FROTA, I. M. A. Estabilidade de genes de referência e influência das BMPs-6 e 7 sobre o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos. 2010. 114 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará. 2010. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-04-04T14:52:49Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_imafrota.pdf: 1470611 bytes, checksum: afb3ce2b8c7bbc8dbd88c66e1c9331c5 (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa(djeannecosta@gmail.com) on 2016-04-04T14:53:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_imafrota.pdf: 1470611 bytes, checksum: afb3ce2b8c7bbc8dbd88c66e1c9331c5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-04T14:53:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_imafrota.pdf: 1470611 bytes, checksum: afb3ce2b8c7bbc8dbd88c66e1c9331c5 (MD5) Previous issue date: 2010 / This study aims to evaluate the stability of reference genes and the expression of growth factors and hormone receptors in goat secondary follicles. It also seeks to quantify the expression of messenger RNA for BMP-6 and BMP-7 in goat preantral follicles and to evaluate the effects of FSH, BMP-6 and BMP-7 on growth and gene expression in secondary follicles goats after 6 days of culture. To evaluate the stability of reference genes, secondary follicles (150-200 μm) were mechanically isolated from goat ovaries. After extraction of total RNA and synthesis of complementary DNA, the quantification of mRNA was carried out by real-time PCR using specific primers for genes of reference (GAPDH, β-tubulin, β-actin, PGK, UBQ, RPL - 19, rRNA18S), growth factors (GDF-9, BMP-15, BMP-6, FGF-2, VEGF, KL and IGF-1) and hormone receptor (FSH-R, LH-R and GH-R). To evaluate expression of BMP-6 and BMP-7, primordial follicles, primary and secondary as well as small and large antral follicles were obtained and the mRNA levels of BMP-6 and 7 were measured. For in vitro studies, the effects of BMP-6 (50 ng / mL) and BMP-7 (50 ng / mL) in the presence or absence of FSH (50 ng / mL) on the development of secondary follicles and on the expression of mRNA for BMP-6 and 7 and FSH-R was evaluated after 6 days of culture. Results showed that mRNA for growth factors (EGF, GDF-9, BMP-15, VEGF, FGF-2, BMP-6, IGF-1 and KL) and the receptors for FSH, LH and GH are expressed in at different levels in preantral follicles of goats. Moreover, among the growth factors studied, IGF-1 and EGF had higher and lower levels or RNA, respectively. UBQ and β-actin genes were the mostr stable reference in fresh and cultured preantral follicles. The level of mRNA for BMP-6 in primary and secondary follicles was significantly higher than those in primordial follicles, while the levels of mRNA for BMP-7 was higher in granulosa cells / theca in large antral follicles than in small antral follicles. After culture of secondary follicles for 6 days, FSH increased follicular diameter and FSH and BMP-7 significantly increased the levels of mRNA for BMP- 7 and FSH-R. In addition, BMP-6 in the presence or absence of FSH increased the diameter of secondary follicles after 6 days of culture. Real-time PCR shoed that FSH increased the levels of mRNA for BMP-6, while both BMP-6 and FSH and increased levels of mRNA for FSH-R, after a period of 6 days of culture. In conclusion, UBQ and β-actin are the two most stable genes for secondary follicles goats and FSH and BMPs of types 6 and 7 stimulate the growth of preantral follicles after 6 days of in vitro culture. / Este trabalho tem como objetivo avaliar a estabilidade de genes de referência e a expressão de fatores de crescimento e de receptores de hormônios em folículos secundários de caprinos. Além disso, visa quantificar a expressão dos RNA mensageiros para BMP-6 e BMP-7 em folículos pré-antrais e antrais caprinos e avaliar os efeitos de FSH, BMP-6 e BMP-7 sobre o crescimento e expressão gênica em folículos secundários caprinos durante 6 dias de cultivo. Para avaliar a estabilidade dos genes de referência, folículos secundários (150-200 µm) foram isolados mecanicamente de ovários caprinos. Após a extração do RNA total e síntese de DNA complementar, realizou a quantificação dos mRNA, por PCR em tempo real, utilizando-se primers específicos para genes de referência (GAPDH, β-tubulina, β-actina, PGK, UBQ, RPL-19, rRNA18S), fatores de crescimento (GDF-9, BMP-15, BMP-6, FGF-2, VEGF, KL e IGF-1) e receptores de hormônio (FSH-R, LH-R e GH-R). Para avaliar a expressão de BMP-6 e BMP-7, folículos primordiais, primários e secundários, bem como pequenos e grandes folículos antrais foram obtidos e os níveis de mRNA de BMP-6 e 7 foram quantificados. Nos estudos in vitro, os efeitos da BMP-6 (50 ng/mL) e BMP-7 (50 ng/mL) na presença ou ausência de FSH (50 ng/mL) sobre o desenvolvimento in vitro de folículos secundários e sobre a expressão de mRNA para BMP-6 e 7 e FSH-R foi avaliada após 6 dias de cultivo. Os resultados mostraram que UBQ e β-actina são os genes de referência mais estáveis em folículos pré-antrais caprinos fresco cultivados por 12 dias. Os RNAs mensageiros para os fatores de crescimento (EGF, GDF-9, BMP-15, VEGF, FGF-2, BMP-6, IGF-1 e KL) e os receptores de FSH, LH e GH são expressos em diferentes níveis em folículos pré-antrais de caprinos, sendo que o IGF-1 e o EGF apresentaram, respectivamente, o maior e o menor nível de mRNA. O nível de mRNA para BMP-6 em folículos primários e secundários foi significativamente maior do que aqueles em primordial, enquanto que os níveis de mRNA para BMP-7 foi maior nas células da granulosa/teca de grandes do que nos pequenos folículos antrais. Após o cultivo de folículos secundários durante 6 dias, FSH aumentou o diâmetro folicular e FSH e BMP-7 aumentou significativamente os níveis de mRNA para BMP-7 e FSH-R. Já a BMP-6 na presença ou ausência de FSH aumentou o diâmetro dos folículos secundários. Além disso, FSH aumentou os níveis de mRNA para BMP-6, enquanto ambos BMP-6 e FSH e aumentaram os níveis de mRNA para FSH-R, após o período de cultivo. Em conclusão, UBQ e β-actina são os dois genes mais estáveis para folículos secundários caprinos e o FSH e as BMPs dos tipos 6 e 7 estimulam o crescimento de folículos pré-antrais in vitro durante 6 dias de cultivo.

As células do cumulus oophorus são firmemente conectadas umas às outras e ao oócito e participam ativamente do amadurecimento oocitário. Essas células apresentam abundância de receptores para o FSH. Os carboidratos da molécula do FSH podem terminar em resíduos de ácido siálico, permitindo que ele exista em numerosas isoformas. As isoformas mais ácidas do FSH contêm mais resíduos de ácido siálico. Os níveis dessas isoformas variam na fase folicular do ciclo menstrual e possuem diferentes capacidades de estímulo ovariano, sendo as menos ácidas mais potentes e de curta meia-vida plasmática. Objetivo: padronizar a técnica de registro eletrofisiológico intracelular para as células do cumulus oophorus humanas e verificar a ação de uma isoforma menos ácida do FSH, a Folitropina Beta (Puregon®) sobre o potencial de membrana dessas células, comparando com a ação de um FSH com menor grau de pureza e mais ácido (FSH ovino). Metodologia: o potencial de membrana foi registrado utilizando células de cumulus oophorus de pacientes encaminhadas ao procedimento de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI). As células do cumulus foram cultivadas em placas de cultura com meio HTF (Life Global® - Guilford, CT USA) acrescido de 10% de Soro Sintético (SSS- Life Global® - Guilford, CT USA) por 24 a 48 horas. Durante o experimento eletrofisiológico, a placa foi perfundida com o fluxo de 1 mL/min de meio de Hank´s acrescido de Hepes com 10% de Soro Sintético (SSS- Life Global® - Guilford, CT USA) mantido a 37º C. O registro intracelular foi realizado com microeletrodos preenchidos com KCl 3 M com uma resistência de 15 a 25 MΩ e acoplados a um eletrômetro. A resistência da membrana ao fluxo de cargas foi avaliada com a aplicação de pulsos quadrados de corrente (0,5 nA, 0,5 Hz e 200 ms) através do eletrodo de registro. Os hormônios testados (FSH ovino e Folitropina Beta) foram aplicados topicamente na placa. Para a análise estatística foi utilizado o teste de Anova de duas vias (seguido do pós-teste de Bonferroni) ou o teste exato de Fischer. Resultados: Foi realizada a padronização da técnica de registro eletrofisiológico para as células do cumulus e o potencial de membrana médio em repouso obtido foi de -34,02 mV, com desvio-padrão de ± 6,46 e erro-padrão da média de ± 2,04. A resistência média das membranas ao fluxo de íons foi de 16,5 MΩ, com desvio-padrão de ± 4,03 e erro-padrão da média de ± 1,8. A aplicação do FSH Ovino (1 μM) causou uma lenta despolarização, estatisticamente significativa 180 segundos após a aplicação do hormônio (P<0,01). A aplicação da Folitropina Beta (Puregon® 1 μM) causou uma lenta despolarização, estatisticamente significativa 120 e 180 segundos após a aplicação do hormônio (P<0,001). O padrão de despolarização foi semelhante entre as duas isoformas, sendo o efeito da Folitropina Beta mais imediato que o do FSH Ovino aos 120 segundos. Conclusões: A partir da padronização da técnica de registro eletrofisiológico intracelular para as células do cumulus oophorus humanas, registrou-se o potencial médio de membrana em repouso (-34,02 mV) e a resistência média da membrana ao fluxo de íons (16,5 MΩ). O FSH Ovino (1 μM) e a Folitropina Beta (Puregon®) (1 μM) possuem uma ação despolarizante sobre o potencial de membrana das células do cumulus. Para o FSH Ovino, essa despolarização foi significativa 180 segundos após a aplicação do hormônio e para a Folitropina Beta, a despolarização foi significativa já aos 120 segundos após a aplicação. Há uma semelhança no padrão de despolarização produzida pelo FSH Ovino e pela Folitropina Beta. Um melhor entendimento das diferenças no funcionamento das isoformas do FSH pode proporcionar o desenvolvimento de melhores protocolos de tratamento para as pacientes, com menos efeitos colaterais. Esse conhecimento também pode ser utilizado para o aprimoramento das técnicas de maturação in vitro dos oócitos, que podem poupar as pacientes dos efeitos colaterais e dos altos custos da estimulação exógena com gonadotrofinas. / The cumulus oophorus cells are firmly connected to each other and to the oocyte and they take an important part on the oocyte maturation. These cells present numerous FSH receptors. The carbohydrates present in the FSH molecule may end in sialic acid residues, allowing FSH to exist in various isoforms. The more acidic isoforms present more sialic acid residues in their carbohydrate moieties. These isoforms exhibit fluctuations in the follicular phase of the menstrual cycle and possess different capabilities of ovarian stimulation, with the least acidic isoform having higher potency and lower plasmatic half-life. Objective: The aim of this study was to standardize the intracellular electrophysiology register technique to the human cumulus oophorus cells and to investigate the membrane potential action of a less acidic FSH isoform (Puregon™), comparing with the membrane action using a less purified, more acidic FSH isoform (sheep FSH). Methods: The membrane potential was registered in cumulus oophorus cells from patients assigned to the intracytoplasmatic sperm injection (ICSI) technique. The cumulus cells were cultured in plates with HTF medium for 24 to 48 hours. During the electrophysiological experiment, the plate was superfused with 1 mL/min of Hank`s medium supplemented with Hepes, maintained at 37º C. The intracellular register was performed with microcapillaries filled with 3 M KCl with resistance ranging between 15 and 25 MΩ, and coupled to an electrometer. The membrane resistance to the ion flow was assessed by the application of square current pulses (0,5 nA, 0,5 Hz and 200 ms) through the register electrode. The tested hormones (sheep FSH and Beta Follitropin Puregon™) were applied topically onto the plate. Statistical analysis was performed using the ANOVA test for repeated measures (with Bonferroni post-test) or Fischer´s exact test. Results: the standardization of the electrophysiological register technique for the cumulus cells was successfully achieved and the mean resting membrane potential obtained was -34,02 ± 2,04 mV (SEM). The mean resistance of the membrane to the ion flow was 16,5 ± 1,8 MΩ (SEM). The sheep FSH application (1 μM) led to a slow depolarization, statistically significant 180 seconds after the hormone application (P<0,01). Beta Follitropin administration (1 μM) led to a slow depolarization, statistically significant 120 and 180 seconds after the hormone application (P<0,001). The depolarization pattern was similar between both isoforms, being that Beta Follitropin`s effect was more immediate than sheep FSH`s. Conclusion: With the electrophysiological intracellular register technique standardization to the human cumulus cells, the mean resting membrane potential was registered (-34,02 mV) and the mean membrane resistance to the ion flow was obtained (16,5 MΩ). Sheep FSH (1 μM) and Beta Follitropin (Puregon™) (1 μM) prompted a depolarizing action in the membrane potential of cumulus cells. Sheep FSH depolarization was significant at 180 seconds after the hormone application and Beta Follitropin depolarization was significant at 120 seconds after its application. Both isohormones have similar depolarization patterns. A better understanding of the differences in the action of both FSH isoforms shall make it possible to develop better hormone induction protocols in fertility treatments, with less side effects for the patients. This knowledge will potencially also make it possible to improve the in vitro oocyte maturation techniques, sparing patients of the hormone treatment side effects and of the high financial costs of the exogenous gonadotrophins administration.

Resumo não disponível.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-08-03Bitstream added on 2014-06-13T19:07:16Z : No. of bitstreams: 1 macedo_mf_me_jabo.pdf: 610247 bytes, checksum: e83787380516ff046b849f0759fc1d31 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Objetivou-se desenvolver uma técnica de cultivo de folículos préantrais pelo auto-enxerto de tecido ovariano, avaliando a viabilidade cirúrgica e histopatológica desta técnica em função do tempo. Sessenta ratas Wistar foram submetidas à ovariosalpingectomia bilateral e enxerto de fragmento ovariano inserido sob a cápsula renal do rim direito. Os animais foram subdivididos em seis grupos experimentais baseados no tempo de pós-cirúrgico. Transcorridas 24 h (grupo 24H), 72 h (grupo 72H), 1 semana (grupo 1 S), 2 semanas (grupo 28), 3 semanas (grupo 3S), e 4 semanas (grupo 4S), os animais foram sacrificados. As peças cirúrgicas, compostas por enxerto ovariano e parênquima renal subjacente, foram imersas em solução de Bouin durante 24 horas, sendo processadas histologicamente, e coradas por hematoxilina-eosina e tricrômico de Masson. Aspectos técnicos cirúrgicos, morfológicos e histopatológicos foram avaliados. Os procedimentos cirúrgicos foram de fácil execução e a avaliação morfológica revelou facilidade de localização, poucos casos de migração e neovascularização do enxerto após 1 semana. Não houve sinais de rejeição do enxerto, e o aspecto macroscópico do útero foi normal na maioria dos animais. A histopatologia mostrou diferentes proporções entre as categorias foliculares em função do tempo de enxerto sem alterações no parênquima renal. Concluiu-se que a técnica de enxerto do tecido ovariano sob a cápsula renal é exeqüível e viável tanto cirúrgica quanto histopatologicamente permitindo o desenvolvimento de folículos a estágios antrais num curto espaço de tempo / This study aims to develop a technique to culture preantral follicles using ovarian autograft, and to evaluate surgically and histopathologically the viability of this technique regarding the time. 8ixty Wistar rats were submitted to bilateral ovariosalpingectomy and her ovarian tissue grafted under renal capsule of the right kidney. The animals were divided into six groups based on the post surgical time. After 24 h (group 24H), 72 h (group 72H), 1 week (group 18), 2 weeks (group 28), 3 weeks (group 38), e 4 weeks (group 48), the animals were sacrificed. The surgical samples, composed by ovarian graft and the near renal parenchyma, were fixed in Bouin solution for 24 hours, submitted to semi-serially sections, and stained with hematoxiline-eosine and Masson tricromic. Surgical, morphological and histopathological aspects were evaluated. The surgical procedures were performed easily and the morphological evaluation resulted easily located, few cases of migration with neovascularization of the graft after one week. No signals of graft rejection and the uterine macroscopy was normal in the majority of the animals. The histology showed different proportions between follicular categories during the graft period and no alterations in the renal parenchyma. In conclusion, grafting of ovarian tissue under renal capsule is easy to execute, viable of the surgical and histopathological points of view, allowing follicular development in a short time

Submitted by TARCISIO TORRE LOURENÇO null (tarcisiolourenco16@yahoo.com.br) on 2016-12-09T13:14:54Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Tarcísio com a ficha.pdf: 10339060 bytes, checksum: 23f48d3539cc446a8efd713c0a0b082d (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-12-13T10:58:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lourenco_tt_me_bot.pdf: 10339060 bytes, checksum: 23f48d3539cc446a8efd713c0a0b082d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-13T10:58:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lourenco_tt_me_bot.pdf: 10339060 bytes, checksum: 23f48d3539cc446a8efd713c0a0b082d (MD5) Previous issue date: 2016-03-30 / O ciclo estral da vaca é composto por 2-3 ondas de crescimento folicular, no qual vários folículos são recrutados e iniciam um novo crescimento. Durante o período denominado desvio folicular, um folículo se torna dominante e os outros entram em atresia. Este processo envolve um mecanismo ainda não completamente compreendido, incluindo proteínas específico, como já estabelecido pela expressão gênica. O objetivo do presente estudo foi caracterizar as proteínas do fluído folicular a fim de identificar macromoléculas relacionadas ao desenvolvimento dos folículos de vacas zebuínas nã-gestantes. Foram colhidos os ovários de 25 vacas mestiças não-gestantes em um abatedouro. A presença do corpo lúteo foi anotada para cada ovário. O líquido folicular foi colhido utilizando-se a imersão do ovário em meio líquido e ultrassonografia. De acordo com a mensuração do diâmetro folicular, foram formados 3grupos, folículos pequenos (≤6,5mm, n=25), médios (>6,5mm a ≤9mm, n=9) e grandes (>9,0mm, n=11). Após 2 centrifugações (600xg/10 minutos e 15.000xg/30 minutos, 4ºC) o sobrenadante foi separado e utilizado para determinação da concentração de proteína total (método de Bradford). A eletroforese foi conduzida sob condições desnaturantes e redutoras, em gel de separação de poliacrilamidaà 12%. A concentração de progesterona e estradiol do líquido folicular foi determinada a fim de identificar os folículos saudáveis. As proteínas diferenciais identificadas pela eletroforese foram submetidas à espectrometria de massas e a ontologia gênica foi investigada nos bancos de dados disponíveis. Foram encontradas 45 bandas proteicas em 45 amostras de líquido folicular. A média da concentração ± desvio padrão da progesterona foi de 129,91 ± 186,43, considerando todos os folículos. Os resultados mostram que houve uma expressão diferenciada de proteínas nas diferentes categorias de folículos. / The estrous cycle of the cow consists of 2-3 follicular waves, in which several follicles are recruited and initiate growth. During the period called follicular deviation, one follicle becomes dominant and the other come into atresia.This process involves mechanisms not yet fully understood, including specific proteins as already determined by gene expression. As a result, the objective of this study was to characterize the proteins of the follicular fluid to identify macromolecules related to the development of follicles from Zebu cow. The ovaries of nonpregnant cows 25 were harvested. The presence of luteum body was noted for each ovary. Follicular fluid was collected using ultrasound. According to the measurement of follicular diameter was 3 separate groups, small follicles (≤6,5mm, n = 28), medium (> 6.5mm to ≤9mm, n = 7) and large (> 9,0mm, n = 11). After 2 centrifugations (600xg / 10 minutes, 15.000xg / 30 minutes, 4 ° C) the supernatant was separated and used for determination of total protein concentration (Bradford method). Electrophoresis was conducted under denaturing and reducing conditions on polyacrylamide separating gel at 12%. The concentration of progesterone and follicular fluid estradiol was determined to identify healthy follicles. The differential proteins identified by electrophoresis will be submitted for MALDI TOF MS / MS approach and gene ontology will be investigated in the databases available. They found 45 protein bands in electrophoresis in 45 follicular fluid samples. The mean ± standard deviation of progesterone concentration was 129.91 ± 186.43 considering all follicles. The results show that there was a differential expression of proteins in different categories of follicles.

Orientador: Wilter Ricardo Russiano Vicente / Coorientador: Maria Emília Franco Oliveira / Banca: Maurício Veloso Brun / Banca: Érika da Silva Carvalho Morani / Banca: Marcus Antônio Rossi Feliciano / Banca: Lindsay Unno Gimenes / Resumo: O objetivo deste trabalho foi descrever uma técnica de aspiração folicular por videolaparoscopia (LOPU), estabelecendo um protocolo de estimulação ovariana para ovelhas recém-desmamadas. Utilizou-se 36 ovelhas de 4 à 8 semanas de idade, submetidas a um protocolo curto de progestágeno para induzir onda folicular, associado à estimulação ovariana pela administração de 300 UI de eCG e ao emprego de FSH, de acordo com cada grupo experimental: dois grupos controles (GCN - sem tratamento e GCI - com somente protocolo de indução de onda folicular); grupos com aplicação de 80 mg de FSH (G80U - 80 mg de FSH em dose única; G80M - 4 administrações de 20 mg); e grupos que com a aplicação de 160 mg de FSH, administrado de modo similar ao descrito para os grupos de 80 mg, contudo, com o volume duplicado (G160U e G160M). Procedeu-se aspiração folicular por videolaparoscopia, realizando avaliações qualitativa e quantitativa dos oócitos recuperados, além da maturação oocitária. O transcirúrgico foi dividido em etapas intraoperatórias e também observação de comportamento sugestivo à desconforto doloroso, além da dosagem sérica de fibrinogênio. O tempo cirúrgico médio foi de 24,3±5,2 min., e com poucas intercorrências. Os dados relativos à observação de dor e das concentrações séricas de fibrinogênio não foram significativos em relação ao basal (p>0,05). O número de oócitos recuperados para os GCN, GCI, G80U, G80M, G160U e G160M foram de 1,1±1,6, 1,1±1,8, 4,6±3,2, 2,2±0,8, 5,8±3,1 e 3,0±2,0, respectivamente. Já o percentual de oócitos viáveis para cada grupo foi de 57,0%, 14,2%, 51,7%, 18,0%, 70,2% e 33,3%, concomitantemente. Destacando que o G160U apresentou melhor resultados na MIV. Concluiu-se que o protocolo do G160U apresentou melhores resultados, verificando que este já apresenta viabilidade comercial / Abstract: The aim of this study was describe a technique of laparoscopic ovum pick-up (LOPU), establishing a ovarian stimulation protocol for newborn weaned lambs. We use 36 sheep, aging 4 to 8 weeks old, subjected to a progestin short protocol to induce follicular wave, associated with ovarian stimulation by administration of 300 IU of eCG and the use of FSH in accordance with following experimental group: two control groups (UCG - untreated and CGI - with single follicular wave induction protocol); groups with application of 80 mg of FSH (S80G - 80 mg single dose of FSH; M80G - 4 doses of 20mg); and groups with application of 160 mg of FSH in similar methodology described for the 80 mg groups, however, doubling the volume (S160G and M160G). Videolaparoscopic follicular aspirations and qualitative and quantitative evaluations of retrieved oocytes were performed, as the oocyte maturation. The surgical procedure was divided in intraoperative stages, observation of behavior suggestive of painful discomfort and serum fibrinogen evaluation. The mean surgical time was 24.3 ± 5.2 min. with rare complications. Data of pain observation and serum fibrinogen concentrations were not significant compared to baseline (p> 0.05). The number of a retrieved oocytes for UCG, CGI, S80G, M80G, and S160G M160G were 1.1 ± 1.6, 1.1 ± 1.8, 4.6 ± 3.2, 2.2 ± 0 8, 5.8 ± 3.1 and 3.0 ± 2.0 respectively. The percentage of viable oocytes for each group was 57.0%, 14.2%, 51.7%, 18.0%, 70.2% and 33.3%, concomitantly. Highlighting the S160G group showed better results for IVM. The protocol S160G showed better results and prompt commercial viability / Doutor

Orientador: Fabiana Ferreira de Souza / Resumo: O ciclo estral da vaca é composto por 2-3 ondas de crescimento folicular, no qual vários folículos são recrutados e iniciam um novo crescimento. Durante o período denominado desvio folicular, um folículo se torna dominante e os outros entram em atresia. Este processo envolve um mecanismo ainda não completamente compreendido, incluindo proteínas específico, como já estabelecido pela expressão gênica. O objetivo do presente estudo foi caracterizar as proteínas do fluído folicular a fim de identificar macromoléculas relacionadas ao desenvolvimento dos folículos de vacas zebuínas nã-gestantes. Foram colhidos os ovários de 25 vacas mestiças não-gestantes em um abatedouro. A presença do corpo lúteo foi anotada para cada ovário. O líquido folicular foi colhido utilizando-se a imersão do ovário em meio líquido e ultrassonografia. De acordo com a mensuração do diâmetro folicular, foram formados 3grupos, folículos pequenos (≤6,5mm, n=25), médios (>6,5mm a ≤9mm, n=9) e grandes (>9,0mm, n=11). Após 2 centrifugações (600xg/10 minutos e 15.000xg/30 minutos, 4ºC) o sobrenadante foi separado e utilizado para determinação da concentração de proteína total (método de Bradford). A eletroforese foi conduzida sob condições desnaturantes e redutoras, em gel de separação de poliacrilamidaà 12%. A concentração de progesterona e estradiol do líquido folicular foi determinada a fim de identificar os folículos saudáveis. As proteínas diferenciais identificadas pela eletroforese foram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Resumo não disponível.

As células do cumulus oophorus são firmemente conectadas umas às outras e ao oócito e participam ativamente do amadurecimento oocitário. Essas células apresentam abundância de receptores para o FSH. Os carboidratos da molécula do FSH podem terminar em resíduos de ácido siálico, permitindo que ele exista em numerosas isoformas. As isoformas mais ácidas do FSH contêm mais resíduos de ácido siálico. Os níveis dessas isoformas variam na fase folicular do ciclo menstrual e possuem diferentes capacidades de estímulo ovariano, sendo as menos ácidas mais potentes e de curta meia-vida plasmática. Objetivo: padronizar a técnica de registro eletrofisiológico intracelular para as células do cumulus oophorus humanas e verificar a ação de uma isoforma menos ácida do FSH, a Folitropina Beta (Puregon®) sobre o potencial de membrana dessas células, comparando com a ação de um FSH com menor grau de pureza e mais ácido (FSH ovino). Metodologia: o potencial de membrana foi registrado utilizando células de cumulus oophorus de pacientes encaminhadas ao procedimento de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI). As células do cumulus foram cultivadas em placas de cultura com meio HTF (Life Global® - Guilford, CT USA) acrescido de 10% de Soro Sintético (SSS- Life Global® - Guilford, CT USA) por 24 a 48 horas. Durante o experimento eletrofisiológico, a placa foi perfundida com o fluxo de 1 mL/min de meio de Hank´s acrescido de Hepes com 10% de Soro Sintético (SSS- Life Global® - Guilford, CT USA) mantido a 37º C. O registro intracelular foi realizado com microeletrodos preenchidos com KCl 3 M com uma resistência de 15 a 25 MΩ e acoplados a um eletrômetro. A resistência da membrana ao fluxo de cargas foi avaliada com a aplicação de pulsos quadrados de corrente (0,5 nA, 0,5 Hz e 200 ms) através do eletrodo de registro. Os hormônios testados (FSH ovino e Folitropina Beta) foram aplicados topicamente na placa. Para a análise estatística foi utilizado o teste de Anova de duas vias (seguido do pós-teste de Bonferroni) ou o teste exato de Fischer. Resultados: Foi realizada a padronização da técnica de registro eletrofisiológico para as células do cumulus e o potencial de membrana médio em repouso obtido foi de -34,02 mV, com desvio-padrão de ± 6,46 e erro-padrão da média de ± 2,04. A resistência média das membranas ao fluxo de íons foi de 16,5 MΩ, com desvio-padrão de ± 4,03 e erro-padrão da média de ± 1,8. A aplicação do FSH Ovino (1 μM) causou uma lenta despolarização, estatisticamente significativa 180 segundos após a aplicação do hormônio (P<0,01). A aplicação da Folitropina Beta (Puregon® 1 μM) causou uma lenta despolarização, estatisticamente significativa 120 e 180 segundos após a aplicação do hormônio (P<0,001). O padrão de despolarização foi semelhante entre as duas isoformas, sendo o efeito da Folitropina Beta mais imediato que o do FSH Ovino aos 120 segundos. Conclusões: A partir da padronização da técnica de registro eletrofisiológico intracelular para as células do cumulus oophorus humanas, registrou-se o potencial médio de membrana em repouso (-34,02 mV) e a resistência média da membrana ao fluxo de íons (16,5 MΩ). O FSH Ovino (1 μM) e a Folitropina Beta (Puregon®) (1 μM) possuem uma ação despolarizante sobre o potencial de membrana das células do cumulus. Para o FSH Ovino, essa despolarização foi significativa 180 segundos após a aplicação do hormônio e para a Folitropina Beta, a despolarização foi significativa já aos 120 segundos após a aplicação. Há uma semelhança no padrão de despolarização produzida pelo FSH Ovino e pela Folitropina Beta. Um melhor entendimento das diferenças no funcionamento das isoformas do FSH pode proporcionar o desenvolvimento de melhores protocolos de tratamento para as pacientes, com menos efeitos colaterais. Esse conhecimento também pode ser utilizado para o aprimoramento das técnicas de maturação in vitro dos oócitos, que podem poupar as pacientes dos efeitos colaterais e dos altos custos da estimulação exógena com gonadotrofinas. / The cumulus oophorus cells are firmly connected to each other and to the oocyte and they take an important part on the oocyte maturation. These cells present numerous FSH receptors. The carbohydrates present in the FSH molecule may end in sialic acid residues, allowing FSH to exist in various isoforms. The more acidic isoforms present more sialic acid residues in their carbohydrate moieties. These isoforms exhibit fluctuations in the follicular phase of the menstrual cycle and possess different capabilities of ovarian stimulation, with the least acidic isoform having higher potency and lower plasmatic half-life. Objective: The aim of this study was to standardize the intracellular electrophysiology register technique to the human cumulus oophorus cells and to investigate the membrane potential action of a less acidic FSH isoform (Puregon™), comparing with the membrane action using a less purified, more acidic FSH isoform (sheep FSH). Methods: The membrane potential was registered in cumulus oophorus cells from patients assigned to the intracytoplasmatic sperm injection (ICSI) technique. The cumulus cells were cultured in plates with HTF medium for 24 to 48 hours. During the electrophysiological experiment, the plate was superfused with 1 mL/min of Hank`s medium supplemented with Hepes, maintained at 37º C. The intracellular register was performed with microcapillaries filled with 3 M KCl with resistance ranging between 15 and 25 MΩ, and coupled to an electrometer. The membrane resistance to the ion flow was assessed by the application of square current pulses (0,5 nA, 0,5 Hz and 200 ms) through the register electrode. The tested hormones (sheep FSH and Beta Follitropin Puregon™) were applied topically onto the plate. Statistical analysis was performed using the ANOVA test for repeated measures (with Bonferroni post-test) or Fischer´s exact test. Results: the standardization of the electrophysiological register technique for the cumulus cells was successfully achieved and the mean resting membrane potential obtained was -34,02 ± 2,04 mV (SEM). The mean resistance of the membrane to the ion flow was 16,5 ± 1,8 MΩ (SEM). The sheep FSH application (1 μM) led to a slow depolarization, statistically significant 180 seconds after the hormone application (P<0,01). Beta Follitropin administration (1 μM) led to a slow depolarization, statistically significant 120 and 180 seconds after the hormone application (P<0,001). The depolarization pattern was similar between both isoforms, being that Beta Follitropin`s effect was more immediate than sheep FSH`s. Conclusion: With the electrophysiological intracellular register technique standardization to the human cumulus cells, the mean resting membrane potential was registered (-34,02 mV) and the mean membrane resistance to the ion flow was obtained (16,5 MΩ). Sheep FSH (1 μM) and Beta Follitropin (Puregon™) (1 μM) prompted a depolarizing action in the membrane potential of cumulus cells. Sheep FSH depolarization was significant at 180 seconds after the hormone application and Beta Follitropin depolarization was significant at 120 seconds after its application. Both isohormones have similar depolarization patterns. A better understanding of the differences in the action of both FSH isoforms shall make it possible to develop better hormone induction protocols in fertility treatments, with less side effects for the patients. This knowledge will potencially also make it possible to improve the in vitro oocyte maturation techniques, sparing patients of the hormone treatment side effects and of the high financial costs of the exogenous gonadotrophins administration.

O hormônio folículo-estimulante (FSH) produz um efeito dual sobre o potencial de membrana das células de Sertoli, com uma fase inicial rápida, que compreende uma hiperpolarização, por um período de segundos e uma fase de despolarização, que ocorre mais lentamente, por um período de minutos. A fase de despolarização envolve um mecanismo relacionado à entrada de cálcio estimulada pelo FSH. O Isoproterenol, um agonista de receptores β-adrenérgicos, induz uma hiperpolarização imediata e prolongada na membrana de células de Sertoli de ratos imaturos. Este efeito é provavelmente resultante da queda de [ATP]i a qual libera a inibição exercida pelo nucleotídeo sobre o canal de K+ATP. Dessa forma, objetivou-se estudar a ação do Isoproterenol sobre o potencial de membrana das células de Sertoli para melhor avaliar o componente hiperpolarizante produzido por FSH nas células de Sertoli, além de estudar a captação de Ca2+ estimulada pelo FSH e pelo isoproterenol. O potencial de membrana foi registrado utilizando túbulos seminíferos isolados de testículos de ratos Wistar machos de 15 dias de idade. O registro intracelular da célula de Sertoli foi realizado utilizando microcapilares preenchidos com KCl 3mmol/L acoplados a um eletrômetro. Foi realizada a aplicação tópica isolada de FSH (4mU/mL) e Isoproterenol (2μM). Depois, em experimentos individuais, foram aplicados topicamente, FSH e isoproterenol, 5 minutos após a aplicação tópica da Tolbutamida (10μM) e Glibenclamida (10μM), sulfonilureias de ação hipoglicemiante, que exercem efeito de fechamento dos canais de K+ATP. A Tolbutamida (10μM), ainda, foi perfundida 15 minutos antes da aplicação do Isoproterenol, a fim de testar se esta sulfoniluréia impediria de forma mais significativa a ação deste. Na técnica de captação de Ca2+, utilizou-se FSH e isoproterenol com toxina pertussis (PTX), bloqueador da subunidade Gi da proteína G para avaliar o seu envolvimento na captação de Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. Utilizou-se a toxina colérica, estimulador da proteína Gs, para avaliar o envolvimento do AMPc na captação de Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. Fez-se uso de SQ22536, inibidor da enzima adenilato ciclase, para avaliar o envolvimento dessa enzima na ação estimulante do FSH nas células de Sertoli de ratos imaturos. Os resultados foram dados como média ± SEM. Os dados da variação do potencial de membrana foram analisados pelo teste ANOVA para medidas repetidas com o pós-teste de Bonferroni. O FSH teve sua hiperpolarização inibida quando foi aplicado tolbutamida (10μM) anteriormente. O SQ22536 também aboliu a hiperpolarização causada pelo FSH. O Isoproterenol, quando aplicado isoladamente produziu uma resposta hiperpolarizante sobre o potencial de membrana, alterando de – 32,4mV ± 1,32 mV para -40,0 ± 0,78 mv, aos 60 segundos após a sua aplicação (*p<0,001) (n=6 células de Sertoli). A aplicação tópica de Tolbutamida (10 μM) bloqueou a ação do Isoproterenol (2μM), causando uma despolarização de –41,0± 0,47mV variou até -39,0 ± 2,02mV, aos 120 segundos após a aplicação do Isoproterenol (p>0,05) (n=6 células de Sertoli). A perfusão com Tolbutamida foi mais eficaz no bloqueio da resposta beta-adrenérgica, causando uma despolarização de -41,6 ±1,21 mV para -35,4 ± 0,98 mV, aos 120 segundos após a aplicação tópica do Isoproterenol (p>0,05) (n=9 células de Sertoli). A aplicação tópica de Glibenclamida (10μM), a qual é um inibidor do canal de k +ATP, bloqueou a ação do Isoproterenol (2μM), causando despolarização, demonstrando que a hiperpolarização do isoproterenol está relacionada com a abertura desses canais. A tolbutamida (10μM), quando aplicada topicamente, impediu a fase de hiperpolarização característica causada pelo FSH (4mU/mL), causando despolarização do potencial de membrana das células de Sertoli de ratos imaturos. O Isoproterenol apresentou uma resposta hiperpolarizante rápida sobre o potencial de membrana, causada, provavelmente, por uma abertura dos canais de K+ATP na membrana das células de Sertoli de testículos de ratos imaturos. PTX quando aplicada topicamente e anteriormente à aplicação de isoproterenol não impediu a hiperpolarização característica causada por isoproterenol. A ação hiperpolarizante de isoproterenol independe de proteína Gi. PTX não impede a captação de 45Ca2+ estimulada pelo isoproterenol. A toxina colérica, que estimula proteína Gs, não estimula a captação de 45Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. / Follicle-stimulating hormone (FSH) produces a dual effect on the membrane potential of Sertoli cells, with an initial rapid phase, which comprises a hyperpolarization for a period of seconds and a depolarization phase, wich occurs more slowly, within minutes. The depolarization phase involves calcium entry stimulated by FSH. Isoproterenol, an agonist of β-adrenergic receptors, induces an immediate and prolonged hyperpolarization on the membrane of Sertoli cells from immature rats. The aim of this work is to study the involvement of K+ATP channels in the hiperpolarization effect of isoproterenol on the membrane of Sertoli cells. This work also aimed to study the action of Isoproterenol on the membrane potential of Sertoli cells to better understanding the hyperpolarizing component produced by FSH in Sertoli cells, in addition to study the Ca2+ uptake stimulated by FSH and by isoproterenol. Membrane potential was recorded using isolated seminiferous tubules of testes of 15 days-old rats. The record of intracellular Sertoli cell was performed using microcapillary filled with KCl3 mmol/L coupled to an electrometer. We performed a single topical application of FSH(4mU/mL) and Isoproterenol (2μM). Then, inindividual experiments were applied topically, FSH and isoproterenol, 5 minutes after topical application of Tolbutamide (10μM) and glibenclamide(10μM), sulfonylurea a hypoglycemicaction, exercising effect closing of K+ channels ATP. The Tolbutamide (10μM) also was infused 15 minutes before application of Isoproterenol in order totest whether this would prevents ulfonylurea most significantly to the action of isoproterenol. In the technique of 45Ca2+ uptake, we used FSH and isoproterenol with pertussis toxin (PTX), blocking the G protein subunit Gi to evaluate its involvementon Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats. We used the cholera toxin, a stimulator of Gs protein, to evaluate the involvement of AMPc on Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats. SQ22536, an inhibitor of the enzyme adenylate cyclase, was used to evaluate the involvement this enzyme in the stimulatory action of FSH in Sertoli cells from immature rats. The results were given as mean ± SEM. The data of the change in membrane potential were analyzed by ANOVA for repeated measures with Bonferroni post-test. The hyperpolarization produced by FSH was inhibited when tolbutamide was applied (10μM). The SQ22536 also abolished the hyperpolarization caused by FSH. The Isoproterenol when used alone produced a hyperpolarizing response on the membrane potential , changing from -32.4mV±1.32 mV to -40.0±0.78 mV at 60 seconds after its application (*p<0.001) (n=6Sertoli cells). Topical application of Tolbutamide (10μM) blocked the action of Isoproterenol (2μM), causing a depolarization of -41.0±0.47 mV ranged up to-39.0± 2.02 mV at 120 seconds after application of Isoproterenol (p>0.05) (n=6Sertoli cells). The Tolbutamide infusion was more effective inblocking beta-adrenergic response, causing a depolarization of -41,6 ±1,21 mV to -35,4 ± 0,98 mV at 120seconds after the topical application of Isoproterenol (p>0.05) (n=9Sertoli cells). Isoproterenol produces a rapid hyperpolarization on membrane potential of Sertoli cells. This effect was blocked by tolbutamide, indicating that the activation of beta-adrenergic receptors involves opening of K+ATP channels in the membrane of Sertoli cells from immature rat testes. PTX,when applied topically prior to application of isoproterenol did not prevent the characteristic hyperpolarization caused by isoproterenol. The hyperpolarizing action of isoproterenol is independent of Gi protein. PTX does not prevent the uptake of 45Ca2+ stimulated by isoproterenol. The cholera toxin, which stimulates Gs protein, does not stimulate 45Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats.