Au cours des quarante dernières années, l’optimisation des méthodes sylvicoles et l’introduction de variétés améliorées ont permis d’accroître considérablement la productivité du pin maritime. Pour permettre à la filière bois de disposer d’une matière première de qualité sur ce matériel amélioré, un programme de recherches multidisciplinaire a été développé afin d’étudier le déterminisme génétique de la qualité du bois. Neuf facteurs de transcription potentiellement impliqués dans la xylogenèse et l’adaptation des arbres à leur milieu, ont tout d’abord été séquencés dans la population Aquitaine, et leurs patrons de diversité nucléotidique ont été étudiés. Ces patrons ont été comparés à l’attendu de modèles neutres d’évolution et s’en écartent par un niveau élevé de déséquilibre de liaison et l’excès de mutations en fréquences intermédiaires détectés pour trois de ces gènes (HDZ31, LIM2 et MYB1). Ces résultats suggèrent des changements de taille de population affectant l’ensemble du génome, et l’action de sélection balancée sur l’un d’entre eux (MYB1). Les géniteurs de la population d’amélioration Aquitaine ont ensuite été génotypés pour 384 marqueurs moléculaires et évalués pour la croissance et les propriétés chimiques du bois. Ces données moléculaires et phénotypiques ont permis de mettre en évidence des associations significatives entre la variation pour le diamètre du tronc ou la teneur en cellulose du bois et deux marqueurs situés respectivement dans un facteur de transcription HD-Zip (HDZ31) et dans un gène encodant une fascicline. La cohérence des résultats de génétique évolutive et de génétique d’association ouvre ainsi des perspectives encourageantes pour la compréhension de l’architecture génétique de la formation du bois chez cette espèce. Cependant, le faible nombre d’associations significatives pose de nombreux problèmes théoriques et méthodologiques qui sont discutés en vue d’améliorations pour de nouveaux designs expérimentaux. / During the last four decades, the optimization of silvicultural and tree breeding methods has contributed to improve growth and wood homogeneity of maritime pine. In order to provide the different actors of the forestry wood-chain with high quality raw material, the genetic determinism and chemical components of wood quality are being studied in the frame of a multidisciplinary research program. First, nine transcription factors putatively involved in wood formation have been sequenced in the Aquitaine population, and their nucleotide diversity pattern studied. Since these genes potentially play important roles in the adaptation of trees to their environment, their patterns have been compared to those expected under neutral evolution. Strong departures from neutrality were observed, with high levels of linkage disequilibrium and an excess of intermediate frequency variants for three of them (HDZ31, LIM2 and MYB1), which could be linked to population size changes that affected the whole genome, and to balancing selection effects at one of them (MYB1). Secondly, the genitors of the Aquitaine breeding population were genotyped for 384 markers and evaluated for growth and wood chemical properties. Significant associations were detected for two markers, one in a HD-Zip transcription factor (HDZ31) with growth, and the other in a gene coding for a fasciclin protein with cellulose content. The consistency of evolutionary and molecular genetics opens encouraging perspectives for understanding the genetic architecture of wood formation in this species. However, the low number of associations detected raises several theoretical and methodological issues which are discussed for the perspective of improving future experimental designs.

En parallèle à son rôle dans l’initiation de la cascade métastatique, la transition épithéliomésenchymateuse est capable de faciliter la transformation néoplasique par le biais de mécanismes encore indéfinis. Nous avons démontré que, comme SNAIL1 et SNAIL2, l’expression de SNAIL3 est réactivée de façon aberrante dans les cancers humains, en particulier dans les carcinomes mammaires, établissant un lien entre l’ensemble des membres de la famille SNAIL et la tumorigénèse. Expérimentalement, les trois protéines SNAIL induisent une EMT avec des efficacités différentes. Ce différentiel reflète leur capacité à protéger les cellules de l’anoikis et à favoriser la prolifération dans des conditions de faible adhérence en absence d’altération oncogénique. La réversion partielle du processus d’EMT en réponse à l’expression ectopique des protéines ST14/Matriptase ou de l’E-cadhérine inhibe le potentiel oncogénique des protéines SNAIL. Nous avons donc démontré que la perte de protéines responsables du maintien de l’intégrité de l’épithélium contribue à l’activité pro-tumorale des inducteurs d’EMT / Beyond its role in initiating the metastatic cascade, cell commitment to the epithelial-to-mesenchymal transition program has been shown to facilitate neoplastic transformation, the underlying mechanisms yet remaining elusive. We herein demonstrate that likewise SNAI1 and SNAI2, the expression of SNAI3 is aberrantly reactivated in human cancers, mainly in breast carcinomas, linking all members of the SNAIL family to tumorigenesis. Experimentally, the three SNAIL proteins trigger EMT with unequal efficiencies. This differential mirrors their ability to protect cells from anoikis and to sustain proliferation in low-adherent conditions in absence of an oncogenic insult. Partial reversion of the EMT-process, achieved through forced expression of the ST14/Matriptase or E-cadherin proteins, alleviates the SNAIL oncogenic potential. We thus demonstrate that loss of epithelial integrity gatekeepers contributes to the tumor promoting activity of embryonic EMT-inducers

Le cœur humain est un organe composé de différents types cellulaires tels que les cardiomyocytes, les fibroblastes, les muscles lisses et les cellules endothéliales. Ces cellules se diversifient grâce à des mécanismes moléculaires spécifiques en acquérant leurs propriétés fonctionnelles spécifiques. L’embryon de Drosophile est un modèle simple et adapté pour étudier la diversification des cellules cardiaques et leurs propriétés spécifiques. Le but du projet est d’améliorer notre connaissance sur les acteurs moléculaires qui contrôlent la diversification des cellules cardiaques. Pour atteindre cet objectif nous avons appliqué la méthode TRAP-rc ("rare cell Translation Ribosome Affinity Purification") suivie du séquençage ARN pour identifier les ARN messagers en cours de traduction spécifiques des cellules cardiaques Tin et Lb (Tin CBs et Lb CBs) à deux stades de développement corrélés avec la morphogenèse du cœur embryonnaire. Dans une première analyse focalisée sur l'analyse des données issues des TRAP-Seq sur cellules Tin nous avons mis en évidence que CAP et MSP-300 sont impliqués dans la migration des cardioblasts pendant la fermeture du cœur. En parallèle, nous avons également identifié deux autres gènes impliqués dans la morphogenèse, kon-tiki et dGrip qui semblent contrôler la cohésion des CBs au cours de la migration. En outre, nous avons trouvé qu'au stade 16, environ 60% des gènes enrichis sont communs entre les populations Tin et Lb. Parmi ces gènes, Src42, sqa et flr participent à la régulation du cytosquelette d'actine et nos analyses ont permis de démontrer qu'ils avaient également des fonctions dans la morphogenèse cardiaque. Nous avons également identifié des groupes de gènes plus spécifiques à chacune des populations ciblées. Une catégorie fonctionnelle fortement associée à la population Lb, comprend les gènes qui régulent l'épissage des ARN messagers et certains de ces gènes semblent être requis au cours de la morphogenèse cardiaque. Enfin, nous avons comparé nos données de TRAP-seq cardiaque avec des données de TRAP-Seq issues du muscle somatique (de l'équipe), et ainsi identifié près de 90 gènes qui présentent des isoformes protéiques spécifiques à chaque tissu notamment impliquées dans la formation de l'unité contractile sarcomérique. Ceci suggère que des mécanismes d'épissage spécifiques sont mis en place dans différents types cellulaires pour moduler les fonctions de certaines protéines musculaires. A travers ce projet, nous avons identifié de nouveaux acteurs généraux de la migration collective des cardioblastes au cours de la fermeture du cœur mais également de nouveaux gènes potentiellement impliqués dans l’acquisition des propriétés spécifiques dessous populations cardiaques Tin et Lb et de tissus musculaires distincts. Nous espérons que les données générées permettront dans le futur de mieux comprendre les mécanismes de la cardiogenèse des vertébrés ainsi que l’étiologie de maladies cardiaques. / Cardiac cells diversification is required for the formation of a functional heart. Human heart is a multi-lineage organ that develops through progressive diversification of progenitors derived from different heart fields. This process is underlined by numerous changes in the expression of a repertory of genes that allow cells to acquire their own identity and functions. The Drosophila embryo is a relatively simple model to study the diversification of cardiac cells and their properties. The goal of this project is to identify the repertories of genes that control the formation of different types of cardiac cells. To reach this objective we applied Translation Ribosome Affinity Purification (TRAP) method followed by RNA sequencing in order to identify mRNA engaged in translation specific to two cardiac cell types (Tinman (Tin) and Labybird (Lb) expressing cells), at two different time windows. We obtained a list of enriched genes for the different types of cardiac cells and time points. In a first part, we focused our attention on the Tindatasets and found that two genes, CAP and Msp300, are involved in cardioblasts migration during the heart closure. Then we identified two other candidate genes kontiki and dGrip that seem to contribute to maintain cohesion between CBs during heartmorphogenesis. Moreover by comparing our spatial datasets, we found that for the same time point, around 60% of Tin CBs enriched genes are common with Lb CBs enriched population and within this group we identified evolutionary conserved genes such as Src42, flr and sqa known to be involved in the cytoskeleton organization and in the actinpolymerization and depolymerisation. Our premiminary analyses show that they seem to be required for correct cardiac morphogenesis. We also identified sets of genes more specific for each cardiac cell population. Indeed, Lb CBs datasets show that in early stage there is the enrichment of genes mostly involved in transcriptional regulation and RNA splicing and some of these genes (prp8 and prp38) are involved in cardiac development. In parallel, we compared our TRAP-Seq dataset in the cardiac system with the TRAP-seqon muscle cells, and identified close to 90 genes that present cardiac or muscular specific isoforms. It is known that the alternative splicing, by increasing proteins diversity, contributes to the acquisition of specific cell properties. Furthermore, some cardiomyopathies are associated to defects in the alternative splicing of genes encoding sarcomeric proteins that we found in our dataset such as Tropomyosin and Zasp52. With this project, we have identified new actors of collective cardioblast migration and a set of genes with potential role in the acquisition of individual properties of Tin and Lbcardiac cells or of specific type of muscle tissue. We hope that our data could provide new insights into the genetic control of vertebrate cardiogenesis and into etiology of cardiac diseases.

Les dinoflagellés sont une famille d'eucaryotes unicellulaires trouvés dans les écosystèmes marins et d'eau douce et sont d'importants producteurs primaires. Ils sont réputés pour plusieurs comportements distinctifs, notamment la formation de proliférations d'algues nuisibles appelées « marées rouges », l'émission de bioluminescence dans l'océan et leur contribution à la formation de récifs coralliens. Leur structure génomique est inhabituelle avec de grandes quantités d'ADN et des chromosomes condensés en permanence à toutes les étapes du cycle cellulaire. L’ADN est sans nucléosome et se trouve dans une structure de cristaux liquides. Plusieurs gènes sont codés dans de multiples répétitions situées dans des réseaux en tandem produisant des protéines pratiquement identiques sans aucun élément conservé détecté dans les régions présumées promotrices en amont de la séquence codante. Ces caractéristiques uniques rendent difficile à comprendre comment les cellules régulent l'expression des gènes. Cette thèse examine l’hypothèse que la régulation de transcription est difficile et peu utilisée chez les dinoflagellés. Les dinoflagellés présentent une rareté des facteurs de transcription, les protéines du domaine de choc froid (CSP) représentant la majorité des protéines de liaison à l'ADN potentielles dans le transcriptome de Lingulodinium polyedra et le génome de Symbiodinium kawagutii. Le potentiel des CSP de dinoflagellés à agir en tant que facteurs de transcription spécifiques à la séquence a été testé en utilisant des tests de déplacement de mobilité électrophorétique. Ces études ont révélé que quatre CSP différentes ont montré une préférence pour l'ARN par rapport à l'ADN simple et double brin. Une deuxième approche a examiné le ciblage de la séquence spécifique par des tests de sélection et de liaison d'amplification, et cela n'a révélé aucun motif consensus détectable dans la liaison à l'ADN. Nous concluons que les CSP dinoflagellés sont plus susceptibles de fonctionner comme des protéines de liaison à l'ARN que comme des facteurs de transcription. Il a été rapporté que l'expression de nombreux gènes chez plusieurs espèces de dinoflagellés était régulée par l'exposition à la lumière. Cela a été testé pour trois gènes, dont l'expression régulée par la lumière chez l'espèce formant des récifs Symbiodinium kawagutii. La régulation de ces gènes a été rapportée dans la littérature suggérant la possibilité d’identifier les éléments régulateurs dans le promoteur. Cependant, l'analyse par transfert de Northern n'a pas pu valider le modèle d'expression de ces trois gènes chez S. kawagutii. De plus, le séquençage d'ARN à haut débit a confirmé que ces trois gènes n'étaient pas induits par la lumière. Au total, seuls sept gènes ont été exprimés de manière différentielle à l'aube et au crépuscule en utilisant RNA-Seq, et tous étaient de moindre abondance à la fin de la période de lumière sur un 12: 12 cycle L: D. Trois des sept ont également été examinés en utilisant une analyse qPCR, et seule deux des trois ont pu être confirmés comme étant altérés, mais avec une différence de facteur inférieure à celle observée avec RNA-Seq. Nous en concluons qu'il y a peu de régulation lumineuse de l'expression génique dans cette espèce dinoflagellé. Dans l’ensemble, les études décrites ici appuient l’hypothèse que les dinoflagellés ont un moins grande dépendance sur la régulation transcriptionnelle que d’autres organismes. / Dinoflagellates are a large family of unicellular eukaryotes found in marine and freshwater ecosystems and are important primary producers in marine ecosystem. They are famous for several distinctive behaviors including forming harmful algal blooms called “red tides”, emission of bioluminescence in the ocean, and contributing to the formation of coral reefs. They have an unusual genome structure with large amounts of DNA and permanently condensed chromosomes throughout all stages of the cell cycle. The chromatin lacks observable nucleosomes and has a liquid crystal structure. Some genes are encoded in multiple repeats located in tandem arrays producing virtually identical proteins without any known conserved elements detected in the upstream promoter regions or intergenic spacers. These unique features make it difficult to understand how gene expression is regulated. This thesis describes two experimental tests for the hypothesis that transcriptional regulation is difficult and is not the primary means of regulating gene expression in dinoflagellates. Dinoflagellates show a paucity of transcription factors, and of these, cold shock domain proteins (CSPs) account for the majority of potential DNA binding proteins in the transcriptome. Here, the potential of dinoflagellate CSPs from free-living Lingulodinium polyedra and reef-forming Symbiodinium kawagutii (recently renamed to Fugacium kawagutii) to act as sequence specific transcription factors was tested. These studies using four different CSPs showed a preference for RNA over both single and double stranded DNA using electrophoretic mobility shift assays (EMSA). A second approach, testing for specific sequence binding by three cycles of selection and amplification binding (SAAB) did not enrich any consensus motif for any of the four proteins. We conclude dinoflagellate CSPs are more likely to function as RNA binding proteins than as transcription factors. Expression of many genes in many dinoflagellate species has been reported to be regulated by light. This was tested for three genes whose expression was reported to be light-regulated in Symbiodinium kawagutii. The availability of a genome sequence for this species suggested that it might be possible to identify potential regulatory elements in the promoter of these genes. However, Northern blot analysis was unable to confirm differential expression of these three genes over a 24 hour light-dark cycle. Furthermore, RNA-Seq of samples taken at the end of the day and night also indicated these three genes were not light-induced. In total, only seven genes were found to be differentially expressed at dawn and dusk using RNA-Seq in triplicate with a false discovery rate (FDR) of 0.1. All were of lower abundance at the end of the light period on a 12:12 L:D cycle suggesting possible repression by light. Three of these seven, picked at random, were examined using qPCR analysis. Only two of the three had lower abundance at the end of the day by this technique, and the fold difference was less than what was observed with RNA-Seq. We conclude from this that there is little light regulation of gene expression in this dinoflagellate species. Taken together, the studies described here support the hypothesis that dinoflagellates do not rely on regulation of genes at the transcriptional level to the same extent as other organisms.

La leucémie est une forme de cancer qui affecte les cellules du système hématopoïétique. Selon la lignée cellulaire affectée et la vitesse de développement du cancer, la leucémie peut être myéloïde ou lymphoïde, aiguë ou chronique, respectivement. Chez les enfants, elles sont souvent caractérisées par la présence de translocations chromosomiques, impliquant notamment le gène KMT2A. L'impact biologique de ces fusions de gènes, connues pour être des perturbateurs épigénétiques, est encore mal compris. Afin d’étudier spécifiquement les conséquences de la présence de fusion impliquant le gène KMT2A, un modèle leucémique humain chez la souris a été mis en place. Le modèle utilisé consiste à induire de manière rétrovirale l’expression d’une fusion oncogénique dans des cellules souches hématopoïétiques et progénitrices d’un unique donneur sain. Ces cellules sont ensuite injectées dans des souris immunodéficientes pour produire une leucémie aiguë myéloïde ou lymphoïde après quelques semaines. L’utilisation de ce modèle leucémique vise à définir les gènes qui sont régulés de manière épigénétique et essentiels dans le processus de leucémogenèse médié par une translocation chromosomique faisant intervenir le gène KMT2A. La première partie des travaux cartographie les changements génétiques et épigénétiques à chacun des stades de la leucémogénèse causée par la fusion KMT2A-MLLT3. Nous avons cartographié les changements épigénétiques tels que la méthylation de l’ADN (Methyl-seq), les modifications des histones (ChIP-seq) et l’accessibilité de la chromatine (ATAC-seq), puis les avons corrélés avec les niveaux d’expression des gènes (RNA-seq). Nous avons observé que les leucémies myéloïdes aiguës présentent un phénotype global d'hypométhylation tandis que les changements d'expression après l'addition de la fusion ont mis en évidence l’inactivation de gènes associés aux cellules souches et des altérations dans d'autres gènes impliqués dans la leucémogenèse tels que S100A8/9. Nos données d’ATAC-seq ont montré qu'il y avait relativement peu de changements spécifiques à la leucémie myéloïde aiguë et que la grande majorité correspondait à des régions de chromatine ouvertes et à des régions contenant des motifs pour des facteurs de transcription précédemment observés dans d'autres types de cellules sanguines. L’analyse des marques d’histones associées à des promoteurs actifs suggère également un potentiel rôle du récepteur CCR1 et de son ligand spécifique CCL23. Finalement, nos résultats suggèrent que la transformation leucémique par la fusion KMT2A-MLLT3 implique des modifications épigénétiques minimes qui requièrent également la coopération des réseaux transcriptionnels utilisés dans les cellules sanguines normales. La deuxième partie de cette thèse s’intéresse à la fusion de gènes KMT2A-MLLT4, une translocation chromosomique peu étudiée mais pour laquelle le pronostic vital des patients est connu pour être défavorable et pire que celui des patients porteurs de la fusion KMT2A-MLLT3. L’extension de notre modèle à la fusion KMT2A-MLLT4 nous permet d’appliquer les mêmes approches que précédemment et de détailler les différences génétiques et épigénétiques entre ces deux fusions, jusqu’à maintenant jamais caractérisées. Nous avons pu observer une baisse globale d’expression dans un groupe de gènes intervenant dans les processus ribosomaux et traductionnels. Par ailleurs, PROM1 (CD133) fait office de potentiel candidat biomarqueur permettant la distinction entre ces deux translocations chromosomiques tandis que le gène LPL pourrait jouer un rôle dans la leucémogenèse médiée par la fusion de gènes KMT2A-MLLT4. En conclusion, l’étude des mécanismes à chacun des stades du développement leucémique nous a fourni une meilleure compréhension des changements épigénétiques intervenant dans le processus de leucémogenèse causé par des réarrangements de type KMT2A. Une meilleure caractérisation de la pathophysiologie de la leucémie pourrait permettre d’explorer des avenues thérapeutiques plus ciblées. / Leukemia is a form of cancer that affects blood cells. Depending on the affected cell lineage and the rate at which the cancer grows, leukemia can be myeloid or lymphoid, or acute or chronic, respectively. In children, they are often characterized by the presence of chromosomal translocations, in particular involving the KMT2A gene. The biological impact of these gene fusions, known to be epigenetic disruptors, is still poorly understood. To study the consequences of the presence of gene fusions involving KMT2A, we have developed a human leukemia model. The model consists of transducing hematopoietic stem and progenitor cells (CD34+) from a single healthy donor with a retrovirus bearing an oncogenic fusion. These cells are injected into immunodeficient mice to produce acute myeloid or lymphoid leukemia after a few weeks. By using this model, we aim to define genes that are epigenetically regulated and essential in the process of leukemogenesis mediated by KMT2A gene fusions. The first part of this thesis characterized the genetic and epigenetic changes at each step of leukemogenesis caused by KMT2A-MLLT3 gene fusion. We investigated epigenetic changes such as DNA methylation (Methyl-seq), histone marks (ChIP-seq), and chromatin accessibility (ATAC-seq) and correlated these with expression changes (RNA-seq). We observed that acute myeloid leukemias exhibit a profound hypomethylation phenotype while expression changes after addition of the fusion highlighted the loss of stem cell associated genes and alterations in other genes implicated in leukemogenesis such as S100A8/9 in the early stages of leukemic transformation. Our ATAC-seq data showed that there were relatively few changes specific to acute myeloid leukemia and that the vast majority corresponded to open chromatin regions and clusters of transcription factors previously seen in other types of blood cells. Examination of ChIP-seq data for active histone marks revealed that leukemia specific expression of the chemokine CCL23 can enable autocrine signalling through its cognate receptor, CCR1. Our results suggest that KMT2A-MLLT3 induces minimal changes in the epigenome while co-opting the normal transcriptional machinery to drive leukemogenesis. The second part of this thesis focuses on KMT2A-MLLT4 gene fusion, another chromosomal translocation for which the vital prognosis of patients is known to be worse than that of patients carrying the KMT2A-MLLT3 fusion. The extension of our model to the KMT2A-MLLT4 fusion allows us to apply the same approaches and to characterize the genetic and epigenetic differences between these two different leukemias. We were able to observe a dramatic decrease in the expression level of a group of genes involved in ribosomal and translational processes. Furthermore, PROM1 (CD133) acts as a potential biomarker candidate which might be used to make the distinction between these two leukemias. LPL gene might play a role in leukemogenesis mediated by KMT2A-MLLT4 gene fusion. In conclusion, studying the mechanisms at each stage of leukemic development has provided us with a better understanding of the epigenetic changes involved in the process of leukemogenesis mediated by KMT2A rearrangements. A better characterization of the pathophysiology of leukemia could make it possible to eventually develop more targeted therapeutic treatments.

Le sommeil est un comportement qui occupe un tiers de notre vie. L'horaire, la durée, et la qualité du sommeil sont contrôlés par deux processus principaux : la régulation homéostatique du sommeil et l’horloge qui synchronise les rythmes circadiens internes. EPHA4 est une molécule d'adhésion cellulaire qui régule la neurotransmission et qui est exprimée dans des régions cérébrales impliquées dans la régulation circadienne et du sommeil. De manière intéressante, le gène EphA4 contient des éléments régulateurs des facteurs de transcription circadiens et les souris Clock mutantes voient leur expression d’EphA4 modifiée. De plus, les souris EphA4 knockout (KO) ont des rythmes circadiens d’activité locomotrice anormaux, moins de sommeil paradoxal dans la période de lumière, et une distribution des oscillations cérébrales du sommeil modifiée sur un cycle de 24 heures. Par conséquent, et étant donné que EPHA4 est crucial pour le neurodéveloppement, il convient d’explorer si les phénotypes du sommeil/circadiens observés chez les souris EphA4 KO proviennent d'effets sur le développement ou des rôles d'EPHA4 dans la fonction neuronale adulte. Par ailleurs, les mécanismes de régulation transcriptionnelle d'EphA4 sont encore méconnus. Dans cette thèse, nous avons émis les hypothèses que i) l'expression du gène EphA4 ou de leurs ligands Éphrines (Efns) est régulée de manière circadienne ; et ii) que le modulateur de l’activité d’EPHA4 rhynchophylline (RHY) modifie le sommeil chez les souris adultes d'une manière qui ressemble au phénotype EphA4 KO. L'étude I montre que les facteurs de transcription de l’horloge (CLOCK/NPAS2 et BMAL1) activent la transcription via les éléments de réponse à l'ADN «boîtes E» trouvées dans les promoteurs putatifs d'EphA4, EfnB2 et EfnA3 in vitro. Cependant, les protéines EPHA4 et EFNB2 n’ont pas montré une oscillation circadienne dans le cortex préfrontal et les noyaux suprachiasmatiques (horloge principale) de souris. Dans le projet II, l'effet de RHY sur le sommeil a été étudié chez des souris mâles et femelles avec des enregistrements electroencéphalographiques. Nos données ont démontré que RHY prolonge le sommeil à onde lente, mais les effets sur le sommeil paradoxal dépendent de l’heure d’injection. RHY modifie aussi les oscillations cérébrales pendant l’éveil et le sommeil. Tous ces effets sont notablement plus marqués chez les femelles, ce qui souligne l’importance d’étudier les deux sexes lors des essais pharmacologiques. La transcriptomique spatiale cérébrale révèle que RHY modifie des transcrits liés à des réponses d’inflammation dans tout le cerveau, mais qu'elle affecte l'expression génique des neuropeptides associés à la régulation du sommeil et hypophysaires particulièrement dans l’hypothalamus. En outre, RHY affecte l'expression des gènes de la transcription/traduction de manière diffèrent selon l’heure d’injection. La première publication met en évidence que la régulation transcriptionnelle d’EphA4 et des Efns pourraient expliquer quelques-uns des phénotypes observés chez les souris KO. La deuxième publication démontre que RHY induit le sommeil chez la souris et souligne l’importance de caractériser des mécanismes inexplorés sous-jacents aux composés naturels. Décrire la régulation moléculaire du sommeil peut apporter des éclairages utiles pour la chronopharmacologie. / Sleep is a behavior which occupies a third of our lifetime. The schedule, the duration and the quality of sleep are controlled by two main processes: the homeostatic sleep regulation and the clock that synchronizes the internal circadian rhythm. EPHA4 is a cell adhesion molecule regulating neurotransmission and is expressed in brain centers regulating sleep and circadian rhythms. Interestingly, the EphA4 gene contains regulatory elements for circadian transcription factors, and Clock mutant mice have altered EphA4 expression. Moreover, EphA4 knockout mice (KO) have abnormal circadian rhythms of locomotor activity, less paradoxical sleep in the light period and altered sleep brain oscillations across the 24 hours. Given that EPHA4 is crucial for development, it should be investigated whether the sleep/circadian phenotypes observed in EphA4 KO originate from developmental effects or from roles of EPHA4 in adult neuronal function. Moreover, very little is known about the transcriptional regulation of EPHA4. Thus, the hypotheses of this thesis were that i) the gene expression of EphA4 or that of its ligands Ephrins (Efns) is regulated in a circadian manner; and ii) that the modulator of EPHA4 activity rhynchophylline (RHY) modifies sleep in adult mice in manners that resemble the EphA4 KO phenotype. Project I demonstrates that the clock transcription factors (CLOCK/NPAS2 et BMAL1) activate transcription via the DNA regulatory elements “E-boxes” found in the putative promoters of EphA4, EfnB2 and EfnA3 in vitro. Nevertheless, EPHA4 and EFNB2 proteins did not show a circadian oscillation in the mouse prefrontal cortex and suprachiasmatic nuclei (master clock). In project II, the effect of RHY on sleep was studied in male and female mice with electroencephalographic recordings. RHY extends slow wave sleep and effects on paradoxical sleep depended on the time-of-injection. RHY also modified the brain oscillations during wakefulness and sleep. Importantly, all these effects were larger in females, which highlights the need to consider both sexes in pharmacological studies. Brain spatial transcriptomics reveals that RHY modifies transcripts linked to inflammatory responses throughout the brain, while it affects transcripts linked to sleep regulation and pituitary responses particularly in the hypothalamus. Moreover, RHY affected the expression of genes for transcription/translation differently depending on the time of injection. The first publication underscores that the transcriptional regulation of EphA4 and Efns may underly some of the phenotypes observed in the KO mice. The second publication demonstrates that RHY induces sleep in mice, that it modifies brain activity associated to cognitive processes and highlights the importance of characterizing unexplored mechanisms of natural compounds. Describing the molecular regulation of sleep may provide useful insights for chronopharmacology.

Les modèles de Markov d’ordre 2 (HMM2) sont des modèles stochastiques qui ont démontré leur efficacité dans l’exploration de séquences génomiques. Cette thèse explore l’intérêt de modèles de différents types (M1M2, M2M2, M2M0) ainsi que leur couplage à des méthodes combinatoires pour segmenter les génomes bactériens sans connaissances a priori du contenu génétique. Ces approches ont été appliquées à deux modèles bactériens afin d’en valider la robustesse : Streptomyces coelicolor et Streptococcus thermophilus. Ces espèces bactériennes présentent des caractéristiques génomiques très distinctes (composition, taille du génome) en lien avec leur écosystème spécifique : le sol pour les S. coelicolor et le milieu lait pour S. thermophilus / Second-order Hidden Markov Models (HMM2) are stochastic processes with a high efficiency in exploring bacterial genome sequences. Different types of HMM2 (M1M2, M2M2, M2M0) combined to combinatorial methods were developed in a new approach to discriminate genomic regions without a priori knowledge on their genetic content. This approach was applied on two bacterial models in order to validate its achievements: Streptomyces coelicolor and Streptococcus thermophilus. These bacterial species exhibit distinct genomic traits (base composition, global genome size) in relation with their ecological niche: soil for S. coelicolor and dairy products for S. thermophilus. In S. coelicolor, a first HMM2 architecture allowed the detection of short discrete DNA heterogeneities (5-16 nucleotides in size), mostly localized in intergenic regions. The application of the method on a biologically known gene set, the SigR regulon (involved in oxidative stress response), proved the efficiency in identifying bacterial promoters. S. coelicolor shows a complex regulatory network (up to 12% of the genes may be involved in gene regulation) with more than 60 sigma factors, involved in initiation of transcription. A classification method coupled to a searching algorithm (i.e. R’MES) was developed to automatically extract the box1-spacer-box2 composite DNA motifs, structure corresponding to the typical bacterial promoter -35/-10 boxes. Among the 814 DNA motifs described for the whole S. coelicolor genome, those of sigma factors (B, WhiG) could be retrieved from the crude data. We could show that this method could be generalized by applying it successfully in a preliminary attempt to the genome of Bacillus subtilis

Les biopuces à ADN permettent d’étudier à une échelle génomique une très grande variété de questions sur la physiologie et la différenciation cellulaires. Elles ont ainsi contribué de manière considérable aux progrès récents de nombreux domaines de la biologie et occuperont bientôt une place de choix dans le secteur du diagnostic médical. C’est la levure Saccharomyces cerevisiae qui a servi de modèle pour le développement de la première biopuce génomique. L’application de cette approche à la levure a permis d’explorer sous un angle nouveau l’étude de ses différents états de différenciation, de son cycle cellulaire, et de sa capacité d’adaptation à diverses conditions nutritionnelles ou à des conditions environnementales induisant un stress cellulaire. Plusieurs études ont plus particulièrement examiné la réponse des cellules de levure à une carence en azote ou en acides aminés. Cependant, une étude systématique de la réponse transcriptionnelle de la cellule aux différentes sources d’azote n’a jamais été entreprise en croissance confinée à l'état de régime. S. cerevisiae est capable d’utiliser plus d’une vingtaine de substances en tant que sources uniques d’azote pour la croissance. On distingue parmi les sources d’azote celles qui permettent une croissance optimale, appelées « bonnes » sources d’azote, des autres, appelées « mauvaises » sources d’azote. La levure possède plusieurs systèmes de régulation lui permettant de s'adapter à la condition azotée. Au niveau transcriptionnel, on recense trois régulations générales – la NCR (répression catabolique azotée), le GAAC (le contrôle général de la biosynthèse des acides aminés) et le système SPS (Ssy1-Ptr3-Ssy5) – et une multitude de régulations plus spécifiques.<p>En utilisant la technique des puces à ADN, nous avons généré une matrice d'expression de l'ensemble des gènes de la levure en croissance confinée à l'état de régime dans un milieu de culture contenant une parmi 21 sources d'azote différentes. Nous avons pu ainsi recenser systématiquement 506 gènes soumis à une régulation transcriptionnelle dépendante de l'azote.<p>En nous basant sur ces résultats, nous avons pu décrire l'ensemble des régulations transcriptionnelles engagées dans l'adaptation à la source d'azote fournie dans le milieu de culture. Parallèlement, nous avons défini deux grands groupes de sources d'azote en fonction du transcriptome de S. cerevisiae. Le premier groupe rassemble les composés qui exercent une répression catabolique azotée forte et dont la liste a été complétée. Fait nouveau, nous montrons que ces mêmes composés enclenchent aussi l'activation de la réponse aux protéines mal repliées (UPR). Au contraire, lorsque la source d'azote appartient au second groupe que nous avons défini, non seulement la croissance des levures est plus lente, la NCR levée et la réponse aux protéines mal repliées réprimée, mais nous montrons de façon inattendue que le contrôle général de la biosynthèse des acides aminés est activé. Plusieurs autres régulations qui ne sont pas impliquées dans le métabolisme azoté présentent un comportement différent en fonction de la source d'azote fournie. C'est le cas notamment des gènes dont l’expression est régulée selon l’apport en zinc et qui sont moins exprimés sur le milieu urée. De même, les gènes impliqués dans les résistances multiples aux drogues sont activés par le tryptophane.<p>En confrontant nos résultats à ceux obtenus dans le cadre de travaux indépendants, nous avons proposé plus d'une cinquantaine de nouveaux gènes cibles de la NCR. Beaucoup d'entre eux n'ont jamais été caractérisés expérimentalement. En utilisant des techniques avancées d'analyse de séquences primaires de protéines, nous avons pu proposer une fonction pour plusieurs de ces gènes. Ces analyses bioinformatiques et la réalisation d’expériences complémentaires à l’aide de biopuces à ADN nous ont permis de proposer que l'un d'entre eux code pour une protéine impliquée dans la déstabilisation d'ARN messagers lors de la carence azotée. Nous avons aussi identifié plusieurs nouveaux gènes appartenant à des régulons spécifiquement activés en réponse à un nombre restreint de sources d'azote. Il est probable que ces gènes soient impliqués dans le catabolisme des sources d'azote sur lesquelles ils sont activés. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les cancers, qu’il s’agisse de leucémies ou de tumeurs solides, sont le résultat de proliférations cellulaires anormales et non contrôlées au sein des tissus. Ces proliférations anarchiques sont le reflet d’une surexpression et/ou sur-activation de protéines intracellulaires engendrées par un événement oncogénique. Aujourd’hui encore il est donc nécessaire de trouver de nouvelles molécules à usage thérapeutique ciblant spécifiquement ces protéines. C’est dans ce contexte que les facteurs de transcription STAT5 constituent de véritables cibles de choix puisque ces protéines participent activement à la leucogénèse. L’implication directe des protéines STAT5 dans la génèse des leucémies a été démontrée par l’utilisation de formes mutées constitutivement active de STAT5. Les facteurs de transcription STAT5 jouent un rôle essentiel dans la voie de signalisation JAK/STAT. Cette voie aboutit à la régulation de grandes fonctions biologiques telles que la prolifération cellulaire, la différenciation cellulaire ou encore l’apoptose. L’objectif de ce projet consiste donc à cibler spécifiquement les protéines STAT5 dans le but de rétablir le processus de mort cellulaire et empêcher la prolifération des cellules cancéreuses. Les inhibiteurs spécifiques des protéines STAT5 sont sélectionnés selon la méthode SELEX qui permet d’isoler des ligands structurés de forte affinité pour la protéine. L’affinité et la spécificité de ces inhibiteurs, appelés aptamères, sont caractérisées à partir de modèles cellulaires de leucémies dépendant de l’activité des facteurs de transcription STAT5. Les aptamères sont aujourd’hui de véritables outils thérapeutiques en pleine évolution. / Leukemias are due to abnormal cell proliferation, which is the result of intracellular over-expression or excessive activation of protein due to oncogenic event. Still today, it is necessary to find new therapeutic molecules, which specifically target these proteins. STAT5, via the JAK/STAT signaling pathway, controls fundamental cellular processes, including .cell survival, proliferation and differentiation. To struggle against tumorigenesis, JAK/STAT signaling pathway has to be inhibited. The aim of this project is to target specifically STAT5 factors to restore healthy signal transduction. We generated aptamers by an iterative in vitro selection. Aptamers are short-structured single strand DNAs or RNAs that bind with high affinity and specificity to their target. Once STAT5B recombinant proteins are produced, they are subjected to SELEX process. The number of rounds depends on various parameters. After seven rounds, two sequences are retrieved. The specificity and affinity of these aptamers are assessed by fluorescent immunoassays. Binding affinity and kinetics of interaction are characterized by SPR. Aptamer anti proliferative effects are determined by evaluation of the growth of cells depending on STAT5. Finally, we developed several .assays aiming at understanding the mechanism of an aptamer action on STAT5B such as phosphorylation measurement and EMSA. Aptamers are now emerging therapeutic tools; they exhibit significant advantages relative to protein therapeutics.

Dans le domaine de la biologie développementale, un des principaux défis est de comprendre comment des tissus multicellulaires, à l'origine indifférenciés, peuvent engendrer des formes aussi complexes que celles d'une fleur. De part son implication dans l'organogenèse florale, l'auxine est une phytohormone majeure. Nous avons donc déterminé son réseau binaire potentiel, puis y avons appliqué des modèles de clustering de graphes s'appuyant sur les profils de connexion présentés par ces 52 facteurs de transcription (FT). Nous avons ainsi pu identifier trois groupes, proches des groupes biologiques putatifs: les facteurs de réponse à l'auxine activateurs (ARF+), répresseurs (ARF-) et les Aux/IAAs. Nous avons détecté l'auto-interaction des ARF+ et des Aux/IAA, ainsi que leur interaction, alors que les ARF- en présentent un nombre restreint. Ainsi, nous proposons un mode de compétition auxine indépendent entre ARF+ et ARF- pour la régulation transcriptionelle. Deuxièmement, nous avons modélisé l'influence des séquences de dimérisation des FT sur la structure de l'interactome en utilisant des modèles de mélange Gaussien pour graphes aléatoires. Les groupes obtenus sont proches des précédents, et les paramètres estimés nous on conduit à conclure que chaque sous-domaine peut jouer un rôle différent en fonction de leur proximité phylogénétique.Enfin, nous sommes passés à l'échelle multi-cellulaire ou, par un graphe spatio-temporel, nous avons modélisé les premiers stades du développement floral d'A. thaliana. Nous avons pu extraire des caractéristiques cellulaires (3D+t) de reconstruction d'imagerie confocale, et avons démontré la possibilité de caractériser l'identité cellulaire en utilisant des méthodes de classification hiérarchique et des arbres de Markov cachés. / A striking aspect of flowering plants is that, although they seem to display a great diversity of size and shape, they are made of the same basics constituents, that is the cells. The major challenge is then to understand how multicellular tissues, originally undifferentiated, can give rise to such complex shapes. We first investigated the uncharacterised signalling network of auxin since it is a major phytohormone involved in flower organogenesis.We started by determining the potential binary network, then applied model-based graph clustering methods relying on connectivity profiles. We demonstrated that it could be summarise in three groups, closely related to putative biological groups. The characterisation of the network function was made using ordinary differential equation modelling, which was later confirmed by experimental observations.In a second time, we modelled the influence of the protein dimerisation sequences on the auxin interactome structure using mixture of linear models for random graphs. This model lead us to conclude that these groups behave differently, depending on their dimerisation sequence similarities, and that each dimerisation domains might play different roles.Finally, we changed scale to represent the observed early stages of A. thaliana flower development as a spatio-temporal property graph. Using recent improvements in imaging techniques, we could extract 3D+t cellular features, and demonstrated the possibility of identifying and characterising cellular identity on this basis. In that respect, hierarchical clustering methods and hidden Markov tree have proven successful in grouping cell depending on their feature similarities.