To increase profitability in beef and dairy cattle operations, adequate reproductive management strategies that provide high service and conception rates, especially at the beginning of the breeding season for beef cattle, and after the voluntary waiting period for dairy herds, are necessary. To achieve these goals various hormonal protocols have been developed to synchronize the emergence of a new follicular wave, estrus and ovulation, thus allowing fixed time artificial insemination (FTAI). Treatment with eCG has been included in FTAI protocols. Considering that eCG is an indispensable tool for reproductive management, a better understanding of its biological action in the final follicular growth process, ovulation and luteal development is crucial to optimize its use in hormonal protocols. At the same time, alternatives for eCG need to be tested. In this regard, it is important a better understanding of how FSH and LH act in the dominant follicle. Based on that, three studies were performed. The first study evaluated effects of eCG on fertility of 679 crossbred lactating grazing cows synchronized for FTAI. Treatment with eCG tended to increase P/AI at 30 and 60 days and increased P/AI at 30 and 60 days for cows inseminated at ≤ 70 DIM but had no effect in cows receiving AI after 70 DIM. The second study evaluated the effect of eCG or different doses of hCG on the final growth of the dominant follicle in 84 Nelore cows submitted FTAI. No differences were observed for the diameter of the largest follicle on D8 or D10. However, the growth rate of the dominant follicle between D8 and D10 was greater for the groups eCG and hCG 300. In addition, more cows from the Groups hCG 300 and hCG 200 SC presented premature ovulation. Treatment with different hCG doses on D8 of a FTAI protocol failed to produce similar effects compared to eCG. The third study evaluated the effect of eCG, FSH, or hCG on follicular growth rate, ovulatory follicle size, CL volume and circulating E2 and P4 concentrations, as well as the number of large and small luteal cells in cows submitted to a protocol for synchronization of ovulation. Seventeen non-lactating Nelore cows were used. Two Latin squares were done, totaling eight replicates. The gonadotropin treatments, eCG, FSH, or hCG, were effective in increasing the follicular growth rate between D7-10 and consequently the follicular diameter on D10 and ovulatory follicle diameter in comparison to Control. In addition, treatment with different gonadotropins increased the number of large and small luteal cells, however, there was no difference in preovulatory E2 peak concentration, CL volume and circulating P4 concentration post ovulation. / Para aumentar a rentabilidade nos sistemas de produção de bovinos de corte e leiteiro, são necessárias estratégias de manejo reprodutivo que proporcionem elevadas taxas de serviço e concepção, especialmente no início da estação de monta em bovinos de corte e após o período de espera voluntária para rebanhos leiteiros. Para atingir esses objetivos, vários protocolos hormonais foram desenvolvidos com o intuito de sincronizar a onda folicular, o estro e a ovulação, permitindo assim inseminação artificial em tempo fixo (IATF). Considerando que a eCG é uma ferramenta indispensável para o manejo reprodutivo, é fundamental uma melhor compreensão de sua ação biológica no processo de crescimento folicular final, ovulação e desenvolvimento luteal, otimizando seu uso em protocolos hormonais. Além disso, alternativas para a eCG precisam ser testadas. Dessa forma é importante uma melhor compreensão de como FSH e LH atuam no folículo dominante. Com base nisso, três estudos foram realizados. O primeiro avaliou os efeitos da eCG na fertilidade de 679 vacas lactantes mestiças em sistema de pastejo sincronizadas para IATF. O tratamento com eCG tendeu em aumentar a P/IA aos 30 e 60 dias e aumentou a P/IA aos 30 e 60 dias para vacas inseminadas com DEL ≤ 70, mas não houve efeito nas vacas que receberam IA após 70 DEL. O segundo avaliou o efeito da eCG ou diferentes doses de hCG no crescimento final do folículo dominante em 84 vacas Nelore submetidas a IATF. Não houve diferença quanto ao diâmetro do maior folículo no D8 ou D10. No entanto, a taxa de crescimento folicular entre D8 e D10 foi maior para os grupos eCG e hCG 300. No entanto, mais vacas dos Grupos hCG 300 e hCG 200 SC apresentaram ovulação precoce. O tratamento com diferentes doses de hCG no D8 do protocolo de IATF não produziu efeitos semelhantes em relação à eCG. O terceiro estudo avaliou o efeito de eCG, FSH ou hCG na taxa de crescimento folicular, tamanho do folículo ovulatório, volume de CL e concentrações circulantes de E2 e P4, bem como o número de células lúteas grandes e pequenas em vacas submetidas a sincronização da ovulação. Foram utilizadas 17 vacas Nelore não lactantes em delineamento com dois quadrados latinos, totalizando oito réplicas. Os tratamentos com as gonadotrofinas eCG, FSH, ou hCG foram efetivos em aumentar a taxa de crescimento folicular entre D7-10 e consequentemente o diâmetro folicular no D10 e o diâmetro do folículo ovulatório em relação ao Controle. Além disso, o tratamento com diferentes gonadotrofinas aumentou o número de células lúteas grandes e pequenas sem, entretanto, se detectar diferenças no pico pré-ovulatório de E2, volume luteal e concentração circulante de P4 após a ovulação.

Orientador: Sony Dimas Bicudo / Banca: Eunice Oba / Resumo: O presente estudo visou avaliar a resposta ovariana a superestimulação utilizando 80UI de FSH e 300UI de eCG após ablação por laparoscopic ovum pic-up (LOPU1) de todos os folículos visíveis presentes em ambos os ovários. Determinar o melhor momento para realização de uma nova LOPU (LOPU2), mediante a avaliação ultrassonográfica dos ovários a cada 12 horas após LOPU1. E comparar a respostas ovariana do tratamento Duplo LOPU (DLOPU) com o tratamento One Shot adaptado de Baldassarre (1996), quanto a quantidades dos Complexos Cumulos-Oócito (COCs), e qualidade das estruturas obtidas e após processo de maturação in vitro (MIV) por 24 horas. Foi determinado o momento para realização da LOPU2 em 36 horas após a superestimulação. A média de folículos presentes na avaliação ultrassonográfica imediatamente antes a LOPU em ambos os tratamentos foi cerca de 9 estruturas, não diferindo da media de folículos aspirados, a taxa de recuperação comum aos dois tratamentos foi de 62,5%. A avaliação imediata das estruturas obtidas bem como a após 24 de MIV demonstrou que não houve diferença qualitativa COCs entre os tratamentos / Abstract: The present study aimed to evaluate the ovarian response to superstimulation using 80UI FSH and eCG 300UI after ablation LOPU (LOPU1) of all follicles present in both ovaries. Determine mlehor time to make a new LOPU (LOPU2) by ultrasound evaluation of the ovaries every 12 hours LOPU1. And comparing the responses ovarian DLOPU treatment with the treatment Ono Shot adapted Baldassarre (1996) with the DLOPU described here, the amounts of COC and quality of the structures obtained after process and IVM for 24 hours. It was determined the time for completion of LOPU2 in 36 hours after the overstimulation. The mean number of follicles present in the ultrasonographic evaluation immediately before the LOPU in both treatments was about 9 structures did not differ from follicles aspirated media, the recovery rate common to the two treatments was 62.5%. Immediate assessment of the structures obtained as well as after 24 IVM demonstrated that COCs do not hear qualitative difference between treatments / Mestre

Biotecnologias como a Ovum Pick-Up e a Produção In vitro de embriões (OPU-PIVE) tem sido uma importante ferramenta para alcançar o melhoramento genético rápido nos rebanhos, diminuindo o intervalo entre gerações. No Brasil, a PIVE está em fase de crescimento e representa 70,7% de toda a produção in vitro mundial. Contudo a OPU-PIVE é ainda ineficiente em vacas de leite, especialmente devido à sua reduzida população folicular. Muitos estudos têm mostrado um efeito positivo do FSH em gado de leite e corte. Recentemente, a pré-estimulação com FSH mostrou ser capaz de aumentar o diâmetro dos folículos aspirados e a porcentagem de embriões transferíveis. O FSH estimula o recrutamento dos folículos na fase antral, fazendo com que eles possam se desenvolver até o momento em que ocorre a divergência e um ou mais folículos se torne dominante. A hipótese do presente estudo é que o uso de FSH (200 mg), fracionado em 4 ou 6 aplicações, em vacas holandesas não lactantes, com emergência de onda folicular sincronizada, aumenta o número de folículos ovarianos, o número de oócitos viáveis e a quantidade de embriões na produção in vitro. Trinta e seis vacas Holandesas não lactantes foram utilizadas como doadoras de oócitos e distribuídas em três tratamentos: Controle (C), 4 aplicações de FSH (F4) e 6 aplicações de FSH (F6). Todas as vacas foram submetidas ao mesmo protocolo de sincronização de emergência de onda folicular, diferindo apenas pela administração e número de 4 ou 6 doses de FSH, conforme descrito acima. Em dia aleatório do ciclo estral (D0), todas as vacas receberam um dispositivo de P4 (Primer®, Tecnopec-Agener União, São Paulo, SP, Brasil) e 2 mg de benzoato de estradiol (Ric-BE®, Tecnopec-Agener União, São Paulo, SP, Brasil). Três dias após (D3), foi administrado 0,530 mg de Cloprostenol Sódico (Cioprostinn®, Innovare Biotecnologia e Saúde Animal Ltda, Monte Aprazível, SP, Brasil), induzindo a luteólise com a intenção de liberar espaço no estroma ovariano para o crescimento folicular e facilitar a visualização de folículos na OPU. Vacas do grupo C não receberam tratamentos adicionais. Vacas do grupo F4 receberam 200 mg de FSH (Folltropin - Bioniche Anim,al Health, Belleville, ON, Canadá) fracionados em 4 aplicações de equivalentes concentrações em intervalos de 12 h, iniciando no D4 pela manhã. Vacas do grupo F6 receberam 200 mg de FSH fracionados em 6 aplicações de equivalentes concentrações em intervalos aproximados de 12 h, tendo início no D3 pela manhã. No D7, o dispositivo foi removido e a OPU realizada concomitantemente à contagem dos folículos existentes nos ovários. Os oócitos considerados viáveis foram fertilizados in vitro com sêmen sexado de touros da raça Holandesa. Os dados foram analisados pelo PROC GLIMIX do SAS 9.3, utilizando contrastes ortogonais C1 (C x FSH) e C2 (F4 x F6). Não houve efeito de tratamento no número de folículos (C = 53,3 ± 4,9 vs FSH = 51,36 ± 3,1;P = 0,89), número total de oócitos (C = 19,46 ± 1,64 vs FSH = 18,47 ± 1,27; P = 0,55), número de oócitos viáveis (C = 12,57 ± 1,26 vs FSH = 12,70 ± 1,03; P= 0,606), taxa de recuperação de oócitos (C = 36,5% vs FSH = 36,0%; P = 0,48) e produção de embriões in vitro (C = 4,11 ± 0,52 vs FSH = 4,32 ± 0,46; P = 0,79). Apesar de não ter havido efeito no número de folículos, o tratamento com FSH alterou a distribuição dos mesmos, proporcionando o aumento no número de folículos médios (6 a 10 mm). No entanto, não houve efeito do tratamento com FSH no número de oócitos totais e viáveis recuperados, nem na produção de embriões. / Reproductive biotechnologies such as Ovum Pick-Up and in vitro Embryo production (OPU-IVEP) have been widely used as important tools to achieve faster genetic improvement in herds, diminishing the intervals between generations. In Brazil, in vitro Embryo Production (IVEP) is growing in popularity and accounts for 70.7% of all in vitro embryo production worldwide. However, the OPU-IVEP is still poorly efficient in high-producing dairy cattle, especially because of their reduced follicular population. Several studies have shown a positive effect of FSH on OPU-IVEP yeld. Recently, FSH pre-stimulation has shown to be able to increase the diameter of aspirated follicles and the percentage of transferable embryos. The hormone FSH stimulates follicle recruitment in the antral phase, in the way that they develop until the moment of divergence and one or more follicles becomes dominant. The hypothesis of this study is that the use of 200mg FSH split into 6 doses in non-lactating Holstein cows with a synchronized follicular wave emergence increases the number of follicles, the recovery rate and the number of embryos produced in vitro. Thirty six Holstein cows used as oocyte donors were homogenously allocated to one of three treatment groups in a 3x3 Latin square design: Control (C); 4 doses of FHS (FSH4); 6 doses of FSH (F6). All cows were synchronized using the same protocol for synchronization of follicular wave emergence, except for the administration and number of doses of FSH as previously described. At random days of the estrous cycle known as D0, all cows received an intravaginal P4 device (Primer®, Tecnopec-Agener União, São Paulo, Brazil) and 2mg estradiol benzoate (Ric-BE®, Tecnopec-Agener União). Three days after (D3), all cows received 0.530 mg D-Cloprostenol (Cioprostinn®, Innovare Biotecnologia e Saúde Animal Ltda, Monte Aprazível, SP, Brasil). Cows from the Control group received no additional treatment. Cows from group FSH4 were treated with 200 mg of FSH split in 4 doses of similar concentration given approximately 12 h apart, starting on D4 AM. Cows form group FSH6 were treated with 200 mg of FSH split in 6 doses of similar concentration given approximately 12 h apart, starting on D3 AM. On D7, the device was removed and OPU was performed concomitant with antral follicle count in each ovary. The oocytes considered as viable were sent to IVEP. Data was analyzed using the Glimmix of SAS 9.3, with orthogonal contrasts C1 (C x Treatment with FSH) and C2 (FSH4 x F6). There was no effect on the number of antral follicle (C = 53.3 ± 4.9 vs FSH = 51.36 ± 3.1;P = 0.89), number of total oocytes (C = 19.46 ± 1.64 vs FSH = 18.47 ± 1.27; P = 0.55), number of viable oocytes (C = 12.57 ± 1.26 vs FSH = 12.70 ± 1.03; P= 0.61), oocyte recovery rate (C = 36.5% vs FSH = 36.0%; P = 0.48) and number of embryos produced in vitro (C = 4.11 ± 0.52 vs FSH = 4.32 ± 0.46; P = 0.79). Although FSH treatment did not affect the number of follicles, it affected the distribution of them, increasing the number of follicles from 6 to 10 mm. However, FSH treatment did not alter the total number of oocytes and number of viable oocytes or embryo production.

A puberdade é o momento quando um mamífero, macho ou fêmea, se torna capaz de produzir gametas viáveis e exibir comportamento sexual completo. Trata-se do resultado do ajuste gradativo entre o aumento da atividade gonadotrófica e a habilidade das gônadas em assumir simultaneamente a esteroidogênese e a gametogênese. Um dos principais fatores que influenciam o início à puberdade é o genético. A puberdade é uma característica fisiológica originada por muitos fatores (orgânicos e ambientais), que relacionam-se com a expressão de diversos genes, muitos dos quais ainda com funções desconhecidas. Metodologias para a análise da expressão gênica diferencial em tecidos, em particular a Análise Serial de Expressão Gênica (SAGE), incluem ferramentas que permitem a análise global e simultânea de vários transcritos de um determinado tecido, sejam eles conhecidos ou não, fornecendo informações sobre o padrão de expressão gênica de um determinado tipo celular de maneira qualitativa e semi-quantitativa. O objetivo do presente projeto foi analisar, por meio da técnica de SAGE, a expressão gênica diferencial no folículo ovariano de fêmeas bovinas da raça Nelore púberes e pré-púberes, segundo o critério da apresentação ou não de ondas de crescimento folicular que culminavam com a ovulação.. Um total de 14.531 e 14.285 tags tiveram sua seqüência de DNA determinada, revelando a existência de 6.840 e 6.386 genes únicos (biblioteca das novilhas pré-púberes e púberes respectivamente). A comparação entre as duas bibliotecas revelou um total de 127 tags diferencialmente expressos (P<0,05). Os folículos ovarianos de novilhas púberes apresentaram expressão mais elevada de algumas enzimas esteroidogências (CYP11A1 e CYP19) e do transportador de colesterol para a mitocôndria (StAR) indicando intensa atividade esteroidogência (produção de estrógeno) quando comparada ao folículo das bezerras pré-púberes. Além disso, o CTGF (fator de crescimento do tecido conectivo) e o TIMP2 (inibidor tecidual de metaloproteinases) foram mais abundantes nos folículos dos animais púberes, indicando que os mesmos já iniciaram o processo de luteinização, sem entrentanto iniciar o processo de ruptura da matriz extracelular que ocorre na ovulação. A maior expressão de genes relacionados ao metabolismo da matriz extracelular e do citoesqueleto (como por exemplo a osteonectina, a actina e proteínas relacionadas à actina) sugere que os folículos dos animais púberes estão se preparando para a remodelação tecidual. A maior expressão de conexina 43 (gap junction protein) nos folículos dos animais púberes sugere uma intensa comunicação das células da granulosa entre si e com o oócito quando comparadas aos folículos das bezerras pré-púberes. Dentre os genes diferencialmente expressos e mais abundantes no folículo das bezerras pré-púberes, destacou-se o gene da proopiomelanocortina (POMC), que codifica vários fatores hipofisários. Os conhecimentos gerados por este trabalho poderão ser úteis para a identificação de marcadores genéticos para aplicação em programas de seleção assistida por marcadores / Puberty is the stage where any mammal, male or female, becomes able to produce viable gametes and manifest complete sexual behavior. These are results from the gradative adjustment between the increase in gonadotrophic activity and the ability of gonads in undergoing simultaneously both steroidogenesis and gametogenesis. One of the major factors interferring with puberty initiation is the genetics. Puberty is a physiological process controlled by several factors (organic and environmental) related with the expression of several genes, most of them with unknown function. Differential gene expression approaches, in particular the Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), include tools that allow the global and simultaneous analysis of several transcripts from a given tissue, being known or unknown, providing qualitative and semi-quantitative information about the genetic profiles of any cellular type of interest. Using the SAGE approach, the aim of the present study was to analyse the differential gene expression profiles of ovarian follicles from pubertal and pre-pubertal Nelore breed females, observed for the presence or not of follicular growth waves ending in an ovulation, A total of 14,531 and 14,285 tags had their DNA sequences determined, revealing the existence of 6,840 and 6,386 unique tags (pre-pubertal and pubertal follicle libraries respectively). Comparison between the two SAGE libraries revealed 127 differentially expressed genes (P<0,05). Follicles from pubertal heifers showed increased expression of some steroidogenic enzymes (CYP11A1 and CYP19) and StAR, the mitochondrial cholesterol transporter, which together indicates a marked steroidogenic activity (oestrogen production), when compared with follicles from pre-pubertal heifers. Furthermore, connective tissue growth factor (CTGF) and TIMP2 (tissue inhibitor of metalloproteinases 2) were shown to be increased in pubertal follicles, indicating the starting of luteinization proccess, without however initiating the rupture of extracellular matrix, which takes place in ovulation. Higher levels of expression presented by extracellular matrix and cytoskeletal related genes (as examples osteonectin, actin and actin-related proteins) also indicate that the follicle from pubertal heifers is at the verge of tissue remodelation. The higher expression of connexin 43 (gap junction protein) indicated that this follicle shows a more intense communication among granulosa cells and between these and the oocyte, as compared to the pre-pubertal calves follicle. Among the differentially expressed genes more abundant in the pre-pubertal follicle is the proopiomelanocortin gene (POMC), which codifies to some hypophiseal factors. The knowledge generated by this study may contribute to the identification of genetic markers to be used in marker assisted selection programmes

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-06-26T17:18:17Z No. of bitstreams: 1 HellydaPereira.pdf: 924393 bytes, checksum: d85908be39f7a02e10afd3d2dd03ad43 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-26T17:18:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 HellydaPereira.pdf: 924393 bytes, checksum: d85908be39f7a02e10afd3d2dd03ad43 (MD5) Previous issue date: 2016-08-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA) / The aim of this study was to evaluate the effect of inhibition of the Angiotensin Converting Enzyme (ECA) with enalapril maleate, on blood pressure, follicular growth, ovulation rate, utero-ovarian hemodynamics, P4/E2 concentrations and gene expression of follicular cells. Were used 31 Nelore (Bos indicus) cows. The females were synchronized with progesterone/estradiol-based protocol and then treated with enalapril maleate (0.5 mg/kg/day) or placebo (NaCl 0.9%) throughout the protocol (10 days). A half of the synchronized cows (n=17) were ultrasonographically evaluated for monitoring the follicular dynamics and utero-ovarian dopplerflowmetry. A half of animals (n=14) were submitted to follicular aspiration guided by ultrasound Ovum pick up (OPU) for measurement of the follicular hormonal synthesis and gene expression. There was no effect of enalapril on arterial pressure, in utero-ovarian hemodynamics and follicular and luteal growth. The ovulation rate (%) was significantly higher in the enalapril treated cows. The plasma and intrafollicular concentrations of progesterone and estradiol not differed significantly between treatments. The enalapril altered significantly the gene expression of enzymes P450aromatase, ECA2 and MAS receptor in the granulosa cells of dominant follicles. / O objetivo com este estudo foi avaliar o efeito da inibição da Enzima Conversora de Angiotensina (ECA), utilizando Maleato de Enalapril, na pressão arterial, crescimento folicular, taxa de ovulação, hemodinâmica útero-ovariana, concentrações de P4 e E2 e expressão gênica de células foliculares. Utilizou-se 31 fêmeas bovinas da raça Nelore (Bos indicus), que foram sincronizadas com protocolo à base de progesterona/ estradiol e, em seguida, tratadas com maleato de enalapril (0,5 mg/kg/dia) ou placebo (NaCl 0,9%) durante todo o protocolo (10 dias). Metade das fêmeas sincronizadas (n=17) foram submetidas a avaliações ultrassonográficas para acompanhamento da dinâmica folicular e dopplerfluxometria útero-ovariana. A outra metade (n=14) foi submetida à aspiração folicular guiada por ultrassom (Ovum pick up; OPU) para aferição da síntese hormonal e expressão gênica pelas células foliculares ovarianas. Não houve efeito do enalapril na pressão arterial média, na hemodinâmica útero-ovariana e no crescimento folicular e luteínico, porém a taxa de ovulação (%) foi significativamente maior no grupo Enalapril. As concentrações plasmáticas e intrafoliculares de Progesterona e Estradiol não diferiram significativamente entre tratamentos. O Enalapril alterou significativamente expressão gênica das enzimas P450aromatase, ECA2 e do receptor MAS nas células da granulosa dos folículos dominantes.

Biotecnologias como a Ovum Pick-Up e a Produção In vitro de embriões (OPU-PIVE) tem sido uma importante ferramenta para alcançar o melhoramento genético rápido nos rebanhos, diminuindo o intervalo entre gerações. No Brasil, a PIVE está em fase de crescimento e representa 70,7% de toda a produção in vitro mundial. Contudo a OPU-PIVE é ainda ineficiente em vacas de leite, especialmente devido à sua reduzida população folicular. Muitos estudos têm mostrado um efeito positivo do FSH em gado de leite e corte. Recentemente, a pré-estimulação com FSH mostrou ser capaz de aumentar o diâmetro dos folículos aspirados e a porcentagem de embriões transferíveis. O FSH estimula o recrutamento dos folículos na fase antral, fazendo com que eles possam se desenvolver até o momento em que ocorre a divergência e um ou mais folículos se torne dominante. A hipótese do presente estudo é que o uso de FSH (200 mg), fracionado em 4 ou 6 aplicações, em vacas holandesas não lactantes, com emergência de onda folicular sincronizada, aumenta o número de folículos ovarianos, o número de oócitos viáveis e a quantidade de embriões na produção in vitro. Trinta e seis vacas Holandesas não lactantes foram utilizadas como doadoras de oócitos e distribuídas em três tratamentos: Controle (C), 4 aplicações de FSH (F4) e 6 aplicações de FSH (F6). Todas as vacas foram submetidas ao mesmo protocolo de sincronização de emergência de onda folicular, diferindo apenas pela administração e número de 4 ou 6 doses de FSH, conforme descrito acima. Em dia aleatório do ciclo estral (D0), todas as vacas receberam um dispositivo de P4 (Primer&reg;, Tecnopec-Agener União, São Paulo, SP, Brasil) e 2 mg de benzoato de estradiol (Ric-BE&reg;, Tecnopec-Agener União, São Paulo, SP, Brasil). Três dias após (D3), foi administrado 0,530 mg de Cloprostenol Sódico (Cioprostinn&reg;, Innovare Biotecnologia e Saúde Animal Ltda, Monte Aprazível, SP, Brasil), induzindo a luteólise com a intenção de liberar espaço no estroma ovariano para o crescimento folicular e facilitar a visualização de folículos na OPU. Vacas do grupo C não receberam tratamentos adicionais. Vacas do grupo F4 receberam 200 mg de FSH (Folltropin - Bioniche Anim,al Health, Belleville, ON, Canadá) fracionados em 4 aplicações de equivalentes concentrações em intervalos de 12 h, iniciando no D4 pela manhã. Vacas do grupo F6 receberam 200 mg de FSH fracionados em 6 aplicações de equivalentes concentrações em intervalos aproximados de 12 h, tendo início no D3 pela manhã. No D7, o dispositivo foi removido e a OPU realizada concomitantemente à contagem dos folículos existentes nos ovários. Os oócitos considerados viáveis foram fertilizados in vitro com sêmen sexado de touros da raça Holandesa. Os dados foram analisados pelo PROC GLIMIX do SAS 9.3, utilizando contrastes ortogonais C1 (C x FSH) e C2 (F4 x F6). Não houve efeito de tratamento no número de folículos (C = 53,3 &plusmn; 4,9 vs FSH = 51,36 &plusmn; 3,1;P = 0,89), número total de oócitos (C = 19,46 &plusmn; 1,64 vs FSH = 18,47 &plusmn; 1,27; P = 0,55), número de oócitos viáveis (C = 12,57 &plusmn; 1,26 vs FSH = 12,70 &plusmn; 1,03; P= 0,606), taxa de recuperação de oócitos (C = 36,5% vs FSH = 36,0%; P = 0,48) e produção de embriões in vitro (C = 4,11 &plusmn; 0,52 vs FSH = 4,32 &plusmn; 0,46; P = 0,79). Apesar de não ter havido efeito no número de folículos, o tratamento com FSH alterou a distribuição dos mesmos, proporcionando o aumento no número de folículos médios (6 a 10 mm). No entanto, não houve efeito do tratamento com FSH no número de oócitos totais e viáveis recuperados, nem na produção de embriões. / Reproductive biotechnologies such as Ovum Pick-Up and in vitro Embryo production (OPU-IVEP) have been widely used as important tools to achieve faster genetic improvement in herds, diminishing the intervals between generations. In Brazil, in vitro Embryo Production (IVEP) is growing in popularity and accounts for 70.7% of all in vitro embryo production worldwide. However, the OPU-IVEP is still poorly efficient in high-producing dairy cattle, especially because of their reduced follicular population. Several studies have shown a positive effect of FSH on OPU-IVEP yeld. Recently, FSH pre-stimulation has shown to be able to increase the diameter of aspirated follicles and the percentage of transferable embryos. The hormone FSH stimulates follicle recruitment in the antral phase, in the way that they develop until the moment of divergence and one or more follicles becomes dominant. The hypothesis of this study is that the use of 200mg FSH split into 6 doses in non-lactating Holstein cows with a synchronized follicular wave emergence increases the number of follicles, the recovery rate and the number of embryos produced in vitro. Thirty six Holstein cows used as oocyte donors were homogenously allocated to one of three treatment groups in a 3x3 Latin square design: Control (C); 4 doses of FHS (FSH4); 6 doses of FSH (F6). All cows were synchronized using the same protocol for synchronization of follicular wave emergence, except for the administration and number of doses of FSH as previously described. At random days of the estrous cycle known as D0, all cows received an intravaginal P4 device (Primer&reg;, Tecnopec-Agener União, São Paulo, Brazil) and 2mg estradiol benzoate (Ric-BE&reg;, Tecnopec-Agener União). Three days after (D3), all cows received 0.530 mg D-Cloprostenol (Cioprostinn&reg;, Innovare Biotecnologia e Saúde Animal Ltda, Monte Aprazível, SP, Brasil). Cows from the Control group received no additional treatment. Cows from group FSH4 were treated with 200 mg of FSH split in 4 doses of similar concentration given approximately 12 h apart, starting on D4 AM. Cows form group FSH6 were treated with 200 mg of FSH split in 6 doses of similar concentration given approximately 12 h apart, starting on D3 AM. On D7, the device was removed and OPU was performed concomitant with antral follicle count in each ovary. The oocytes considered as viable were sent to IVEP. Data was analyzed using the Glimmix of SAS 9.3, with orthogonal contrasts C1 (C x Treatment with FSH) and C2 (FSH4 x F6). There was no effect on the number of antral follicle (C = 53.3 &plusmn; 4.9 vs FSH = 51.36 &plusmn; 3.1;P = 0.89), number of total oocytes (C = 19.46 &plusmn; 1.64 vs FSH = 18.47 &plusmn; 1.27; P = 0.55), number of viable oocytes (C = 12.57 &plusmn; 1.26 vs FSH = 12.70 &plusmn; 1.03; P= 0.61), oocyte recovery rate (C = 36.5% vs FSH = 36.0%; P = 0.48) and number of embryos produced in vitro (C = 4.11 &plusmn; 0.52 vs FSH = 4.32 &plusmn; 0.46; P = 0.79). Although FSH treatment did not affect the number of follicles, it affected the distribution of them, increasing the number of follicles from 6 to 10 mm. However, FSH treatment did not alter the total number of oocytes and number of viable oocytes or embryo production.

Comparações da dinâmica ovariana entre mais de duas raças equinas, sob condições padronizadas, não são encontradas na literatura. Objetivando comparar a dinâmica folicular e luteal, foram realizados exames diários de ultrassonografia durante um intervalo interovulatório contemporâneo, em éguas de pequeno porte (grupo Mini Pony – MP; n=10), médio porte (grupo Large Pony – LP; n=9) e grande porte (grupo Brasileiro de Hipismo – BH; n=12). Concluiu-se que os três grupos diferiram quanto ao máximo diâmetro do folículo pré-ovulatório (FPO) (mm) (MP=36,15; LP=40,95; BH=46,66), diâmetro do FPO um dia antes da ovulação (mm) (MP=35,8; LP=40,55; BH=46,48) e crescimento diário médio do FPO (mm/dia) (MP=2,6; LP=3,05; BH=3,51). O grupo MP diferiu dos demais quanto ao número de folículos por onda ovulatória (MP=4,8; LP=10,11; BH=9,75), número de folículos por dia (MP=4,19; LP=10,27; BH=10,63), número de folículos maiores ou iguais a 10mm (MP=2,98; LP=5,88; BH=5,98), diâmetro do FPO à divergência (mm) (MP=22,62; LP=24,81; BH=25,58), diâmetro do segundo maior folículo à divergência (SMF) (mm) (MP=15,56; LP=21,25; BH=21,83), diferença de diâmetro entre FPO e SMF à divergência (mm) (MP=7,25; LP=3,56; BH=3,75) e área do corpo lúteo (CL) (mm2) (MP=436,1; LP=674,4; BH=720,4). Não houve diferença entre os grupos quanto à duração do ciclo (dias) (MP=21,9; LP=20,22; BH=20,58), ocorrência de divergência (MP=80%; LP=88,89%; BH=100%), dias decorridos entre a emergência do FPO e SMF (MP=0,8; LP=0,89; BH=0,92) e diferença de diâmetro entre estes na emergência (mm) (MP=0,4; LP=0,44; BH=0,5) e na divergência (mm) (MP=7,25; LP=3,56; BH=3,75); dias entre emergência e divergência (MP=5,12; LP=5,5; BH=5,5) e divergência e ovulação (MP=7,12; LP=6,62; BH=6,8), número de ondas menores (MP=0,3; LP=0,33; BH=0,42) e duração do CL (dias) (MP=12,4; LP=14,67; BH=13,92). / Comparisons of ovarian dynamics between more than two equine breeds, under standardized conditions, are not found in the literature. The objective of this study was to compare follicular and luteal dynamics during one contemporary intervulatory interval by daily ultrasonography examinations in small size mares (Mini Pony group - MP; n=10), medium size (Large Pony group - LP; n=9) and large size (Brazilian Warmblood group - BH; n=12). It was concluded that all three groups differed regarding maximum diameter of the preovulatory follicle (POF) (mm) (MP=36.15; LP=40.95; BH=46.66), maximum diameter of POF one day before ovulation (mm) (MP=35.8; LP=40.55; BH=46.48) and the mean daily growth of POF (mm / day) (MP=2.6; LP=3.05; BH=3.51). The MP group differed from LP and BH groups regarding number of follicles per ovulatory wave (MP=4.8; LP=10.11; BH=9.75), number of follicles per day (MP=4.19; LP=10, 27; BH=10.63), number of follicles equal or greater than 10mm (MP=2.98; LP=5.88; BH=5.98), diameter of POF at deviation (mm) (MP=22.62; LP=24.81; BH=25.58), diameter of second largest follicle (SLF) at deviation (MP=15.56; LP=21.25; BH=21.83), diameter difference between FPO and SLF at deviation (mm) (MP=7.25; LP=3.56; BH=3.75), corpus luteum (CL) area (mm2) (MP=436.1; LP=674.4; BH=720.4). There was no difference between groups regarding cycle length (MP=21.9; LP=20.22; BH=20.58), occurrence of deviation (MP=80%; LP=88.89%; BH=100%), days between emergence of POF and SLF (MP=0.8, LP = 0.89, BH = 0.92), and diameter difference between POF and SLF at emergence (mm) (MP=0.4; LP=0.44; BH=0.5) and at deviation (mm) (MP=7.25; LP=3.56; BH=3.75); days between emergence and deviation (MP=5.12; LP=5.5; BH=5.5), deviation and ovulation (MP=5.12; LP=6.62; BH=6.8), number of minor waves (MP = 0.3; LP = 0.33; BH = 0.42) and CL lifespan (days) (MP=12.4; LP=14.67; BH=13.92).

Orientador: José Buratini Júnior / Resumo: Na produção in vitro (IVP), trabalha-se com uma população de oócitos heterogênea em relação ao estágio da maturação nuclear que estes oócitos se encontram, mais especificamente o estágio de vesícula germinativa (GV), uma vez que estes são obtidos de folículos em diferentes estágios de desenvolvimento. Visto que essa heterogeneidade impacta nos resultados da IVP, torna-se necessário que os processos de seleção de oócitos e de maturação in vitro sejam adequados e articulados, para que ocorra o desenvolvimento da competência oocitária para subsequente desenvolvimento. Neste estudo, objetivou-se avaliar a população de ovócitos obtida de folículos antrais grandes, testando a hipótese de que folículos dominantes saudáveis conteriam oócitos com grau intermediário de compactação da cromatina (oócitos em GV2). Em seguida, avaliou-se a população de oócitos obtida em dia aleatório do ciclo estral após OPU e testou-se o efeito de protocolo de sincronização combinando aspiração de folículos e tratamento com FSH para homogeneizar a população e controlar a qualidade dos oócitos. Os resultados sugerem que folículos dominantes saudáveis são predominantemente compostos por oócitos com níveis intermediários de compactação da cromatina e que protocolos de sincronização de aspiração do folículo combinadas ao tratamento com FSH podem ser úteis para controlar a qualidade do oócito para OPU / IVP. / Abstract: In vitro production (IVP), a heterogeneous oocyte population is employed in relation to the stage of nuclear maturation that these oocytes are found, more specifically the germinal vesicle (GV) stage, once they are obtained from follicles in different stages of development. Since this heterogeneity impacts the results of IVP, it is necessary that the processes of oocyte selection and in vitro maturation are adequate and articulated, so that occurs development of oocyte competence for subsequent development. The objective of this study was to evaluate the oocyte population obtained from large antral follicles, testing the hypothesis that healthy dominant follicles would contain oocytes with an intermediate degree of chromatin compaction (GV2 oocytes). Then we evaluated the population of oocytes obtained at random day of the estrous cycle after OPU and tested the synchronization protocol combining follicle aspiration and FSH treatment to homogenize the population and control the quality of oocytes. The results suggest that healthy dominant follicles are predominantly composed of oocytes with intermediate levels of chromatin compaction and that follicle aspiration synchronization protocols combined with FSH treatment may be useful to control oocyte quality for OPU / IVP. / Mestre

O hormônio folículo estimulante (FSH) desempenha um papel central no desenvolvimento da célula de Sertoli até a puberdade, e na sinalização desta célula em relação à série espermatogênica, após a puberdade. Na fase proliferativa, FSH atua estimulando a captação de Ca2+ e o transporte de aminoácidos neutros nas células de Sertoli, além de ativar a via adenilil ciclase-AMPc. Neste período, que em ratos compreende do 5º dia ao 25º após o nascimento, FSH atua aumentando o número e o tamanho das células de Sertoli, sendo esta ação fundamental para que se processe uma espermatogênese normal no indivíduo adulto. A sinalização estimulada por FSH nestas células varia com idade, reduzindo seu estímulo sobre o transporte de Aminoácidos neutros (via sistema A) no período pós- púbere. Adicionalmente, FSH estimula uma resposta eletrofisiológica bifásica, representada por uma hiperpolarização rápida, seguida de uma despolarização prolongada. O objetivo desta tese foi analisar o envolvimento de vias sinalizadas pela gonadotrofina na fase pré-puberal da célula de Sertoli de ratos. Para tanto, foram utilizadas as técnicas de captação de 45Ca2+, de transporte de [14C]MeAIB e de registro eletrofisiológico intracelular, para a verificação da ação do FSH através de proteína Gs e proteína Gi, bem como de suas vias subseqüentes. Foi observado que FSH estimula a captação de 45Ca2+ e o transporte de [14C]MeAIB via proteína Gi, ação esta independente do aumento de AMPc, pois foram bloqueadas por Toxina Pertussis (PTX) e não foram mimetizadas por forscolina. Da mesma forma, a despolarização estimulada por FSH foi inibida por PTX. Subseqüente a ativação de Gi, PI3K é estimulada por FSH, em células de Sertoli imaturas. Esta via foi bloqueada por wortmannin, o que inibiu a ação de FSH nos parâmetros analisados. Também foi estudada a ação de IGF-I sobre a captação de 45Ca2+, sobre o transporte de [14C]MeAIB e foi observada sua resposta eletrofisiológica. Verificou-se ação de IGF-I nos transportes de 45Ca2+ e [14C]MeAIB de maneira significativa, e observou-se uma despolarização como resposta eletrofisiológica à sua aplicação tópica, em células de Sertoli de ratos imaturos. Sabe-se que FSH e IGF-I agem de maneira sinérgica no desenvolvimento das células de Sertoli, e que FSH estimula a síntese e a secreção de IGF-I, nestas células durante o período pré-púbere. Então foi verificada se a ação de FSH ocorre via IGF-I ou através de mecanismos paralelos. Para esta verificação utilizou-se o bloqueador de receptor de IGF-I, JB1, o qual bloqueia o acesso do fator de crescimento ao seu receptor tirosina cinase. Como resultado foi observado que o bloqueador JB1, inibe as ações estimuladas por IGF-I, entretanto sem alterar a resposta de FSH sobre os parâmetros analisados. E com o intuito de verificar o envolvimento de Cav1 (canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo L), foi utilizado verapamil, o qual bloqueou a ação de FSH sobre a captação de 45Ca2+. A partir destes resultados, é possível sugerir que FSH estimula a captação de 45Ca2+, o transporte de [14C]MeAIB, bem como apresenta uma resposta eletrofisiológica vinculada a via GPCR/Gi/Gßy/PI3K/Akt-PKB/Cav1, em células de Sertoli de ratos imaturos durante sua fase proliferativa. / FSH plays a central role on Sertoli cell proliferation in development during puberty, and after this period is related to spermatogenic progression. FSH increase Sertoli cells number and size from the 5º to 15º day after birth, in the same period the FSH strongly stimulates neutral amino acid transport, also, FSH plays a biphasic electrophysiology response characterized by a rapid hyperpolarization following to a prolonged depolarizing. The aim of this work was study the pathways stimulated by FSH in Sertoli cells of rats during the pre pubertal phase. As markers we use 45Ca2+ uptake, [14C]MeAIB transport and the membrane potential (MP) to verify the action of FSH on Gi and Gs protein pathways. It was observed that FSH enhanced 45Ca2+ uptake through Gi protein pathway, independently of cAMP, this action was bloked by PTX (250ng/mL) independent of adenil ciclase action. Also 45Ca2+ uptake, [14C]MeAIB transport and MP response were blocked by wortmannin (100nM). The action IGF-1 in these parameters was also analyzed, the growth factor stimulates 45Ca2+ uptake and [14C]MeAIB transport and induce a prolonged depolarization on the MP. The use of an inactive analog of the IGF-1(JB1 1μg/ml) blocked the IGF-1 action but not the effects of FSH. The utilization of Verapamil (100 μM) blocker of the Cav1 (L type VDCC) inhibited the stimulation of FSH on 45Ca2+ uptake and [14C]MeAIB transport. These results suggest that the FSH action during proliferative stage of Sertoli cells on 45Ca2+ uptake, [14C]MeAIB transport and MP modification related to the GPCR/Gi/Gßy/PI3K/Akt-PKB/Cav1 pathway.

Leitão, C. C. F. Efeito do FSH, Ativina-A e GDF-9 sobre o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos. 2011. 112 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia), Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2011. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-15T15:22:10Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_ccfleitao.pdf: 1217871 bytes, checksum: f33f9f636971df4fb09b48a95e60fefb (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-15T15:48:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_ccfleitao.pdf: 1217871 bytes, checksum: f33f9f636971df4fb09b48a95e60fefb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-15T15:48:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_ccfleitao.pdf: 1217871 bytes, checksum: f33f9f636971df4fb09b48a95e60fefb (MD5) Previous issue date: 2011 / The aim of this study was to investigate the levels of messenger RNA (mRNA) for activin-A on goat preantral and antral follicles and the effects of follicle stimulating hormone (FSH), activin-A and growth and differentiation factor - 9 (GDF-9) on growth and mRNA expression for activin-A, GDF-9, bone morphogenetic protein (BMP) -2, -4, -6, -7, -15 and FSH receptor (FSH-R) in goat preantral follicles cultured in vitro. Initially, primordial, primary and secondary follicles, as well as cumulus-oocyte complexes (COCs) and mural granulosa/theca cells of small and large antral follicles were isolated mechanically from goat ovaries and the expression of mRNA for activin-A was evaluated by real-time PCR. For in vitro studies, goat secondary follicles were isolated and cultured for 6 days in the presence of FSH alone (50 ng/mL) or in combination with activin-A (100 ng/mL) or GDF-9 (200 ng/mL). Alone or in combination with FSH, the influence of activin-A on expression of activin-A and FSH-R, and the effect of GDF-9 on the levels of mRNA for GDF-9, FSH-R and BMP -2, -4, -6, -7 and -15 in secondary follicles after 6 days of culture were tested. For this, after extraction of total RNA and cDNA synthesis, the levels of mRNA for activin-A, GDF-9, FSH-R and BMP -2, -4, -6, -7 and -15 were quantified by real time PCR. The results showed that secondary follicles had lower levels of mRNA for activin-A, than compared to primary follicles (p<0.05). There was no difference in levels of mRNA for activin-A between primordial and primary or secondary (p>0.05). Allied to this, there was no difference between COCs of small and large antral follicles (p>0.05). Moreover, granulosa and theca cells of large antral follicles showed higher levels of mRNA for activin-A than in small antral follicles (p<0.05). When comparing mRNA expression for activin-A between COCs from small and large antral follicles and their granulosa and theca cells, no difference in expression levels was observed (p>0.05). After in vitro culture of secondary follicles, the presence of FSH either alone or associated with activin-A or GDF-9 increased survival, follicular growth and antrum formation (p<0.05). The FSH increased mRNA for activin-A, while the follicles cultured with activin-A showed increased levels of mRNA for FSH-R (p<0.05). In addition, GDF-9 decreased mRNA expression for BMP -2 and -15 (p<0.05), but had no effect on expression of BMP -4, -6, and -7 (p>0.05). In conclusion, during the transition from primary to secondary follicles there is a reduction of mRNA for activin-A, whereas there is an increased expression of this factor during the growth of antral follicles. FSH, activin-A and GDF-9 stimulate growth of goat secondary follicles after 6-day culture. After follicle culture FSH controls the expression of activin-A, and the expression of FSH-R is regulated by activin-A. Furthermore, GDF-9 reduces the mRNA expression for BMP-2 and -15 / O objetivo deste estudo foi investigar os níveis de RNA mensageiro (RNAm) para ativina-A em folículos pré-antrais e antrais caprinos e os efeitos do hormônio folículo estimulante (FSH), ativina-A e fator de crescimento e diferenciação - 9 (GDF-9) sobre o crescimento e a expressão de RNAm para ativina-A, GDF-9, proteína morfogenética óssea (BMP) -2, -4, -6, -7, -15 e receptor de FSH (R-FSH) em folículos pré-antrais caprinos cultivados in vitro. Inicialmente, folículos primordiais, primários e secundários, bem como complexos cumulus-oócito (COCs) e células da granulosa mural/teca de pequenos e grandes folículos antrais foram isoladas mecanicamente a partir de ovários de cabra e a expressão de RNAm para ativina-A foi avaliada por PCR em tempo real. Para os estudos in vitro, folículos secundários caprinos foram isolados e cultivados por 6 dias na presença de FSH sozinho (50 ng/mL) ou em combinação com ativina-A (100 ng/mL) ou GDF-9 (200 ng/mL). Isoladamente ou em combinação com FSH, a influência de ativina-A na expressão de ativina-A e R-FSH, e o efeito do GDF-9 sobre os níveis de RNAm para GDF-9, R-FSH e BMP -2, -4 , -6, -7 e -15 em folículos secundários após 6 dias de cultivo foram testados. Para isso, após a extração do RNA total e síntese do cDNA, os níveis de RNAm para ativina-A, GDF-9, R-FSH e BMP -2, -4, -6, -7 e -15 foram quantificados por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que folículos secundários apresentavam níveis menores de RNAm para ativina-A comparado aos folículos primários (p<0,05). Não houve diferença nos níveis de RNAm para ativina-A entre folículos primordial e primário ou secundário (p>0,05). Aliado a isso, não houve diferença entre COCs de pequenos e grandes folículos antrais (p>0,05). Além disso, as células da granulosa e da teca de grandes folículos antrais apresentaram maiores níveis de RNAm para ativina-A do que de pequenos folículos antrais (p<0,05). Quando comparamos a expressão do RNAm para ativina-A entre COCs de pequenos e grandes folículos antrais e suas células da granulosa e da teca, nenhuma diferença nos níveis de expressão foi observada (p>0,05). Após o cultivo in vitro de folículos secundários, a presença de FSH sozinho ou associado com ativina-A ou GDF-9 aumentou a sobrevivência, crescimento folicular e formação de antro (p<0,05). O FSH também aumentou o RNAm para ativina-A, enquanto os folículos cultivados com ativina-A apresentaram níveis aumentados de RNAm para R-FSH (p<0,05). Além disso, o GDF-9 diminuiu a expressão de RNAm para BMP -2 e -15 (p<0,05), mas não teve efeito sobre a expressão de BMP -4, -6 e -7 (p>0,05). Em conclusão, durante a transição de folículo primário para secundário há uma diminuição do RNAm para ativina-A, enquanto ocorre um aumento da expressão deste fator durante o crescimento de folículos antrais. FSH, ativina-A e GDF-9 estimulam o crescimento de folículos secundários caprinos após 6 dias de cultivo. Após cultivo folicular, FSH controla a expressão de ativina-A e a expressão do R-FSH é regulada por ativina-A. Ainda, GDF-9 reduz a expressão do RNAm para BMP -2 e -15