Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-03-06T14:52:59Z No. of bitstreams: 1 2011_MiguelCampeloMeloFerraz.pdf: 2183258 bytes, checksum: 1c17fabbfdac60368588a51256fe7807 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-03-07T12:35:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_MiguelCampeloMeloFerraz.pdf: 2183258 bytes, checksum: 1c17fabbfdac60368588a51256fe7807 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-07T12:35:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_MiguelCampeloMeloFerraz.pdf: 2183258 bytes, checksum: 1c17fabbfdac60368588a51256fe7807 (MD5) / Fonsecaea pedrosoi é um fungo dimórfico, caracterizado pelas formas aprofítica/reprodutiva (micélio/conídio) e infecciosa (corpos escleróticos), pertencente à família Dematiceae. Habita o solo, plantas e matéria orgânica em decomposição. Encontra-se em todos os continentes, mais comumente em regiões tropicais e subtropicais da América, Ásia e África. F. pedrosoi é o principal agente etiológico da cromoblastomicose, uma doença infecciosa crônica da pele e do tecido subcutâneo. No Brasil, essa doença é endêmica na região Amazônica. A infecção ocorre por implantação traumática transcutânea de conídios e fragmentos de hifa do fungo, acometendo principalmente trabalhadores rurais. Poucos são os dados a respeito da biologia molecular de F. pedrosoi disponíveis na literatura científica. Informações a respeito da expressão gênica são essenciais à compreensão do mecanismo de interação patógeno-hospedeiro e para o desenho de novas estratégias terapêuticas e de drogas específicas. Nesse sentido, o objetivo do presente trabalho foi a construção de uma biblioteca de cDNA de F. pedrosoi, seguido do sequenciamento de clones de cDNA dessa biblioteca e da respectiva geração de um banco de sequências expressas (ESTs, Expressed Sequence Tags). Dentre 480 ESTs analisadas, empregando ferramentas convencionais de bioinformática (pipeline disponível on-line: http://helix.biomol.unb.br/phph/index.html), 353 sequências de nucleotídeos distintas foram selecionadas segundo os parâmetros específicos estabelecidos (QV > 20 e extensão > 100 bases). Destas, 139 sequências apresentaram similaridade com sequências depositadas em banco de dados, dentre as quais destacam-se genes de transportadores de íons, transportadores de drogas, enzimas envolvidas na respiração celular, proteínas de parede celular e proteínas de choque térmico. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Fonsecaea pedrosoi is a dimorphic fungus, characterized by saprophytic/reproductive (mycelium/conidia) and infectious forms (sclerotic bodies) belonging to the family Dematiceae. Inhabits soil, plants and decaying organic matter. It is found in all continents, most commonly in tropical and subtropical America, Asia and Africa. F. pedrosoi is the major etiologic agent of chromoblastomycosis, a chronic infectious disease of the skin and subcutaneous tissue. In Brazil, this disease is endemic in the Amazon region. Infection occurs by traumatic transcutaneous implantation of conidia and hyphae fragments of the fungus, affecting mainly rural workers. There are few data regarding the molecular biology of F. pedrosoi available in scientific literature. Information on the gene expression is essential to understanding the mechanism of host-pathogen interaction and for designing new therapeutic strategies and specific drugs. Thus, the purpose of this study was to construct a cDNA library of F. pedrosoi, followed by sequencing of cDNA clones in this library and the generation of a database of expressed sequence tags (ESTs). Of 480 ESTs analyzed, using conventional tools of bioinformatics (pipeline available online: http://helix.biomol.unb.br/phph/index.html), 353 distinct nucleotide sequences were selected according to specific parameters established (QV > 20 and length > 100 bases). Of these, 139 sequences showed similarity to sequences stored in databases, among which stand out genes of ion transporters, drug transporters, enzymes involved in cellular respiration, cell wall proteins and heat shock proteins.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-03-08T14:21:26Z No. of bitstreams: 1 2011_PedroGoesMesquita.pdf: 3103350 bytes, checksum: 5f80214db9abd08147986bc7114c1cf5 (MD5) / Approved for entry into archive by Leila Fernandes (leilabiblio@yahoo.com.br) on 2012-03-16T15:55:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_PedroGoesMesquita.pdf: 3103350 bytes, checksum: 5f80214db9abd08147986bc7114c1cf5 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-16T15:55:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_PedroGoesMesquita.pdf: 3103350 bytes, checksum: 5f80214db9abd08147986bc7114c1cf5 (MD5) / O diabetes mellitus é uma desordem metabólica que acomete milhões de pessoas em todo o mundo e que está associada à disfunção de vários órgãos, à diminuição da expectativa de vida, além da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs). Tiazolidinadionas são substâncias agonistas totais de receptores ativados por proliferadores peroxissomais (PPAR ), capazes de aumentar a sensibilidade à insulina e, por isso, utilizadas no tratamento do diabetes tipo 2. Porém, estas substâncias promovem o aparecimento de efeitos adversos durante o tratamento, como aumento no risco do infarto do miocárdio, hepatopatia e ganho de peso. Por causa dos efeitos indesejados, substâncias que possam substituir a terapia com tiazolidinadionas no tratamento do diabetes têm sido buscadas. Estudos recentes mostraram que extratos das folhas da Bauhinia variegata são capazes de ativar o PPAR e, ainda, que ligantes de PPARs podem regular a produção de EROs. Fungos endofíticos, microrganismos que colonizam os tecidos das plantas de forma simbiótica, são responsáveis pela produção de produtos naturais com efeitos biológicos importantes. Alguns deles são capazes de produzir os mesmos metabólitos do seu hospedeiro. O objetivo deste trabalho foi isolar das folhas de Bauhinia variegata fungos endofíticos que pudessem ser avaliados como fonte de compostos antioxidantes e agonistas a receptores nucleares PPAR . Nove extratos de cultura dos fungos endofíticos das folhas de Bauhinia variegata foram obtidos, todos apresentaram atividade antioxidante no ensaio sequestro do radical estável 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPHo) e um desses extratos, que apresentou a menor taxa de atividade antioxidante, apresentou atividade agonista parcial ao PPAR pelo ensaio de gene repórter. Além disso, todos os extratos apresentaram altos teores de polifenóis e flavonóides nas quantificações realizadas pelos métodos Folin-Ciocalteu e cloreto de alumínio, respectivamente. Estudos posteriores devem ser realizados para melhor elucidar esta relação PPAR/EROs. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Diabetes mellitus is a metabolic disorder that affects millions of people worldwide and it is associated with multiple organ diseases, decreased life expectancy, besides the production of reactive oxygen species (ROS). Thiazolidinediones, full agonists of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) are able to increase insulin sensitivity and, therefore, they are used in the treatment of type 2 diabetes. However, these substances can promote the coming out of adverse effects during the treatment, such as increased risk of myocardial infarction, liver disease and weight gain. Because of the unwanted effects, substances that could replace the thiazolidinedione therapy in diabetes care have been pursued. Recent studies have shown that extracts of the Bauhinia variegata leaves are able to activate the PPAR, and also that PPARs ligands can regulate the production of ROS. Endophytic fungi, microorganisms that colonize the tissues of plants in a symbiotic form, are responsible for the production of natural products with important biological effects. Some of them are capable of producing the same metabolites produced by their host plants. The objective of this study was to isolate endophytic fungi from the Bauhinia variegata leaves that could be evaluated as a source of antioxidant compounds and agonists of PPAR. Nine extracts were produced from cultures of endophytic fungi isolated from Bauhinia variegata leaves, and all of them showed antioxidant activity in the scavenge the stable radical 2,2-diphenyl-1-picril-hydrazyl (DPPH•). Among the extracts, the one showing the lowest rate of antioxidant activity, was the only one that showed partial agonist activity to PPAR, according to reporter gene assay. In addition, all extracts produced showed high levels of polyphenols and flavonoids in the measurements carried out by the methods of Folin-Ciocalteu and aluminum chloride, respectively. Further studies should be conducted to further elucidate this relationship PPAR/ROS.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2011. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2012-03-26T13:07:53Z No. of bitstreams: 1 2010_ClaudioJoseOliveiraSouza_Parcial.pdf: 391277 bytes, checksum: cd10f63fe321539df90cc7a62492c131 (MD5) / Rejected by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br), reason: on 2012-03-26T15:29:10Z (GMT) / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2012-03-26T16:34:28Z No. of bitstreams: 1 2011_JorgeWilliamArboledaValencia_Parcial.pdf: 305137 bytes, checksum: d980502aca4c6f93fd3f9a478bcda6aa (MD5) / Approved for entry into archive by Elzi Bittencourt(elzi@bce.unb.br) on 2012-03-29T14:50:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_JorgeWilliamArboledaValencia_Parcial.pdf: 305137 bytes, checksum: d980502aca4c6f93fd3f9a478bcda6aa (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-29T14:50:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_JorgeWilliamArboledaValencia_Parcial.pdf: 305137 bytes, checksum: d980502aca4c6f93fd3f9a478bcda6aa (MD5) / A biotecnologia visa atender inúmeros problemas que afetam a humanidade e para isto muitas moléculas devem ser exploradas como ferramentas para construir soluções alternativas. Metabólitos como os produzidos por fungos apresentam geralmente duplicidade de ação, o que permite explorar seu potencial uso em aplicações industriais em diferentes áreas, como farmacologia, agroindústria, bioprocessos, tecnologia ambiental e bioconversão. Com o objetivo de estabelecer o potencial dos metabólitos produzidos pelo fungo Beauveria bassiana, toxinas puras (beauvericina, basianina, tenellina, oosporeina) e extratos brutos foram testados em diferentes ensaios de atividade citotóxica e antimicrobiana. Os resultados mostram que a produção de beauvericina (BEA) foi significativamente diferente entre todos os isolados e sugerem uma ativa participação desses metabólitos na morte do inseto, mostrando diferenças estatisticamente significativas entre a CC50 de BEA sobre a linhagem celular Spodoptera frugiperda SF-9 (2,81 e 6,94 μM) e os valores das outras micotoxinas (4,23 - 11,95 μM). Adicionalmente, demonstrou-se o efeito no desenvolvimento da ferrugem e redução na germinação. Todos os tratamentos dos metabólitos puros e dos extratos brutos provenientes do crescimento do fungo B. bassiana apresentaram efeitos inibitórios sobre as diferentes espécies de bactérias utilizadas nos ensaios mostrando atividade bactericida contra o gênero Proteus sp. e bacteriostática sobre os gêneros Staphylococcus sp., Klebsiella sp., Salmonella sp .e E. coli. Da mesma forma, as enzimas digestivas β-glicosidases e Leucina-aminopeptidase (LAP) da broca gigante da cana-de-açúcar Telchin licus licus foram estudadas visando o controle da praga. Os resultados mostraram que as β–glicosidases da broca possuem uma Km e Vmax para p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (pNβG) de 1,74 mM e 0,005 mmol/min/mg de proteína respectivamente, a melhor atividade da enzima foi encontrada com pH 6,0 e 7,0 e temperatura entre 50 e 55° C. Do mesmo modo, demonstrou-se o efeito de diferentes inibidores e ativadores da enzima, registrando para Mg2+ o maior incremento em atividade. Na comparação da atividade especifica de LAPs com outros insetos, Hypothenemus hampei mostrou a maior atividade. T. licus licus possui 3 isoformas da enzima que são inibidas completamente com bestatin 0,1 mM a pH 7,0. Adicionalmente, um completo estudo da atividade holocelulase do fungo Schizophyllum commune demonstrou o efeito indutor do carboximetilcelulose (CMC) 1% e das diferentes fontes de carbono na produção das enzimas, aparentes Km e Vmax para pNβG das β–glicosidases de 0,303 mM e 0,504 mmol/min/mg de proteína, a melhor atividade da enzima foi a temperatura entre 50 - 60˚ C e pH 7,0. Finalmente, usando microscopia eletrônica de varredura (MEV) o mecanismo físico usado pelo fungo para degradar bambu (Guadua angustifolia) foi observado e o potencial dos metabólitos produzidos avaliado. Os dados aqui apresentados constituem uma valiosa ajuda no desenho de estratégias voltadas a geração de plantas resistentes aos insetos-praga estudados, na busca de novos compostos antibacterianos e no aproveitamento de resíduos lignocelulósicos para produção de álcool de segunda geração. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Biotechnology aims to address several problems affecting mankind. For this reason, many molecules should be explored as tool to develop new alternatives solutions. Metabolites produced by fungi have usually double action, which allow approach theirs potentials use in different industrial applications in areas such as pharmacology, agroindustry, bioprocess, environmental technology and bioconversion. In order to establish the potential of metabolites from Beauveria bassiana fungus, the cytotoxicity and antimicrobial activity of pures toxins (beauvericin, bassianin, tenellin, oosporein) and crude extracts were tested. The results show that beauvericin (BEA) production was significantly different among all isolates and suggest an active participation of these metabolites in the insect’s death. Statistical difference was found when BEA CC50 values on cell line Spodoptera frugiperda SF-9 (2.81 and 6.94 μM) were compared with those values from others mycotoxins (4.23 - 11.95 μM). Additionally, it was shown an effect on the development of rust, and reduced germination. All treatments of pure metabolites and crude extracts from B. bassiana growth showed inhibitory effects on different species of bacteria used in bioassays, showing bactericidal activity on the genus Proteus sp. and bacteriostatic effect on the genus Staphylococcus sp., Klebsiella sp., Salmonella sp. and E. coli. Likewise, digestive enzymes β-glucosidases and Leucine aminopeptidase (LAP) from sugarcane giant borer Telchin licus licus were studied in order to control the insect pest. The results showed apparent Km and Vmax towards p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside of 1.74 mM and 0.005 mmol/min/mg of protein respectively for β-glucosidases, the highest enzyme activity resulted with pH between 6.0 and 7.0 and temperature between 50 e 55 °C. Besides, it was shown an effect of activators and inhibitors on the enzyme with major increments with Mg2+. The LAP specific activity was compared among different insects and Hypothenemus hampei exhibited the highest activity. T. licus licus has three isoforms that are inhibited completely with 0.1 mM bestatin at pH 7.0. Finally, a complete study of holocellulase activity from Schizophyllum commune fungus showed inducing effect of 1% carboxymethyl-cellulose CMC and different carbon sources on enzyme production. Km and Vmax towards p-nitrophenyl-β-D- glucopyranoside (pNβG) of β-glucosidases were 0.303 mM and 0.504 mmol / min / mg protein respectively, the highest enzyme activity resulted with temperature between 50 - 60˚ C and pH 7.0. Finally, by using scanning electron microscopy (SEM), the physical mechanism used by the fungus to degrade bamboo (Guadua angustifolia) was observed and the potential of metabolites produced was evaluated. The data presented here constitute a valuable contribution in the design of strategies to generate plants resistant to insect pests, in search of new antibacterial compounds and the use of lignocellulosic residues for production of second generation biofuels.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-08-26T14:41:10Z No. of bitstreams: 1 2013_DandaraBragaSantana.pdf: 2501353 bytes, checksum: 6d96772a5d16d10a2900c58bb4539ea7 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-08-29T15:47:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_DandaraBragaSantana.pdf: 2501353 bytes, checksum: 6d96772a5d16d10a2900c58bb4539ea7 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-29T15:47:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_DandaraBragaSantana.pdf: 2501353 bytes, checksum: 6d96772a5d16d10a2900c58bb4539ea7 (MD5) / Tanto as infecções fúngicas quanto as leishmanioses são caracterizadas por tratamentos tóxicos, resistência crescente aos medicamentos disponíveis e manejo clínico com fármacos similares, como a anfotericina B. Diante desse cenário, descobrir novas alternativas terapêuticas para esses modelos biológicos torna-se uma ferramenta interessante para a comunidade acadêmica e necessária para a prática clínica. Os metabólitos secundários de plantas são uma fonte importante de moléculas promissoras para diversas doenças. Neste trabalho foi realizado uma triagem de extratos pertencentes a três espécies de plantas do Cerrado em Leishmania (Leishmania) amazonensis, dermatófitos e leveduras: Enterolobium ellipticum Benth. (Fabaceae), Sclerolobium aureum (Tul.) Baill. (Fabaceae) e Vatairea macrocarpa (Benth.) Ducke (Fabaceae). O extrato de Vatairea macrocarpa apresentou os melhores resultados nos micro-organismos testados, sendo que essa atividade ainda não havia sido relatada na literatura. O extrato acetato de etila da casca da raiz foi selecionado para o fracionamento químico e foram isolados e identificados os compostos dianellidina (D3) e vatacarpina (D93), sendo esta última não descrita na literatura. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmaniasis as well fungal infections are diseases which have toxic and similar treatments (i.e., amphotericin B) and increasing resistance to available drugs. So, finding out new therapeutic alternatives for these biologic models is essential to research and clinical practices. Plant secondary metabolites are an interesting avenue to find out promising molecules to several diseases. This work conducted a screening of Cerrado species extracts Enterolobium ellipticum Benth. (Fabaceae), Sclerolobium aureum (Tul.) Baill. (Fabaceae) e Vatairea macrocarpa (Benth.) Ducke (Fabaceae) against Leishmania (Leishmania) amazonensis, dermatophytes and yeasts. Vatairea macrocarpa extracts presented the most promising results against all three micro- organisms, which has not been described in the literature. The ethyl acetate extract of the root bark was selected for chemical fractionation and the following compounds were identified: ethanone (D3) and vatacarpina (D93), that hasn’t been previously reported.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, 2013. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2014-01-02T10:23:34Z No. of bitstreams: 1 2013_LuisaDefrancoFerreiraPeconick_Parcial.pdf: 855251 bytes, checksum: bb95fc3c687f69b402e9466503c903f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2014-01-02T13:07:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_LuisaDefrancoFerreiraPeconick_Parcial.pdf: 855251 bytes, checksum: bb95fc3c687f69b402e9466503c903f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-02T13:07:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_LuisaDefrancoFerreiraPeconick_Parcial.pdf: 855251 bytes, checksum: bb95fc3c687f69b402e9466503c903f5 (MD5) / O basidiomiceto Cryptococcus neoformans, é um fungo oportunista, que comumente infecta pacientes portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e imunocomprometidos em geral. É o agente etiológico da criptococose, doença potencialmente fatal e cosmopolita cuja incidência mundial vem se aproximando da de doenças como a tuberculose. O gene VOSA pertence à família velvet, exclusiva de fungos e primeiramente descrita em Aspergillus, e está envolvido na viabilidade dos esporos e na regulação das fases assexuada e sexuada. Proteínas dessa família são fatores transcricionais altamente conservados entre ascomicetos e basidiomicetos que regulam diferentes processos em resposta a estímulos ambientais. A análise in silico do gene VOSA de C. neoformans mostrou sua conservação entre os fungos. Construiu-se um cassete de deleção do gene VOSA contendo o gene de resistência à higromicina B por PCR double joint. O cassete foi transformado por biobalística nas linhagens selvagens KN99a/α (soroA) que permitiu a obtenção de mutantes vosAaΔ e vosAαΔ. Da mesma forma, o fragmento contendo o locus VOSA foi transformado para obtenção do reconstituído tipo a (vosAaΔ::VOSA). Confirmou-se a deleção e a reconstituição de VOSA por PCR comum. Os mutantes vosAaΔ e vosAαΔ foram submetidos aos testes de fenótipo: crescimento a 30°C e 37°C, formação de cápsula, produção de urease e fosfolipase, alterações de parede celular e produção de melanina, no entanto não foram observadas quaisquer alterações no fenótipo quando comparados com a linhagem selvagem. Quanto à capacidade de realizar acasalamento, os mutantes vosAaΔ e vosAαΔ foram submetidos a acasalamento com linhagem selvagem de tipo sexual oposto e apresentaram diminuição na formação de hifas e alteração morfológica significativa de sua estrutura. Mutantes de tipo sexual opostos (vosAaΔ vs. vosAαΔ) também foram submetidos a acasalamento e não apresentaram qualquer formação de hifas. Acredita-se que VOSA seja um regulador positivo da reprodução sexuada, e que controle a formação de estruturas sexuais. A expressão de genes velvet foi analisada no mutante vosAaΔ em comparação à cepa selvagem sem indicação de qualquer alteração transcricional. Os resultados até agora obtidos em C. neoformans colaboram para um melhor entendimento do papel de VOSA na patobiologia deste patógeno. Pretende-se identificar em detalhe o papel deste gene no ciclo de vida de C. neoformans, em especial na produção de esporos, que são as formas infectivas e de disseminação deste patógeno. Os dados moleculares gerados neste trabalho servem como ponto de partida para elucidar a complexa regulação do ciclo sexual de C. neoformans e pela primeira vez descreve o envolvimento de um gene velvet na biologia de um basidiomiceto. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The basidiomycete fungus Cryptococcus neoformans is an opportunistic organism which commonly infects HIV and immunocompromised patients. It is the etiological agent of cryptococcosis, a potentially fatal and cosmopolitan disease, whose world’s incidence is approaching from diseases such as tuberculosis. VOSA gene belongs to the velvet family, fungal exclusive and primarily described in Aspergillus, involved in the regulation of sexual and asexual development as well as in the viability of the spores. Proteins of this family are transcriptional factors highly conserved among ascomycetes and basidiomycetes regulating different process in response to environmental stimuli. In silico analysis of VOSA gene showed its conservation among the fungi. A VOSA disruption cassette containing the hygromycin reistance gene was assembled by Double Joint PCR. The cassette was transformed by biolistic in KN99a/α (soroA) wild type strains that allowed obtaining the vosAaΔ and vosAαΔ mutants. Likewise, the fragment containing the VOSA locus was transformed to obtain a mating type a reconstituted strain (vosAaΔ::VOSAa). Both disruption and reconstitution were confirmed by traditional PCR. The mutants vosAαΔ and vosAaΔ were tested for various phenotypes: growth at 30 and 37°C, capsule formation, urease and phospholipase production, changes in cell wall and melanin production, however no phenotypic changes were observed compared to the wild type strains. Regarding the ability to mate, vosAaΔ and vosAαΔ mutants were crossed with wild type strain of opposite mating type and the crosses showed decreased hyphae formation and significant morphological alteration of its structure. Mutants of opposite mating type (vosAaΔ vs. vosAαΔ) were subjected to mating and showed no formation of hyphae. VOSA is believed to be a positive regulator of sexual reproduction, and that controlling the formation of sexual structures. Expression of velvet genes was analyzed in vosAaΔ mutant in comparison with wild type strain and any significant transcriptional changes were noticed. The results obtained so far in C. neoformans collaborate for a better understanding of its role in the pathobiology of this pathogen. It is intended to identify in detail the role of VOSA in C. neoformans lyfe cycle, in particular spore production, the infective and dissemination form of the pathogen. The molecular data generated in this study are starting point for a research to elucidate the molecular mechanism of the sexual cycle regulation on C. neoformans and for the first time describ a velvet gene involved in the biology of a basidiomycete.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-05-21T21:29:13Z No. of bitstreams: 2 2009_JulianaAlvesParente_Parte1.pdf: 4665446 bytes, checksum: 7b742076f0f6642f386f8fef149a7f67 (MD5) 2009_JulianaAlvesParente_Parte2.pdf: 4205180 bytes, checksum: 194103bc54f6c42a2c3959e9ec4c2af8 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-05-21T21:32:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 2009_JulianaAlvesParente_Parte1.pdf: 4665446 bytes, checksum: 7b742076f0f6642f386f8fef149a7f67 (MD5) 2009_JulianaAlvesParente_Parte2.pdf: 4205180 bytes, checksum: 194103bc54f6c42a2c3959e9ec4c2af8 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-05-21T21:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 2009_JulianaAlvesParente_Parte1.pdf: 4665446 bytes, checksum: 7b742076f0f6642f386f8fef149a7f67 (MD5) 2009_JulianaAlvesParente_Parte2.pdf: 4205180 bytes, checksum: 194103bc54f6c42a2c3959e9ec4c2af8 (MD5) / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo patogênico humano, agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM). P. brasiliensis apresenta dimorfismo térmico, apresentando-se sob a forma miceliana a temperaturas inferiores a 28 ºC e sob a forma leveduriforme no hospedeiro humano e em temperaturas superiores à 28 ºC. Proteases são enzimas que clivam proteínas e desempenham funções como o processamento intracelular e a clivagem de proteínas do meio extracelular para obtenção de nitrogênio. Em microrganismos patogênicos proteases podem atuar como fatores de virulência, clivando proteínas do hospedeiro para facilitar a penetração pelos tecidos. No presente trabalho, foi realizado o rastreamento e identificação de proteases em banco de dados de ESTs oriundas de células leveduriformes de P. brasiliensis. Foram detectadas 53 ORFs codificantes para proteases. As seqüências preditas de aminoácidos foram obtidas e classificadas por homologia em banco de dados de proteases, sendo agrupadas em 3 aspartil, 8 cisteíno proteases, 10 metalo-, 10 serino proteases e 22 proteínas relacionadas às subunidades proteassomais. O presente trabalho inclui também o rastreamento e a identificação de ESTs codificantes de proteínas relacionadas à síntese e ao processamento de proteínas em banco de dados de ESTs oriundas de células de P. brasiliensis durante a transição dimórfica de micélio para levedura por 22 horas. Foram identificadas 200 ORFs apresentando homologia com seqüências codificantes a proteínas relacionadas aos processos de síntese e processamento de proteínas. Destas, 16 ORFs codificam para genes não descritos anteriormente em P. brasiliensis. Foi possível identificar ESTs que compõem subunidades ribossomais, assim como fatores de iniciação transcricional induzidos durante a transição dimórfica, sugerindo um aumento no nível de proteínas sintetizadas durante este processo. Também foram identificadas ESTs codificantes para chaperonas, para glicosiltransferases e para proteínas relacionadas com a aceleração do enovelamento de proteínas, sugerindo aumento da produção e do controle de qualidade durante a transição dimórfica de micélio para células leveduriformes. Alguns genes codificantes para proteases são induzidos após a indução da transição termodimórfica: uma aspartil protease A01, uma lon protease S16 e uma metaloprotease M28, o que sugere aumento dos processos de controle de qualidade das proteínas produzidas e da aquisição de aminoácidos do meio extracelular. Uma serino protease S08 foi caracterizada. As seqüências de nucleotídeos (Pbsp) e aminoácidos (PbSP) foram obtidas e analisadas. O cDNA codificante para Pbsp foi clonado em vetor de expressão para sistema bacteriano e a proteína recombinante foi utilizada para obtenção de anticorpo policlonal em camundongos. O anticorpo policlonal reconheceu especificamente uma espécie protéica de 66 kDa em extrato protéico e em sobrenadante de cultura de células leveduriformes de P. brasiliensis, sugerindo que PbSP seja uma molécula secretada. Ensaios de deglicosilação in vitro com endoglicosidase H demonstraram que PbSP é uma molécula N-glicosilada. PbSP tem seu nível de expressão induzido durante a privação de nitrogênio tanto em extrato protéico quanto em sobrenadante de cultura de células leveduriformes de P. brasiliensis, sugerindo que PbSP tenha importância na captação de nitrogênio. A expressão de Pbsp é aumentada durante a internalização de células leveduriformes por macrófagos murinos, sugerindo a importância do produto deste gene na resposta adaptativa de P. brasiliensis à internalização por macrófagos. A interação de PbSP com moléculas de P. brasiliensis foi avaliada utilizando o sistema de duplo-híbrido em Saccharomyces cerevisiae. Proteínas relacionadas com enovelamento protéico, controle de qualidade e destinação de proteínas, além de uma proteína de parede celular de P. brasiliensis foram identificadas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis is a human pathogenic fungus, the causative agent of paracoccidioidomycose (PCM). P. brasiliensis is a thermodimorphic fungus presents as mycelium form in temperatures below 28º C and as yeast form in the human host and in temperatures above 28ºC. Proteases are enzymes that cleave proteins and are related to the intracellular protein processing and cleavage of extracellular proteins to nitrogen acquisition. In pathogenic microorganisms proteases could act as virulence factors by cleaving host proteins facilitating the invasion process in the host tissues. The present work identified proteases in ESTs database constructed with cDNAs sequences of P. brasiliensis yeast form. It was detected 53 ORFs encoding proteases. The predicted amino acids sequences were obtained and classified by homology in protease database: 3 sequences were classified as aspartil, 8 as cysteine, 10 as metallo-, 10 as serino and 22 proteins related to proteasomal subunits. The present work also includes the identification of ESTs encoding proteins related to protein synthesis and processing in ESTs database of P. brasiliensis during transition from mycelium to yeast cells. It was identified 200 ORFs presenting homology to sequences encoding proteins related to protein synthesis and processing. Sixteen ORFs were described as novel genes of P. brasiliensis. It was identified ESTs related to ribosomal subunits and initiation transcription factors, suggesting intense synthesis of new ribosome particles, affecting the rate of protein synthesis. It was identified ESTs encoding chaperones, glycosiltransferases and proteins related to acceleration of protein folding, suggesting high protein production and high quality control in the protein production during transition from mycelium to yeast cells in P. brasiliensis. Transcripts encoding proteases were induced in P. brasiliensis during transition from mycelium to yeast: an aspartil protease A01, a lon protease S16 and a metaloprotease M28. The higher expression of these genes during transition in P. brasiliensis suggests high control quality of proteins and nitrogen acquisition. A serine protease S08 was characterized. The cDNA (Pbsp) and deduced amino acids (PbSP) sequences were obtained and analyzed. Pbsp was cloned into expression vector in bacterial system and used to generate polyclonal antibody in mice. The polyclonal antibody recognized specifically a 66 kDa protein species in protein extracts and culture supernatants of P. brasiliensis yeast cells, suggesting PbSP is a secreted molecule. In vitro deglycosylation assays with endoglycosidase H demonstrated that PbSP is a N-glycosylated molecule. PbSP is increased during nitrogen starvation both in protein extracts and cultures supernatants of P. brasiliensis yeast cells, suggesting PbSP is important in nitrogen acquisition. Pbsp expression was induced during internalization of P. brasiliensis yeast cells by murine macrophages, suggesting the Pbsp product is important in the P. brasiliensis adaptative response to macrophage internalization. PbSP interaction with P. brasiliensis proteins was evaluated by two-hybrid assay in Saccharomyces cerevisiae. Proteins related to protein folding, quality control of translation, protein destination and a cell wall protein of P. brasiliensis were identified.

Microsporum canis é um dermatófito zoofílico e o fungo mais frequentemente isolado de cães e gatos, de crianças com tinea capitis e de adultos com tinea corporis. Ainda não se conhece as possíveis variáveis envolvidas no estabelecimento de infecções clínicas ou subclínicas em cães e gatos, assim como os fatores envolvidos na transmissão de M. canis para os seres humanos. Diversas técnicas de biologia molecular falharam em demonstrar variabilidade genética entre diferentes linhagens de M. canis, porém, estudos recentes indicam que a utilização de primers mais discriminatórios, como os marcadores microsatélites, possibilite a detecção de diferentes genótipos de M. canis. Os objetivos deste trabalho de pesquisa foram: identificar e comparar o genótipo de M. canis isolados de cães e gatos sintomáticos e assintomáticos e de seres humanos utilizando marcadores microssatélites e investigar uma possível correlação entre as características genotípicas e dados epidemiológicos de M. canis isolados de cães, gatos e seres humanos. Foram incluídos no estudo isolados de 102 cães e gatos sintomáticos e assintomáticos e de pacientes humanos com tinea nos quais se isolou o M. canis durante os anos de 2006 a 2010. Essas amostras foram provenientes de Curitiba, Porto Alegre, Florianópolis e Cuiabá. Dentre elas, 37 eram de gatos sintomáticos, 35 de gatos assintomáticos, 19 de pacientes humanos sintomáticos, 9 de cães assintomáticos e 2 de cães sintomáticos. A amplificação da região de microsatélites do DNA foi realizada utilizando dois primers, McGT13 e McGT17, a qual possibilitou a formação de grupos de acordo com o grau de similaridade genética baseada no número de repetições nessas duas regiões do DNA do M. canis. Os loci Mc(GT)13 e Mc(GT)17 revelaram 3 e 6 alelos, variando de 2 e 5 repetições de dinucleotídeos dentro de cada locus, respectivamente. Dos 14 genótipos e 5 grandes grupos formados após análise da árvore filogenética gerada pelo método Dc, 1 foi compartilhado por 26 isolados, outro por 21, um por 12 isolados e outros dois com 11 isolados cada um. Outros dois pequenos grupos foram formados com 7 e 5 isolados cada. Os marcadores microssatélites possibilitaram a identificação, o estudo filogenético e a comparação dos isolados de M. canis oriundos de gatos, cães e pacientes humanos incluídos no estudo. Apesar da formação de grupos geneticamente relacionados, não houve correlação entre as linhagens e os dados epidemiológicos analisados entre as isolados, incluindo fonte, sintomatologia, quadro clínico, raça, idade, sexo, moradia e localização geográfica. / Microsporum canis is a zoophilic dermatophyte and the most commonly isolated fungi from dogs, cats, children with tinea capitis and adults with tinea corporis. There are unknown variables in establishment of clinical or subclinical infection in dogs and cats and also in M. canis transmission to humans. Several molecular techniques failed to show genetic variability between different strains of M. canis, but recent studies indicate that the use of more discriminatories primers, as microsatellite markers, may detect different genotypes of this dermatophyte. This study has as objectives to identify and compare M. canis strains genotype isolated from symptomatic and asymptomatic dogs and cats and from people with dermatophytosis using microsatellite technique and to investigate a possible correlation between epidemiologic data and genotypic characteristics of M. canis isolated from dogs, cats and people. One hundred and two strains of M. canis isolated from symptomatic and asymptomatic dogs and cats and people with tinea between 2006 and 2010 were included in this study. These strains were from Curitiba, Porto Alegre, Florianópolis and Cuiaba. Among them, 37 were from symptomatic cats, 35 from asymptomatic cats, 19 from people with tinea, 9 from asymptomatic dogs and 2 from symptomatic dogs. Amplification of microsatellite DNA region was performed using two primers, McGT13 e McGT17, which allowed the formation of groups according to the degree of genetic similarity based on the amount of repetition in these two regions of M. canis DNA. Loci Mc(GT)13 e Mc(GT)17 revealed 3 and 6 alleles, varying between 2 and 5 dinucleotide repeats within each locus, respectively. Of the 14 genotypes and 5 major groups formed after phylogenetic tree analysis generated by DC method, 1 was shared by 26 strains, the other by 21, one by 12 strains and another two with 11 strains each. Microsatellite markers allowed identification, phylogenetic analysis and comparison of M. canis strains isolated from cats, dogs and people included in this study. Despite the formation of genetically related groups, there was no correlation between the lineage and epidemiologic characteristics, including source, symptoms, clinical picture, breed, age, sex, housing and geographical location.

Resumo não disponível.

Visando aumentar a resistência a moléstias fúngicas, o presente trabalho teve como objetivo introduzir um gene (chit1) que codifica uma quitinase do fungo Metarhizium anisopliae em cultivares de soja [Glycine max (L.) Merrill]. A co-transformação foi a estratégia escolhida, visando a obtenção de plantas livres de transgenes marcadores na progênie das plantas transformadas. A co-transformação foi realizada via biolística, tendo como tecido-alvo conjuntos de embriões somáticos globulares das cultivares MG/BR46 Conquista e IAS-5. O plasmídeo pGusHyg, que contém o gene repórter gusA e o gene marcador hpt, foi bombardeado concomitantemente com o plasmídeo pMOG463chit1, que porta o gene chit1. Os conjuntos de embriões bombardeados foram transferidos para meio seletivo contendo higromicina, visando a obtenção de material estavelmente transformado. Os conjuntos embriogênicos higromicina-resistentes foram transferidos seqüencialmente para meios de proliferação D-20 (sem higromicina), maturação e regeneração. No total, foram obtidos 387 e 380 embriões histodiferenciados das cultivares MG/BR46 Conquista e IAS-5, respectivamente. Plantas transgênicas adultas e férteis foram regeneradas. Para avaliar a eficiência da estratégia de cotransformação, foram realizadas análises moleculares de embriões histodiferenciados e de plantas regeneradas. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram o cálculo da taxa de co-transformação de 44% para os embriões histodiferenciados da cultivar MG/BR46 Conquista e de 50% para plantas de IAS-5. Não existem, até o momento, relatos de trabalhos em soja utilizando embriões somáticos globulares em proliferação como alvo para estudos de co-transformação. / Aiming the increase of plant resistance to fungal disease, the present work was carried out with the objective of introducing a gene (chit1) coding a chitinase from Metarhizium anisopliae in soybean cultivars [Glycine max (L.) Merril]. Co-transformation was the strategy elected, in order to obtain marker-free transgenic plants in the progeny of transformed plants. Co-transformation was performed via biolistic using somatic globular embryo clusters of MG/BR46 Conquista and IAS-5 cultivars as target tissues. Plasmid pGusHyg, containg the reporter gusA gene and the selectable marker hpt gene, was co-delivered with the pMOG463chit1 plasmid containg the chit1 gene. Bombarded embryo clusters were transferred to selective medium containg hygromycin, aiming to obtain stable transformed material. Hygromycin-resistant embryogenic clusters were sequentially transferred to proliferation D20 (without hygromycin), maturation and regeneration media. A total of 387 and 380 histodifferentiated embryos were respectively obtained from MG/BR46 Conquista and IAS-5 cultivars. Transgenic adult fertile plants were regenerated. To evaluate the co-transformation eficiency, DNA from histodifferentiated embryos and from regenerated fertile plants was submitted to molecular analysis. Data obtained allowed us to calculate co-transformation frequencies of 44% and 50% for MG/BR46 Conquista and IAS-5 cultivars, respectively. As far as we are concerned there is no studies utilizing soybean somatic embryos for cotransformation via biolistic.

A rinossinusite crônica é uma doença complexa, com etiologia multifatorial. O seu manejo é controverso, principalmente no paciente pediátrico. O tratamento preconizado é a antibioticoterapia empírica, embora o papel da infecção bacteriana não esteja completamente definido na patogênese da rinossinusite crônica. A técnica de coleta de secreção considerada padrão áureo é a punção do seio maxilar via fossa canina. Entretanto, provoca dor, necessita da colaboração do paciente, pode causar dano ao nervo infraorbitário e em crianças, pode lesionar brotos dentários. Além disso, principalmente em pacientes pediátricos, requer sedação ou anestesia geral e identifica apenas germes restritos ao seio maxilar. A visualização do meato médio, considerado área-chave da doença rinossinusal, através de endoscópios, permite a coleta de amostras com desconforto mínimo e a execução de culturas e testes de sensibilidade. Este estudo visou determinar a microbiologia do meato médio por meio de coleta sob visão endoscópica em crianças com rinossinusite crônica bem como testar a sensibilidade dos germes identificados. Foram incluídos na pesquisa 39 pacientes pediátricos com sinais e sintomas de rinossinusite por mais de 3 meses, cujas endoscopias nasais evidenciaram secreção no meato médio e com tomografia computadorizada demonstrando comprometimento dos seios paranasais. Um grupo de 94 adultos com rinossinusite crônica (RSC) foi estudado paralelamente. Os germes mais freqüentemente encontrados no grupo das crianças foram o Streptococcus pneumoniae (33%), a Moraxella catharralis (23%) e oHaemophilus influenzae (21%). O Streptococcus pneumoniae foi resistente a sulfametoxazol-trimetropim em 23% e à penicilina em 17% das amostras. Cepas produtoras de beta-lactamase foram encontradas em 67% e 12,5% das amostras de Moraxella catharralis e Haemophilus influenzae, respectivamente. Nos adultos, o Staphylococcus aureus e o Staphylococcus coagulasenegativo foram os germes mais freqüentes, e apresentaram 83 % e 89 % de resistência à penicilina, respectivamente. Bactérias Gram-negativas e Streptococcus pneumoniae foram estatisticamente mais freqüentes no grupo das crianças. Haemophilus influenzae e Staphylococcus coagulase negativo foram os germes que apresentaram diferença estatisticamente significativa em relação à resistência antimicrobiana entre crianças e adultos, sendo mais resistentes nestes últimos. / Chronic rhinosinusitis is a complex disease and its etiology multifactorial. Its management is controversal, especially in the pediatric population. Although bacterial infection is not totally defined in its pathogenesis the recomended treatment is still empiric antibiotics. The gold standard technique to obtain secretion for culture is piercing the maxillary sinus through the canine fossa. It needs patient´s colaboration, may damage the infraorbitary nerve and, in children, may hurt the teeth buds. In children it may also require sedation or general anesthesia, and it can only help identify microorganisms restricted to the maxillary sinuses. Visualization through the middle meatus, considered the key area for the rhinosinusal disease, through endoscopy, permits the collection of samples for culture, with minimum discomfort. This study tried to determine the microbiology of the middle meatus through collection of samples for culture and sensitivity testing under direct endoscopic vision in children with chronic rhinusinusitis. Thirty nine children and ninety four adults with signs and symptoms attributable to rhinosinusitis for longer than three months were included in this study. All patients had nasal endoscopy with evidence of secretion in the middle meatus and computed tomography showing envolvment of the paranasal sinuses. The microorganisms most frequently encountered among children were: Streptococcus pneumoniae 33%, Moraxella catharralis 23%, Haemophilus influenzae 21%. Streptococcus pneumoniae was resistant tosulfametoxazol-trimetropim in 23%, and to penicillin in 17% of the samples. Beta-lactamase producing organisms were found in 67% of Moraxella catharralis and 12,5% of the Haemophilus influenzae samples. In adults, Staphylococcus aureus and Staphylococcus coagulase negative were the most frequently found bacteria and were resistant to penicillin in 83% and 89% respectively. Gram-negative bacteria and Streptococcus pneumoniae were statistically most frequent in the children group. Haemophilus influenzae and Staphylococcus coagulase negative showed a statistically significant diference regarding resistance to antimicrobials, between children and adults, being more resistant in the latter.