This thesis aims to contribute to the knowledge of the regulation and function of the natriuretic peptide (NP) system during follicular dominance, ovulation, oocyte meiosis resumption and cumulus cells expansion in cattle. In the first study, the NP system was characterized in bovine COC. Moreover, NPPA and NPPC increased cGMP levels in cumulus cells and oocyte after 3 hours of culture, preventing the increase of cAMP in oocyte in the presence of forskolin. In the second study, using in vivo experimental models, none of the three NPs were detected in the granulosa cells during follicular deviation in cattle. However, NPR-3 is highly expressed at the expected time of follicular deviation, and all three NP receptors are expressed in granulosa cells of the dominant follicle. FSH injection maintained the expression of the three NP receptors after follicular deviation in the largest and second largest follicles. However, only NPR-1 mRNA decreased after inhibition of estradiol receptors by intrafollicular injection of fulvestrant. In the granulosa cells of pre ovulatory follicles, only NPPB mRNA was not detected. Nevertheless, after the administration of a GnRH analog, NPPC mRNA expression increased within 3 and 6 hours and NPR-3 mRNA gradually decreased after 3 hours. NPPA and NPR-2 mRNA was not regulated by GnRH, but NPR-1 mRNA increased at 24 hours after GnRH. In the third study, abundance of mRNA for NPR-1, NPR-2 and NPR-3 was not altered by LH and/or AG1478 (EGFr inhibitor) after 6 hours of culture in vitro. Also, LH stimulated NPPC mRNA expression and AG1478 prevented this increase in granulosa cultured in vitro. To confirm the in vitro results, was used an in vivo model and observed that the NPPC mRNA expression increased and NPR-3 mRNA decreased in granulosa cells after 6 hours of GnRH challenge. However, intrafollicular injection of AG1478 prevented the effect of GnRH on NPPC and NPR-3 mRNA expression. In addition, it we obseved that ANP in association with LH stimulated COX2 expression in comparison with LH alone or absence of this gonadotropin. It was observed that the EGFr blockade in vivo did not prevent ovulation in cattle. In the fourth study, it was observed that NPR-3 mRNA expression decreases in bovine cumulus cells after treatment of COCs with FSH or FSH+LH via EGFr. Forskolin, an adenylate cyclase stimulator, also decreased NPR-3 mRNA expression in cumulus cells. Expression of NPR-1 mRNA was very low in bovine cumulus cells and NPR-2 mRNA was not regulated in the proposed treatments. In addition, it was observed that the activation of NPR-3 by a specific agonist (cANP4-23) did not interfere in bovine oocyte nuclear maturation, but it inhibited the complete expansion of cumulus cells FSH+LH-stimulated. Additionally, the association of cANP4-23 with CNP further decreased cumulus cell expansion. / Esta tese tem como objetivo contribuir para o conhecimento da regulação e função do sistema dos peptídeos natriuréticos (NP) durante a dominância folicular, ovulação, retomada da meiose oocitária e expansão das células do cumulus em bovinos. No primeiro estudo, caracterizou-se o sistema NP no CCO de bovino e foi demonstrado que o NPPA e o NPPC aumentam os níveis de cGMP no cumulus e no oócito após 3 horas de cultivo, impedindo o aumento de cAMP no oócito na presença de forskolin. No segundo estudo, utilizando modelos experimentais in vivo, os três NPs não foram detectados nas células da granulosa durante a divergência folicular em bovinos. Contudo, demonstrou-se que o NPR-3 apresenta maior expressão no momento esperado da divergência folicular, sendo que após este momento os três receptores NPs apresentavam alta expressão nas células da granulosa do folículo dominante. A administração de FSH manteve a expressão dos três receptores NPs após a divergência folicular no maior e segundo maior folículo. Porém, somente a expressão do NPR-1 diminui após a inibição dos receptores de estradiol pela injeção intrafolicular de fulvestrant. Nas células da granulosa de folículos pré ovulatórios, somente o NPPB não foi detectado. De modo que, após a administração de um análogo de GnRH, a expressão de NPPC aumentou em 3 e 6 horas e a de NPR-3 gradualmente diminuiu após 3 horas. NPPA e NPR-2 não foram regulados pelo GnRH, e o NPR-1 teve a expressão aumentada somente 24 horas após o GnRH. No terceiro estudo, a abundância de mRNA para NPR-1, NPR-2 e NPR- 3 nas células da granulosa não foi alterada por LH e/ou por AG1478 (inibidor do EGFr) após 6 horas de cultivo in vitro. Também em cultivo in vitro de células da granulosa, o LH estimulou a expressão de NPPC, sendo que o AG1478 impediu este aumento. Como forma de comprovar esses resultados in vitro, utilizamos um modelo in vivo e observamos que a expressão do NPPC aumentou e a do NPR-3 diminuiu após 6 horas do desafio com GnRH, nas células da granulosa. De maneira que, a injeção intrafolicular de AG1478 preveniu o efeito do GnRH sobre a expressão do NPPC e NPR-3. Além disso, foi demonstrado que o ANP em associação com o LH estimulou a expressão de COX2 em comparação com LH isoladamente ou ausência desta gonadotrofina. Também foi demonstrado que o bloqueio do EGFr in vivo não foi suficiente para bloquear a ovulação em bovinos. No quarto estudo, foi observado que a expressão do NPR-3 diminui nas células do cumulus pelo tratamento dos CCOs com FSH ou FSH+LH via EGFr em bovinos. Forskolin (estimulador adenilato ciclase) também induziu a diminuição da expressão do NPR-3. A expressão do NPR-1 foi muito baixa no cumulus de bovino e o NPR-2 não apresentou regulação nos tratamentos propostos. Além disso, foi observado que a ativação do NPR-3 por um agonista específico (cANP4-23) não interferiu na maturação nuclear oocitária em bovinos, porém, inibiu a completa expansão das células do cumulus estimulada por FSH+LH. De maneira que, a associação do cANP4-23 com CNP potencializou a inibição da expansão das células do cumulus.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Transvaginal ultrasound-guided follicle aspiration is a non-invasive procedure for oocyte recovery from live animals. In equine medicine there are a few studies about this technique, so there is lack of information. Therefore, to evaluate the effect of follicular aspiration on subsequent fertility in mares, two experiments were conducted using an ultrasound with a setorial probe (5.0MHz). On the first experiment, fifteen Criollo mares were not aspirated and fifteen were assigned to one of three groups according to the diameter of the aspirated follicle: 25-29mm (n=4; Group 1); 30-34mm (n=6; Group 2) or > 35mm (n=5; Group 3), all of them in oestrus. On the second experiment, the follicular aspiration was performed in twenty five mares during dioestrus and thirty one were used as control mares. The number of follicles aspirated was between 4 and 8 and all visualized follicles were aspirated. Follicle aspiration was performed when at least four follicles (> 5mm) were present on both ovaries. In the Experiment I, the pregnancy rates were 75.0% (Group 1), 83.3% (Group 2), 60.0% (Group 3), and 73.3% (Group 4 - Control). In the Experiment II, pregnancy rates were 76.0% in aspirated group and 77.4% in control group. On both experiments, pregnancy rates were similar in treated and control mares (P>0.05). So far the study indicated that next cycle fertility was not affected by the follicular aspiration. / A aspiração folicular transvaginal é um método não invasivo de obter oócitos de animais vivos. Devido à quase inexistência de estudos relacionados à técnica, na espécie eqüina ainda não se conhece bem seus efeitos sobre a fertilidade. Para avaliar o efeito da aspiração folicular sobre a fertilidade de éguas no ciclo subseqüente, foram realizados dois experimentos utilizando um ultra-som de 5,0MHz com transdutor setorial. No primeiro experimento, quinze éguas Crioulas serviram como controle e não foram aspiradas e outras quinze foram distribuídas em três grupos, de acordo com o tamanho do folículo aspirado: 25-29mm (n=4; Grupo 1); 30-34mm (n=6; Grupo2) ou > 35mm (n=5; Grupo 3), todas na fase do estro. No segundo experimento, vinte e cinco éguas foram aspiradas durante o diestro e trinta e uma serviram como éguas-controle, não sendo aspiradas. O número de folículos aspirados por ovário variou de quatro a oito. Todos os folículos visualizados no monitor foram aspirados. A escolha do dia da aspiração foi determinada quando as éguas apresentaram acima de quatro folículos com diâmetro superior à 5mm em cada ovário. No primeiro experimento, as taxas de prenhez foram: 75,0% (Grupo 1), 83,3% (Grupo 2), 60,0% (Grupo 3) e 73,3% (Grupo 4 - Controle). No Experimento II, o grupo de éguas com folículos aspirados apresentou porcentagem de gestação de 76,0% e o grupo controle 77,4%. Nos dois experimentos, a taxa de prenhez das éguas controle e das que foram aspiradas foi similar (P>0,05). Esta pesquisa indica que a fertilidade das éguas no primeiro ciclo pós-aspiração não foi afetada pela técnica.

Resumo: Vários produtos à base de GnRH são efetivos em protocolos de Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF). Entretanto, o Acetato de Fertirelina é um análogo deste hormônio cujas informações sobre sua ação na dinâmica folicular dos bovinos são poucas, principalmente nas condições brasileiras. Este trabalho teve como objetivo comparar a eficiência de duas doses de Acetato de Fertirelina para sincronização da emergência da onda de desenvolvimento folicular e ovulação, em vacas leiteiras submetidas ao protocolo "Ovsynch". Utilizaram-se 77 vacas, a partir dos 60 dias pós-parto e escore corporal entre 2,5-4,0. Os animais apresentavam população folicular e corpo lúteo (CL) característico (Classe 1) ou ausência de CL, porém presença de pelo menos um folículo com diâmetro >10mm (Classe 2). As fêmeas foram distribuídas aleatoriamente em quatro tratamentos. Em conclusão, as concentrações séricas de progesterona e estradiol, taxas de sincronização, ovulação e prenhez demonstraram que o Acetato de Fertirelina foi eficiente em provocar a emergência da onda folicular e induzir a ovulação, nas doses de 50 ou 100mg, sugerindo que doses de 50mg de Fertirelina podem ser indicadas sem comprometimento nos resultados finais do programa. / Abstract: Many similar products to GnRH are effective in protocols of fixed timed artificial insemination (FTAI). However, Fertirelin Acetate is an analog of this hormone whose information about action in the bovine follicular dynamics is inconsistent, mainly in brazilian conditions. Therefore, the objective of this work was to compare the efficiency of two doses of Fertirelin used for synchronization of follicular wave emergence and ovulation, in dairy cows submitted to "Ovsynch" protocol. Seventy seven lactating dairy cows, on over of 60 days postpartum and body score of 2.5 to 4.0. The animals presenting a reasonable number of follicles either a presence of CL (group 1) or without CL but at last =10 mm follicles (group 2). The females were randomly distributed in four treatments. The pregnancy rates were also similar (P>0.05) with mean of 28.37%. In conclusion, Progesterone and Estradiol concentrations, follicular wave synchronization, induction of ovulation and pregnant rates demonstrate that Fertirelin was efficient in inducing a new follicular wave emergency, as well as the induction of the ovulation at the end of the protocol, using the dose of either 50mg or 100 mg, suggesting that 50mg of Fertirelin can be useful without compromising the final results. / Orientador: Eunice Oba / Coorientador: Carlos Antonio de Carvalho Fernandes / Banca: Gilson Toniollo / Banca: Alício Martins Júnior / Banca: Maria Inêz Lenz Souza / Doutor

Atualmente, o Brasil é o segundo maior exportador de carne bovina e o sexto exportador de leite no mundo. Visando melhorar a produtividade da bovinocultura, torna-se importante a aplicação de programas sanitários adequados e eficientes. As doenças virais são preocupações constantes em qualquer programa de sanidade, devido aos grandes prejuízos econômicos que causam e o seu diagnóstico correto depende de técnicas laboratoriais eficientes. O gênero Pestivirus, da família Flaviviridae, possui três espécies reconhecidas que podem infectar bovinos: o vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), o BVDV-2 e o vírus da doença da fronteira (BDV), além de uma espécie atípica proposta como BVDV-3. Causam principalmente distúrbios respiratórios, reprodutivos e digestivos em bovinos, levando a queda de índices de produção. Os objetivos do presente trabalho foram: descrever o uso de uma técnica modificada de detecção de agentes virais que possam estar presentes em insumos utilizados na reprodução assistida e descrever a caracterização patológica e análise filogenética de pestivírus detectados em um surto da doença, sendo os dados apresentados sob a forma de dois artigos. No primeiro, pools de líquidos foliculares colhidos durante a punção ovariana de vacas para coleta de oócitos para produção in vitro de embriões foram selecionados. As amostras foram analisadas para a detecção de BVDV, herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) por isolamento viral, RT-PCR e nested PCR, sendo utilizados dois protocolos de extração de DNA e RNA: um convencional e o outro com adição de etapas pré-extração de ácido nucleico, no intuito de reduzir possíveis inibidores de RT-PCR e PCR presentes nas amostras. A utilização da técnica de pré-extração permitiu detectar um maior número de amostras positivas. No segundo trabalho, foi descrito um surto de diarreia viral bovina em um rebanho que foi testado por imunohistoquímica, ELISA, isolamento viral, RT-PCR e sequenciamento de três regiões do genoma. Foram obtidas quatro amostras distintas de BVDV-3 e as principais alterações clinicas foram encontradas nos sistemas digestivo e respiratório, mas lesões de pele e opacidade de córnea também foram observadas. Os resultados encontrados nos trabalhos realizados reforçam a necessidade da verificação quanto à presença de patógenos em materiais biológicos utilizados na reprodução assistida utilizando técnicas sensíveis e que a doença causada por BVDV-3 em bovinos é indistinguível clinicamente das causadas por outros pestivírus, sugerindo que pestivírus atípicos podem estar subdiagnosticados nos rebanhos brasileiros. / Currently, Brazil is the second largest beef and the sixth milk exporter worldwide. To improve the livestock productivity, it becomes important the applying of appropriate and efficient health programs. Viral diseases are constant concerns on any health program due to major economic losses they cause and their correct diagnosis depends of the development of efficient diagnostic techniques. The genus Pestivirus of the family Flaviviridae, has three recognized species which can infect cattle: the bovine viral diarrhea virus type 1 (BVDV-1), BVDV-2 and border disease virus (BDV), and one atypical species putatively named as BVDV-3. These viruses mainly cause respiratory, digestive and reproductive disturbances in cattle, resulting in decrease of production rates. The goals of the present work were: describe the use of a modified procedure in detecting viral agents that may be present on byproducts utilized in assisted reproduction and describe the pathological and phylogenetic frame of pestivirus detected in an outbreak of disease. The data was presented in two papers. In the first study, pooled follicular fluid collected during oocyte retrieval for in vitro embryo production were selected. The samples were analyzed for BVDV, bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) by virus isolation, RT-PCR and nested PCR, using two extraction protocols for DNA and RNA: a conventional and the other with addition of pre-extraction of nucleic acid step, in order to reduce potential inhibitors of PCR and RT-PCR present in the samples. The use of the prenucleic acid procedure allowed detecting a greater number of positive samples. In the second paper, an outbreak of bovine viral diarrhea virus was described and has been tested by immunohistochemistry, ELISA, virus isolation, RT-PCR and sequencing of three regions of the genome. Four different BVDV-3 samples were obtained and major clinical disturbances were found in the digestive and respiratory systems, but skin lesions and corneal opacity were also observed. The results obtained in the works underscore the need in checking for pathogens in biologicals used in assisted reproduction utilizing sensitive techniques and shows that the disease caused by BVDV-3 in cattle is clinically undistinguishable from those caused by other pestiviruses, suggesting that atypical pestivirus may be underdiagnosed in the Brazilian herds.

Atualmente, o Brasil é o segundo maior exportador de carne bovina e o sexto exportador de leite no mundo. Visando melhorar a produtividade da bovinocultura, torna-se importante a aplicação de programas sanitários adequados e eficientes. As doenças virais são preocupações constantes em qualquer programa de sanidade, devido aos grandes prejuízos econômicos que causam e o seu diagnóstico correto depende de técnicas laboratoriais eficientes. O gênero Pestivirus, da família Flaviviridae, possui três espécies reconhecidas que podem infectar bovinos: o vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), o BVDV-2 e o vírus da doença da fronteira (BDV), além de uma espécie atípica proposta como BVDV-3. Causam principalmente distúrbios respiratórios, reprodutivos e digestivos em bovinos, levando a queda de índices de produção. Os objetivos do presente trabalho foram: descrever o uso de uma técnica modificada de detecção de agentes virais que possam estar presentes em insumos utilizados na reprodução assistida e descrever a caracterização patológica e análise filogenética de pestivírus detectados em um surto da doença, sendo os dados apresentados sob a forma de dois artigos. No primeiro, pools de líquidos foliculares colhidos durante a punção ovariana de vacas para coleta de oócitos para produção in vitro de embriões foram selecionados. As amostras foram analisadas para a detecção de BVDV, herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) por isolamento viral, RT-PCR e nested PCR, sendo utilizados dois protocolos de extração de DNA e RNA: um convencional e o outro com adição de etapas pré-extração de ácido nucleico, no intuito de reduzir possíveis inibidores de RT-PCR e PCR presentes nas amostras. A utilização da técnica de pré-extração permitiu detectar um maior número de amostras positivas. No segundo trabalho, foi descrito um surto de diarreia viral bovina em um rebanho que foi testado por imunohistoquímica, ELISA, isolamento viral, RT-PCR e sequenciamento de três regiões do genoma. Foram obtidas quatro amostras distintas de BVDV-3 e as principais alterações clinicas foram encontradas nos sistemas digestivo e respiratório, mas lesões de pele e opacidade de córnea também foram observadas. Os resultados encontrados nos trabalhos realizados reforçam a necessidade da verificação quanto à presença de patógenos em materiais biológicos utilizados na reprodução assistida utilizando técnicas sensíveis e que a doença causada por BVDV-3 em bovinos é indistinguível clinicamente das causadas por outros pestivírus, sugerindo que pestivírus atípicos podem estar subdiagnosticados nos rebanhos brasileiros. / Currently, Brazil is the second largest beef and the sixth milk exporter worldwide. To improve the livestock productivity, it becomes important the applying of appropriate and efficient health programs. Viral diseases are constant concerns on any health program due to major economic losses they cause and their correct diagnosis depends of the development of efficient diagnostic techniques. The genus Pestivirus of the family Flaviviridae, has three recognized species which can infect cattle: the bovine viral diarrhea virus type 1 (BVDV-1), BVDV-2 and border disease virus (BDV), and one atypical species putatively named as BVDV-3. These viruses mainly cause respiratory, digestive and reproductive disturbances in cattle, resulting in decrease of production rates. The goals of the present work were: describe the use of a modified procedure in detecting viral agents that may be present on byproducts utilized in assisted reproduction and describe the pathological and phylogenetic frame of pestivirus detected in an outbreak of disease. The data was presented in two papers. In the first study, pooled follicular fluid collected during oocyte retrieval for in vitro embryo production were selected. The samples were analyzed for BVDV, bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) by virus isolation, RT-PCR and nested PCR, using two extraction protocols for DNA and RNA: a conventional and the other with addition of pre-extraction of nucleic acid step, in order to reduce potential inhibitors of PCR and RT-PCR present in the samples. The use of the prenucleic acid procedure allowed detecting a greater number of positive samples. In the second paper, an outbreak of bovine viral diarrhea virus was described and has been tested by immunohistochemistry, ELISA, virus isolation, RT-PCR and sequencing of three regions of the genome. Four different BVDV-3 samples were obtained and major clinical disturbances were found in the digestive and respiratory systems, but skin lesions and corneal opacity were also observed. The results obtained in the works underscore the need in checking for pathogens in biologicals used in assisted reproduction utilizing sensitive techniques and shows that the disease caused by BVDV-3 in cattle is clinically undistinguishable from those caused by other pestiviruses, suggesting that atypical pestivirus may be underdiagnosed in the Brazilian herds.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2017-05-04T12:31:58Z No. of bitstreams: 1 Guilherme Aniceto Veras.pdf: 755618 bytes, checksum: abf9279c842f5f903daa9429771d78c0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-04T12:31:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guilherme Aniceto Veras.pdf: 755618 bytes, checksum: abf9279c842f5f903daa9429771d78c0 (MD5) Previous issue date: 2013-08-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The aim of this study was to evaluate the effect of different progesterone concentrations (P4) on follicular dynamics in Holstein heifers (Bos taurus) subjected to synchronization of estrus and ovulation. The experiment was conducted at the Experimental Station of São Bento do Una/PE Agronomic Institute of Pernambuco / IPA, between September and December 2012. There were used 19 pubertal Holstein heifers presenting BSC between 3.0 and 3.5 and kept in intensive system. The heifers were divided into two groups, receiving an intravaginal devices at D0 containing 0.75 g of P4 in G1 (n = 10) and 1 g of P4, in G2 (n = 9) along with 2 mg BE im. At D7, there were applied 530μg of cloprostenol and 300 IU of eCG im, at D8 intravaginal devices were removed. At D9, heifers in both groups received 1mg of EB im and at D10 TAI were preceded. The ovarian activity was monitored at D0, D4, D8, D10 and at each 6 hours after TAI until ovulation. Pregnancy diagnosis were performed 30 days after TAI. The data were subjected to analysis of variance (ANOVA) and means were compared by the test of Turkey at 5% by the statistical program SPSS 16 for Windows. Binomial variables were analyzed by chi-square. No significant effect was observed between wave synchronization (100 vs. 100%), ovulation rate (70 vs. 89%), time of ovulation (60.5 ± 2.65 vs. 64.5 ± 0.33 h) and conception rate (40 vs. 44.4%) between G1 and G2, respectively. The dominant follicle average diameter at D9 between heifers that ovulated from G1 was 14,8±0,6 mm and in G2 11,2±1,6mm presenting no statistical difference (P=0.07) the same way was not also observed statistical difference between heifers that did not ovulate from G1 (9.6±0.7mm and in G2 (7.7±0.03)(P=0.42). .) Already when comparing the average diameters of dominant follicles in D9 between the heifers that ovulated (14.8 ± 0.6 mm) and those that did not ovulate (9.6 ± 0.7 mm) from G1, it was observed significant difference (P ˂ 0.05), as well as from G2 (11,2 ± 1.6 vs. 7.7 ± 0.03 mm). The ovulation rate increased significantly in the follicles larger than 11 mm, measured on D9 However, conception rates were higher when the follicles were larger than 8 mm on D9. In the present study, no significant effect was observed in DFØ, OFØ, time of ovulation, ovulation and conception rates in pubertal Holstein heifers, but animals receiving device with lower concentrations of P4 in D0 showed higher daily rate growth follicular. / O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de progesterona (P4) sobre a dinâmica folicular em novilhas Holandesas (Bos taurus) submetidas à sincronização de estro e ovulação. O experimento foi realizado na Estação Experimental de São Bento do Una/PE do Instituto Agronômico de Pernambuco/IPA, entre setembro e dezembro de 2012. Foram utilizadas 19 novilhas púberes Holandesas, com ECC entre 3,0 e 3,5 e mantidas em sistema intensivo. Foram distribuídas em dois grupos, onde no D0, receberam implantes intravaginal contendo 0,75g de P4 no G1 (n=10) e 1g de P4 no G2 (n=9), associado a 2 mg de BE i.m. No D7, foram aplicados 530μg de cloprostenol sódico e 300 UI de eCG i.m. e no D8 os implantes intravaginais foram removidos. No D9, foi aplicado 1mg de BE i.m. em ambos os grupos e no D10 a IATF. A atividade ovariana foi acompanhada no D0, D4, D8, D10 e após a IA de 6/6 horas até a ovulação. O diagnóstico de gestação, realizado 30 dias após a IATF. Os dados foram analisados pelo SPSS 16.0, empregando-se a análise de variância (ANOVA). Sendo evidenciada diferença estatística, aplicou-se o teste de Turkey. As variáveis binominais foram analisadas pelo Qui-quadrado. Não foi observado efeito significativo entre a sincronização da onda (100 vs. 100%), taxa de ovulação (70 vs. 89%), momento da ovulação (60,5±2,65 vs. 64,5±0,33 h) e taxa de concepção (40 vs. 44,4%) entre G1 e G2, respectivamente. O diâmetro do folículo dominante no D9 (ØFD) (13,5±0,1 vs. 10,8±1,7 mm) não diferiu entre os grupos, assim como o Ø máx. FD (14,3±1,5 vs. 11,9±0,86 mm) e do Ø máx. FO (14,7±0,74 vs. 12,3±1,37 mm), porém a taxa de crescimento diário dos folículos foi significativamente maior no G1 que no G2 (1,6±0,12 vs. 1,0±0,18 mm/dia). O diâmetro médio do folículo dominante no D9 entre as novilhas que ovularam do grupo G1 foi 14,8±0,6 mm e no G2 11,2±1,6 mm não se observando diferença estatística entre os tratamentos (P=0,07), da mesma forma que também não se observou diferença estatística entre novilhas que não ovularam do G1 (9,6±0,7) e do G2 (7,7±0,03)(P=0,42). Já ao se comparar os diâmetros médios dos folículos dominantes no D9 entre as novilhas que ovularam (14,8±0,6 mm) e as que não ovularam (9,6±0,7 mm) do G1, observou-se diferença significativa (P˂0,05), assim como no G2 (11,2±1,6 vs. 7,7±0,03 mm. A taxa de ovulação aumentou significativamente nos folículos maiores de 11 mm, mensurados no D9, no entanto, as taxas de concepção foram maiores quando os folículos se encontravam maiores que 8 mm, no D9. No presente estudo não foi observado efeito significativo da concentração de P4 no ØFD, ØFO, momento da ovulação, taxas de ovulação e concepção em novilhas púberes Holandesas, porém os animais que receberam dispositivo com menor concentração de P4 no D0 apresentaram maior taxa de crescimento folicular diário.

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-01-15T13:51:53Z No. of bitstreams: 2 Tese - Kele Amaral Alves - 2014.pdf: 3078200 bytes, checksum: a734ef24de50dd8371530cfbd9e5c3d4 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-01-18T08:47:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Kele Amaral Alves - 2014.pdf: 3078200 bytes, checksum: a734ef24de50dd8371530cfbd9e5c3d4 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-18T08:47:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Kele Amaral Alves - 2014.pdf: 3078200 bytes, checksum: a734ef24de50dd8371530cfbd9e5c3d4 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-12-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Studies with equine preantral follicles are scarce and the follicular dynamics features remain unclear. The mare’s ovarian function (e.g., folliculogenesis) has similarities with woman’s cycle and based on these aspects, this species can be considered an animal model for comparative studies and techniques with preantral follicles to preserve female fertility. The purpose of the first project was to determine methodologies that might speed up the process of histological evaluation of preantral follicle population. On the second project, we evaluated the follicular population features considering the follicular density factor by means of a mathematical model, to determine the appropriate experimental design to estimate the follicular density in ovarian fragments. The third project, analyzed the effects of reproductive phases, ovary, and ovarian structures on the quality, classification, follicular and cellular densities in ovarian fragments. The results allowed an establishment of the best thickness of histological sections and the ideal number of fragments and sections to estimate the equine preantral follicle density. Furthermore, it was observed a low follicular density associated with a high heterogeneity within and among animals. Moreover, we demonstrated the best scenario (diestrous phase with the presence of a functional corpus luteum) to collect ovarian fragments with higher follicular and cellular densities. In summary, this study demonstrated: (i) advance on the knowledge of equine follicular dynamic on the preantral phase; (ii) the concept of the mare as an animal model to study the reproductive challenges on woman; and (iii) provided basic information for future biotechnology research with the aim to preserve or improve the reproductive capability as cryopreservation, in vitro culture, and transplants of ovarian tissue. / Estudos com folículos pré-antrais equinos são escassos e as características da dinâmica folicular pré-antral permanecem pouco elucidadas. A função ovariana (ex. foliculogênese) da égua possui diversas similaridades com a mulher e, baseado nestes aspectos, podemos considerá-la como modelo animal para estudos comparativos e técnicas que utilizam folículos pré-antrais na preservação da fertilidade feminina. O primeiro projeto teve a proposta de definir metodologias para agilizar o processo de avaliação histológica da população folicular pré-antral. No segundo projeto, avaliou-se as características da população folicular considerando o fator densidade folicular, determinando por meio de modelo matemático, o apropriado desenho experimental para estimar a densidade em fragmentos ovarianos. No terceiro projeto, analisou-se os efeitos da fase reprodutiva, ovário e estruturas ovarianas sobre a qualidade, classificação, densidade folicular e celular em fragmentos ovarianos. Os resultados permitiram estabelecer a melhor espessura de secção histológica e o número de fragmentos e de secções suficientes para estimar a densidade de folículos pré-antrais equinos. Adicionalmente, observou-se uma baixa densidade folicular associada a alta heterogeneidade dentre e entre os animais. Além disso, determinou-se afase de diestro com a presença de corpo lúteo ativo como o melhor cenáriopara a coleta de fragmentos ovarianos com maior densidade folicular e celular. Finalmente, dos resultados originados deste trabalho, pode-se concluir: (i) obteve-se avanço no conhecimento da dinâmica folicular pré-antral equina; (ii) o conceito da égua como modelo animal para estudos de desafios reprodutivos na mulher foi reforçado; e (iii) ocorreu a geração de informações básicas para futuras pesquisas com biotecnologias que visam preservar ou implementar a capacidade reprodutiva como a criopreservação, cultivo in vitro e transplantes de tecido ovariano.

Orientador: Marcos Nogueira Eberlin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-26T03:09:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Steola_MarcosPaulo_M.pdf: 3243022 bytes, checksum: 9b7450eb5a75ce0b22ccba84584755de (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A utilização da espectrometria de massas como ferramenta de quantificação de moléculas em matrizes biológicas complexas vem sendo difundida durante os últimos anos, devido ao sua versatilidade, facilidade no preparo das amostras, alta sensibilidade e rapidez na quantificação. A utilização da cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas uniu o poder de separação da cromatografia líquida com o poder de identificação da espectrometria de massas, proporcionando corridas analíticas mais rápidas e menores limites de detecção. O presente trabalho teve como objetivo validar metodologia para a quantificação de 5 hormônios esteroides (estradiol, cortisol, testosterona, progesterona e androstenediona) em plasma e 2 hormônios esteroides ( estradiol e progesterona) em fluído folicular bovino, utilizando-se cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massas, para uso na quantificação de amostras provenientes de duas raças diferentes, Bós taurus e Bós indicus, principais constituintes do rebanho brasileiro, submetidas a duas dietas diferentes. Devido à dificuldade de encontrar matrizes biológicas isentas de hormônios esteroides optou-se pelo uso da técnica de diluição isotópica na validação da metodologia, técnica em que o sinal do hormônio a ser analisado é comparado com seu análogo deuterado, minimizando o efeito da matriz biológica. A metodologia desenvolvida e validada poderá ser utilizada na quantificação de hormônios em matrizes biológicas provenientes de outras raças bovinas, bem como ser aplicada para a quantificação de hormônios esteroides em plasma e fluído folicular em humanos / Abstract: The use of mass spectrometry and quantification of molecules in complex biological matrices tool has been widespread over the last years due to its versatility, ease of sample preparation , high sensitivity and fast quantification . The use of high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry attached the separation power of the liquid chromatography and identification mass spectrometry, giving analytical runs faster and lower detection limits. This study aims to validate the methodology for quantification of 5 steroid hormones ( estradiol , cortisol , testosterone , progesterone and androstenedione ) in plasma and 2 steroid hormones ( estradiol and progesterone ) in bovine follicular fluid , using liquid chromatography with mass spectrometry detector , for use in the quantification of samples from two different breeds , Bos taurus and Bos indicus , the main constituent of the Brazilian herd , subjected to two different diets . Due to the difficulty of finding in biological matrices free steroid hormones, we opted for the use of the isotope dilution technique to validate the methodology , a technique in which the signal of the hormone being examined is compared with its deuterated analogue, minimizing the effect of the biological matrix . The methodology developed and validated may be used in the quantification of hormones in biological matrices from other cattle breeds , as well as be applied to quantify steroid hormones in plasma and follicular fluid in humans / Mestrado / Quimica Analitica / Mestre em Química

La vaccination du tissu cutané présente un fort potentiel, car elle permet le ciblage de l’antigène aux populations de cellules dendritiques uniques et spécialisées de la peau, et le recrutement de cellules inflammatoires du sang.Les cellules T helper folliculaires (TFH) jouent un rôle crucial dans l’établissement de la réponse humorale. Cependant, les interactions cellulaires et moléculaires qui gouvernent leur induction dans un contexte de vaccination restent à élucider.Mon projet de thèse a eu pour but de mieux comprendre les mécanismes d’induction des réponses TFH et humorales, par l’étude des événements précoces ayant lieu aux sites d’immunisation et d’induction de l’immunité adaptative après vaccination cutanée. L’utilisation de modèles murins nous a permis d’évaluer la contribution de différentes populations de la peau, du ganglion, et du sang dans la mise en place de ces réponses après immunisation intradermique avec un antigène particulaire présentant l’antigène modèle p24 du VIH. Cette étude a révélé un rôle crucial des cellules de Langerhans et des cellules dendritiques migratoires de la peau dans l’induction de réponses TFH et humorales.Nous avons ensuite évalué la capacité de différentes formulations d’adjuvants à polariser la réponse TFH et humorale contre un antigène de l’enveloppe du VIH à fort potentiel vaccinal. L’utilisation de l’émulsion IFA favorise l’induction des cellules TFH et induit la production d’anticorps neutralisants des souches du VIH.Ces résultats soulignent l’importance de cibler les DCs de la peau par l’utilisation de voies de vaccination pertinentes et l’utilisation d’adjuvants capables de favoriser la réponse cellulaire TFH. / Skin vaccination is of great interest, as it enables targeting of the antigen to unique and specialized dendritic cell populations of the skin, as well as recruitment of inflammatory blood cells.T follicular helper (TFH) cells play a critical role in the setting of the humoral response. However, the cellular and molecular interactions that underlie their induction after vaccination remain unknown.My thesis project aimed at understanding the immune mechanisms by which skin vaccination could favor the induction of TFH and humoral immune responses by studying the early events that take place in tissue and lymph node.Using mice models, we evaluated the relative contributions of various populations from the skin, lymph node and blood in the setting of TFH cell responses after intradermal immunization with nanoparticles coated with p24 antigen from HIV. This revealed a crucial role of Langerhans cells and skin migratory dendritic cells in the induction of TFH and germinal center responses.We then evaluated the ability of different adjuvant formulations to polarize the TFH and humoral response against a promising vaccine antigen from HIV envelope protein. Emulsifying the antigen in IFA favors the induction of TFH cells and induces the production of neutralizing antibodies able to block viral infection.This work highlights the relevance of targeting skin dendritic cells by using relevant vaccination routes and adjuvant formulation able to induce TFH cell responses.

La réponse humorale est altérée lors de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Les lymphocytes T CD4+ folliculaires helper (Tfh) sont impliqués dans la maturation des lymphocytes B (LB) dans les organes lymphoïdes secondaires. Mon travail de thèse s’est articulé autour de deux axes complémentaires visant à étudier les Tfh et les réponses B mémoires lors de l’infection par le VIH. J’ai d’abord étudié les Tfh spléniques lors de la phase chronique de l’infection par le VIH. J’ai mis en évidence une augmentation des populations de Tfh dans les rates de patients VIH+. D’autre part l’infection par le VIH a un impact sur le profil transcriptionnel des Tfh de la rate et la production de cytokines impliquées dans la différenciation des LB, suggérant un défaut fonctionnel des Tfh. Parallèlement, la maturation des LB est altérée dans les rates VIH+. Dans le second axe de ma thèse, j’ai étudié les réponses B mémoires anti-VIH dans différentes cohortes de patients VIH+ : Elite controller (EC) contrôlant l’infection sans traitements et des patients VIH+ traités. J’ai mis en évidence que les EC préservent naturellement leurs compartiments B mémoires et que les réponses B mémoires spécifiques du VIH sont maintenues dans le sang de ces patients. Les réponses B mémoires IgG1+ anti-VIH sont majoritaires chez les EC, tandis que les réponses IgG2+ et IgG3+ sont plus rares. Ces travaux permettent une meilleure compréhension de la physiopathologie de l’infection par le VIH en apportant de nouveaux éléments sur la fonctionnalité des Tfh et les réponses B mémoires anti-VIH. / HIV infection is associated with a defect of humoral response. T follicular helper cells (Tfh) support multiple steps of B cell maturation and antibody production. My work was divided in two complementary axes aiming to characterize Tfh and memory B cell responses in HIV-infected patients.I identified several Tfh populations in HIV+ and HIV- spleens by FACS. These three populations were increased in HIV+ spleen. I also evidenced an impact of HIV infection on transcriptional profile and a compromised production of B cell differentiation-related cytokines by splenocytes from HIV+ donors. These results suggest Tfh functions impairment during HIV-infection. In parallel, we noticed an altered maturation of B cells in HIV+ spleens. In a cohort study, we compared memory B cell responses in the blood of Elite controllers (EC) who naturally control HIV and treated HIV+ patients. I evidenced that EC naturally preserve their memory B cell compartments. In contrast to anti-HIV IgG2 and IgG3 secreting B cells, most EC exhibit a high frequency of anti-HIV IgG1 secreting B cells. My work highlights a defective Tfh differentiation, which might explain why B cell maturation is severely affected in HIV-progressors. The status of HIV-controller seems associated with the presence of an IgG1 B cell memory response. Further work will highlight whether Tfh functions are preserved in EC.