optimale des sous-unités p35 et p28 alors qu'IRF9 joue un rôle essentiel dans le contrôle de l'expression de la p28, deux facteurs activés par la boucle autocrine des IFNs de type I. Nos résultats indiquent donc qu’en réponse aux ligands TLRs, l'expression des différentes sous-unités qui composent les cytokines de la famille de l'IL-12 est régulée de manière différentielle et complexe. Les facteurs de transcription de la famille des IRFs, de par leur implication dans le contrôle de l’expression de certaines de ces sous-unités, participent à la balance entre ces différentes cytokines.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished