L’anxiété est un symptôme prédominant au cours des périodes initiales de sevrage à la cocaïne et est considérécomme un facteur important de rechute. Le but de cette étude était de caractériser les dysfonctionnementscérébraux qui pourraient contribuer à l’expression de cet état pathologique chez le rat.Les rats sont traités avec de la cocaïne en chronique et le comportement anxieux est évalué au cours du sevragedans différents paradigmes expérimentaux (tests du labyrinthe en croix surélevé, du confinement dans un brasouvert surélevé et de l’enfouissement défensif). Nos résultats ont montré que le sevrage à la cocaïne induit unétat anxieux élevé qui persiste pendant au moins 28 jours de sevrage. Nous avons ensuite utilisél’immunohistochimie de Fos pour comparer les patterns d’activation cérébrale chez les rats sevrés et témoinsaprès exposition au test de l’OA. Nos données ont montré que l’anxiété élevée des rats sevrés était accompagnéed’une altération de la réactivité des neurones glutamatergiques de la partie dorsale du cortex préfrontal médian(dCPFm) et de certaines régions sous-corticale (aires hypothalamiques latérale et antérieure et le noyauparaventriculaire du thalamus). Nous avons ensuite montré que l’inactivation pharmacologique du dCPFm avecdu muscimol atténuait les comportements anxieux des rats sevrés suggérant ainsi une hyperréactivité de cetterégion corticale durant le traitement des informations de type anxieux. Notre étude amène des données nouvellesquant aux substrats neuronaux sous-tendant l’anxiété pathologique observée au cours du sevrage à la cocaïne etsouligne l’importance du CPFm dans la régulation de cet état d’anxiété pathologique. / Anxiety is one of the prevailing symptoms observed during the initial period of abstinence in cocaine abusersand is considered as an important factor of relapse. The aim of this study was to provide further insight into thecerebral dysregulations that might contribute to this pathological state in rats.Rats were treated chronically with cocaine and anxiety-behaviors were assessed in different paradigms duringwithdrawal (elevated plus maze, open arm and shock probe burying tests). Our results demonstrated that cocainewithdrawal induced persistent heightened levels of anxiety that last for at least 28 days. We then used Fosimmunohistochemistry to map neuronal activation patterns in withdrawn rats confined to one open arm (OA) ofan elevated plus maze. Our data showed that the exacerbated anxiety observed in cocaine treated rats exposed toan OA was accompanied by an altered reactivity of the dorsal part of the medial prefrontal cortex (dmPFC)glutamatergic neurons and some sub-cortical regions (anterior and lateral hypothalamic areas and theparaventricular nucleus of the thalamus). Finally, we showed that pharmacological inactivation of the dmPFCwith muscimol considerably attenuated anxiety-related behaviors in cocaine withdrawn rats suggesting anexaggerated response of this cortical area during the processing of anxiogenic stimuli. The present studyprovides new data on the neural substrate underlying pathological anxiety observed during cocaine withdrawaland highlights the importance of the dmPFC in the regulation of this pathological anxiety state.

Submitted by Natalie Mendes (nataliermendes@gmail.com) on 2015-11-12T01:28:44Z No. of bitstreams: 1 Disserta??o Lippia grata UEFS.pdf: 1504199 bytes, checksum: 6547f6ba792b976ed41c1fae77889843 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-12T01:28:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Disserta??o Lippia grata UEFS.pdf: 1504199 bytes, checksum: 6547f6ba792b976ed41c1fae77889843 (MD5) Previous issue date: 2013-09-27 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / The treatment of orofacial pain remains a major challenge for modern medicine. So, new therapeutic proposals has sought in natural products pharmacological options for this nosology. In the current study, it was prepared and physicochemically characterized a ?-cyclodextrin complex containing L. grata leaf essential oil (?-CD/EO) in order to investigate their possible antinociceptive activity in animal models of orofacial pain. The essential oil from the leaves of Lippia grata (EO ) was obtained by hydrodistillation in a Clevenger-type apparatus and the main compounds identified was made through CG-MS. The phytochemical analysis of EO demonstred the presence of camphor (28,69%), (E)-caryophillene (11,47%), bicyclogermacrene (10,22%), camphene (9,45%) and borneol (7,64%) as the main compounds. Following these preliminary results, the inclusion complex of ?-cyclodextrin and EO (?-CD/EO) was prepared by slurry procedure (SC). It was taken physicochemical characterization. The results of DSC and TG/DTG showed that the products prepared by SC methods were able to incorporate greater amounts of EO. In the X-ray diffractogram, it was showed that complex between EO and ?-CD was formed. Male Swiss mice were pretreated with ?-CD/EO (6, 12 or 24 mg/kg, per os, gavage, p.o.), morphine (5 mg/kg, i.p.), or vehicle (distilled water, p.o.), 90 min. before treatment with formalin (20 ?l, 2%), capsaicin (20 ?l, 2,5 ?g), or glutamate (40 ?l, 25 ?M) into the right upper lip. The obtained data were evaluated by one-way analysis of variance (ANOVA), followed by Tukey?s test. The results demonstrated that p.o. treatment with ?-CD/EO was (p<0,05 or p<0,001) capable in reducing the nociceptive face-rubbing behavior in both phases of the formalin test. ?-CD/EO-treated mice were also (p<0.05 or p<0.001) protected against nociception induced by capsaicin and glutamate. For the action in the central nervous system (CNS), ninety minutes after the treatment, the mice were perfused, the brains collected, crioprotected, cut in a criostate and submitted to an imunofluorescence protocol for Fos protein. The imunofluorescence protocol demonstrated that the ?-CD/EO significantly activated (p<0,05; p<0,01 or p<0,001) the motor cortex, the locus ceruleus, the nucleus raphe magnus and the periaqueductal gray of the CNS. These effects did not alter, in tested doses, the motor coordination of mice in the rota-rod test. These results suggest that treatment with ?-CD/EO induces an analgesic profile in experimental models of orofacial nociception, promising pharmacologic complex in treatment of orofacial pain. / O tratamento da dor orofacial representa um importante desafio para a medicina moderna. Desta forma, novas propostas terap?uticas t?m buscado nos produtos naturais op??es farmacol?gicas para esta nosologia. No presente estudo, foi preparado e caracterizado fisicoquimicamente, um complexo de ?-ciclodextrina incorporado com o ?leo essencial das folhas de Lippia grata (?-CD/OE) buscando avaliar sua poss?vel a??o antinociceptiva em modelos animais de dor orofacial. O ?leo essencial (OE) foi obtido por hidrodestila??o em aparato de Clevenger e os compostos marjorit?rios foram identificados por CG-MS. A an?lise fitoqu?mica do ?leo demonstrou a presen?a de c?nfora (28,69%), (E)-cariofileno (11,47%), biciclogermacreno (10,22%), c?nfeno (9,45%) e borneol (7,64%) como principais componentes. Ap?s estes resultados preliminares, este ?leo foi ent?o complexado em ?-ciclodextrina e a an?lise fisicoqu?mica realizada. Os resultados da DSC e TG/DTG demonstraram que produtos preparados por m?todos de coevapora??o foram capazes de incorporar grandes quantidades de ?leo essencial. No difractograma de raios X, foi mostrado que o complexo entre OE e ?-CD foi formado. Camundongos machos Swiss foram pr?-tratados com ?-CD/OE (6, 12 ou 24 mg/kg, per os, gavagem, v.o.), morfina (5 mg/kg, i.p.), ou ve?culo (?gua destilada, v.o.), 90 min. antes do tratamento com formalina (20 ?l, 2%), capsaicina (20 ?l, 2,5 ?g), ou glutamato (40 ?l, 25 ?M) no l?bio superior direito. Os dados obtidos foram avaliados por an?lise de vari?ncia de uma via (ANOVA), seguido pelo teste de Tukey. Os resultados demonstraram que o tratamento v.o. com ?-CD/OE foi capaz de reduzir (p<0,05 ou p<0,001) o comportamento nociceptivo de co?ar a face em ambas as fases do teste da formalina. Camundongos tratados com ?-CD/OE foram tamb?m (p<0,05 ou p<0,001) protegidos contra a nocicep??o induzida por capsaicina e glutamato. Para avaliar a a??o no sistema nervoso central (SNC), noventa minutos ap?s o tratamento, os camundongos foram perfundidos, os c?rebros coletados, crioprotegidos, cortados num criostato e submetidos a um protocolo de imunofluoresc?ncia para prote?na Fos. O protocolo de imunofluoresc?ncia demonstrou que o complexo de ?-CD/EO ativou (p<0,05; p<0,01 ou p<0,001) o c?rtex motor, o locus ceruleus, o n?cleo magno da rafe e a subst?ncia cinzenta periaquedutal do SNC. Esses efeitos n?o alteraram, nas doses testadas, a coordena??o motora dos camundongos no teste rota-rod. Os resultados sugerem que o tratamento com ?-CD/EO induz perfil analg?sico em modelos experimentais de nocicep??o orofacial, sendo um complexo farmacol?gico promissor no tratamento da dor orofacial.

Messenger RNA (mRNA) is transcribed by RNA polymerase II (Pol II) and has to undergo multiple processing events before it can be translated into a protein: a cap structure is added to its 5’ end, noncoding, intervening sequences (introns) are removed and coding exons are ligated together and a poly(A) tail is added to its 3’end. Splicing, the process of intron removal, is carried out in the spliceosome, a megacomplex comprehending up to 300 proteins. The core components of the spliceosome that directly interact with the pre-mRNA are the small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs). They consist of one of the U-rich snRNAs U1, U2, U4, U5 or U6 together with several particle-specific proteins and core proteins. All mRNA processing events can occur co-transcriptionally, i.e. while the RNA is still attached to the gene via Pol II. The in vivo studies of co-transcriptional RNA processing events had been possible only in special biological systems by immunoelectron microscopy and only recently, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) made it possible to investigate cotranscriptional splicing factor assembly on genes. My thesis work is divided into two parts: Part I shows that the core components of the splicing machinery are recruited co-transcriptionally to mammalian genes in vivo by ChIP. The co-transcriptional splicing factor recruitment is dependent on active transcription and the presence of introns in genes. Furthermore, a new assay was developed that allows for the first time the direct monitoring of co-transcriptional splicing in human cells. The topoisomerase I inhibitor camptothecin increases splicing factor accumulation on the c-fos gene as well as co-transcriptional splicing levels, which provides direct evidence that co-transcriptional splicing events depend on the kinetics of RNA synthesis. Part II of the thesis is aimed to investigate whether Pol II has a functional role in the biogenesis of the U6 snRNA, which is the RNA part of the U6 snRNP involved in splicing. Pol III had been shown to transcribe the U6 snRNA gene, but ChIP experiments revealed that Pol II is associated with all the active U6 snRNA gene promoters. Pol II inhibition studies uncovered that U6 snRNA expression and probably 3’end formation is dependent on Pol II.

Le maintien de notre poids corporel résulte d'un équilibre entre les dépenses et les apports énergétiques. Cet équilibre appelé « homéostasie énergétique » implique un grand nombre de molécules. Parmi elles, la nesfatine-1, découverte en 2006, est un peptide de 82 acides aminés issu du clivage de la protéine NUCB2. L'intérêt généré par la nesfatine-1 réside dans son action anorexigène exercée indépendamment de la signalisation à la leptine. La nesfatine-1 est exprimée dans plusieurs organes tels que le tissu adipeux, l'estomac, le pancréas, ainsi que le cerveau. Dans le cerveau, son expression se limite principalement à quelques groupes neuronaux localisés dans l'hypothalamus et le complexe vagal dorsal. Au cours de ce travail, nous avons analysé la sensibilité des neurones exprimant NUCB2/nesfatine-1 aux signaux périphériques physiologiques et physiopathologiques affectant la prise alimentaire. Nous montrons que ces neurones sont sensibles à une hypoglycémie et qu'ils pourraient contribuer à la contre-régulation mise en place afin de rétablir la glycémie de base. De plus, nous montrons qu'ils sont activés en réponse à deux stimuli inflammatoires : l'administration de lipopolysaccharide et l'intoxication alimentaire avec une mycotoxine appelée déoxynivalénol. Ainsi, les neurones exprimant NUCB2/nesfatine-1 pourraient contribuer au développement de l'anorexie inflammatoire. Cette étude a constitué la première mise en évidence d'une implication de ce peptide en situation pathologique. L'ensemble de ces résultats suggère qu'en plus de son effet satiétogène, la nesfatine-1 participe à la signalisation centrale impliquée dans la glucodétection et les réponses inflammatoires. / The long term maintenance of body weight results from a balance between energy expenditure and intake. This balance, called “energy homeostasis”, involves a large number of molecules. Among these, nesfatin-1, discovered in 2006, is an 82 amino-acid peptide derived from the cleavage of the protein NUCB2. The interest generated by nesfatin-1 lies in its anorexigenic effect performed independently of leptin signalization. Nesfatin-1 is expressed in several organs such as adipose tissue, stomach, pancreas, and brain. In the brain, its expression is limited to a few neuronal groups located in the hypothalamus and dorsal vagal complex. In this work, we analyzed the sensitivity of NUCB2/nesfatin-1-expressing neurons to physiological and physiopathological peripheral signals affecting food intake. We show that these neurons are sensitive to hypoglycemia and that they could contribute to the counter-regulatory response established in order to restore the basal blood glucose level. Moreover, we show that they are activated in response to two inflammatory stimuli: lipopolysaccharide administration and food intoxication with a mycotoxin named deoxynivalenol. So, NUCB2/nesfatin-1-expressing neurons could contribute to the development of inflammatory anorexia. This study was the first evidence of an involvement of this peptide in a pathological situation. Taken together, these results suggest that in addition to its satiating effect, nesfatin-1 participates in the central signalization involved in glucodetection and inflammatory responses.

Estudos prévios demonstram projeções dos núcleos da rafe para áreas clássicas relacionadas ao controle do sistema cardiovascular, como locus coeruleus, núcleo do trato solitário, coluna intermédio lateral da medula espinal, núcleos motor dorsal do vago e ambíguo. Baseado nesta informação este estudo investigou a participação dos núcleos da rafe nas respostas adaptativas a estímulos de hipervolemia e hipovolemia. Foram utilizados ratos machos (Wistar), adultos, mantidos em biotério sob condições controladas, divididos em cinco grupos: hipovolemia (Hipo, submetidos à punção cardíaca com remoção sangüínea), controle da hipovolemia (C hipo, submetidos à punção cardíaca sem remoção sangüínea), hipervolemia (Hiper, submetidos à cirurgia para canulação da veia jugular externa e adição de solução salina no sexto dia pós-cirúrgico), controle da hipervolemia (C hiper, submetidos à cirurgia para canulação da veia jugular externa sem adição de solução salina) e basal (BS). Após 90 minutos do estímulo, os animais foram profundamente anestesiados e perfundidos transcardiacamente com salina seguida de fixador Paraformaldeído + Bórax 4%, 4ºC, pH 9,5. Os encéfalos foram removidos pós-fixados, crioprotegidos e seccionados em cortes coronais de 40 µm e processados com técnicas de imunohistoquímica contra Fos e 5-HT. Os estímulos de hipo e hipervolemia não causaram aumento significativo dos neurônios Fos-imunoreativos ou 5HT/Fos-imunoreativos. Nos núcleos Li, DR, MnR, RMg e ROb o grupo C hipo apresentou maior número de neurônios Fos-IR e 5HT/Fos-IR em relação ao grupo C hiper. Os resultados sugerem que os núcleos da rafe não participam nas repostas adaptativas aos estímulos aplicados. Entretanto, os mesmos parecem estar envolvidos em processos de nocicepção, seja através da 5-HT ou de outras substâncias neuroativas, presentes nestes núcleos. / Previous studies presented projections from the raphe nuclei to areas related to the cardiovascular control, like the locus coeruleus, nucleus of the solitary tract, spinal cord intermedium lateral column, dorsal motor vagus and ambiguus nuclei. Based in this information, the present work analyzed the participation of the raphe nuclei in the adaptative responses to hypovolaemia and hypervolaemia. Were used wistar rats, kept in controlled conditions, divided in 5 groups: hypovolaemia (Hypo, cardiac puncture and blood extraction), hypovolaemia control (C Hypo, cardiac puncture without blood extraction), hypervolaemia (Hyper, external jugular vein canulation surgery and saline addition), hypervolaemia control (C Hyper, external jugular vein canulation surgery and no saline addition) and basal condition (BS). Ninety minutes after the stimulus, the animals were anesthetized and perfused with saline followed by 4% paraformaldehyde plus borax, pH 9.5 at 4ºC. The brains were removed, pos-fixated, cryoprotected, sectioned in 40µm thickness coronal slices and proceeded with double-labeling immunohistochemistry techniques against Fos protein and serotonin. The Hypo and Hyper stimuli presented no significant increase of Fos-IR and double-labeled neurons. The C Hypo group presented higher number of labeled neurons in the Li, DR, MnR, RMg and ROb nuclei in comparison to the group C Hyper. These results suggest that the raphe nuclei have no participation in the adaptative responses to the volemy stimuli. However, this nuclei seems to be related to the nociception no modulated just by the serotonin but by others neurotransmitters too.

No condicionamento clássico de medo, os animais são treinados associando-se um estímulo neutro, por exemplo, som, contexto ou luz a um estímulo aversivo incondicionado, como um choque elétrico nas patas. Apos repetidos pareamentos, a presença do estímulo que inicialmente era neutro passa a eliciar uma resposta condicionada de medo no animal. O congelamento é a resposta mais proeminente dos animais expostos aos estímulos condicionados previamente pareados com choques nas patas, sendo freqüentemente utilizado como medida de medo condicionado (MC). Circuitos cerebrais independentes subjacentes a diferentes formas de memória, e, dentro de um determinado domínio de memória, o envolvimento de estruturas específicas pode depender do tipo de condicionamento se utilizando contexto ou explícito tais sinais leves ou som. Diversos relatos clínicos têm implicado o prejuízo do lobo temporal medial (LTM) com amnésia retrógrada. Embora muito tenha sido feito para desvendar os circuitos neurais subjacentes ao medo condicionado, utilizando contexto, som ou luz como estímulo condicionado (EC) o envolvimento do LTM nessas formas de condicionamento ainda não está claro. Para abordar esta questão foi avaliada a distribuição de Fos no LTM de ratos após a exposição a um contexto, um som ou luz, previamente emparelhado com choques nas patas. Vinte e quatro horas após as sessões de condicionamento, os animais foram colocados na mesma caixa experimental ou a um contexto distinto ou foram expostos ao som e luz sem receber choques nas patas. Diferença significativa na expressão de Fos foi determinada por análise de regiões do lobo temporal medial (córtex ectorrinal, perirrinal e entorrinal) e do hipocampo ventral. Os resultados comportamentais mostraram que houve congelamento nos três tipos de medo condicionado, mas o padrão de distribuição Fos foi diferente em ratos expostos a estímulos específicos ou contexto previamente emparelhado com choques nas patas. Apesar da saliente aquisição da resposta do medo se simular nas três condições, o achado mais saliente foi uma distribuição selectiva de Fos no córtex ectorrinal, perirrinal e entorrinal do grupo. Surpreendentemente, esses animais não mostraram significativa expressão Fos no hipocampo ventral. Isto sugere que o contexto e estímulos aversivos explícitos apresentam propriedades distintas de mapeamento ao de distribuição de Fos no circuito cortico-hipocampal cerebral. Estes resultados indicam que regiões corticais no LTM parecem ser críticas no armazenamento de informações contextuais, mas não de informações associadas a estímulos explícitos previamente pareados a choques nas patas. / Conditioned fear (CF) is one of the most frequently used animal models of associative memory to background or foreground stimuli. Independent brain circuits underlie different forms of memory, and, within a particular memory domain, the involvement of specific structures may depend upon the type of conditioning whether using context or explicit cues such light or tone. Several clinical reports have implicated the damage to the medial temporal lobe (MTL) with retrograde amnesia. Although much has been done to disclose the neural circuits underlying CF using context, tone or light as conditioned stimuli (CS) the involvemet of the MTL in these forms of conditioning is still unclear. To address this issue we assessed the Fos distribution in the MTL of rats following exposure to a context, a tone or a light previously paired with footshocks. Twenty-four hours later the conditioning sessions they were placed to the same chamber or to a distinct context and presented with tone or light only without any footshocks. Significant group differences in regional Fos expression were determined by analysis in regions of the medial temporal lobe (ectorhinal, perirhinal and entorhinal cortices) and the ventral hippocampus. The behavioral results showed comparable freezing in the three types of CF but the pattern of Fos distribution was distinct in rats exposed to specific cues or context previously paired with footshocks. Despite comparable acquisition of the conditioned fear response, the most remarkable finding was a selective distribution of Fos in the entorhinal, perirhinal and ectorhinal cortices of the MTL for context-CS groups. Remarkably, these animals did not show significant Fos expression in the ventral hippocampus. It is suggested that context and explicit stimuli endowed with aversive properties through conditioning cause distinct Fos brain mapping in the corticohippocampal circuitry. These results indicate that tasks requiring the association between context and an aversive stimulus depend on subregions of the MTL. Such findings suggested that cortical regions of the MTL appears to be critical for storing context but not explicit cue footshock associations.

As células Y-1 pertencem a uma linhagem clonal de células funcionais de córtex adrenal de camundongo, que respondem a ACTH. Em células Y-1, ACTH promove a esteroidogênese (função) e tem efeitos regulatórios complexos na transição G0&#8594;G1&#8594;S do ciclo celular. ACTH promove a transição G0&#8594;G1, mas inibe a transição G1&#8594;S. É possível que a regulação do ciclo celular por ACTH seja mediada pelo controle da expressão dos proto-oncogenes das famílias fos, jun e myc. Nosso laboratório mostrou, anteriormente, que ACTH induz a expressão dos genes fos e jun, mas inibe c-myc. O objetivo deste trabalho foi identificar pontos de controle na expressão dos genes fos, jun e myc e na atividade dos fatores de transcrição AP-1 (dímeros da proteínas Fos e Jun) por ACTH, derivados de cAMP (ativadores de PKA), PMA (ativador de PKC) e FCS (soro fetal bovino). ACTH, PMA e dcAMP aumentam a atividade de ligação de AP-1 a DNA, independentemente de síntese protéica. Ensaios de elongação de cadeia nascente de RNA (run off transcription) mostram que ACTH, PMA e FCS são fortes indutores de c-fos, c-jun e junB, enquanto dcAMP induz apenas c-fos e junB. Hibridizações Northern permitiram estimar a meia-vida dos mRNAs de c-fos e c-jun em 30 min, independentemente do tratamento com ACTH ou PMA. Diferentemente de c-fos, o mRNA de fosB é superinduzido por ActinomicinaD em células Y-1 tratadas com ACTH e PMA. / The Y-1 cells belong to a clonal lineage of functional mouse adrenocortical cells, which are responsive to ACTH. In Y-1 cells, ACTH promotes esteroidogenesis (function) and has complex effects on the G0&#8594;G1&#8594;S transition of the Y-1 cell cycle. ACTH induces the G0&#8594;G1 transition but inhibits the G1+S transition. Probably, the cell cycle regulation by ACTH is mediated by the expression control of the proto-oncogenes from the fos, jun and myc families. Our laboratory has previously shown that ACTH induces the fos and jun genes expression, but inhibits c-myc expression. The target of this work was to identify control points in the fos, jun and myc genes expression and in the AP-1 transcription factors (Fos and Jun proteins dimers) by ACTH, cAMP derivatives (PKA activators), PMA (PKC activator) and FCS (Fetal Calf Serum). ACTH, PMA and dcAMP raise the AP-1 DNA binding activity, independently of protein synthesis. Run off transcription assays show that ACTH, PMA and FCS are strong c-fos, c-jun and junB inducers, while dcAMP induces only c-fos and junB. Northern hybridisations allowed us to estimate the half life of the fos and jun mRNAs in about 30 min, independently of ACTH or PMA treatment. Differently of c-fos, fosB mRNA is superinduced by ActinomicinD treatment in Y-1 cells treated with ACTH or PMA.

A exposição de animais ao labirinto em cruz elevado (LCE), um modelo animal de ansiedade, resulta na exibição de comportamentos defensivos e antinonicepção, bem como induz a expressão de proteína Fos em várias regiões límbicas em ratos. O presente estudo investigou possíveis correlações neuroanatômicas de estruturas envolvidas na modulação do medo e antinocicepção, em camundongos expostos a diferentes tipos de LCE [fechado (LCEf: quatro braços fechados), padrão (LCEp: dois braços abertos e dois fechados) e aberto (LCEa: quatro braços abertos)] e tratados ou não com um estímulo nociceptivo. A proteína Fos foi utilizada como marcador funcional de ativação neuronial da matéria cinzenta periaquedutal (PAG) (dorsal e ventro-lateral), amígdala (AMY), núcleo intersticial da estria terminal (BNST), núcleo do trato solitário (Sol), hipotálamo dorsomedial (dmHYP), núcleos da rafe [Magno (RmG), Mediano (MnR) e dorsal (DR)], colículo superior (SC) e inferior (IC) e núcleo parabraquial (PB). O Experimento I investigou o efeito da exposição aos diferentes LCEs sobre a resposta nociceptiva de camundongos submetidos ao teste de retirada da cauda (TRC), teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético 0,6% (TCA) e teste da formalina (TFo). Enquanto a exposição ao LCE produziu resultados inconsistentes no TRC, a exposição ao LCEp e LCEa provocou antinocicepção no TCA e somente a exposição ao LCEa eliciou antinocicepção no TFo. O Experimento II investigou a expressão de Fos em animais submetidos ou não ao TCA e expostos aos diferentes LCEs. Outro grupo, sem qualquer manipulação, foi incluído ao estudo para verificar a expressão basal de Fos. As exposições aos LCEa e LCEp provocaram, respectivamente, antinocicepção e esquiva dos braços abertos sem alterar a nocicepção. Na maioria das estruturas foi encontrado um alto nível da expressão da proteína no grupo Basal e LCEf. A exposição aos LCEs aumentou a expressão da proteína no dmHYP e na PAG ventrolateral, um efeito que se mostrou independente do estímulo nociceptivo. A injeção de ácido acético tendeu em diminuir a marcação de Fos (em comparação com o grupo correspondente), alcançando significância no PB e MnR. O Experimento III investigou se a manipulação diária (habituação às condições experimentais por 10 dias antes da exposição aos LCEs e do TCA) interfere na expressão de Fos. Um grupo Basal e um somente submetido ao TCA foram incluídos. Semelhante ao Exp. II, os animais se esquivaram dos braços abertos do LCEp, e as exposições aos LCEp e LCEa resultaram em antinocicepção. Em relação ao Exp. II, a expressão de Fos diminuiu na maioria das estruturas, mas o perfil de redução na marcação foi mantido para várias estruturas (Sol, Gi, AMY e PAG) para os animais submetidos ao TCA, com exceção do DR, no qual houve aumento da expressão de Fos no grupo LCEf. A redução na expressão não se deve ao TCA per se, pois nos animais submetidos ao TCA e não expostos aos LCEs, houve aumentos na expressão de Fos em várias estruturas (MnR, DR, SC, dmHYP, AMY, CeAMY, BlAMY e PAG). Os resultados do presente estudo indicam que a exposição de animais ao LCEp e LCEa elicia antinocicepção em diferentes testes de nocicepção e que a aversão gerada pela exposição ao LCEa é mantida mesmo na ausência de conflito. É possível que a redução da marcação de Fos provocada em animais expostos concomitantemente aos LCEs e ao TCA esteja associada a inibição em nivel espinhal da estimulação dos feixes nociceptivos ascendentes provocada pela experiência no LCE. / The exposure of mice to the elevated plus-maze (EPM), an animal model of anxiety, results in exhibition of defensive behaviors and antinociception. It also induces Fos protein expression in several limbic structures in rats. The present study investigated possible neuroanatomical correlations between the structures involved in the modulation of fear and antinociception in mice exposed to differente types of EPM [enclosed (eEPM: four enclosed arms), standard (sEPM: two open and two enclosed arms) and open (oEPM: four open arms)] with or without prior nociceptive stimulation. The evaluation of Fos-like immunoreactivity (FLI) was used as a functional marker of neuronal activation in the periaqueductal gray matter (PAG) (dorsal and ventrolateral), amygdala (AMY), bed nucleus of the stria terminalis (BNST), solitary tract nucleus (Sol), dorsomedial hypothalamus (dmHYP), raphe nuclei [Magno (RMg), Median (MnR) and Dorsal (DR)], superior (SC) and inferior coliculus (IC) and parabrachial nucleus (PB). Experiment I assessed the effect of EPMs exposure under the nociceptive response in three different types of nociception test: tail flick test (TF), writhing test (WT: induced by i.p injection of 0.6% acetic acid) and formalin test (FT). While the EPM exposure produced inconsitent results in the TF, exposure to the sEMP and the oEPM resulted in antinociception in WT. Only the oEPM exposure elicited antinociception in the FT. Experiment II investigated FLI in animals submitted or not to the WT and exposed to the different EPMs (see above). A group without any manipulation to verify the basal expression of Fos was added to the study. Exposure to the oEPM and sEPM provoked, respectively, antinociception and open arm avoidance without any change in nociception. EPM exposure increased protein expression in dmHYP and ventrolateral PAG, an effect that was independent of the nociceptive stimulation. Acetic acid injection tended to decrease FLI in many structures and a significant effect was recorded in PB and MnR. However, in general, a high level of Fos expression was found in Basal and eEPM groups rendering data interpretation difficult. Experiment III investigated whether diary handling (10 days) would reduce the FLI. Two groups – one group to measure Fos Basal expression and one to measure Fos expression in animals submitted to the WT only – were included to the study. As in EXP II, animals avoided the open arms of the sEPM. Also exposure to sEPM and oEPM provoked antinociception. Compared to Exp. II, FLI was decreased in almost all structures investigated, but as recorded in EXP II, nociceptive stimulation reduced FLI in several structures (Sol, Gi, AMY and PAG) in animals concurrently exposed to EPM. An exception was in the DR, in which an enhancement of Fos expression was revealed in eEPM exposed animals. The reduction in FLI cannot be attributed to the WT per se, since an increment of FLI was detected in several structures (MnR, DR, SC, dmHYP, AMY, CeAMY, BlAMY and PAG) in mice submitted to the WT but not exposed to the EPM. Present results indicate that the sEPM and oEPM exposure elicit antinociception evaluated in different chemical nociceptive tests. The antinociceptive response induced by oEPM exposure suggests that conflict situation is not crucial to inhibit pain in mice. It is possible that the FLI reduction recorded in animals exposed concurrently to both EPM and WT is associated with an inhibitory effect of the EPM experience on the nociceptive spinothalamic bundle stimulation induced by WT.

O protocolo de teste/reteste no labirinto em cruz elevado (LCE) mostra que a experiência prévia no labirinto produz alterações duradouras nas respostas comportamentais de roedores. Nesse contexto, ratos submetidos ao LCE pela primeira vez apresentam um aumento característico na exploração dos braços abertos e uma redução dos comportamentos de avaliação de risco após a administração de drogas ansiolíticas. Na reexposição ao labirinto, porém, essas drogas tornam-se ineficazes em alterar as medidas tradicionais do LCE. Esse fenômeno foi inicialmente observado com o benzodiazepínico clordiazepóxido e referido como one-trial tolerance (tolerância de um ensaio OTT). A proposta do presente estudo é compreender a OTT por meio do exame dos fatores hormonais, cognitivos e neuroanatômicos envolvidos nesse fenômeno. A administração sistêmica do benzodiazepínico midazolam ou de metirapona, um bloqueador da síntese de glicocorticóides, reduziu a frequência dos comportamentos de avaliação de risco e dos níveis plasmáticos de corticosterona quando injetados antes das sessões teste ou reteste. Além disso, a reexposição de ratos ao LCE foi caracterizada por uma avaliação de risco mais proeminente, de acordo com a análise fatorial, e pela ativação de estruturas límbicas envolvidas com aspectos cognitivos do medo, como a região ventral do córtex pré-frontal medial (CPFm) e a amígdala, mostrada por meio da distribuição da proteína Fos. Midazolam administrado antes da primeira exposição ao LCE produziu uma redução significativa do número de neurônios Fos-positivos no córtex cingulado anterior, área 1 (Cg1) e nos núcleos anterior e pré-mamilar dorsal do hipotálamo. Por outro lado, midazolam causou uma redução no número de neurônios Fos-positivos no CPFm, amígdala, núcleo dorsomedial do hipotálamo e núcleos da rafe em ratos reexpostos ao LCE. Cg1 foi a única estrutura-alvo do benzodiazepínico em ambas as sessões. Resultados comportamentais similares aos produzidos pelo tratamento sistêmico foram obtidos com infusões de midazolam intra-Cg1. Esses resultados apontam para um papel crucial dos comportamentos de avaliação de risco no desenvolvimento da OTT e indicam o Cg1 como um importante sítio de ação ansiolítica dos benzodiazepínicos em roedores. / The elevated plus maze (EPM) test/retest protocol has shown that prior experience to the maze produces enduring changes in behavioral responses of rodents. In this context, rats submitted for the first time to the EPM display a characteristic increase in open arm exploration and reduced risk assessment behaviors after the administration of anxiolytic drugs. Upon re-exposure to the maze, however, these drugs become unable to change the traditional measures of the EPM. This phenomenon was initially observed with the benzodiazepine chlordiazepoxide and referred to as one-trial tolerance (OTT). The purpose of the present study is to understand the OTT through the exam of the hormonal, cognitive and neuroanatomical factors involved in this phenomenon. The systemic administration of the benzodiazepine midazolam or metyrapone, a glucocorticoids synthesis blocker, reduced the frequency of risk assessment behaviors and the corticosterone levels when injected before the test or retest sessions. Moreover, the re-exposure of rats to the EPM was characterized by more prominent risk assessment behaviors, according to the factor analysis, and by activation of limbic structures involved with cognitive aspects of fear, such as the ventral regions of the medial prefrontal cortex (mPFC) and amygdala, as shown through the distribution of the Fos protein. Midazolam injected before the first exposure to the EPM produced a significant decrease in the number of Fos-positive neurons in the anterior cingulate cortex, area 1 (Cg1), anterior and dorsal premammillary nuclei of hypothalamus. On the other hand, midazolam caused a decrease in the number of Fos-positive neurons in the mPFC, amygdala, dorsomedial nucleus of hypothalamus and raphe nuclei in rats re-exposed to the EPM. Cg1 was the only structure targeted by the benzodiazepine in both sessions. Behavioral results similar to those produced by systemic treatment were obtained with intra-Cg1 infusions of midazolam. These results point to a crucial role of the risk assessment behaviors in the development of the OTT and indicate the Cg1 as an important locus for the anxiolytic-like action of benzodiazepines in rodents.

A hipóxia-isquemia (HI) neonatal é uma causa importante de deficits neurológicos. Estimativas relatam que 3-5 em cada 1.000 nascidos vivos ocorrem encefalopatia neonatal, sendo que, encefalopatia hipóxico-isquêmica (EHI) moderada ou grave acomete 0,5-1/1000 dos nascidos vivos. Aproximadamente 10 a 60% das crianças com EHI morrem, e pelo menos 25% dos que sobrevivem, apresentam deficiência permanente, como paralisia cerebral, epilepsia e dificuldades na aprendizagem. Evidências clínicas e experimentais sugerem que a exposição a estímulos nocivos no início da vida pode resultar em mudanças duradouras no processamento sensorial. Apesar da magnitude do problema, pouco se conhece sobre a modulação da dor e mecanismos envolvidos durante um processo hipóxico-isquêmico em neonatos e suas conseqüências ao longo da vida. Sendo assim, a presente tese objetivou avaliar respostas comportamentais e bioquímicas de filhotes de ratos submetidos à hipóxia/isquemia no 7°dia de vida, avaliados em diferentes idades. Ninhadas de ratos Wistar machos foram randomizadas em 6 grupos experimentais: controle, hipóxia-isquemia, isquemia, hipóxia, sham-ischemia, sham-hipóxia. O modelo experimental utilizado foi de HI unilateral descrito por Levine (1960) e adaptado por Rice e colaboradores (1981), realizando-se isquemia através da oclusão da carótida esquerda e hipóxia com câmara hipóxica de 92% de nitrogênio e 8% de oxigênio. Avaliaram-se os animais no 14° (P14), 30°(P30) e 60° (P60) dias de vida. Para avaliação da (s) resposta (s): nociceptiva térmica foram utilizados testes de tail-flick e placa quente; e alodinia mecânica utilizou-se teste de Von Frey eletrônico. Para as avaliações dos biomarcadores foram utilizados kits comerciais de BDNF e TNF por métodos ELISA e LDH por espectrofotometria. A ativação neuronal foi quantificada em lâminas de imunoistoquímica de c-fos em regiões CA1 e giro dentado de hipocampo bilateral. Foi observado que ratos com hypoxia e/ou isquemia tiveram diminuição irreversível de neurônios com ativação por c-fos em área CA1 do hipocampo, região ipsilateral do insulto. Maior sensibilidade em animais com HI em P14 foi observado no teste do Von Frey, mas não foi observada em P30 e P60. Independentemente do grupo experimental, a idade do animal desempenhou um papel significativo na resposta de comportamento nociceptivo, bem como sobre o BDNF e dos níveis séricos de TNF-α, mas não sobre os níveis séricos de LDH. Em conclusão, o insulto cerebral da HI induz uma redução significativa e irreversível sobre a ativação neuronal ipisilateral à lesão, com a evidência de uma alteração da resposta comportamental nociceptiva manifestada no curto, mas não a médio ou longo prazo. Biomarcadores de neuroplasticidade, inflamação e danos celulares apresentaram poucas alterações sobre o insulto cerebral, mas mudanças mais pronunciadas foram observadas com relação à idade. / Neonatal hypoxia-ischemia (HI) is an important cause of neurological deficits. It is estimated that 3-5 in 1000 newborns suffer neonatal encephalopathy, and moderate or severe hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) in 0,5-1/1000 of the newborns. Approximately 10 to 60% of the children with HIE die, and at least 25% of the survivors present permanent deficits such as cerebral palsy, epilepsy and learning difficulties. Clinical and experimental evidence suggest that the exposure to noxious stimuli at the beginning of the life might result in long lasting changes in sensorial processing. Despite the magnitude of the problem, few is known regarding pain modulation and its involved mechanisms during the HI process in neonates and its life lasting consequences. Hence, the present thesis aimed to evaluate behavioral and biochemical responses in rats’ litters submitted to HI during their seventh day of life, evaluated at different ages. Male Wistar rats’ litters were randomized into 6 experimental groups: control, HI, ischemia, hypoxia, sham-ischemia and sham-hypoxia. The experimental model was the one of unilateral HI described by Levine (1960) and adapted by Rice et al (1981), inducing ischemia by occlusion of the left carotid artery, and hypoxia using hypoxic chamber with nitrogen 92% and oxygen 8%. Animals were evaluated in their 14th (P14), 30th(P30) and 60th (P60) postnatal day. To assess the thermal nociceptive response the tail flick and hot plate test were employed; and mechanical allodynia was assessed by means of the digital Von Frey test. To evaluate biomarkers, commercial BDNF and TNF kits with ELISA, and LDH kits with spectrophotometry were used. Neuronal activation was quantified by c-fos immunohistochemistry in CA1 and dentate gyrus of bilateral hippocampi. It was observed that rats with hypoxia and/or ischemia had irreversible diminution of neurons with c-fos activation in the CA1 area of the hippocampus ipsilateral to the insult. Higher sensitivity in animals with HI at P14 was observed in the Von Frey test, but was not observed at P30 or at P60. Irrespective of the experimental group, animals’ age played a significant role in the nociceptive behavioral response, as well as on the BDNF and TNF-α serum levels, but not on the LDH serum levels. In conclusion, cerebral HI insult induces a significant and irreversible reduction on neuronal activation ipsilateral to the insult, with evidence of a significant alteration on the nociceptive behavioral response manifested in the short, but not in the medium or long term. Biomarkers of neuroplasticity, inflammation and cellular damage present few alterations after the cerebral insult, however more pronounced changes were observed related with age.