Submitted by Socorro Pontes (socorrop@ufersa.edu.br) on 2017-05-12T15:29:10Z No. of bitstreams: 1 EricaCGP_DISSERT.pdf: 2673309 bytes, checksum: c441c049726d8b3cc5250d4dbb83b8ea (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-12T15:29:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 EricaCGP_DISSERT.pdf: 2673309 bytes, checksum: c441c049726d8b3cc5250d4dbb83b8ea (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The objective of the present thesis was to use the manipulation of oocytes enclosed in preantral follicles (MOIFOPA) as a tool for the female gametes rescue and conservation, from wild species agouti (Dasyprocta leporina). The dissertation was divided into two experimental phases. At first, it was performed solid surface vitrification (SSV) using different concentrations of cryoprotectant agents (CPAs) in which the effects of the 3 and 6 M concentrations of dimethylsufoxide (DMSO) and ethylene glycol (EG) were verified, as well as the association of both CPAs in the high concentration (6 M) under morphology, viability and apoptosis cell on the in situ PFs. A total of 865 PFs was analyzed before and after vitrification, it was observed an average of 80.7 ± 5.21% of morphologically normal follicles in the control group and after SSV, indifferent the CPA used, it was possible to preserve until 76.7% ± 5.4 OF PFs. At viability analysis, DMSO 3 M, DMSO 6 M, EG 3, EG 6 M (70.0%, 81.11%, 76.6% and 71.11%, respectively) presented similar values to the control group (79.0%). No apoptotic cells (TUNEL positive) were found before and after vitrification. At second, vitrification was performed using the association of CPAs, followed by xenografting of ovarian tissue in C57Bl/6 SCID Black mice. Through vaginal washing monitoring, was observed that 80% mice of the xeno-fresh group and 42% of the xeno-vitrified group returned to ovarian activity, confirmed by hormonal measures. Microscopically, primordial, primary and transitional follicles were observed in the grafts, and all had normal morphology for the species studied. However, major primordial and primary follicles were observed in transplants. The NORs revealed that after transplantation a significant reduction (1.66 ± 0.25) occurred when compared to the control groups (group fresh control: 7.19 ± 1.23 and xeno-fresh group: 9.10 ± 0.64). Apoptotic cells (TUNEL positive) were found only after transplantation of samples vitrified and the healthy follicles (TUNEL negative) observed in other groups (TUNEL negative). Thus, as the general conclusion, the use of MOIFOPA in agouti allowed the knowledge of aspects related to its reproductive morphology and physiology, enabling the germplasm conservation, with the possibility of germplasm bank formation, as the elucidation of mechanisms related to the PF survive and in vivo development / O objetivo do presente estudo foi utilizar a manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré antrais (MOIFOPA) como ferramenta para o resgate e conservação do uso de gametas femininos de cutias (Dasyprocta leporina). A dissertação foi dividida em duas fases experimentais. Na primeira, foi realizada a vitrificação em superfície sólida (SSV) utilizando diferentes concentrações de agentes crioprotetores (ACPs), na qual foram verificados os efeitos das concentrações de 3 e 6 M de dimetilsufoxido (DMSO) e etilenoglicol (EG), bem como a associação de ambos os ACPs na concentração maior (6 M) sob a morfologia, viabilidade e apoptose celular de folículos ovarianos pré-antrais in situ (FOPAs). Um total de 865 FOPAs foi analisado antes e após a vitrificação. No grupo controle, foi observado 80,7 ± 5,21% de FOPA morfologicamente normais. Após SSV, independentemente do ACP utilizado, foram obtidos até 76,7% ± 5,4 de FOPAS. Na análise de viabilidade, DMSO 3 M, DMSO 6 M, EG 3, EG 6 M (70,0%; 81,11%; 76,6% e 71,11%; respectivamente) apresentaram valores semelhantes de FOPAS viáveis ao grupo controle (79,0%). Na segunda fase, foi realizada a SSV utilizando a associação dos ACPs (DMSO e EG), seguido do xenotransplante de tecido ovariano de cutias em camundongas C57Bl/6 SCID. Através do monitoramento do lavado vaginal, observou-se que 80% das camundongas do grupo controle e 42% do grupo vitrificado retornaram à atividade ovariana, confirmada pela dosagem hormonal. Microscopicamente, folículos primordiais, primários, transição e secundários foram observados nos enxertos, e todos tinham morfologia normal para as espécies estudadas. No entanto, os folículos primordiais e primários foram observados em maior quantidade após transplante. As Regiões organizadoras de nucléolos (NORs) revelaram que após o transplante ocorreu uma redução significativa de NORs no grupo vitrificado-xenotranplantado (1,66 ± 0,25) quando comparados aos grupos controles (grupo controle fresco: 7,19 ± 1,23; grupo controle xenotransplantado: 9,10 ± 0,64). As células apoptóticas (TUNEL positivo) foram encontradas somente após o transplante das amostras vitrificadas e folículos saudáveis foram encontrados nos outros grupos tratado (TUNEL negativo). Assim, como conclusão geral, o uso da MOIFOPA em cutias permitiu o conhecimento de aspectos relacionados a sua morfofisiologia reprodutiva, possibilitando tanto a conservação do material genético, com a possibilidade de formação de bancos de germoplasma; e ainda a elucidação dos mecanismos relacionados à sobrevivência e ao desenvolvimento dos FOPA in vivo / 2017-05-12

CAVALLANTE, Andréa Pighinelli. Estimativa populacional de folículos pré-antrais in situ de Sotalia fluviatilis (Cetacea, Delphinidae). 2000. 67 f. : Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Engenharia de Pesca, Fortaleza-CE, 2000 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-07-11T11:44:33Z No. of bitstreams: 1 2000_dis_apcavallante.pdf: 777240 bytes, checksum: 39a347ed2388e4b8a3cbc5c7aa377fe0 (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-07-11T11:45:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2000_dis_apcavallante.pdf: 777240 bytes, checksum: 39a347ed2388e4b8a3cbc5c7aa377fe0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-11T11:45:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2000_dis_apcavallante.pdf: 777240 bytes, checksum: 39a347ed2388e4b8a3cbc5c7aa377fe0 (MD5) Previous issue date: 2000 / Tucuxi, Sotalia fluviatilis, a coastal cetacean species threatened by artisanal fishing, needs a reproductive biology study in order to manage and preserve the populations subject to mortality for antropic action. A in situ of the preantral follicles allows a better understanding of the preantral phase of the folliculogenesis, little known in cetaceans and totally unknown in S. fluviatilis. Quantitative analysis of the preantral follicle was made in ovarian of S. fluviatilis recovered on the Ceara coast between 1997-1999. The age of the studied sample varied from 0 to 23 years, being sexual maturation above 6 years. The population preantral follicular analysed, was completely degenerate, possibly because of “pos-morten” time. Even so, significant difference were observed among sexual maturation stage, whwere immature animals showed na averege of 1.162.460 follicles, while in matures animals the averege was 66.270 follicles. Due to anatomic position of the ovarian, it was observed that the left ovarian had a higher number of follicles when compared to the right one. This difference was significant only for immature animals. There wasn’t a significant difference related to weight of right and left ovarian of mature and imature sample. Number of follicles showed a negative relation with age and weight of the ovarian, although weight had a positive relation with age. These results indicate that the population follicular fo S. fluviatilis may be affected by many factors such as: reproductive stage, age, ovarian weight and anatomical position of the ovary. Quantitative data of the foliculogenisis described can be used as a parameter for future studies in vitro or in vivo of the folliculogenisis of S. fluviatilis. From this, new information about preantral follicles of S. fluviatilis can be acquired, leading to new reserch to explain the folliculogenese of preantral follicles phase of the species, contributing to a better utilization of oociterio potencial. / O boto cinza, Sotalia fluviatilis, é uma espécie de cetáceo costeira ameaçada pela pesca artesanal, sendo necessário um estudo da biologia reprodutiva, para a administração e conservação das populações que estão sujeitas à mortalidade por ação antrópica. O estudo de folículos pré-antrais in situ permite uma melhor compreensão da fase pré-antral da foliculogênese, pouco conhecida nos cetáceos em geral, e totalmente desconhecida em S. fluviatilis. A análise quantitativa de folículos pré-antrais foi realizada enm ovários de S. fluviatilis recuperados na costa do Ceará entre 1997-1999. A idade dos exemplares em estudo variou de 0 a 23 anos, com idade de maturação sexual acima de 6 anos. A população folicular pré-antral analisada, apresentou-se totalmente degenerada, possivelmente em decorrência do tempo “pós-mortem”. Ainda assim, foram observadas diferenças significativas entre os estágios de maturação sexual, onde animais imaturos apresentaram uma média de 1.162.460 folículos, enquanto os exemplares maturos apresentaram em média 66.270 folículos. Em relação a posição anatômica do ovário foi observado que, em média, o ovário esquerdo apresentou um número mais elevado de folículos quando comparado ao lado direito. Essa diferença foi significativa somente para animais imaturos. Não houve uma diferença significativa com relação ao peso do ovário direito e esquerdo dos exemplares imaturos e maturos. O número de folículos apresentou uma relação uma relação negativa com a idade e peso do ovário, embora o peso tenha apresentado uma relação positiva com a idade. Tais resultados mostraram que a população folicular de S. fluviatillis pode ser afetada por diversos fatores, entre eles estágio reprodutivo, idade, peso ovariano e posição anatômica do ovário. Os dados quantitativos da foliculogênese descrito neste trabalho poderão servir como parâmetro para futuros estudos in vivo ou in vitro da foliculogênese em S. fluviatilis. Desta forma, novas informações acerca dos folículos pré-antrais de S. fluviatilis poderão ser obtidos, gerando oportunidade para a realização de novas pesquisas, visando a elucidação da foliculogênese da fase pré-antral na espécie, o que contribuirá no futuro para um melhor aproveitamento do seu potencial oocitário.

Protocolos de sucesso para a maturação in vitro de oócitos de peixe são importantes, uma vez que é necessário para garantir uma fertilização bem sucedida, formação do zigoto, crescimento do embrião e seu completo desenvolvimento. Em algumas espécies, a eficiência deste processo ainda é muito baixa ou restrita a poucas substâncias que podem ser utilizadas. Assim, pesquisou-se a utilização de hormônios alternativos ao protocolo já existente para maturação in vitro de ovócitos de zebrafish. O objetivo foi avaliar a eficiência do extrato de hipófise de carpa (EHC), dos hormônios folículo estimulante (FSH) e luteinizante (LH) para fazer a maturação dos ovócitos estádio III de zebrafish. Os oócitos estádio III foram colocados em meio de cultivo Leibovitz modificado, suplementado com soro fetal bovino e adicionado o hormônio correspondente a seu tratamento (T1-controle; T2-16 μg/ml de EHC; T3- 32 μg/ml de EHC; T4- 48 μg/ml de EHC; T5- 64 μg/ml de EHC; T6- 80 μg/ml de EHC; T7- 0,5 μg/ml de FSH; T8- 0,5 μg/ml de LH e T9- 0,5 μg/ml de FSH e 0,5 μg/ml de LH). A taxa de maturação foi avaliada através da visualização da quebra da vesícula germinal (GVBD). Em todos os tratamentos houve maturação, embora o EHC tenha demonstrado taxas de maturação muito baixas (T2= 12,8%; T3=24,8%; T4=27%; T5=22,7%; T6=9,7%) e inferiores em relação a maior eficiência dos hormônios gonadotrópicos (T7=16%; T8=35%; T9=50%). Além disso foi possível verificar a viabilidade dos oócito através da fertilização in vitro do melhor tratamento (T9) com uma taxa de eclosão e desenvolvimento em larva de 60%. Os resultados da maturação in vitro utilizando estes indutores hormonais em oócitos estádio III de zebrafish mostraram-se promissores, e reforçam as perspectivas para o aprimoramento e uso desta técnica para produção in vitro de embriões viáveis. / Successful protocols for maturation of oocytes are important, as it is necessary for ensuring successful fertilization, zygote formation, embryo growth and full development. In some species the efficiency of in vitro maturation is still very low or is still restricted to a little amount of substances which can be used for the matter. Thus, we studied the use of alternative hormones to the existing protocol for in vitro maturation of zebrafish oocytes. The aim of this study was to evaluate the efficiency of the use of carp pituitary extract (CPE), the follicle stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH) to oocyte maturation stage III of zebrafish. Oocytes stage III were placed in modified Leibovitz culture medium, suplemented with fetal bovine serum and added to the correnponding hormone treatment (T1-control; T2-16 g / ml of CHE; T3 32 g / ml of CHE, T4 - 48 g / ml of CHE; T5- 64 g / ml of CHE; T6- 80 g / ml of CHE; T7- 0.5 g / ml of FSH, T8 0.5 mg / ml of LH and T9- 0.5 g / ml of FSH and 0.5 mg / ml LH). The maturation rate was assessed by the germinal vesicle break down (GVBD). In all cases there was maturation, though the EHC has demonstrated fairly low maturation rate (T2= 12,8%; T3=24,8%; T4=27%; T5=22,7%; T6=9,7%) and lower in relation of the high efficiency presented by the gonadotropic hormones (T7=16%; T8=35%; T9=50%). In addition it was possible to verify the viability of the oocyte through IVF of the best treatment (T9) with a result of 60% of hatching and larvae development rate. The results of maturation in turn using this hormones in stage III oocytes of zebrafish proved promising, and enhance the prospects for improvement and use of this technique for in vitro production of viable embryos.

Comparações da dinâmica ovariana entre mais de duas raças equinas, sob condições padronizadas, não são encontradas na literatura. Objetivando comparar a dinâmica folicular e luteal, foram realizados exames diários de ultrassonografia durante um intervalo interovulatório contemporâneo, em éguas de pequeno porte (grupo Mini Pony – MP; n=10), médio porte (grupo Large Pony – LP; n=9) e grande porte (grupo Brasileiro de Hipismo – BH; n=12). Concluiu-se que os três grupos diferiram quanto ao máximo diâmetro do folículo pré-ovulatório (FPO) (mm) (MP=36,15; LP=40,95; BH=46,66), diâmetro do FPO um dia antes da ovulação (mm) (MP=35,8; LP=40,55; BH=46,48) e crescimento diário médio do FPO (mm/dia) (MP=2,6; LP=3,05; BH=3,51). O grupo MP diferiu dos demais quanto ao número de folículos por onda ovulatória (MP=4,8; LP=10,11; BH=9,75), número de folículos por dia (MP=4,19; LP=10,27; BH=10,63), número de folículos maiores ou iguais a 10mm (MP=2,98; LP=5,88; BH=5,98), diâmetro do FPO à divergência (mm) (MP=22,62; LP=24,81; BH=25,58), diâmetro do segundo maior folículo à divergência (SMF) (mm) (MP=15,56; LP=21,25; BH=21,83), diferença de diâmetro entre FPO e SMF à divergência (mm) (MP=7,25; LP=3,56; BH=3,75) e área do corpo lúteo (CL) (mm2) (MP=436,1; LP=674,4; BH=720,4). Não houve diferença entre os grupos quanto à duração do ciclo (dias) (MP=21,9; LP=20,22; BH=20,58), ocorrência de divergência (MP=80%; LP=88,89%; BH=100%), dias decorridos entre a emergência do FPO e SMF (MP=0,8; LP=0,89; BH=0,92) e diferença de diâmetro entre estes na emergência (mm) (MP=0,4; LP=0,44; BH=0,5) e na divergência (mm) (MP=7,25; LP=3,56; BH=3,75); dias entre emergência e divergência (MP=5,12; LP=5,5; BH=5,5) e divergência e ovulação (MP=7,12; LP=6,62; BH=6,8), número de ondas menores (MP=0,3; LP=0,33; BH=0,42) e duração do CL (dias) (MP=12,4; LP=14,67; BH=13,92). / Comparisons of ovarian dynamics between more than two equine breeds, under standardized conditions, are not found in the literature. The objective of this study was to compare follicular and luteal dynamics during one contemporary intervulatory interval by daily ultrasonography examinations in small size mares (Mini Pony group - MP; n=10), medium size (Large Pony group - LP; n=9) and large size (Brazilian Warmblood group - BH; n=12). It was concluded that all three groups differed regarding maximum diameter of the preovulatory follicle (POF) (mm) (MP=36.15; LP=40.95; BH=46.66), maximum diameter of POF one day before ovulation (mm) (MP=35.8; LP=40.55; BH=46.48) and the mean daily growth of POF (mm / day) (MP=2.6; LP=3.05; BH=3.51). The MP group differed from LP and BH groups regarding number of follicles per ovulatory wave (MP=4.8; LP=10.11; BH=9.75), number of follicles per day (MP=4.19; LP=10, 27; BH=10.63), number of follicles equal or greater than 10mm (MP=2.98; LP=5.88; BH=5.98), diameter of POF at deviation (mm) (MP=22.62; LP=24.81; BH=25.58), diameter of second largest follicle (SLF) at deviation (MP=15.56; LP=21.25; BH=21.83), diameter difference between FPO and SLF at deviation (mm) (MP=7.25; LP=3.56; BH=3.75), corpus luteum (CL) area (mm2) (MP=436.1; LP=674.4; BH=720.4). There was no difference between groups regarding cycle length (MP=21.9; LP=20.22; BH=20.58), occurrence of deviation (MP=80%; LP=88.89%; BH=100%), days between emergence of POF and SLF (MP=0.8, LP = 0.89, BH = 0.92), and diameter difference between POF and SLF at emergence (mm) (MP=0.4; LP=0.44; BH=0.5) and at deviation (mm) (MP=7.25; LP=3.56; BH=3.75); days between emergence and deviation (MP=5.12; LP=5.5; BH=5.5), deviation and ovulation (MP=5.12; LP=6.62; BH=6.8), number of minor waves (MP = 0.3; LP = 0.33; BH = 0.42) and CL lifespan (days) (MP=12.4; LP=14.67; BH=13.92).

O zebrafish (Danio rerio) tem se destacado na pesquisa biomédica por sua homologia fisiológica e genética aos humanos. No entanto, há poucos relatos sobre a criopreservação ovariana desta espécie. Assim, pesquisamos a utilização de um recipiente de metal na vitrificação de tecido ovariano de zebrafish. O objetivo foi avaliar a sobrevivência e o desenvolvimento in vitro de folículos de zebrafish após a vitrificação de fragmentos ou ovários inteiros usando a cápsula de metal. Primeiro, testamos quatro soluções de vitrificação (VS1 – 1,5 M metanol + 4,5 M propilenoglicol; VS2 – 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO; VS3 – 1,5 M metanol + 4,5 M propilenoglicol + 0,5 M sacarose; VS4 – 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO + 0,5 M sacarose) e cinco estágios de desenvolvimento folicular utilizando o teste de coloração supravital iodeto de propídio combinado com diacetato de fluoresceína. Estes resultados mostraram que os folículos em estágio I, imaturos, apresentaram as maiores taxas de sobrevivência celular e que VS1 foi a melhor solução em termos de viabiidade. No Experimento 2, utilizou-se VS1 para vitrificar o tecido ovariano em diferentes dimensões (fragmentos ou ovários inteiros) e em dois diferentes recipientes (palheta de plástico ou cápsula de metal). Para avaliar a sobrevivência e o crescimento folicular dos folículos em estádio I, o diâmetro dos folículos foi mensurado antes e depois de cultivo in vitro por 24 horas. A morfologia folicular foi analisada por microscopia de luz após vitrificação utilizando a cápsula de metal. Os dados mostraram que a morfologia de folículos imaturos foi bem preservada após a criopreservação. A taxa de sobrevivência folicular foi maior (P <0,05) em fragmentos vitrificados, quando comparados com a vitrificação de ovários inteiros. Não houve diferenças significativas na sobrevivência e crescimento folicular entre os dois recipientes de vitrificação, palheta de plástico ou cápsula de metal. No entanto, a cápsula de metal diminui os riscos de contaminação, pois é hermeticamente fechada evitando contato com nitrogênio líquido e poder ser esterilizada, em vista que é manufaturada em aço inoxidável. Por essas razões, acreditamos que a cápsula de metal tem um uso potencial em reprodução humana para a vitrificação em grau clínico de tecido ovariano. / Zebrafish (Danio rerio) has excelled in biomedical research for its physiological and genetic homology to humans. However, there are few reports on ovarian cryopreservation of this specie. Thus, we studied the use of a metal capsule to vitrify zebrafish ovarian tissue. The aim of this study was to assess the survival and in vitro development of zebrafish follicles after vitrification of fragmented or whole ovaries using the metal capsule. First, we tested four vitrification solutions (VS1 - 1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol; VS2 - 1.5 M methanol + 5.5 M Me2SO; VS3 - 1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol + 0.5 M sucrose; VS4 - 1.5 M methanol + 5.5 M Me2SO + 0.5 M sucrose) and five follicular developmental stages using fluorescein diacetate and propidium iodide supravital staining test. These results showed that immature follicles, stage one, presented the highest survival rates and VS1 the best vitrification solution in terms of viability. In Experiment 2, we used VS1 to vitrify ovarian tissue in different dimensions (fragments or whole ovaries) and tested two different carriers (plastic straw or metal capsule). To evaluate follicular survival and growth of stage I, we measured follicle diameter before and after twenty-four-hour in vitro culture. The follicular morphology was analyzed by light microscopy after vitrification using the metal capsule. Data showed that the immature follicles morphology was well preserved after cryopreservation. Follicular survival rate was higher (P<0.05) on vitrified fragments, when compared to whole ovaries. There were no significant differences on follicular survival and growth between the two vitrification devices, plastic straw or metal capsule. However, the metal capsule being tightly sealed and manufactured in stainless steel avoids contact with liquid nitrogen and can be sterilized reducing contamination risk. These reasons lead us to believe that the metal capsule has a potential use in human reproduction for the clinical grade vitrification of ovarian tissue.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-22Bitstream added on 2014-06-13T19:45:12Z : No. of bitstreams: 1 bezerra_mb_dr_jabo.pdf: 930909 bytes, checksum: f1899f875197e48c17afaf824f63cfca (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Objetivou-se testar diferentes protocolos de cultivo in vitro e in vivo de folículos ovarianos pré-antrais de fetos bovinos. Para tanto, um total de 41 ovários de fetos bovinos foram obtidos em matadouro, transportados e utilizados para o cultivo in vitro (n=20) e para o xenotransplante (n=21). Após processados no laboratório em fragmentos entre 0,5 e 1 mm3 foram encaminhados para os cultivos O cultivo in vitro baseou-se em protocolo bem sucedido de cultivo de FOPA em caprinos e testou diferentes fontes de macromoléculas e a utilização do azul de tripan na viabilidade dos tecidos cultivados a uma atmosfera controlada de 5% CO2 em ar, a 38,5°C e nutridos com dMEM (300 mOsm/L, pH 7,2) suplementado com antibióticos, ITS, piruvato de sódio, glutamina, hipoxantina, dAMPc, bFSH e IGF-I. A depender do tratamento, foi adicionado BSA (0,1%) SFB (10%) ou PVA (1%). O cultivo in vivo de FOPA foi executado por xenotransplante sob a cápsula renal num total de 65 camundongas imunodeficientes. Desenvolveu-se uma técnica de biopsia e verificou-se o efeito do tempo de transplante (30, 60 e 30 e 60 dias após o transplante) sobre a percentagem e a viabilidade de FOPA bem como a possível presença de folículos antrais. Num segundo momento, 32 receptoras receberam estímulo hormonal de 10 UI de eCG (n=18) e 10 UI r-hFSH (n=14). Os resultados mostraram que o cultivo com PVA apresentou FOPA normais em percentagem semelhante aos cultivos com BSA e PVA. Quanto ao cultivo por xenotransplante, observou-se o crescimento sucessivo de FOPA até estádios antrais ao longo do tempo de transplante (> 30 dias). O resultado das estimulações exógenas apresentou folículos antrais com oócitos que apresentaram o cumulus expandido em 2/5 (40%) dos oócitos selecionados para MIV de cada um dos tratamentos propostos. Concluindo, FOPA oriundos de fetos bovinos podem ser cultivados por pelo menos 8 dias em PVA... / This study aimed to evaluate different protocols of in vitro and in vivo preantral follicles (PFs) culture from bovine fetus. Thus, a total of 41 fetal bovine ovaries, from a slaughterhouse, were collected and transported at laboratory for in vitro culture (n=20) and for xenotransplantation (n=21), after processing into small cortical pieces measuring between 0,5 and 1mm3 the slices were cultured. The in vitro culture was based on well successful protocol of preantral follicles in caprine and tested different sources of macromolecules and trypan blue viability of cultured tissues cultured at controlled atmosphere (5%CO2 in air, 39°C). The culture medium used was dMEM (300 mOsm/L, pH 7, 2) supplemented with antibiotics, ITS, sodium pyruvate, glutamine, hypoxanthine, dAMPc, bFSH, and IGF-I. Depending of treatment, was added BSA (0,1%), FCS (10%) or PVA (1%). In vivo culture of preantral follicles was carried out by xenotransplantation under renal capsule of immunodeficient females mice (total of 65) that were submitted to a biopsy technique previously developed for tissue collection and to verify the effectiveness of time of transplantation (30, 60 and 30 and 60 days post surgery) under percentage and viability as well as putative growth of PFs to antral follicles. At second stage, 32 recipient mice were submitted to hormonal stimuli with 10 IU of eCG (n=18) and 10 IU of r-hFSH (n=14). The results showed that PVA culture presented normally PF in similar distribution when compared with BSA and PVA culture. Regarding xenotransplantation, successive growth of PF until antral stages was observed belong time of transplantation. Exogenous stimulation presented oocytes with expanded cumulus in 2/5 (40%) of selected oocytes for IVM from each treatment. Conclusively PFs from fetal bovine ovaries can be cultured at PVA at least 8 days and grows until antral stages after xenotransplantation procedures... (Complete abstract click electronic access below)

Protocolos de sucesso para a maturação in vitro de oócitos de peixe são importantes, uma vez que é necessário para garantir uma fertilização bem sucedida, formação do zigoto, crescimento do embrião e seu completo desenvolvimento. Em algumas espécies, a eficiência deste processo ainda é muito baixa ou restrita a poucas substâncias que podem ser utilizadas. Assim, pesquisou-se a utilização de hormônios alternativos ao protocolo já existente para maturação in vitro de ovócitos de zebrafish. O objetivo foi avaliar a eficiência do extrato de hipófise de carpa (EHC), dos hormônios folículo estimulante (FSH) e luteinizante (LH) para fazer a maturação dos ovócitos estádio III de zebrafish. Os oócitos estádio III foram colocados em meio de cultivo Leibovitz modificado, suplementado com soro fetal bovino e adicionado o hormônio correspondente a seu tratamento (T1-controle; T2-16 μg/ml de EHC; T3- 32 μg/ml de EHC; T4- 48 μg/ml de EHC; T5- 64 μg/ml de EHC; T6- 80 μg/ml de EHC; T7- 0,5 μg/ml de FSH; T8- 0,5 μg/ml de LH e T9- 0,5 μg/ml de FSH e 0,5 μg/ml de LH). A taxa de maturação foi avaliada através da visualização da quebra da vesícula germinal (GVBD). Em todos os tratamentos houve maturação, embora o EHC tenha demonstrado taxas de maturação muito baixas (T2= 12,8%; T3=24,8%; T4=27%; T5=22,7%; T6=9,7%) e inferiores em relação a maior eficiência dos hormônios gonadotrópicos (T7=16%; T8=35%; T9=50%). Além disso foi possível verificar a viabilidade dos oócito através da fertilização in vitro do melhor tratamento (T9) com uma taxa de eclosão e desenvolvimento em larva de 60%. Os resultados da maturação in vitro utilizando estes indutores hormonais em oócitos estádio III de zebrafish mostraram-se promissores, e reforçam as perspectivas para o aprimoramento e uso desta técnica para produção in vitro de embriões viáveis. / Successful protocols for maturation of oocytes are important, as it is necessary for ensuring successful fertilization, zygote formation, embryo growth and full development. In some species the efficiency of in vitro maturation is still very low or is still restricted to a little amount of substances which can be used for the matter. Thus, we studied the use of alternative hormones to the existing protocol for in vitro maturation of zebrafish oocytes. The aim of this study was to evaluate the efficiency of the use of carp pituitary extract (CPE), the follicle stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH) to oocyte maturation stage III of zebrafish. Oocytes stage III were placed in modified Leibovitz culture medium, suplemented with fetal bovine serum and added to the correnponding hormone treatment (T1-control; T2-16 g / ml of CHE; T3 32 g / ml of CHE, T4 - 48 g / ml of CHE; T5- 64 g / ml of CHE; T6- 80 g / ml of CHE; T7- 0.5 g / ml of FSH, T8 0.5 mg / ml of LH and T9- 0.5 g / ml of FSH and 0.5 mg / ml LH). The maturation rate was assessed by the germinal vesicle break down (GVBD). In all cases there was maturation, though the EHC has demonstrated fairly low maturation rate (T2= 12,8%; T3=24,8%; T4=27%; T5=22,7%; T6=9,7%) and lower in relation of the high efficiency presented by the gonadotropic hormones (T7=16%; T8=35%; T9=50%). In addition it was possible to verify the viability of the oocyte through IVF of the best treatment (T9) with a result of 60% of hatching and larvae development rate. The results of maturation in turn using this hormones in stage III oocytes of zebrafish proved promising, and enhance the prospects for improvement and use of this technique for in vitro production of viable embryos.

O zebrafish (Danio rerio) tem se destacado na pesquisa biomédica por sua homologia fisiológica e genética aos humanos. No entanto, há poucos relatos sobre a criopreservação ovariana desta espécie. Assim, pesquisamos a utilização de um recipiente de metal na vitrificação de tecido ovariano de zebrafish. O objetivo foi avaliar a sobrevivência e o desenvolvimento in vitro de folículos de zebrafish após a vitrificação de fragmentos ou ovários inteiros usando a cápsula de metal. Primeiro, testamos quatro soluções de vitrificação (VS1 – 1,5 M metanol + 4,5 M propilenoglicol; VS2 – 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO; VS3 – 1,5 M metanol + 4,5 M propilenoglicol + 0,5 M sacarose; VS4 – 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO + 0,5 M sacarose) e cinco estágios de desenvolvimento folicular utilizando o teste de coloração supravital iodeto de propídio combinado com diacetato de fluoresceína. Estes resultados mostraram que os folículos em estágio I, imaturos, apresentaram as maiores taxas de sobrevivência celular e que VS1 foi a melhor solução em termos de viabiidade. No Experimento 2, utilizou-se VS1 para vitrificar o tecido ovariano em diferentes dimensões (fragmentos ou ovários inteiros) e em dois diferentes recipientes (palheta de plástico ou cápsula de metal). Para avaliar a sobrevivência e o crescimento folicular dos folículos em estádio I, o diâmetro dos folículos foi mensurado antes e depois de cultivo in vitro por 24 horas. A morfologia folicular foi analisada por microscopia de luz após vitrificação utilizando a cápsula de metal. Os dados mostraram que a morfologia de folículos imaturos foi bem preservada após a criopreservação. A taxa de sobrevivência folicular foi maior (P <0,05) em fragmentos vitrificados, quando comparados com a vitrificação de ovários inteiros. Não houve diferenças significativas na sobrevivência e crescimento folicular entre os dois recipientes de vitrificação, palheta de plástico ou cápsula de metal. No entanto, a cápsula de metal diminui os riscos de contaminação, pois é hermeticamente fechada evitando contato com nitrogênio líquido e poder ser esterilizada, em vista que é manufaturada em aço inoxidável. Por essas razões, acreditamos que a cápsula de metal tem um uso potencial em reprodução humana para a vitrificação em grau clínico de tecido ovariano. / Zebrafish (Danio rerio) has excelled in biomedical research for its physiological and genetic homology to humans. However, there are few reports on ovarian cryopreservation of this specie. Thus, we studied the use of a metal capsule to vitrify zebrafish ovarian tissue. The aim of this study was to assess the survival and in vitro development of zebrafish follicles after vitrification of fragmented or whole ovaries using the metal capsule. First, we tested four vitrification solutions (VS1 - 1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol; VS2 - 1.5 M methanol + 5.5 M Me2SO; VS3 - 1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol + 0.5 M sucrose; VS4 - 1.5 M methanol + 5.5 M Me2SO + 0.5 M sucrose) and five follicular developmental stages using fluorescein diacetate and propidium iodide supravital staining test. These results showed that immature follicles, stage one, presented the highest survival rates and VS1 the best vitrification solution in terms of viability. In Experiment 2, we used VS1 to vitrify ovarian tissue in different dimensions (fragments or whole ovaries) and tested two different carriers (plastic straw or metal capsule). To evaluate follicular survival and growth of stage I, we measured follicle diameter before and after twenty-four-hour in vitro culture. The follicular morphology was analyzed by light microscopy after vitrification using the metal capsule. Data showed that the immature follicles morphology was well preserved after cryopreservation. Follicular survival rate was higher (P<0.05) on vitrified fragments, when compared to whole ovaries. There were no significant differences on follicular survival and growth between the two vitrification devices, plastic straw or metal capsule. However, the metal capsule being tightly sealed and manufactured in stainless steel avoids contact with liquid nitrogen and can be sterilized reducing contamination risk. These reasons lead us to believe that the metal capsule has a potential use in human reproduction for the clinical grade vitrification of ovarian tissue.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Os objetivos deste estudo foram investigar o efeito de diferentes concentraÃÃes de jacalina e da interaÃÃo de jacalina e FSH sobre a sobrevivÃncia, ativaÃÃo e expressÃo gÃnica em folÃculos primordiais caprinos cultivados in vitro. Para isto, os fragmentos do cÃrtex ovariano foram cultivados em Meio Essencial MÃnimo (MEM) suplementado com diferentes concentraÃÃes de jacalina (0, 10, 25, 50 e 100 &#956;g/mL - experimento I), por um e seis dias. ApÃs o tÃrmino do perÃodo de cultivo, os fragmentos de cÃrtex ovariano foram fixados para histologia clÃssica. Em seguida, avaliou-se a percentagem de folÃculos primordiais ou em desenvolvimento no controle nÃo cultivado e no tecido ovariano cultivado nos diferentes tratamentos. ApÃs a determinaÃÃo da concentraÃÃo de jacalina mais eficiente (50 &#956;g/mL), realizou-se o cultivo de fragmentos de cÃrtex ovariano em MEM suplementado com a jacalina (50 &#956;g/mL), FSH (50 ng/mL) ou ambos (experimento II). ApÃs 6 dias de cultivo, os fragmentos ovarianos foram fixados para histologia clÃssica. AlÃm disso, para cada tratamento, foram coletadas amostras de tecido para avaliar o perfil de expressÃo de RNAs mensageiros para BMP-15, KL, c-kit, GDF-9 e PCNA em folÃculos ovarianos caprinos cultivado in vitro por 6 dias. Os resultados demonstraram que apÃs seis dias de cultivo, a presenÃa de 50 &#956;g/mL de jacalina no meio de cultivo promoveu um aumento de folÃculos morfologicamente normais, bem como uma reduÃÃo da percentagem de folÃculos primordiais e aumento de folÃculos em desenvolvimento, quando comparado ao meio controle. No experimento II, demonstrou-se que jacalina ou FSH estimulam a ativaÃÃo dos folÃculos e contribuem para a manutenÃÃo da viabilidade, mas nÃo foi observada uma interaÃÃo positiva entres essas duas substÃncias. A expressÃo de RNAm para a BMP-15 e KL apÃs o cultivo in vitro de fragmentos de ovÃrio nos diferentes tratamentos por 6 dias nÃo foi alterada. No entanto, a presenÃa de FSH aumentou os nÃveis de RNAm para o c-kit e para o PCNA, enquanto que o GDF-9 teve sua expressÃo reduzida em meio suplementado com jacalina. Em conclusÃo, jacalina e FSH foram capazes de promover a sobrevivÃncia e ativaÃÃo de folÃculos primordiais caprinos apÃs 6 dias de cultivo. A presenÃa de FSH aumentou a expressÃo do RNAm para PCNA e c-kit, enquanto que a presenÃa da jacalina reduziu a expressÃo do GDF-9. / The aims of this study were to investigate the effect of different concentrations of jacalin and the interaction of jacalin and FSH on survival, activation and gene expression of goat primordial follicles cultured in vitro. For this, fragments of ovarian cortex were cultured in Minimum Essential Medium (MEM) supplemented with different concentrations of jacalin (0, 10, 25, 50 and 100 mg/mL - experiment I) for one and six days. After the end of cultured period, the fragments of ovarian cortex were fixed for histology. Then, the percentage of primordial follicles in uncultured or cultured ovarian tissue in different treatments were evaluated. After determining the most effective concentration of jacalin (50 &#956;g/mL), ovarian cortex fragments were cultured in MEM supplemented with jacalin (50 &#956;g/ml), FSH (50 ng/ml) or both (experiment II). After 6 days of culture, the ovarian fragments were fixed for histology. Furthermore, for each treatment, tissue samples were collected to evaluate the expression profile of mRNA for c-kit, KL, GDF-9, BMP-15 and PCNA in goats ovarian follicles cultured in vitro for 6 days. The results showed that after six days of culture, the presence of 50 &#956;g/ml jacalin in culture medium increased the percentage of normal follicles, and promoted a reduction in the percentage of primordial follicles and increase of developing follicles, when compared to control medium. In experiment II, jacalin or FSH stimulated primordial follicle activation and contributed to maintain follicle viability, but there was no positive interaction between these two substances. The levels of mRNA for BMP-15 and KL after in vitro culture of ovarian fragments in different treatments was not altered. However, the presence of FSH increased levels of mRNA for c-kit and PCNA, while the GDF-9 expression was reduced in medium supplemented with jacalin. In conclusion, jacalin and FSH were able to promote the survival and activation of goat primordial follicles after 6 days of culture. The presence of FSH increased expression mRNA of PCNA and c-kit, while the presence of jacalin reduced the expression of GDF-9.

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / O boto cinza, Sotalia fluviatilis, à uma espÃcie de cetÃceo costeira ameaÃada pela pesca artesanal, sendo necessÃrio um estudo da biologia reprodutiva, para a administraÃÃo e conservaÃÃo das populaÃÃes que estÃo sujeitas à mortalidade por aÃÃo antrÃpica. O estudo de folÃculos prÃ-antrais in situ permite uma melhor compreensÃo da fase prÃ-antral da foliculogÃnese, pouco conhecida nos cetÃceos em geral, e totalmente desconhecida em S. fluviatilis. A anÃlise quantitativa de folÃculos prÃ-antrais foi realizada enm ovÃrios de S. fluviatilis recuperados na costa do Cearà entre 1997-1999. A idade dos exemplares em estudo variou de 0 a 23 anos, com idade de maturaÃÃo sexual acima de 6 anos. A populaÃÃo folicular prÃ-antral analisada, apresentou-se totalmente degenerada, possivelmente em decorrÃncia do tempo âpÃs-mortemâ. Ainda assim, foram observadas diferenÃas significativas entre os estÃgios de maturaÃÃo sexual, onde animais imaturos apresentaram uma mÃdia de 1.162.460 folÃculos, enquanto os exemplares maturos apresentaram em mÃdia 66.270 folÃculos. Em relaÃÃo a posiÃÃo anatÃmica do ovÃrio foi observado que, em mÃdia, o ovÃrio esquerdo apresentou um nÃmero mais elevado de folÃculos quando comparado ao lado direito. Essa diferenÃa foi significativa somente para animais imaturos. NÃo houve uma diferenÃa significativa com relaÃÃo ao peso do ovÃrio direito e esquerdo dos exemplares imaturos e maturos. O nÃmero de folÃculos apresentou uma relaÃÃo uma relaÃÃo negativa com a idade e peso do ovÃrio, embora o peso tenha apresentado uma relaÃÃo positiva com a idade. Tais resultados mostraram que a populaÃÃo folicular de S. fluviatillis pode ser afetada por diversos fatores, entre eles estÃgio reprodutivo, idade, peso ovariano e posiÃÃo anatÃmica do ovÃrio. Os dados quantitativos da foliculogÃnese descrito neste trabalho poderÃo servir como parÃmetro para futuros estudos in vivo ou in vitro da foliculogÃnese em S. fluviatilis. Desta forma, novas informaÃÃes acerca dos folÃculos prÃ-antrais de S. fluviatilis poderÃo ser obtidos, gerando oportunidade para a realizaÃÃo de novas pesquisas, visando a elucidaÃÃo da foliculogÃnese da fase prÃ-antral na espÃcie, o que contribuirà no futuro para um melhor aproveitamento do seu potencial oocitÃrio. / Tucuxi, Sotalia fluviatilis, a coastal cetacean species threatened by artisanal fishing, needs a reproductive biology study in order to manage and preserve the populations subject to mortality for antropic action. A in situ of the preantral follicles allows a better understanding of the preantral phase of the folliculogenesis, little known in cetaceans and totally unknown in S. fluviatilis. Quantitative analysis of the preantral follicle was made in ovarian of S. fluviatilis recovered on the Ceara coast between 1997-1999. The age of the studied sample varied from 0 to 23 years, being sexual maturation above 6 years. The population preantral follicular analysed, was completely degenerate, possibly because of âpos-mortenâ time. Even so, significant difference were observed among sexual maturation stage, whwere immature animals showed na averege of 1.162.460 follicles, while in matures animals the averege was 66.270 follicles. Due to anatomic position of the ovarian, it was observed that the left ovarian had a higher number of follicles when compared to the right one. This difference was significant only for immature animals. There wasnât a significant difference related to weight of right and left ovarian of mature and imature sample. Number of follicles showed a negative relation with age and weight of the ovarian, although weight had a positive relation with age. These results indicate that the population follicular fo S. fluviatilis may be affected by many factors such as: reproductive stage, age, ovarian weight and anatomical position of the ovary. Quantitative data of the foliculogenisis described can be used as a parameter for future studies in vitro or in vivo of the folliculogenisis of S. fluviatilis. From this, new information about preantral follicles of S. fluviatilis can be acquired, leading to new reserch to explain the folliculogenese of preantral follicles phase of the species, contributing to a better utilization of oociterio potencial.