Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-06-01T19:32:30Z No. of bitstreams: 1 2017_JamileMendesdeSouza.pdf: 1897459 bytes, checksum: dab45c6dc6c6b6a66aaa43b62141d549 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-06-21T23:40:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_JamileMendesdeSouza.pdf: 1897459 bytes, checksum: dab45c6dc6c6b6a66aaa43b62141d549 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-21T23:40:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_JamileMendesdeSouza.pdf: 1897459 bytes, checksum: dab45c6dc6c6b6a66aaa43b62141d549 (MD5) Previous issue date: 2017-06-21 / Trabalho realizado com apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Embrapa Gado de Corte, Embrapa Cerrados e Universidade de Brasília (UnB). / As pastagens, no sistema produtivo brasileiro, ocupam uma grande e significativa área, com mais de 190 milhões de hectares de pastagens tropicais tanto naturais quanto plantadas e que servem como fonte de alimento para o rebanho brasileiro que possui cerca de 214 milhões de cabeças, sendo esse, o segundo maior rebanho comercial do mundo. Estas pastagens são em grande parte compostas por gramíneas e leguminosas forrageiras e são essenciais para a produção e qualidade da carne e leite bovinos. O uso de Stylosanthes (leguminosa) vem crescendo no Brasil devido seu valor nutricional, além disso, apresenta grande potencial em recuperação de pastagens e áreas degradadas devido à fixação de nitrogênio, tornando-a capaz de crescer em regiões muito arenosas, sendo muito resistente à seca. Porém, problemas como manejo inadequado, ausências de adubações periódicas e problemas bióticos, têm prejudicado áreas que são destinadas à pecuária. Além desses problemas, recentemente, tem-se observado em campos experimentais e naturais da Embrapa, sintomas típicos daqueles causados por agentes de etiologia viral. Diante do exposto, o presente trabalho teve como objetivo geral estudar a diversidade e caracterizar molecularmente e biologicamente os vírus que estão infectando leguminosas forrageiras da espécie Stylosanthes guianensis no Brasil. Resultados preliminares obtidos via sequenciamento de nova geração (NGS) em duas amostras sintomáticas de Stylosanthes guianensis, oriundas da Embrapa Gado de Corte, detectou a presença de três novos vírus pertencentes à família Potyviridae. Simultaneamente, foi feita a montagem dos contigs e então, desenvolvidas ferramentas de detecção por RT-PCR com primers específicos em que uma região genômica, correspondente a 3’UTR, CP e NIb, foi amplificada e sequenciada pelo método Sanger. A partir do consenso do NGS, foram realizadas análises filogenéticas comparativas de nucleotídeos e também de aminoácidos das proteínas virais com base na poliproteína. Essas análises demonstraram que estes vírus potencialmente representam dois novos gêneros dentro da família e foram tentativamente nomeados como Stylosanthes mosaic associated virus 1 (StyMaV 1), Stylosanthes mosaic associated virus 2 (StyMaV 2) e Stylosanthes mosaic associated virus 3 (StyMaV 3). As próximas etapas do estudo desses patógenos envolverão a produção de clones infecciosos que permitirão uma melhor compreensão da interação entre esses novos membros da família Potyviridae e suas hospedeiras, assim como, possibilitar a busca de resistência genética em plantas forrageiras. / In Brazil forage crops occupie a large and significant area, with more than 190 million hectares of tropical pastures both natural and planted and serving as a food source for the Brazilian cow herds that has about 214 million animals, this is the second largest commercial herd in the world. These pastures are largely composed of grasses and forage legumes and are essential for the production and quality of bovine meat and milk. The use of Stylosanthes (legume) has been increasing in Brazil its nutritional value, in addition, it presents great potential in the recovery of pastures and degraded areas due to the nitrogen fixation, being able to grow in very sandy regions, being very resistant, management problems, absences from accidents and biological problems, have impaired areas that are destined to livestock. Besides the problems, recently, it has observed in experimental and natural fields of Embrapa, typical symptoms caused by agents of viral etiology. In view of the above, the present work had as general objective to study the diversity and to characterize molecularly and biologically the viruses that are infecting forage legumes of the species Stylosanthes guianensis in Brazil. Preliminary results obtained through new generation sequencing (NGS) in two symptomatic samples of Stylosanthes guianensis, from the Embrapa Gado de Corte, detected a new presence of new genes in the Potyviridae family. At the same time, the contacts were assembled and RT-PCR detection tools with specific primers were developed in a genomic region, corresponding to 3’UTR, CP and NIb, amplified and sequenced by the Sanger method. From the consensus of the NGS, comparative phylogenetic analyzes of nucleotides and also of amino acids of the viral proteins based on the polyprotein were made. (StyMaV 1), Stylosanthes mosaic associated virus 2 (StyMaV 2) and Stylosanthes mosaic associated virus 3 (StyMaV 3). The pathogen study stages involve the production of infectious clones that allow a better understanding of the interaction between the new members of the Potyviridae family and their hosts, as well as, make possible a search of genetic resistance in forage plants.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2016. / Submitted by Aline Mequita (alinealmeida@bce.unb.br) on 2016-11-21T16:28:26Z No. of bitstreams: 1 2016_GabrielaCorezziWerneck.pdf: 1385523 bytes, checksum: c2833d3a8449c2a1c2ac26e1daebbd63 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-06T18:37:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_GabrielaCorezziWerneck.pdf: 1385523 bytes, checksum: c2833d3a8449c2a1c2ac26e1daebbd63 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-06T18:37:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_GabrielaCorezziWerneck.pdf: 1385523 bytes, checksum: c2833d3a8449c2a1c2ac26e1daebbd63 (MD5) / Proteases são enzimas, que catalisam a hidrolise das ligações peptídicas. Estas enzimas são aplicadas em diversas indústrias como a alimentícia, farmacêutica, cosmética, de couro e de detergente. São produzidas por animais, plantas e microrganismos. Entre seus produtores encontram-se os fungos endofíticos, que são microrganismos que vivem no interior de plantas de forma simbiótica. Sabendo disso, o objetivo principal deste trabalho foi isolar fungos endofíticos de plantas do cerrado, avalia-los quanto á produção de proteases extracelulares, visando aplicação industrial. Foram isolados 58 fungos de 13 espécies de plantas endêmicas do cerrado. Primeiramente, foi realizada uma triagem para avaliar quais fungos eram produtores de protease, 36 fungos demonstraram halo indicando produção de protease em meio de cultura ágar-leite. Foi realizado ensaio enzimático utilizando azocaseína 0,5% como substrato para avaliar quantitativamente a produção de proteases. Os produtores que demonstraram maior atividade de protease foram os fungos endofíticos codificados como BR, OH03, PT02, PEQ03 e KC01. O fungo BR, apresentou 41 UI/mL de atividade proteolítica, pH ótimo 7,0 e temperatura ótima de 60°C e foi escolhido para dar continuidade ao trabalho. Visando a otimização da produção de protease foram testados meios com diferentes fontes de nitrogênio e carbono, a maior produção de proteases ocorreu no meio contendo peptona, extrato de levedura e glicose. A curva de crescimento mostrou que o melhor dia de produção da enzima foi o 9° dia. A protease foi parcialmente purificada utilizando cromatografia de troca iônica. A fração parcialmente purificada foi caracterizada com atividade ótima em pH 7,0 e 60°C e manteve 100% desta atividade a 60°C por 1 hora. A enzima foi testada como removedor de manchas para a indústria de detergentes melhorando a remoção de manchas quando adicionada a um detergente comercial e demonstrou ser compatível com marcas de detergente para roupas comerciais. ___________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Proteases are enzymes which catalyze the hydrolysis of peptides bonds. These enzymes are applied in various industries such as food, pharmaceutical, cosmetics, leather and detergent. They are produced by animals, plants and microorganisms. Among its producers are the endophytic fungi, which are microorganisms that live inside plants symbiotically. Thus, the aim of this study was to isolate endophytic fungi of the Cerrado biome plants and evaluate the production of extracellular proteases for an industrial application. It was isolated 58 endophytic fungi from 13 different species of endemic plants. First, a screening was performed to evaluate fungi protease producing. 36 fungi has shown halo production using milk agar culture. Enzyme assay was performed using azocasein 0.5% as substrate to evaluate quantitatively the production of proteases. The best producers were endophytes encoded as BR, OH03, PT02, PEQ03 and KC01. Since then BR fungus stood out among them. BR showed 41 IU / mL of proteolytic activity, optimum pH 7.0 and optimum temperature of 60 °C and was chosen. To optimize protease production the medium were tested with different carbon and nitrogen sources. The best production of proteases occurred in a medium containing peptone, yeast extract and glucose. The best day of the enzyme production, based on growth curve curve, was the 9th day. The protease was partially purified using ion exchange chromatography. The partially purified fraction was characterized and showed highest activity at pH 7.0, 60 °C and maintained 100% stability at 60 °C for 1 hour. The enzyme was tested as stain remover detergent industry to improve the spot removal. When added to a commercial detergent, the enzyme demonstrated to be compatible with commercial brands of detergent clothes.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Tecnologia, Departamento de Engenharia Florestal, Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-04-13T18:15:56Z No. of bitstreams: 1 2016_ElianMenesesOliveira.pdf: 5093536 bytes, checksum: 7c2632ead0b686f1c0b8a96327c0707a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-05-17T21:37:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_ElianMenesesOliveira.pdf: 5093536 bytes, checksum: 7c2632ead0b686f1c0b8a96327c0707a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-17T21:37:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_ElianMenesesOliveira.pdf: 5093536 bytes, checksum: 7c2632ead0b686f1c0b8a96327c0707a (MD5) / Este estudo teve como objetivo monitorar e avaliar, por meio de técnicas não destrutivas, o processo de biodeterioração das madeiras de Simarouba amara (marupá) e Eucalyptus saligna (eucalipto) submetidas aos fungos Trametes versicolor (podridão branca) e Gloeophyllum trabeum (podridão parda). O ensaio de apodrecimento acelerado ocorreu durante 12 semanas, e empregou-se uma adaptação da norma ASTM D 2017. As propriedades biológicas foram avaliadas por meio da perda de massa decorrente da exposição aos fungos apodrecedores. As técnicas não destrutivas de colorimetria, espectroscopia no infravermelho médio (DRIFT-MIR) e fluorescência molecular foram utilizadas para avaliar alterações nos parâmetros colorimétricos e nas propriedades químicas das espécies de madeira nos diferentes estágios de ataque dos fungos. Os resultados mostraram que a madeira de eucalipto apresentou maior resistência natural quando comparada à de marupá. O fungo de podridão parda apresentou ataque mais severo às madeiras, levando a uma maior alteração das propriedades tecnológicas estudadas. Os parâmetros mais alterados foram L*, a* e b*, sendo os principais estimadores da resistência natural das madeiras de marupá e eucalipto. O monitoramento dos parâmetros químicos por meio de DRIFT-MIR possibilitou a visualização de deformação na banda referente à celulose (899 cm-1) após o ataque do fungo de podridão parda. Entretanto, após o ataque do fungo de podridão branca, os espectros não foram alterados em forma, apenas em intensidade. A análise da fluorescência emitida pelas madeiras após o ataque de podridão branca e parda permitiu a detecção precoce do ataque e a discriminação entre os fungos apodrecedores até a quarta semana de exposição. Os ensaios não destrutivos de colorimetria, espectroscopia no infravermelho médio (DRIFT-MIR) e fluorescência molecular mostraram ser capazes de detectar alterações nos parâmetros colorimétricos e químicos logo nas primeiras semanas, além de permitir a discriminação entre os ataques de podridão branca e parda. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The present study aimed to monitore and evaluate, using non-destructive techniques, the biodeterioration process of Simarouba amara and Eucalyptus saligna woods submitted to Trametes versicolor (white rot) and Gloeophyllum trabeum (brown rot). The accelerated decay test occurred during 12 weeks, according to an adaptation of ASTM D 2017/2005. The biological properties were evaluated by weight loss due to the exposure to rot fungi. The non-destructive techniques of colorimetry, medium infrared spectroscopic (DRIFT-MIR) and molecular fluorescence were used to evaluate changes in colorimetric parameters and chemical properties of wood species in different levels of fungi decay. The results showed that Eucalyptus saligna wood presented a higher natural resistance when compared to Simarouba amara. Gloeophyllum trabeum presented a more severe attack to woods, leading to more changings in the technological properties studied. The most affected parameters were L *, a* and b *, the main estimators of natural resistance of Simarouba amara and Eucalyptus saligna woods. The monitoring of chemical parameters through DRIFT-MIR allowed visual deformation in the band related to the cellulose (899 cm-1) after the Gloeophyllum trabeum decay. However, after the Trametes versicolor decay, the spectra have not changed in shape, only in intensity. The emitted fluorescence analysis by woods after the Trametes versicolor and Gloeophyllum trabeum decay allowed early detection and discrimination between them until the fourth week of exposure. The non-destructive tests of colorimetry, medium infrared spectroscopic and molecular fluorescence have shown to be capable of detecting changes in colorimetric and chemical parameters in the first few weeks, and also permitting the discrimination between white and brown rot.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-04Bitstream added on 2014-06-13T19:55:51Z : No. of bitstreams: 1 henn_c_me_sjrp.pdf: 849585 bytes, checksum: d5adb0af2720ff51aa6a25169134ce33 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A introdução de moléculas xenobióticas no ambiente muitas vezes ocorre sem que sejam conhecidos muitos de seus aspectos bioquímicos e toxicológicos fundamentais. A presença anéis aromáticos na estrutura molecular muitas vezes é o fator determinante da toxicidade, recalcitrância e propriedades mutagênicas associadas e muitos destes compostos. O papel dos insumos agrícolas neste processo é de particular relevância, devido ao seu caráter de liberação intencional no ambiente e dos crescentes volumes aplicados em todo o mundo. Neste trabalho, foram selecionadas linhagens de basidiomicetos com base na sua tolerância aos herbicidas atrazina e diurom, para estudo detalhado do potencial de degradação e do papel desempenhado pelas enzimas ligninolíticas no processo. A tolerância não se mostrou relacionada à degradação dos xenobióticos; esta foi muito eficiente para algumas linhagens estudadas, chegando a 38% da atrazina e 96% do diurom, por MCA 17 agaricales e SXS 320 P. cubensis, respectivamente, após 20 dias de cultivo. As linhagens mais tolerantes à atrazina, Pluteus cubensis SXS 320 e Polyporus tenuiculus MCA 11, e ao diurom, Pycnoporus sanguineus MCA 16 e Dacryopinax elegans SXS 323, foram empregadas em ensaios mais detalhados para a degradação e produção de enzimas. Os efeitos de diferentes concentrações do diurom e da atrazina como única fonte de carbono ou em presença de fontes alternativas como glicose ou bagaço de cana (1%), foram determinados para os microrganismos tolerantes. Apenas Pycnoporus sanguineus MCA 16 e Polyporus tenuiculus MCA 11 produziram lacases, única enzima do sistema ligninolítico detectada nas culturas. No caso de Pycnoporus sanguineus, as lacases foram constitutivamente produzidas em meio contendo glicose, atingindo 283 U.l-1. A lacase de P. tenuiculus, por sua vez, foi produzida apenas em presença de constituintes... / The introduction of xenobiotic molecules in the environment often occurs without the knowledge about many basic aspects related to biochemistry and toxicology. The aromatic ring presence in their molecular structure many times is the determinant feature for toxicity, recalcitrance and mutagenic properties associated with those compounds. The role of agricultural chemicals in this process has particular relevance, due to their intentional release on environment and the crescent volumes employed worldwide. In this work, basidiomycete strains were chosen based on their tolerance to herbicides atrazine and diuron, for detailed study of the fungi’s degradative potential and the role developed by ligninolytic enzymes in this process. The tolerance was not related to xenobiotic’s degradation, which was very efficient for many strains, reaching 38% for atrazine and 96% for diuron, by MCA 17 Agaricales and SXS 320 Pluteus cubensis, respectively, after 20 days in culture. Those ones more tolerant to atrazine, Pluteus cubensis SXS 320 and Polyporus tenuiculus MCA 11, and for diuron, Pycnoporus sanguineus MCA 16 and Dacryopinax elegans SXS 323, were employed in assays focusing on degradation and enzyme production. The effect of different concentrations of diuron and atrazine as sole carbon source or in presence of alternative sources, like glucose and sugarcane bagasse (1%), were determined for tolerant microorganisms. Only Pycnoporus sanguineus MCA 16 and Polyporus tenuiculus MCA 11 have produced laccases, the unique enzyme of ligninolytic system detected in cultures. For Pycnoporus sanguineus, the laccases were constitutively produced in medium containing glucose, reaching 238 U.l-1. The laccase from P. tenuiculus was released only with the presence of lignocellulosic constituents in culture medium, resulting in 1,219 U.l-1 in medium containing wheat bran. The biochemical properties... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Nilton Luiz de Souza / Resumo: O pimentão (Capsicum annuum) é uma hortaliça de grande consumo no Brasil, e a murchadeira, causada por Phytophthora capsici, é uma das principais doenças da cultura, podendo causar perdas de até 100%. Este trabalho visou a avaliação de diversas características do patógeno: agressividade, nível de resistência dos genótipos de pimentão cultivados no estado de São Paulo, sensibilidade a fungicidas, oxigenação para produção de esporângios e caracterização molecular. A determinação destas variáveis tem importância prática para o produtor, na escolha correta de genótipo de pimentão e estratégia de controle; e, para instituições de pesquisa, na otimização da produção de inóculo para programas de melhoramento. Concluiu-se que a agressividade não depende do grupo de compatibilidade; assim como a sensibilidade a fungicidas e o comportamento em relação à oxigenação. Entre os genótipos escolhidos para o teste de resistência o híbrido Nathalie foi o que apresentou o melhor nível. A idade das plantas influenciou a manifestação da resistência. O balanço O2/CO2 influenciou diretamente na esporulação do patógeno. Em P. capsici marcadores de RAPD não foram consistentes na separação de grupos de compatibilidade. / Abstract: The sweet pepper (Capsicum annuum) is a vegetable well consumed in Brazil, and the blight, caused by Phytophthora capsici, is the main disease of the culture, and can cause losses up to 100%. This work sought the evaluation of several characteristics of the pathogen: aggressiveness, level of resistance of pepper genotypes cultivated in the state of São Paulo, sensibility to fungicides, aeration for sporangia production and molecular characterization. The determination of these characteristics have practical importance to the grower, for the correct choice of pepper genotype and control strategy; and, to research institutions, for the correct inoculum production in breeding programs. It was concluded that the aggressiveness doesn't depend of the mating type; as well as the sensibility to fungicides and the behaviour in relation to the aeration. Among the genotypes in the resistance test, the hybrid Nathalie was the one that presented the best level. The age of the plants influenced the manifestation of the resistance. The O2/CO2 balance had direst influence on the sporulation of the pathogen. In P. capsici RAPD markers are not consistent in the separation of mating types.

Orientadora: Valéria Marta Gomes do Nascimento / Banca: Jonas Contiero / Banca: Cintia Duarte de Freitas Milagre / Resumo: A riqueza nutricional da biomassa de Lasiosiplodia theobromae, resíduo do bioprocesso que tem como finalidade a produção de exopolissacarídeo (EPS), foi estudada neste trabalho, bem como a produção de EPS pelo mesmo fungo, em cultivos suplementados com esse biomaterial. Inicialmente, o microrganismo foi cultivado em condição padrão (sacarose 50 g/L, sais mínimos de Vogel (SMV) e nitrato de amônio 2 g/L, 28 °C, 72 h), e o EPS e a biomassa (Biomassa A), provenientes deste cultivo, foram separados e quantificados por gravimetria. Parte da biomassa foi lavada, por duas vezes, com solução de NaCl 0,15 mol/L, autoclavada, liofilizada, tamisada e analisada quanto à composição bromatológica (Weende e Kjeldahl) e de minerais (Absorção Atômica), e utilizada como suplemento aos meios de cultivo. A biomassa A apresentou 332 g/kg de C e 51 g/kg de N, além de sais minerais, como Zn, Fe, Cu, Mn, K, Mg, Ca, S e P. Para avaliar a adição de biomassa em meio de cultivo para produção de EPS, foram realizados 18 experimentos, com 6 diferentes composições (meios BSVN, BSV, BVN, BV, BN e B), identificados de acordo com a composição de nutrientes: Biomassa A 20, 40 ou 60 g/L (B), sacarose 50 g/L (S), SMV (V) e nitrato de amônio 2 g/L (N). Houve produção de EPS em 16 experimentos, sendo que em apenas três condições experimentais a produção de EPS foi inferior à condição padrão de cultivo. Destaque para os resultados obtidos em meios BV, compostos por biomassa 40 e 60 g/L e SMV, sendo 3,22 e 3,99 g/L de EPS, respectivamente, enquanto que na condição padrão de cultivo, houve produção de 1,3 g/L de EPS. A biomassa resultante do primeiro cultivo com adição de Biomassa A, identificada como Biomassa B (Biomassa A residual + biomassa de novo crescimento microbiano), também foi avaliada quanto à composição bromatológica e ... (Resumo completo clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The nutritional value of Lasiodiplodia theobromae' biomass, waste of the bioprocess used for the production of exopolysaccharide (EPS) was studied in this work, as well as the production of EPS by the same fungus when grown in cultures supplemented with this biomaterial. Initially the microorganism was cultured in standard conditions (Sucrose 50 g/L, Vogel minimal salts (SMV) and ammonium nitrate 2 g/L, 28 °C, 72 h) and the EPS and the biomass (A Biomass) from this culture were separated and quantified by gravimetry. Part of the biomass was rinsed twice with NaCl 0.15 mol/L solution, autoclaved, lyophilized, sieved and analyzed for chemical composition (Weende and Kjeldahl) and minerals (Atomic Absorption) and used as a supplement to culture medium. Biomass A presented 332 g/kg C and 51 g/kg of N, and minerals such as Zn, Fe, Cu, Mn, Mg, Ca, S and P. In order to evaluate the addition of biomass in the culture medium for EPS production, 18 experiments were conducted with six different compositions (BSVN, BSV, BVN, BV, BN and B growth mediums), identified accordingly to the nutritional components: A Biomass 20, 40 or 60 g/L (B), Sucrose 50 g/L (S), SMV (V) and ammonium nitrate 2 g/L (N). EPS production occurred in 16 experiments, and in only three experimental conditions EPS production was lower than on the standard cultivation condition. Emphasis to the results obtained in BV medium, composed by biomass 40 and 60 g / L and SMV, being 3.22 and 3.99 g/L EPS, respectively, while the standard conditions of cultivation, production occurred of 1.3 g/L EPS. The biomass resulting this first cultivation with addition of A Biomass, identified as B Biomass (A Biomass waste + the biomass new microbial growth) was also evaluated for their chemical and mineral composition. As result 414 g/kg C and 46 g/kg N. Cultivations on BV condition with ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-06-28T14:59:15Z No. of bitstreams: 1 2013_DianaPaolaGomezMendoza.pdf: 3302680 bytes, checksum: 30eebfba95186093786be13ff26f3486 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-06-28T15:12:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_DianaPaolaGomezMendoza.pdf: 3302680 bytes, checksum: 30eebfba95186093786be13ff26f3486 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-28T15:12:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_DianaPaolaGomezMendoza.pdf: 3302680 bytes, checksum: 30eebfba95186093786be13ff26f3486 (MD5) / Trichoderma harzianum é um fungo filamentoso capaz de secretar enzimas hidrolíticas ao meio extracelular as quais agem despolimerizando componentes da biomassa vegetal como celulose e hemicelulose. O conjunto de proteínas secretadas por uma célula é denominado de secretoma, uma subpopulação do proteoma total. Amostras correspondentes ao secretoma de T. harzianum foram obtidas por fermentação submersa (SmF) em meio sintético suplementado com 1 %(m/v) de glicose, celulose, xilana ou bagaço de cana como fonte de carbono. Os secretomas foram posteriormente submetidos à análise proteômica seguindo duas abordagens distintas, eletroforese bidimensional (2-DE) seguida de espectrometria de massas MALDI-TOF/TOF para a identificação de polimorfismos proteicos provenientes do gel, e LC-MS/MS para identificação do total de proteínas presentes em cada amostra. Os secretomas de T. harzianum foram igualmente tratados com a enzima PNGase F a fim de detectar presença de proteínas glicosiladas e mudanças no perfil bidimensional das amostras. O crescimento nas diferentes fontes de carbono resultou na identificação de diversos grupos de proteínas extracelulares que incluíram glicosil hidrolases como celulases, xilanases, pectinases e quitinases, bem como proteínas associadas à parede celular fúngica como hidrofobinas e proteínas elicitoras e um alto número de proteínas putativas, cuja expressão diferencial parece estar regulada pela natureza e complexidade da fonte de carbono utilizada na cultura. Adicionalmente este trabalho apresenta evidência sobre a ocorrência de complexos multienzimáticos no secretoma do fungo após o crescimento por SmF em bagaço de cana, graças à utilização de técnicas eletroforéticas, enzimológicas e espectrométricas como BN-PAGE, zimografia e LC-MS/MS, respectivamente. Os resultados indicam que proteínas secretadas por T. harzianum naturalmente envolvidas na desconstrução de substratos (hemi) celulolíticos e quitinolíticos formam parte de elementos oligoméricos constituídos por subunidades de diferente especificidade catalítica que aparentemente são requeridas para uma conversão eficiente e específica dos polímeros da biomassa. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Trichoderma harzianum is a filamentous fungus able to secret hydrolytic enzymes to the extracellular medium which act degrading the biopolymeric components of plant biomass such as cellulose and hemicellulose in fermentable sugars. This set of secreted proteins corresponds to the secretome, a subset of the proteome. The samples related to the T. harzianum secretome were obtained by submerged fermentation (SmF) in synthetic medium supplemented with1% (w/v) glucose, cellulose, xylan or sugarcane bagasse as a carbon source. The secretomes were explored by two different proteomic approaches, gel-based proteomics using two-dimensional electrophoresis (2-DE) followed by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry for the identification of the protein polymorphisms from the gel, and gel-free proteomics using LC-MS/MS for identification of the total of protein present in each sample. The T. harzianum secretomes were also treated with the enzyme PNGase F in order to detect the presence of glycosylated proteins and changes in the dimensional profile of the samples. Growth on different carbon sources resulted in the identification of several groups of extracellular proteins such as glycoside hydrolases including cellulases, xylanases, pectinases, chitinases, as well as cell-wall associated hydrophobins and elicting proteins, and putative proteins whose differential expression appears to be regulated by the nature and complexity of the carbon sources used in the culture. In addition the occurrence of multienzymatic complexes in the secretome after SmF growth in sugarcane bagasse containing medium was demonstrated by means of electrophoretic, spectrometric and enzymologic techniques, such as BN-PAGE, zimography, and LC-MS/MS, respectively. The results indicate that enzymes and proteins secreted by T. harzianum naturally involved in the deconstruction of (hemi) cellulolytic and chitinolytic substrates are part of oligomeric elements composed of subunits with different catalytic specificities apparently required for specific and efficient conversion of biomass polymers.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-11T20:16:38Z No. of bitstreams: 1 2009_DianaPaolaGomezMendonza.pdf: 1719944 bytes, checksum: 7f9cd7d8e9a8ea98371da5f284ba1d63 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-04T18:33:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_DianaPaolaGomezMendonza.pdf: 1719944 bytes, checksum: 7f9cd7d8e9a8ea98371da5f284ba1d63 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-04T18:33:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_DianaPaolaGomezMendonza.pdf: 1719944 bytes, checksum: 7f9cd7d8e9a8ea98371da5f284ba1d63 (MD5) Previous issue date: 2009 / O fungo filamentoso Trichoderma harzianum conhecido produtor de enzimas extracelulares como xilanases e celulases foi crescido em três fontes de carbono quimicamente definidas, glicose, celulose e xilana e uma fonte complexa, bagaço de cana, a fim de determinar-se as variações que cada uma geraria na atividade enzimática e na composição do secretoma do fungo. A produção enzimática de T. harzianum sobre bagaço de cana foi inicialmente avaliada durante 15 dias, evidenciando pouca variação em termos de concentração, produção de proteínas e perfis eletroforéticos ao longo do tempo. Após crescimento por 9 dias, detectou-se atividade xilanolítica (0,00610 UI/mL) e celulolítica (0,00497 UI/mL, 0,00926 UI/mL) no meio suplementado com glicose, indicando uma possível produção constitutiva das enzimas. A mais alta atividade xilanolítica(0,09514UI/mL) e celulolítica (0,03257UI/mL, 0,06353UI/mL) foram observadas quando T. harzianum foi cultivado em meio com bagaço de cana como fonte de carbono. Os secretomas foram submetidos a eletroforese bidimensional (2-DE) em faixa de pH 3-10 que mostrou perfil pouco complexo na amostra do meio com glicose e uma maior concentração de spots protéicos na região ácida dos demais géis. Foram então realizadas eletroforeses 2-DE na faixa de pH 4-7, a fim de obter melhor resolução de spots correspondentes a possíveis isoformas protéicas. Os géis bidimensionais na faixa de 4-7 foram submetidos a análise de imagens para determinar o número total de spots em cada gel assim como os spots exclusivos e os pareados entre as diferentes condições. Tentativas de identificação de spots por peptide mass fingerprinting e MS/MS mostraram baixa porcentagem de sucesso, provavelmente devido ao baixo número de sequências de T. harzianum em banco de dados e a existência de modificações pós-traducionais como glicosilações nas enzimas secretadas. Nacetil-glucosaminidase e α-L-Arabinofuranosidase, foram identificadas no secretoma obtido em meio contendo bagaço de cana. Espera-se que a conclusão dos mapas secretômicos possa contribuir na compreensão dos mecanismos de expressão e secreção de enzimas de T. harzianum e aplicações destas em processos biotecnológicos. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The filamentous fungus Trichoderma harzianum recognized producer of extracellular enzymes such as xylanase and cellulases was grown in three chemically defined carbon sources, glucose, cellulose and xylan, and a complex source, sugarcane bagasse, in order to determine the variations in enzyme activity and secretome composition of fungus. The enzyme production of T. harzianum on sugarcane bagasse, was initially evaluated for 15 days, showing little variation in terms of concentration, protein production and electrophoretic profiles over time. After 9 days of growth, xylanolytic (0,00610 UI/mL) and cellulolytic (0,00497 UI/mL, 0,00926 UI/mL) activities were detected in the medium supplemented with glucose, indicating a possible constitutive production of enzymes. The major cellulolytic (0,03257UI/mL, 0,06353UI/mL) and xylanolytic (0,09514UI/mL) activities were observed when the T. harzianum was grown in medium with sugarcane bagasse. The secretoms were subjected to two-dimensional electrophoresis (2-DE) in pH range 3-10 showed low complex profile in the sample of medium with glucose and a greater concentration of proteic spots in the acidic region of other gels. Electrophoresis were then performed 2-DE in the range of pH 4-7, to obtain greater resolution of spots corresponding to possible protein isoforms. The two-dimensional gels in the range of 4-7 were subjected to computational analysis of images that showed the total number of spots in each gel as well as exclusive and matched spots between the different conditions. Attempts to identify spots by peptide mass fingerprinting and MS / MS showed low percentage of success, probably due to the low number of sequences of T. harzianum in the database and the existence of posttranslational modifications as glycosylation in the secreted enzymes. N-acetyl-glucosaminidase and α-L- arabinofuranosidase, were identified in sugarcane bagasse secretome. It is expected that the conclusion of secretomic maps can contribute to a better understanding of the expression and secretion mechanisms of T. harzianum enzymes and their applications in biotechnological processes.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2010-04-12T17:42:29Z No. of bitstreams: 1 2009_MarcianoRegisRubini.pdf: 2622231 bytes, checksum: f773aa263b3bbdea97f0aa7e2286386a (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-03T21:06:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_MarcianoRegisRubini.pdf: 2622231 bytes, checksum: f773aa263b3bbdea97f0aa7e2286386a (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-03T21:06:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_MarcianoRegisRubini.pdf: 2622231 bytes, checksum: f773aa263b3bbdea97f0aa7e2286386a (MD5) Previous issue date: 2009-08 / Neste trabalho foram realizados estudos pioneiros de Biologia Molecular com o fungo Penicillium echinulatum linhagem 9A02S1 (DSM 18942), que resultaram no primeiro isolamento e caracterização de um cDNA correspondente ao gene egl1, codificador da endoglicanase 1 (EGL1). O cDNA egl1 foi obtido a partir de uma biblioteca construída sob condições de indução do sistema celulolitico deste fungo. Sua sequência, de 1161 pares de bases, exibe alto grau de identidade com genes de endoglicanases fúngicas da família 5A. Este codifica uma proteína predita de 387 resíduos de aminoácidos, com massa molecular de 41,1 kDa, ponto isoelétrico teórico de 4,99 e um sitio potencial de N glicosilação. A proteína predita possui três diferentes domínios: um domínio catalítico, um domínio de ligação à celulose (CBD) altamente conservado, e uma região de conexão entre os dois domínios (hinge). A partir da seqüência predita de aminoácidos de EGL1 foi possível realizar a modelagem tridimensional, utilizando-se proteínas existentes em banco de dados (PDB). Tal proteína apresenta propriedades estruturais similares às endoglicanases da família 5A. O cDNA egl1 foi clonado em um vetor de expressão de Pichia pastoris, pPIC9. Após a transformação, clones recombinantes exibindo maior atividade enzimática foram selecionados, utilizando-se micro-fermentações em placa Deep Well. Após a seleção do melhor clone produtor, foram avaliadas as propriedades bioquímicas da enzima recombinante, bem como a otimização das condições de cultivo e posterior caracterização de sua cinética enzimática. A enzima recombinante expressa em P. pastoris apresenta características de particular interesse para a utilização em processos indústriais: uma atividade ótima na faixa de pH 5,0 – 9,0, temperatura ótima a 60°C, exibindo alta termoestabilidade a 70°C após uma hora de pré-incubação, sendo a atividade da EGL1 recombinante fortemente estimulada pela adição do íon cálcio na reação. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / This work describes the pioneering molecular biology studies with the fungus Penicillium echinulatum lineage 9A02S1 (DSM 18942), which resulted in the first isolation and characterization of a cDNA corresponding to an egl1 gene, encoding a endoglucanase 1 (EGL1). The egl1 cDNA was obtained from a library constructed under induction conditions of the cellulolytic system of this fungus. The cDNA sequence is 1,161 base pairs long, showing high identity scores with genes of fungal endoglicanases family 5A. It encodes a predicted protein of 387 amino acid residues, with molecular mass of 41.1 kDa, theoretical isoelectric point of 4.99 and a potential site of N-glycosylation. The predicted protein has three different domains: a catalytic domain, a highly conserved carbohydrate binding domain (CBD), and a region linking the two domains (hinge). From the predicted amino acid sequence of EGL1 it was possible to perform a three-dimensional modeli, using protein sequences deposited in data bank (PDB). The solved structure revealed that this protein displays structural properties similar to those observed in family 5A endoglucanases. The egl1 cDNA was cloned in a Pichia pastoris expression vector, pPIC9. Following transformation, recombinant clones with higher enzymatic activity were selected, using microfermentations in Deep Well plates. After selecting the best producer clone, we evaluated the biochemical properties of recombinant enzyme, as well as the optimization of culture conditions and subsequent characterization of the enzyme kinetics. The recombinant EGL1 secreted by the recombinant P. pastoris revealed characteristics of particular interest for industrial applications: an optimal activity over a broad range pH (5.0 – 9.0) and an optimal temperature of 60°C. The recombinant EGL1 showed high thermostability at 70°C after 1 h of pre-incubation, and the activity of recombinant EGL1 was strongly stimulated by the addition of calcium ion in the reaction.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-11T14:26:54Z No. of bitstreams: 2 Tese Josiane Santana Monteiro.pdf: 10955046 bytes, checksum: 4e405851eeac883e7daa917660adff42 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-11T14:26:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese Josiane Santana Monteiro.pdf: 10955046 bytes, checksum: 4e405851eeac883e7daa917660adff42 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-02-24 / CAPES / Os fungos são importantes componentes da cadeia trófica nos ambientes aquáticos, atuando como decompositores da matéria orgânica que é levada para estes sistemas, além de contribuírem para aumentar a palatabilidade do material vegetal utilizado por organismos de outros níveis tróficos. Diversos representantes do reino Fungi estão presentes nos ambientes aquáticos e, dentre esses, os fungos conidias são os mais comuns e bem adaptados a estes ambientes. Ecologicamente, são classificados em três grupos distintos de acordo com seus ciclos de vida: fungos aeroaquáticos, fungos aquáticofacultativos e fungos ingoldianos. Para o Bioma Amazônia os estudos sobre fungos presentes no ambiente aquático ainda são escassos. Assim, o presente trabalho teve por objetivo realizar um estudo taxonômico das espécies de fungos conidiais associadas a substratos vegetais em decomposição submersos em corpos d’água de três fragmentos florestais na região metropolitana de Belém, Estado do Pará. Expedições de coleta foram realizadas na Área de Proteção Ambiental Ilha do Combu, Parque Ecológico de Gunma e Parque Estadual do Utinga, entre abril de 2011 a janeiro de 2013. As amostras de substratos vegetais (folhas e galhos) coletadas foram levadas ao Laboratório de Micologia da Universidade Estadual de Feira de Santana, e submetidas à técnica de lavagem em água corrente. Os substratos foram colocados em câmaras-úmidas e incubados à temperatura ambiente por um período de 30 dias e, diariamente, foram analisados em estereomicroscópio. Lâminas permanentes foram confeccionadas com as estruturas reprodutivas e a identificação dos espécimes baseou-se em estudos morfológicos. As lâminas foram incorporadas ao Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana (HUEFS) e Herbário Padre Camille Torrend (URM). Os resultados deste estudo incluem o registro de 235 espécies fúngicas com a descrição de dois novos gêneros (Helicodochium e Atrogeniculata) e dez novas espécies incluídas em Arachnophora, Ceratosporella, Dictyochaeta, Fusichalara, Fusticeps, Nigrolentilocus e Thozetella. Vários novos registros foram encontrados e, dentre estes, 22 para o Brasil; 23 para América do Sul; três para o Neotrópico e 21 para o Continente Americano. Este estudo contribui para ampliar o conhecimento da diversidade de fungos conidiais presentes em ambientes aquáticos no Brasil, particularmente na Amazônia brasileira, ressaltando a importância de se explorar novos habitats em pesquisas micológicas.