Las proteínas ribosomales S13 y L33 pertenecen respectivamente a las subunidades 30S y 50S del ribosoma bacteriano. S13 se posiciona en cercanía a los factores de iniciación (IF1 e IF3). L33 se encuentra opuesta a S13 en la subunidad mayor. El presente estudio, busca evaluar las proteínas S13 y L33 marcadas fluorescentemente durante la iniciación de la síntesis proteica, para generar un sistema experimental que permita analizar cambios estructurales en las subunidades ribosomales, especialmente durante la iniciación de la traducción y en función de la unión de antibióticos. Mediante técnicas recombinantes y cromatografía de intercambio iónico, se expresaron y purificaron ambas proteínas ribosomales. Se obtuvieron rendimientos de la producción de proteína L33 en el rango de miligramos por g de Escherichia coli, e índices de pureza sobre el 98%. S13 fue producido de manera similar y se obtuvieron proteínas puras en el rango de miligramos por g de Escherichia coli con una pureza de 99%. Ambas proteínas ribosomales fueron modificadas con compuestos fluorescentes compatibles con mediciones de FRET (De sus siglas en inglés, Föester Resonance Energy Transfer). En condiciones controladas S13 logró insertarse en la subunidad 30S, mientras que experimentos de sedimentación indicaron que L33 fluorescente no se unía a la subunidad 50S. Se realizaron mediciones FRET entre la subunidad 30S modificada con S13 fluorescente y los factores de iniciación IF1 e IF3. La medición FRET entre S13(Atto-540Q) e IF3-CTD(Atto-488) se utilizó para medir la interacción de estreptomicina, espectinomicina y GE81112, antibióticos que se unen a la subunidad menor del ribosoma. Estreptomicina se une rápidamente a la subunidad 30S y ocasiona un acercamiento de S13(Atto-540Q) al IF3-CTD(Atto-488) mientras que GE81112, y en menor medida espectinomicina, promueven un alejamiento de la proteína ribosomal del factor de iniciación. Ambos movimientos son compatibles con rotaciones de la cabeza de la subunidad 30S, previamente descritos como fundamentales para el funcionamiento del ribosoma. El presente estudio de investigación brinda un sistema experimental novedoso para estudiar cambios estructurales en la subunidad menor en función de la unión de antibióticos al ribosoma. / The ribosomal proteins S13 and L33 belong respectively to the 30S and 50S subunits of the bacterial ribosome. S13 is positioned close to the initiation factors (IF1 and IF3). L33 is opposite and near to S13 in the major subunit. The present study, the aim is to evaluate the fluorescently labeled S13 and L33 proteins during the initiation of protein synthesis, aiming to build an experimental system that allows the analysis of structural changes in the ribosomal subunits, especially during the initiation of translation and with the binding of antibiotics. Using recombinant techniques and ion exchange chromatography, both ribosomal proteins were expressed and purified. Production yields of pure proteins of L33 were obtained in the range of milligrams per g of Escherichia coli, in addition, of 98% purity indices. S13 was produced in a similar manner, obtaining milligrams of pure protein per g of Escherichia coli with a purity of 99%. Both ribosomal proteins were modified with fluorescent compounds compatible with measurements of FRET (Föester Resonance Energy Transfer). Under controlled conditions S13 was able to insert into the 30S subunit, while sedimentation experiments indicated that fluorescent L33 did not bind to the 50S subunit. The 30S subunit modified with fluorescent S13 showed various FRET signals in combination with the initiation factors IF1 and IF3. These signals were used to measure the interaction of streptomycin, spectinomycin and GE81112, antibiotics that bind to the minor subunit of the ribosome. Streptomycin binds rapidly to the 30S subunit and causes an approximation of S13(Atto-540Q) to IF3-CTD(Atto-488) while GE81112, and to a lesser extent spectinomycin, promote a distancing of the ribosomal protein from the initiation factor. Both movements can account for rotations of the head of the 30S subunit, previously described as fundamental for the functioning of the ribosome. The present research provides a novel approach to study structural changes in the minor subunit according to the binding of antibiotics to the ribosome.

[pt] No presente trabalho foram desenvolvidos métodos analíticos para a determinação seletiva de azaarenos básicos. Extração em fase sólida (SPE, do inglês solid phase extraction) em combinação com cromatografia líquida de alta eficiência com detector de fluorescência (HPLC-FD, do inglês high performance liquid chromatography with fluorescence detector) foram utilizados como um método sensível para a determinação de seis azaarenos básicos (7,8-benzoquinolina - 78BQ, 7,9-dimetilbenzo[c]acridina - 79DMBA, 9-amino-1,2,3,4-tetrahidroacridina - 9ATHA, 9-metilacridina - 9MA, acridina - A, e dibenzo[a,j]acridina - DBA) em amostras de querosene de aviação (QAV) e querosene comercial. O procedimento de extração foi realizado em uma única etapa usando um cartucho de ácido propilsulfônico. Para HPLC, foram utilizados separação em fase reversa (C18) e um programa de detecção com os comprimentos de onda ótimos de excitação e de emissão. Um gradiente de eluição com acetonitrila (ACN) e tampão fosfato (pH 6,5) permitiu uma separação rápida e eficiente dos azaarenos em menos de 15 min. Os valores de LOD e LOQ, baseados na razão sinal-ruído de 3:1 e 10:1, respectivamente, ficaram entre 0,0013 e 0,021 e entre 0,0044 e 0,072 ng injetados. As curvas analíticas mostraram comportamento linear na faixa de trabalho estudada, LOQ a 250 ug L(-1), (r2 > 0,99). Para uma amostra de QAV fortificada com 6,0 ug L(-1), as recuperações foram de 92 a 107%, exceto para a 9ATHA, que apresentou um valor de recuperação menor (68%). Finalmente, o método proposto foi aplicado para a quantificação dos seis azaarenos básicos em uma amostra de querosene doméstico e em três amostras de QAV. A presença de 78BQ e DBA foi confirmada nas amostras de QAV. Em seguida, estudos para o desenvolvimento de métodos por eletroforese capilar foram avaliados para a quantificação dos azaarenos básicos em QAV. Em cromatografia eletrocinética capilar micelar, as condições selecionadas para a separação dos analitos, na fase preliminar de estudo, foram: tampão borato 20 mmol L(-1) contendo 40 mmol L(-1) de SDS, 20% de metanol e 2 mol L(-1) de uréia, pH 9,5; condições instrumentais: 30 kV, 30 °C e 10 s de injeção hidrodinâmica por pressão de 50 mbar. No caso de eletroforese capilar de zona (CZE), as condições selecionadas para a separação e a préconcentração dos analitos em linha foram: tampão fosfato 50 mmol L-1 contendo 25% de ACN, pH 2,65; condições instrumentais: 25 kV, 25 °C e 150 s de injeção hidrodinâmica por pressão de 50 mbar; amostra dissolvida em tampão fosfato 1 mmol L(-1) contendo 20% de ACN. Um capilar de sílica fundida com 64,5 cm de comprimento (56 cm efetivos), 50 (u)m de diâmetro interno e 150 (u)m de caminho óptico foi utilizado. Os valores de LOD e LOQ para o método CZE ficaram entre 0,68 e 3,2 e entre 1,1 e 7,7 (u)g L(-1), respectivamente. Os resultados obtidos até o momento indicam, com perspectivas positivas, que é possível aplicar CZE com pré-concentração em linha para a determinação dos azaarenos básicos em QAV. Entretanto, um estudo mais detalhado para melhorar a resolução e a sensibilidade e diminuir o tempo de análise ainda se faz necessário. Além disso, o procedimento de extração dos analitos da amostra de QAV deve ser ajustado para, além de proporcionar bons resultados de recuperação, ser compatível com o método de análise desenvolvido. Finalmente, um método alternativo foi desenvolvido, usando a aquisição de espectros de fluorescência por varredura sincronizada e a análise dos dados por mínimos quadrados parciais (PLS) para a determinação simultânea dos mesmos seis azaarenos em QAV. Foram utilizadas 40 amostras sintéticas, contendo os seis analitos em estudo, na faixa de 10 a 100 (u)g L(-1) em Metanol:HCl 0,01 mol L(-1). Os espectros de varredura sincronizada foram obtidos com (delta)(lambda) = 30, 120 e 150 nm. Na construção dos modelos de regressão PLS foram empregadas 20 amostras para calibração e 20 para a previsão (et / [en] In this work, analytical methods were developed for the selective determination of basic azaarenes. Solid phase extraction (SPE) in combination with high performance liquid chromatography with fluorescence detection (HPLCFD) has been used for the sensitive method determination of six basic azaarenes (7,8-benzoquinoline - 78BQ, 7,9-dimethylbenz[c]acridine - 79DMBA, 9-amino- 1,2,3,4-tetrahydroacridine - 9ATHA, 9-methylacridine - 9MA, acridine - A, and dibenz[a,j]acridine - DBA) in jet fuel samples. The extraction process was performed in a single step using a propyl sulfonic acid cartridge (PRS). The HPLC system consisted of C18 column with a selected detection program of optimum excitation ((lambda) exc) and emission ((lambda)em) wavelengths. A gradient elution with ACN and phosphate buffer (pH 6.5) allowed an efficient and fast separation of the azaarenes within 15 min. The LOD and LOQ values, based on signal-to-noise ratio 3:1 and 10:1, respectively, were between 0.0013 and 0.021 and from 0.0044 to 0.072 ng per injection. The calibration curves showed linear behavior in range from LOQ to 250 mg L(-1) (r(2) > 0.99). For the spiked concentration of 6.0 (u)g L(-1), the recoveries were from 92 to 107% for jet fuel samples, except for 9ATHA, which presented a lower recovery value (68%). Finally, the proposed method was applied to the quantification of those six basic azaarenes in a commercial kerosene sample and in three jet fuel samples. The presence of 78BQ and DBA was confirmed in the jet fuel samples. Capillary electrophoresis methods were evaluated for the quantification of the basic azaarenes in jet fuel samples. In MECC, the best conditions for the separation of the analytes, in the preliminary phase of study, have been: 20 mmol L(-1) borate buffer with 25% of methanol and 40 mmol L(-1) SDS (pH 9.5) as the background solution; instrumental conditions: 30 kV, 30 °C and hydrodynamic injection (50 mbar) for 10 s. In CZE, the best conditions for the separation of the analytes have been: 50 mmol L(-1) phosphate buffer with 25 % of acetonitrile (pH 2.65) as the background solution; instrumental conditions: 25 kV, 25 °C and hydrodynamic injection (50 mbar) for 150 s; sample solvent: 1 mmol L(-1) phosphate buffer with 20 % of acetonitrile. A fused-silica capillary of 50 mm ID x 64.5 cm (56 cm effective length) x 150 mm path length has been used. The LOD and LOQ values were between 0.68 and 3.2 and from 1.1 to 7.7 (u)g L(-1), respectively. The previous results showed positive perspectives to apply CZE with on-line pre-concentration for the determination of the basic azaarenes in jet fuel. However, a more detailed study to improve the resolution and sensitivity and to reduce the analysis time is still necessary. Moreover, the procedure of the analytes extraction from the kerosene sample must be adjusted for providing good results of recovery and to be compatible with the developed method of analysis. Finally, an alternative method was developed, using fluorescence spectra acquisition by synchronous scan and partial least square regression (PLS), for determination of the same basic azaarenes. 40 synthetic mixtures were used in the range of 10 to 100 (u)g L(-1). The synchronous scan spectra were obtained using (lambda)(delta) = 30,120 and 150 nm. In the PLS models, 20 samples were used for calibration and 20 for test. The clean-up procedure was adapted from the HPLC-FD method employing Methanol:HCl 0,01 mol L(-1) as the final solvent of the extraction. The extracts were analyzed by HPLC and the results were used as reference values. The LOD and LOQ values, calculated from the net analytical signal (NAS), were between 0.045 and 2.0 and from 0.15 to 6.6 (u)g L(-1), respectively. The relative standard errors of prediction (%RSEP) were from 3.0 to 10% for the sample test set. For the spiked jet fuel sample the %RSEP were between 4.9 and 11% for four of the six studied analytes, since it

Orientador: Marinônio Lopes Cornélio / Banca: Marcelo Andrés Fossey / Banca: Amando Siuiti Ito / Resumo: Os flavonoides são compostos polifenólicos encontrados nas plantas que são responsaveis pela pigmentação e em alguns casos atuam como inibidores de infecções por microorganismos. Recentemente seu papel como antioxidante e na regulação dos mecanismos de sinalização celular em humanos foi descoberta, motivo pelo qual a pesquisa com os flavonoides despertou interesse na comunidade científica. Uma importante proteína que se encontra no soro humano é a Albumina Sérica Humana (HSA), a qual está encarregada de transportar os nutrientes(ligantes) que se encontram no sangue e disponibiliza-los para células e tecidos. Esse processo pelo qual a HSA leva um ligante a uma célula é chamado de liberação. No processo de liberação do ligante, espera-se que o complexo HSA-Flavonoide seja enfraquecido, assim possibilitando a liberação do ligante. Sendo que o enfraquecimento do complexo HSA-Flavonoide pode ser induzido por fatores fisiológicos como o pH, é que no presente trabalho estudamos o efeito do pH na interação da HSA com os flavonoides Quercetina e Quercitrina. Em vista de determinar o papel modulador do pH na liberação dos flavonoides, neste trabalho exploramos as i) constantes de supressão, ii) os parâmetros termodinâmicos como a entalpia (ΔHo), entropia (ΔSo) e energia livre de Gibbs(ΔGo), iii) o número de sítios de ligação disponível e iv) o FRET dos complexos Quercetina-HSA e Quercitrina-HSA na faixa de pH de 7.0 a 6.0 . Dos dados de supressão de fluorescência a pH 7.0, observou-se que a interação Quercetina-HSA foi descrita pelo modelo de Perrin enquanto que a interação Quercitrina-HSA foi descrita pelo modelo linear de Stern-Volmer. Os modelos supressão de fluorescência foram os mesmos a pH 6.0. No pH ligeiramente ácido as constantes de supressão do complexo Quercetina-HSA diminuíram enquanto que as constantes de supressão do complexo Quercitrina-HSA aumentaram. Da availação das constantes de ... / Abstract: The flavonoids are poliphenolic compounds found in plants, which are responsible to provide pigmentation and in some cases act as an inhibitors of infections mediated by microorganism. Recently, their role as an antioxidant and in the regulation of signaling mechanism have been discovered, reason by which the research with flavonoids have grown. An important protein, which is found in the human plasma is the Human Serum Albumin (HSA), which is responsible to transport the nutrients (ligands) found in the blood to show them to cells and tissues. The process by which the HSA give off the ligand to cell is called delivery. In the delivery process, it is hope that the strenght of the Flavonoid-HSA complex is weakened, causing the delivery of the ligand. Due to the strenght of the Flavonoid-HSA complex could be weakened by a physiological factor such as pH, is that in the present work is studied the effect of the pH on the interaction between HSA and the flavonoids Quercetin and Quercitrin. In order to determine the role of the pH as a modulator of flavonoids delivery, this work will explore, i) the quenching constants, ii) thermodynamic parameters such as enthalpy (ΔHo), entropy (ΔSo) and the Gibbs free energy (ΔGo), iii) the number of binding sites and iv) FRET of the Quercetin-HSA and Quercitrin-HSA complexes in the pH range from 7.0 to 6.0. From the fluorescence quenching data at pH 7.0, was observed that the Quercetin-HSA interaction was described by the Perrin model, while the Quercitrin-HSA complex was described by the linear Stern-Volmer model. The quenching models were the same at pH 6.0. At a slightly acidic pH the fluorescence quenching constants of the Quercetin-HSA showed to decrease, while for the Quercitrin-HSA complexes increased. From the fluorescence quenching studies at different temperatures (288, 298 and 308K) it was showed that the quenching mechanisms for both flavonoids (Quercetin and Quercitrin) are static ... / Mestre

Orientador: Marinônio Lopes Cornélio / Banca: Marcelo Andrés Fossey / Banca: Valdecir Farias Ximenes / Resumo: Piplartina é um alcalóide amida presente em raízes e caules de diferentes espécies de pimentas do gênero Piper. Este composto apresenta várias propriedades farmacológicas promissoras, tais como: antidepressiva, ansiolítica, genotóxica, citotóxica, antiangiogê- nico, antimetastático, entre outras; destaca-se sua propriedade anti-cancerígena, pois este composto demonstra efeito anti-proliferativo maior em células alteradas do que em cé- lulas normais. Estudos têm determinado os parâmetros farmacocinéticos da piplartina em plasma de rato, através de administração via intraperitoneal, porém, sem detalhar qualquer alvo molecular ou descrever as forças físico-químicas da interação. Este estudo foi realizado para compreender a interação entre piplartina (PPTN) e albumina do soro humano (HSA), que é a proteína predominante no plasma sanguíneo e carreadora de vários fármacos. Essa interação foi investigada através de espectroscopia de fluorescência de estado fundamental, monitorando a emissão de fluorescência do único resíduo de triptofano da HSA (Trp214). Observou-se a formação do complexo HSA-piplartina. A análise do parâmetro termodinâmico indicou que o processo ocorre espontaneamente e é entalpicamente dirigido; a constante de afinidade sugere que essa interação é reversível. As análises de deslocamento do marcador de sítio e do método função densidade de ligação indicaram que a piplartina liga sobre um único sítio da HSA, o qual foi sugerido como o subdomínio IIA / Piplartine is an alkaloid amide present in roots and stems of different peppers species of the genus Piper. This compound has several promising pharmacological properties, such as: antidepressant, anxiolytic, genotoxic, cytotoxic, antiangiogenic, antimetastatic, among others; Its anticancer property is highlighted, because this compound does demonstrate greater anti-proliferative effect in altered cells than in normal cells. Studies have determined the pharmacokinetic parameters of piplartine in rat plasma by intraperitoneal administration, however, without pointing any molecular target or describing the physicochemical forces of the interaction. This study was conducted to understand the interaction between piplartine (PPTN) and human serum albumin (HSA), which is the predominant protein in blood plasma and carrier of various drugs. This interaction was investigated through steady-state fluorescence spectroscopy, monitoring the fluorescence emission of the single tryptophan residue of HSA (Trp214). It was observed the complex HSA-piplartine formation. The thermodynamic parameter analysis indicates that the process occurs spontaneously and it is enthalpically driven; the affinity constant suggests that this interaction is reversible. It was indicated by the binding density function method and by the site marker displacement analysis that the piplartine binds on HSA at single site, which was determined like the IIA sub-domain / Mestre

Memoria para optar al título profesional de Ingeniero Agrónomo / El cultivo de la jojoba ((Simmondsia chinensis (Link.) Schneider) se caracteriza por una alta sensibilidad al anegamiento, una alta tolerancia a la salinidad y al déficit hídrico. Es así como en una plantación de jojoba, ubicada en Diego de Almagro, región de Atacama y regadas con aguas claras del tranque de relaves mineros Pampa Austral (con altas concentraciones de sales y metales pesados), se presento una elevada y aleatoria muerte de plantas asociada a lluvias invernales del 2009. De esta forma se estudió el efecto de la simulación de precipitaciones y la salinidad del suelo sobre la planta. Se aplicaron cuatro tratamientos con un diseño experimental en boques completos al azar con arreglo factorial, donde los factores fueron salinidad (lugar de aplicación de los tratamientos) y cantidad de agua aplicada como simulación de lluvia, donde los tratamientos fueron: suelo sin sales y anegamiento (SS/LL); suelo sin sales y simulación de anegamiento (SS/A); suelo con sales y simulación de lluvia (CS/LL); Suelo con sales y simulación de anegamiento (CS/A) Se realizo un seguimiento del comportamiento del suelo (humedad, temperatura y conductividad eléctrica), de la condición fisiológica de la planta (Fluorescencia de clorofilas, temperatura foliar y potencial hídrico de brote) y un estado general de la planta (crecimiento, daño y mortalidad). Se vio diferencia entre las humedades entre hilera para los dos lugares de aplicación (factor salino), las plantas más afectadas fisiológicamente fueron las del tratamiento CS/A, del mismo modo que el crecimiento y desarrollo de las mismas, Presentando una relación inversa entre la fluorescencia de clorofilas y el daño en la planta. Permitiendo concluir que existe un efecto combinado de anegamiento radical y desplazamiento de sales sobre el funcionamiento fisiológico de la plantas de jojoba.

La espectroscopía de absorción transitoria ha resultado ser una herramienta útil para investigar la formación y desaparición de estados excitados singlete formados por aniquilación triplete-triplete, tras sensibilización. De este modo, tras excitar selectivamente BZP a 355 nm en presencia de NPT, se detectó mediante espectroscopía de absorción transitoria una banda negativa centrada a 340 nm, cuya formación y desaparición ocurría en la escala de los microsegundos. Esta banda fue asignada como fluorescencia retardada tipo P de NPT. En el caso de sistemas BZP/NPT quirales, se observó estereodiferenciación en las cinéticas de los procesos fotofísicos implicados. Se ha profundizado en el comportamiento del estado excitado triplete de pseudopéptidos basados en naftaleno en presencia de benzofenona y/o bifenilo, como cromóforos dadores de energía. Este comportamiento ha sido comparado con el del compuesto modelo DMN. En todos los casos, la absorción triplete-triplete de NPT se ha detectado por espectroscopía de absorción transitoria, tras excitación selectiva de benzofenona a 355 nm. Las cinéticas de desaparición y formación de estas especies resultaron ser menores en los PSP, debido a que son más lentos los procesos de transferencia de energía tripletetriplete y formación de exciplejos. La fluorescencia retardada detectada en el modelo de naftaleno no fue observada en los PSP. Se han estudiado las interacciones entre FBP y dThd unidos covalentemente, formando diadas (S)- o (R)-FBP-dThd. En ellas, la única especie que emisora fue 1 FBP*, pero con rendimientos cuánticos y tiempos de vida de fluorescencia menores que los del FBP libre en disolución. Estos resultados indican una desactivación dinámica debida a una transferencia electrónica o formación de exciplejo, donde FBP es la especie dadora de carga. En acetonitrilo, ambos mecanismos resultaron favorables, mientras que en dioxano predominó la formación de exciplejo. El enantiómero (S)- presentó valores más bajos de ¿F y ¿F que su análogo (R)- indicando que la disposición espacial de ambos cromóforos desempeñaba un papel importante. El rendimiento cuántico de triplete de las diadas resultó ser mayor que el esperado únicamente a partir de los ¿CIS de 1 FBP*-dThd, siendo ¿T ((S)-) > ¿T ((R)-). Este hecho se pudo explicar debido a una recombinación de carga del par de iones radicales y/o exciplejos, que podrían depender de factores geométricos. El tiempo de vida de las diadas resultó ser similar al del FBP libre, indicando ausencia de interacción en el estado excitado triplete. Con el propósito de estudiar las interacciones fármaco/proteína se sintetizaron diadas conteniendo un derivado de bifenilo unido covalentemente a triptófano. En el caso de las diadas FBP-Trp se observó una notable desactivación de la fluorescencia, cuya emisión fue asignada al residuo de Trp. Esta desactivación se asignó a una TESS desde 1 FBP* a Trp que resultó ser muy rápida y estereoselectiva, con una constante de desactivación mayor para el diastereómero (R,S)-FBPTrp. A escalas de tiempo mayores, se observó una desactivación, también estereoselectiva, de la fluorescencia del 1 Trp* debido a una transferencia de electrón y/o la formación de un exciplejo. Para el caso de los sistemas BPOH-Trp, la sustitución de F por OH en FBP produjo una disminución de la ES. La emisión en las diadas fue asignada al residuo de BPOH, este hecho fue debido a una TESS desde el 1 Trp* al BPOH. Se observó una marcada desactivación en las diadas, que resultó ser estereoselectiva, con kD mayor para el diastereómero (S,R)-. La desactivación se explica por transferencia de electrón intramolecular y/o formación de un exciplejo. El diasterómero (S,R)- presentó una conformación plegada que justifica los valores obtenidos de ¿F y ¿F, siendo éstos menores para la diada (S,R)- que para la (S,S)-. El tiempo de vida de las diadas resultó inferior al de BPOH, confirmando que la desactivación de las primeras era de naturaleza dinámica. Por otro lado, se estudiaron las interacciones entre derivados de bifenilo y ASH. En el caso de los sistemas FBP/ASH las cinéticas de desaparición a ¿em = 310 nm revelaron una desactivación dinámica de 1 ASH*, tanto en la escala de picosegundos (FU) como nanosegundos (TCSPC). El proceso de transferencia de energía desde 1 FBP* a la ASH resultó ser estereoselectivo. Las cinéticas de desaparición a ¿em = 380 nm, donde únicamente emite la proteína, también fueron dependientes de la configuración de FBP, aunque en menor medida. La desactivación puede ser debida a una transferencia electrónica y/o formación de exciplejo. Se ha caracterizado fotofísicamente BPOH en ausencia de proteína; el espectro de emisión de fluorescencia en medio acuoso presentó dos bandas, una a 332 nm correspondiente a 1 BPOH* y otra a 414 nm correspondiente al 1 (BPOH- )*. En presencia de ASH se detectó la formación de un complejo BPOH@ASH en el estado fundamental (máximo a ca. 300 nm), cuya intensidad se veía aumentada a concentraciones más elevadas de proteína. Tras adición de ASH se observó una disminución de la banda de emisión del fenolato (a ¿em ca. 410 nm), confirmando la inhibición de la desprotonación en el estado excitado dentro de la cavidad hidrofóbica de la proteína. Tras adición de (S)-IBP, como sonda desplazante del sitio II de la ASH la banda correspondiente al complejo BPOH@ASH disminuyó significativamente; en cambio, reapareció la banda correspondiente al fenolato. También se observó una gran estereodiferenciación tanto en la formación del complejo en el estado fundamental como en la desprotonación en el estado excitado. En el espectro de absorción transitoria del BPOH se observó una banda centrada a 380 nm correspondiente a su estado excitado triplete; en presencia de ASH el tiempo de vida del mismo aumentó de 1.3 a 19 µs; en este caso no se observó diastereodiferenciación. / Bonancía Roca, P. (2012). Especies transitorias en sistemas bioorgánicos modelo conteniendo cromóforos de tipo bifenilo, naftaleno o benzofenona [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/27553 / TESIS

Orientador: João Ruggiero Neto / Resumo: Os peptídeos sintéticos L1A (IDGLKAIWKKVADLLKNT-NH2, Q = +3e) e seu análogo acetilado (acL1A, Q = +2e) utilizados neste estudo foram projetados para que tenham características estruturais semelhantes ao peptídeo Polybia-MP1 extraído do veneno da vespa Polybia paulista, em que um dos dois resíduos ácidos ocupa a segunda posição na região Nterminal, e resíduos básicos são terceiros e/ou quartos vizinhos dos resíduos ácidos. Esses peptídeos possuem significativa atividade bactericida seletiva para bactérias Gram-negativas, especialmente Escherichia coli, sem serem hemolíticos. Estudos anteriores, em sistemas modelo, demonstraram que a acetilação do N-terminal resultou no aumento da atividade lítica em vesículas aniônicas (8POPC/2POPG) em comparação com o L1A, o que sugeriu perturbação do empacotamento lipídico de modo mais eficaz para o análogo que é menos carregado. Considerando que a membrana plasmática de bactérias Gram-negativas contém majoritariamente fosfatidiletanolamina (PE) e fosfatidilglicerol (PG), o presente trabalho propôs investigar o impacto dos peptídeos L1A e acL1A em membranas modelo compostas por 3POPE/1DOPG utilizando uma variedade de técnicas experimentais. Os resultados demonstraram que ambos os peptídeos induziram segregação lipídica, sendo o análogo acetilado mais eficiente em recrutar PG e segregar PE. / Abstract: The synthetic peptides L1A (IDGLKAIWKKVADLLKNT-NH2, Q = +3e) and its acetylated analog (acL1A, Q = +2e) used in this study were designed to have some structural features similar to the peptide Polybia-MP1 extracted from the venom of the wasp Polybia paulista, in which one of the acidic residues occupies the second position on the N-terminus region and basic residues are third and/or fourth neighbors of the acidic residues. These peptides display significant bactericidal activity against Gram-negative bacteria, especially Escherichia coli, being non-hemolytic. Previous work performed in model membrane systems has shown that the N-terminal acetylation led to an increase on the lytic activity in anionic vesicles (8POPC/2POPG) compared with L1A, suggesting that the less charged peptide has higher ability to perturb the lipid-packing. Considering that the Gram-negative cell membranes contain mainly phosphatidylethanolamine (PE) and phosphatidylglycerol (PG), the present work proposed to investigate the impact of L1A and acL1A on model membranes composed of 3POPE/1DOPG using a variety of experimental techniques. The results suggested that both peptides induced lipid segregation being the acetylated analog more efficient in recruiting PG and segregating PE. / Mestre

[pt] O petróleo é uma mistura complexa de diversos compostos, sendo os hidrocarbonetos seus principais constituintes, chegando a atingir 98% da composição total. Entre os hidrocarbonetos, os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA) destacam-se por serem, em geral, resistentes à biodegradação e persistentes no ambiente, sendo potencialmente carcinogênicos ao homem e aos organismos. A presença destes compostos nos ecossistemas, de origem natural ou proveniente de fontes antropogênicas, e seus efeitos podem ser monitorados utilizando organismos do próprio ambiente. Nos ecossistemas aquáticos, a determinação de metabólitos de HPA na bílis de peixes que habitam o ambiente pode ser usada como indicadora de exposição ambiental recente. Assim, o desenvolvimento e a validação de métodos usualmente empregados na determinação de metabólitos de HPA em bílis de peixes têm contribuição e aplicação na elaboração de diagnósticos ambientais sobre a contaminação por petróleo e derivados nos sistemas aquáticos. Este trabalho otimizou, validou e comparou dois métodos para a determinação de 1- hidroxipireno em bílis de peixes. Um método usando a cromatografia a liquido de alta eficiência com detector de fluorescência (HPLC-F) e o outro usando a espectroscopia de fluorescência convencional. Os métodos foram validados com base nos parâmetros linearidade, sensibilidade, limite de detecção, limite de quantificação, repetitividade, reprodutibilidade e incluindo os cálculos das incertezas associadas. Nos dois casos, as fontes de contribuição mais significativas para a incerteza dos métodos foram as soluções-padrão. A incerteza padrão combinada associada ao método utilizando a cromatografia a líquido foi menor que a associada ao método utilizando fluorescência molecular. Entretanto, o método em fluorescência, apesar de ser semi-quantitativo e de apresentar incerteza maior, tem tempo de análise e custos de operação e manutenção menores, sendo indicado para análises preliminares. / [en] Petroleum is a complex mixture of several compounds. Among its principal components there are hydrocarbons which account to up to 98% of the total composition. Among the hydrocarbons, there are polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), which are more resistant to biodegradation, quite persistent in the environment and potentially carcinogenic to humans and marine organisms. The presence of these compounds on ecosystems, from natural origin or from anthropogenic sources, and their efluorescênciaects, can be monitored using living organisms of the environment. In aquatic ecosystems, the determination of PAH metabolites, in fish bile from the environment can be used as an indicator of recent environmental exposure. Thus, the development and validation of methods usually employed in the determination of PAH metabolites in the bile of fish have assistance in the preparation and implementation of diagnoses on the environmental contamination by petroleum and derivatives in aquatic systems. In this work two methods for the determination of 1- hydroxypyrene in fish bile were improved, validated and compared. A method using the high liquid chromatography with fluorescence detector (HPLC-F) and the other using fixed fluorescence spectroscopy. The methods were validated based on parameters linearity, sensitivity, limit of detection, limit of quantification, repeatability, reproducibility. In addition, calculations of the uncertainties associated to the 1-hydroxypyrene measurement were made. In both cases, the sources of most significant contribution to the methods uncertainty were the standard solutions. The combined standard uncertainty associated with the method using the liquid chromatography was lower than that associated with the method using molecular fluorescence. The fluorimetric method can be used as a semi-quantitative tool and presented greater uncertainty. However, this method has lower analysis time and costs of operation and maintenance, being quite suitable for preliminary analysis.

[pt] O presente trabalho apresenta uma análise experimental da combustão turbulenta de sprays de etanol, mediante o uso de técnicas de diagnóstico laser, em queimadores tipo obstáculo. São empregadas a fluorescência induzida por plano laser (PLIF) do radical hidroxila (OH), para mapear a frente de chama, a velocimetria por imagens de partículas (PIV), para determinar o campo de velocidades das gotas do spray e Shadowgraphy, para obter o diâmetro e velocidade de gota. Uma caracterização da estrutura do escoamento de ar a jusante do corpo rombudo é realizada com PIV estéreo para diferentes números de Reynolds. Os resultados mostram uma similitude do escoamento na zona de recirculação. As maiores flutuações turbulentas de velocidades são encontradas na região de vórtice e indicam anisotropia no tensor de Reynolds. Os resultados de Shadowgraphy revelam que as gotas do spray não são perfeitamente esféricas em regiões perto do atomizador. O diâmetro médio Sauter (SMD) foi medido em varias posições na região de recirculação. As gotas de maior diâmetro apresentaram as maiores velocidades e as pequenas são ligeiramente desviadas pela zona de recirculação nas regiões mais afastadas da linha central. Os experimentos reativos realizados com diversos valores de vazão de etanol e ar indicam que a frente de chama é descolada do queimador, sua forma é determinada principalmente pela vazão de etanol e a intensidade de luminescência é aumentada com a velocidade do ar. Em alguns casos o escoamento de ar muda a forma do spray. Uma quantidade de gotas apreciável sempre consegue atravessar a frente de chama. O campo de velocidade das gotas é influenciado pelo incremento da velocidade do escoamento anular de ar. / [en] This work presents an experimental analysis of turbulent combustion of ethanol sprays through the use of laser diagnostic techniques in a bluff-body burner. Are employed the planar laser-induced fluorescence (PLIF) of the hydroxyl (OH), to map the flame front, the particle image velocimetry (PIV) to determine the velocity field of the spray droplets and Shadowgraphy to obtain the droplet diameter and velocity. A characterization of the structure of the air flow downstream of the bluff-body is performed with stereo PIV at different Reynolds numbers. The results evidence flow similarity in the recirculation zone. The largest turbulent velocity fluctuations are found in the vortex region, which implies the anisotropy of the Reynolds stresses. The results of Shadowgraphy indicate that the spray droplets are not perfectly spherical near the atomizer. The evolution of Sauter mean diameter (SMD) is measured at various positions at the recirculation region. The largest diameter droplets have the highest velocity and the smaller are slightly deviated by recirculation zone in the far furthest from the centerline. The reactive experiments are performed with different ethanol and air flow rates and indicate that the flame front is detached from the burner, the shape is determined by the ethanol flow rate and the luminescence intensity increases with the air velocity. In some case the air flow changes the shape of the spray. An appreciable number of droplets always passe through the flame front. The velocity of the droplets is influenced by the increase of speed air velocity.

[pt] Neste trabalho se apresenta um estudo experimental e numérico de escoamentos turbulentos quimicamente reativos em um queimador tipo obstáculo. O objetivo principal é estudar uma chama turbulenta não pré-misturada de configuração geométrica simples. Esta chama, que queima gás natural e ar, é estabilizada por um queimador tipo obstáculo. Inicialmente um estudo bibliográfico do estado da arte de experimentos e da comparação entre experimentos e modelagem neste tipo de queimador é apresentado. Na sequência, a formulação matemática, clássica, de dinâmica dos fluidos computacional é exposta, seguida da apresentação da técnica de medição empregada nos experimentos, a fluorescência induzida por plano laser (PLIF). A discussão dos resultados obtidos neste trabalho é divida em três etapas. Na primeira, comparam-se os resultados de modelagem computacional usando quatro modelos de turbulência e dois modelos de combustão com dados experimentais encontrados na literatura. Esta comparação coloca em evidência o conjunto de modelos que possui melhor capacidade preditiva no que diz respeito a este tipo de configuração. A segunda etapa consiste na apresentação dos resultados experimentais obtidos, os quais permitem caracterizar, em três regimes de combustão distintos, a presença de uma espécie química existente durante o processo de combustão, no caso, o radical hidroxila (OH). Esta caracterização é realizada pelo exame tanto da estrutura instantânea da chama turbulenta quanto da média. Por fim, comparam-se os resultados da modelagem com aqueles obtidos no presente aparato experimental. Esta comparação coloca em evidência as deficiências dos modelos clássicos de combustão empregados e indica a necessidade de serem realizadas medidas simultâneas de velocidade e de concentração de espécies químicas que possibilitem o desenvolvimento de novos modelos de combustão em escoamento turbulento. / [en] This work presents an experimental and numerical study of turbulent chemically reactive flows in a bluff body type burner. The main objective of the present work is to study a non-premixed turbulent flame on a simple geometric configuration. This flame, which burns natural gas and air, is stabilized downstream to a bluff-body. Initially, literature is reviewed on the previous experimental and modeling studies which have been performed on this kind of burner. Then, the mathematical formulation of computational fluid dynamic problem is presented. This is followed by the introduction of the experimental measurements techniques which involve planar laser induced fluorescence (PLIF). The discussion of results obtained in this work is divided in three sections. First, a comparison is made between numerical simulations, using four different turbulent models and two different combustion models, and experimental data found in the literature. Is allows to assess capacity of the different models to predict the reactive flow configuration studied. The second section presents the experimental results obtained for three combustion regimes, which are characterized by laser induced fluorescence emission of the hydroxil radical species (OH). This characterization involves the analysis the instantaneous and the average structure of the turbulent flame. Finally, the modeling results are compared to the experimental data obtained. This comparison in evidences the necessity to perform the simultaneous measurement of velocity and chemical species concentration in order to allow for the development of new models of combustion in turbulent flows.