Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines membranaires du génome humain. Ils transmettent les signaux extracellulaires provenant de plusieurs stimuli comme les odeurs, les ions, les hormones et les neurotransmetteurs, à l'intérieur des cellules. En se liant aux RCPGs, ces molécules contribuent à la stabilisation des changements conformationnels activateurs qui se propagent jusqu'au domaine intracellulaire des récepteurs. Ces derniers engagent ensuite un ou plusieurs effecteurs, comme les protéines G hétérotrimériques et les β-arrestines (βarrs), qui activent une cascade d'événements moléculaires menant à la réponse cellulaire.Récemment, la publication de structures cristallines de RCPGs liant des ligands diffusibles a offert une opportunité de raffiner à une résolution atomique les modèles des mécanismes de transduction des signaux. Dans la première partie de cette thèse, nous avons donc exploré les déterminants de la signalisation du récepteur prototypique β2-adrénergique (β2AR), induite par les β-bloqueurs. En ne tenant compte que de leur efficacités sur le β2AR dans les voies de l'adénylate cyclase (AC) et des protéines kinases activées par les facteurs mitogéniques (MAPK), les β-bloqueurs peuvent être classés en 3 groupes distincts (agoniste inverse AC / agoniste MAPK, antagoniste neutre AC / agoniste MAPK et agoniste inverse AC / agoniste inverse MAPK). Afin de déterminer le lien entre leur efficacité et leur mode de liaison, nous avons réalisé des expériences d'arrimages moléculaires in silico entre des β-bloqueurs de chacun des groupes et la structure cristalline du β2AR liée au carazolol. De manière intéressante, les ligands à l'intérieur d'un groupe partagent un mode de liaison, alors que ceux des ligands entre les groupes divergent, suggérant que le mode de liaison des β-bloqueurs pourrait être utilisé pour prédire leur l'efficacité. En accord avec cette hypothèse, nous avons prédit et confirmé l'efficacité agoniste MAPK du carazolol, un inverse agoniste AC du β2AR se liant au récepteur de manière similaire au groupe inverse agoniste AC / agoniste MAPK. De manière intéressante, le groupement aryl des ligands agonistes inverses agonistes AC / agoniste MAPK, le seul groupement chimique variable de ce groupe, est prédite pour lier la région des 3e et 5e hélices transmembranaires (TM3 et TM5). Nous avons donc émis l'hypothèse que cette région pourrait être un déterminant de l'efficacité de ces ligands. En accord avec cette dernière, la mutation de 2 résidus (T118I, S203A) localisés proches du site de liaison des groupements aryls des β-bloqueurs, prévient l'efficacité agoniste inverse de l'ICI-118551 sur la voie de l'AC sans affecter l'efficacité d'un agoniste, indiquant que cette région est importante pour la transmission de l'effet agoniste inverse, du moins sur la voie de l'AC. Les βarrs sont des protéines d'échafaudage qui coordonnent la formation de complexes avec plusieurs dizaines d'effecteurs de signalisation. Originalement identifiées pour leur rôle dans la désensibilisation et l'internalisation des RCPGs, elles sont aussi d'importants effecteurs de la signalisation des RCPGs indépendante des protéines G hétérotrimériques. Cependant, contrairement aux protéines G hétérotrimériques, il n'existe que peu d'outils pour les étudier. Ainsi, la deuxième partie de la thèse est dédiée au développement d'outils pour l'étude des βarrs. À cette fin, nous avons d'abord tenté de transposer une méthode de mesure de l'interaction entre 2 protéines par la technologie de transfert d'énergie de bioluminescence par résonance (BRET) en microscopie et chez des souris transgéniques afin de mesurer de manière subcellulaire et dans un contexte natif l'engagement de la βarr à des RCPGs. Ainsi, nous avons établi les preuves de principe que le BRET peut être utilisé pour localiser l'interaction entre la βarr et le récepteur de la vasopressine de type 2 (V2R) sur une cellule au microscope et pour détecter l'interaction entre la βarr et le β2AR sur des tissus de souris transgéniques exprimant ces protéines fusionnées avec des partenaires BRET. Finalement, il n'existe aucun inhibiteur pharmacologique ciblant les βarrs. Ainsi, grâce à la combinaison d'approches de criblage virtuel sur un modèle de la structure des βarrs et d'essais de validation cellulaire, nous avons développé un inhibiteur pharmacologique des βarrs. À l'aide de cet outil, nous avons confirmé l'implication des βarrs dans l'activation des MAPK par le V2R, mais aussi montré un nouveau rôle des βarrs dans le recyclage du β2AR. Les connaissances et outils développés dans cette thèse permettront de mieux comprendre les déterminants moléculaires de la signalisation des RCPGs et entre autres, grâce à des nouvelles approches pour étudier le rôle cellulaire et physiologique des βarrs. / G Protein-Coupled Receptors (GPCR) are members of the largest family of membrane protein in the human genome. They transduce the signal from a variety of stimuli like odors, ions, hormones and neurotransmitters, inside the cells. By binding directly to the receptors, these molecules stabilize activating conformational changes that are allosterically propagated through transmembrane to intracellular domains. Effectors like heterotrimeric G protein and β-arrestins (βarrs) are then engaged by activated receptors and trigger a cascade of signalling events leading to a cellular response. Recently, the resolution of the crystal structure of GPCR that bind to freely diffusible ligands provided the opportunity to refine at an atomic level the models describing the mecanisms of receptor signal transduction. In the first section of this thesis, we have explored the determinants of the prototypical β2-adrenergic receptor (β2AR) signalling induced by β-blockers. Given their efficacy on Adenylate Cyclase (AC) and Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) pathways, β-blockers can be classified within 3 signalling groups (AC inverse agonist / MAPK agonist, AC neutral antagonist / MAPK agonist and inverse agonist for AC and MAPK). In order to gain insight on the relation between their efficacy and binding mode, we performed in silico binding experiments between β-blockers from each group and the β2AR crystal structure bound to carazolol. Interestingly, ligands within a group share similar binding mode in contrast to those of different groups, suggesting that β-blockers binding mode could be used to predict their efficacy. In accordance to this hypothesis, we have predicted and confirmed that carazolol, an AC inverse agonist that bind to β2AR in a similar way than the AC inverse agonist / MAPK agonist group, is indeed an agonist for MAPK pathway. Moreover, aryl chemical function from AC inverse agonist / MAPK agonist ligands, barely the only variable structure feature of this group, was predicted to bind β2AR nearby the transmembrane helices 3 and 5 (TM3 and TM5). We thus have predicted that this region would be a determinant of the AC inverse agonist / MAPK agonist ligand efficacy. Accordingly, we found that mutation of 2 residues (T118I, S203A) close to the aryl moiety binding site prevents inverse agonist efficacy of ICI-118551 on AC pathway, without affecting agonist efficacy, indicating that this receptor region is important for the efficacy of these group of β-blockers, at least on AC inverse agonism.βarrs are scaffolding proteins that coordinate protein complex formation with dozen of signalling effectors. First identified for their role on GPCR desensitization and internalization, βarrs are also an important heterotrimeric G protein independent GPCR signalling effectors. However, in contrast to heterotrimeric G protein, only a few tools are available for their study. Thus, the second section of this thesis aim at developing tools for the study of βarrs. For this purpose, we had attempted to transpose a method to measure protein-protein interaction that use Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) technology, in microscopy and in transgenic mice, in order to detect subcellular localization and in a native context the engagement of βarr to RCPGs. Thus, we have established a proof of principle that BRET can be combined with microscopy to locate an interaction between βarr and the type 2 vasopressin receptor (V2R) within a cell. Moreover, we have established a second proof of principle that we can detect βarrs recruitment to β2AR on cells extracted from tissues of transgenic mice expressing these proteins fused to BRET partner. Finally, there is no pharmacological inhibitor of βarrs. Thus, using a combination of virtual screening and cellular validation approches, we have developed the first pharmacological βarrs inhibitor. With this novel tool, we have confirmed the implication of βarrs in V2R-mediated MAPK activation, but also showed a new role of βarrs in β2AR recycling.The finding and the tools presented in this thesis should allow to better understand the molecular determinants of GPCR signalling, and among other things, by proposing new tools to study βarrs cellular and physiological roles.

Les opioïdes restent encore à l’heure actuelle les composés pharmacologiques les plus efficaces pour traiter les différentes formes de douleurs, et donc fournir une analgésie thérapeutique. Cependant, l’administration répétée de ces composés entraîne des effets secondaires majeurs comme la dépression respiratoire, la tolérance, mais également, il a été montré que certains de ces opioïdes pouvaient engendrer des états proépileptiques. D’un point de vue thérapeutique, il existe donc un réel besoin pour de nouveaux et meilleurs traitements analgésiques, n’élicitant pas ces effets secondaires. Notre laboratoire étudie la signalétique des récepteurs couplés aux protéines G comme les récepteurs opioïdes et leur capacité de sélectivité fonctionnelle depuis des années, et en particulier celle du récepteur delta opioïde (DOP). En effet, celui-ci présenterait moins d’effets indésirables que le récepteur mu opioïde (MOP) qui est la cible principale des opioïdes classiques comme la morphine. Cependant, il semblerait que le DOP justement soit à l’origine des états proépileptiques précédemment décrits. Ainsi malgré la promesse initiale des agonistes delta par rapport à la diminution des effets secondaires, les effets proépileptiques de certains ont notamment contribué à une baisse d’intérêt vers le DOP et aucun de ses agonistes n’a pu passer les phases de tests cliniques. Cependant, il a été démontré que certains agonistes delta n’entraînaient pas d’effet proépileptique; tandis que d’autres oui. Comment expliquer un tel phénomène ? Ceci est la question que pose la présente recherche. Ainsi notre objectif sera d’obtenir et de comparer les signatures pharmacologiques des agonistes connus pour être proépileptiques versus ceux qui ne le sont pas ; par rapport à la transduction de signal via le récepteur delta opioïde et sa protéine G hétérotrimérique ; et par rapport à un de ses effecteurs principaux pour l’analgésie, un canal potassique rectifiant entrant. Cette comparaison se fera selon les paramètres du modèle classique de la pharmacologie, comme l’efficacité et la puissance ; mais également avec un outil plus récent appelé modèle opérationnel, utilisant des paramètres comme l’affinité et le coefficient de transduction. Pour se faire, le transfert d'énergie par résonance de bioluminescence ou BRET sera utilisé afin de caractériser les différentes voies signalétiques impliquées. Cette recherche s’inscrit dans un vaste contexte de collaboration entre différents laboratoires, et au sein de chacun d’entre eux, dans l’espoir de pouvoir synthétiser un jour, de meilleurs composés pharmacologiques, capables de cibler uniquement les voies médiatrices des effets thérapeutiques voulus, ici l’analgésie ; sans éliciter celles entraînant les effets secondaires associés, ici, les états proconvulsifs. L’aboutissement de cette recherche permettrait donc d’impacter la vie de millions de gens en souffrance, et c’est pourquoi il nous semble plus qu’important de continuer à l’entreprendre. / Opioids are still nowadays the most efficacious pharmacological compounds available to treat the different types of pain, and therefore provide a therapeutic analgesia. However, repeated administration of those compounds lead to major secondary effects like respiratory depression, tolerance, but also it was shown that some opioid compounds could induce seizures. From a therapeutical point of view, there is a serious need for new and better analgesic treatments that do not elicit such adverse effects. Our lab has been studying for years the signaletics of G-protein coupled receptors like the opioid receptors, and their capacity for functional selectivity, especially more recently the one of the delta opioid receptor (DOP). Indeed, this receptor elicits fewer adverse effects compared to the mu opioid receptor (MOP) that is the main target of all clinically used opioids such as morphine. However, it seems like the DOP itself would be responsible for the pro-epileptic states previously described. Thus, despite initial promises of the delta agonists towards reducing adverse effects whilst providing analgesia, the pro-convulsive effects that some seem to elicit have induced a loss of interest towards the DOP, and so far none of its agonists have gone further than pre-clinical trials. However, it has been shown that not all of those DOP agonists had those pro-convulsive adverse effects. How to explain such a phenomenon? This is the question which the present research will be asking. Thus our goal is to obtain and compare pharmacological signatures of the agonists known for being pro-convulsive versus those that are not ; regarding the transduction of signals through the delta opioid receptor and its heterotrimeric G-Protein ; and also regarding one of its main effectors to induce analgesia, an inwardly rectifying potassium channel. This comparison will be done according to the classical parameters of pharmacology, such as efficacy and potency ; but also according to the newest operational model, with parameters such as affinity and transduction coefficients. In order to do so, bioluminescence resonance energy transfer or BRET, will be used in order to characterize and quantify the signalling pathways there implicated. This research is embedded in a vast collaboration context, in between laboratories around the world, and within those laboratories as well, in hope to be able to one day synthesize, better pharmacological compounds, capable of targeting only the pathways responsible for the desired effects, here analgesia ; without triggering the associated adverse effects, here pro-convulsive states. The culmination of this research could allow to impact the lives of millions of people throughout the world, and this is why it is more than important for us to keep on pursuing it.

Les récepteurs couplés aux protéines-G (RCPGs) constituent la première étape d’une série de cascades signalétiques menant à la régulation d’une multitude de processus physiologiques. Dans le modèle classique connu, la liaison du ligand induit un changement de conformation du récepteur qui mène à sa forme active. Une fois activés, les RCPGs vont réguler l’activité d’une protéine membranaire cible qui peut être tant une enzyme qu’un canal ionique. L’interaction entre le récepteur et la cible nécessite l’intermédiaire d’une protéine hétérotrimérique appelée « protéine G », qui est activée pour favoriser l’échange du GDP (guanosine diphosphate) pour un GTP (guanosine triphosphate) et assurer la transduction du signal du récepteur à l’effecteur. Les mécanismes moléculaires menant à l’activation des effecteurs spécifiques via l’activation des RCPGs par les protéines G hétérotrimériques sont encore plutôt méconnus. Dans notre étude nous nous sommes intéressés aux récepteurs FP et PAF, à leurs ligands naturels, la PGF2α et le Carbamyl-PAF respectivement, et à des ligands à action antagoniste sur ces récepteurs. Des ligands considérés comme agonistes, sont des molécules qui interagissent avec le récepteur et induisent les mêmes effets que le ligand naturel. Les antagonistes, par contre, sont des molécules qui interagissent avec le récepteur et bloquent l’action du ligand naturel en prévenant le changement conformationnel du complexe, et ils peuvent avoir une action compétitive ou non-compétitive. Nous avons étudié aussi des ligands orthostériques et allostériques du récepteur FP des prostaglandines et du récepteur PAF. Un ligand orthostérique peut se comporter comme agoniste ou antagoniste en se fixant au site de liaison du ligand (agoniste) naturel. Un ligand allostérique est un agoniste ou antagoniste se fixant à un site autre que celui du ligand naturel entraînant un changement de conformation ayant pour conséquence soit une augmentation (effecteur positif), soit une diminution (effecteur négatif) de l'activité du ligand naturel. / G protein coupled receptors (GPCRs) are involved in the first step of most signalling pathways that regulate a variety of physiological events. The classical view of GPCR activation suggests that ligand binding to the inactive receptor will trigger a conformational change leading to an active conformation of the receptor. The GPCRs activated regulate the activity of a target membrane protein which can then activate other signalling proteins such as enzymes and ionic channels. The interaction between the receptor and the target requires an intermediary, in this case an heterotrimeric protein named « G protein », which is activated in order to facilitate the exchange of GDP (guanosine diphospate) for a GTP (guanosine triphosphate) and allow the transduction of the signal from the receptor to the effector. The molecular mechanisms leading to the activation of signalling effectors via the activation of GPCRs by its heterotrimeric G protein have not yet been well characterized. We focused our study on two GPCRs, the FP and PAF receptors, their natural ligands, PGF2α and Carbamyl-PAF respectively, and their antagonist ligands. Agonists are ligands that bind to the target receptor and trigger the same effects as the natural ligand of the GPCR. In contrast with agonists, antagonist ligands are molecules that prevent the effects of the natural ligand by keeping the GPCR from changing to its active conformation and can be competitive or non-competitive. We have also studied orthosteric and allosteric ligands of the FP and PAF receptors. An orthosteric ligand binds the same site as the natural ligand of the receptor and can act as an agonist or an antagonist. In the contrary, an allosteric ligand will rather have a different binding site then the natural ligand (agonist) and can positively or negatively modulate the effects of the natural ligand.

La prostaglandine E2 est une hormone lipidique produite abondamment dans le corps, incluant dans le rein où elle agit localement pour réguler les fonctions rénales. Un couplage à la protéine Gαs menant à une production d’AMPc a classiquement été attribué au récepteur EP4 de PGE2. La signalisation d’EP4 s’est cependant avérée plus complexe et implique aussi un couplage aux protéines sensibles à la PTX Gαi et des effets reliés aux β-arrestines. Il y a maintenant plusieurs exemples de l’activation sélective de voies de signalisation indépendantes par des ligands des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), et ce concept désigné sélectivité fonctionnelle pourrait être exploité dans le développement de nouveaux médicaments plus spécifiques et efficaces. Dans une première étude, la puissance et l’activité intrinsèque d’une série de ligands d’EP4 pour l’activation de Gαs, Gαi et de la ß-arrestine ont été systématiquement déterminées relativement au ligand endogène PGE2. Dans ce but, trois essais de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) ont été adaptés pour évaluer les différentes voies dans des cellules vivantes. Nos résultats montrent une sélectivité fonctionnelle importante parmi les agonistes évalués et ont une implication pour l’utilisation d’analogues de la PGE2 dans un contexte expérimental et possiblement clinique, puisque leur spectre d’activité diffère de l’agoniste naturel. La méthodologie basée sur le BRET utilisée lors de cette première évaluation systématique d’une série d’agonistes d’EP4 devrait être applicable à l’étude d’autres RCPG. Dans une deuxième étude, des peptides reproduisant des régions juxtamembranaires extracellulaires du récepteur EP4 ont été conçus selon le raisonnement que des peptides ciblant des régions éloignées du site de liaison du ligand naturel ont le potentiel de ne moduler qu’une partie des activités du récepteur. L’insuffisance rénale aiguë est une complication médicale grave caractérisée par un déclin brusque et soutenu de la fonction rénale et pour laquelle il n’y a pas de traitement efficace à l’heure actuelle. Nos résultats montrent que le peptidomimétique dérivé d’EP4 optimisé (THG213.29) améliore significativement les fonctions rénales et les changements histologiques dans une insuffisance rénale aiguë induite par cisplatine ou par occlusion des artères rénales dans des rats Sprague-Dawley. Le THG213.29 ne compétitionnait pas la liaison de la PGE2 à EP4, mais modulait la cinétique de dissociation de la PGE2, suggérant une liaison à un site allostérique d’EP4. Le THG213.29 démontrait une sélectivité fonctionnelle, puisqu’il inhibait partiellement la production d’AMPc induite par EP4 mais n’affectait pas l’activation de Gαi ou le recrutement de la ß-arrestine. Nos résultats indiquent que le THG213.29 représente une nouvelle classe d’agent diurétique possédant les propriétés d’un modulateur allostérique non-compétitif des fonctions du récepteur EP4 pour l’amélioration des fonctions rénales suite à une insuffisance rénale aiguë. / Prostaglandin E2 (PGE2) is a lipid hormone mediator widely produced in the body, including in the kidney where it acts locally to regulate renal function. Classically, the PGE2 receptor EP4 has been classified as coupling to the Gαs subunit, leading to intracellular cAMP increases. However EP4 signaling has been revealed to be more complex and also involves coupling to PTX-sensitive Gαi proteins and ß-arrestin mediated effects. There are now many examples of selective activation of independent pathways by G-protein coupled receptor (GPCR) ligands, a concept referred to as functional selectivity that could be exploited for the development of more specific and efficacious drugs. In a first study, the potencies and efficacies of a panel of EP4 ligands were systematically determined for the activation of Gαs, Gαi and ß-arrestin relative to the endogenous ligand PGE2. For this purpose, three bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assays were adapted to evaluate the respective pathways in living cells. Our results suggest considerable functional selectivity among the tested, structurally related agonists and have implications for the use of PGE2 analogues in experimental and possibly clinical settings, as their activity spectra on EP4 differ from that of the native agonist. The BRET-based methodology used for this first systematic assessment of a set of EP4 agonists should be applicable for the study of other GPCRs. In a second study, peptides were derived from extracellular juxtamembranous regions of the EP4 receptor following the rationale that peptides that target regions of the receptor remote of the ligand-binding site might modulate a subset of the EP4-mediated activities. Acute renal failure is a serious medical complication characterized by an abrupt and sustained decline in renal function and for which there is currently no effective treatment. Our results show that the optimized EP4-derived peptidomimetic THG213.29 significantly improved renal functions and histological changes in acute renal failure induced by either cisplatin or renal artery occlusion in Sprague-Dawley rats. THG213.29 did not displace PGE2 binding to EP4, but modulated PGE2 binding dissociation kinetics, indicative of an allosteric binding mode. THG213.29 exhibited functional selectivity, as it partially inhibited EP4-mediated cAMP production but did not affect Gαi activation or ß-arrestin recruitment. Our results demonstrate that THG213.29 represents a novel class of diuretic agent with noncompetitive allosteric modulator effects on EP4 receptor function for improving renal function following acute renal failure.

Les récepteurs couplés aux protéines GRCPG sont une des plus grandes familles de récepteur membranaire codifié par le génome humain et certainement la plus grande famille de récepteurs. Localisés au niveau des membranes plasmiques, ils sont responsables d’une grande variété de réponses cellulaires. L’activation de ces derniers par des ligands était traditionnellement associée à un changement de conformation de la protéine, passant d’un état inactif à un état actif. Toutefois, certaines observations entraient en contradiction avec cette théorie et laissaient supposer la présence de plusieurs conformations actives du récepteur. Ces différentes conformations pouvaient être actives pour certaines voies de signalisation ou de régulation et inactives pour d’autres. Ce phénomène, initialement appelé agoniste dirigé ou « biased agonism », est maintenant décrit comme étant la sélectivité fonctionnelle des ligands des RCPG. Cette sélectivité des voies de signalisation et de régulation permettrait en théorie de développer des ligands capables de cibler seulement les voies de signalisation et de régulation responsable des effets thérapeutiques sans activer les voies responsables des effets secondaires ou indésirables. Le récepteur delta opiacé (DOR) est un RCPG impliqué dans la gestion de la douleur chronique. L’action analgésique de ses ligands est toutefois soumise à un effet de tolérance produite lors de leur utilisation à long terme. Cet effet secondaire limite l’utilisation thérapeutique de ces médicaments. Cette thèse s’est donc intéressée à la sélectivité fonctionnelle des ligands du DOR afin d’évaluer la possibilité de réduire les effets de tolérance produits par ces molécules. En premier lieu, nous avons déterminé que le DOR peut être stabilisé dans plusieurs conformations actives dépendantes du ligand qui le lie et ces conformations possèdent différents profils d’activation des voies de signalisation et de régulation. En deuxième lieu, nous avons déterminé que les différents ligands du DOR stabilisent des conformations du complexe récepteur/protéine G qui ne concordent pas avec la théorie des récepteurs à deux états, suggérant plutôt la présence d’une multitude de conformations actives. Finalement, nous avons démontré que ces différentes conformations interagissaient de façon distincte avec les protéines de régulation des RCPG; le ligand favorisant le retour du récepteur à la membrane produisant moins de désensibilisation et moins de tolérance aiguë à l’analgésie que le ligand favorisant la séquestration du récepteur à l’intérieur de la cellule. Les résultats de cette thèse démontrent que la sélectivité fonctionnelle des ligands opiacés pourrait être utilisée dans le développement de nouveau analgésique produisant moins de tolérance. / G protein coupled receptors (GPCRs) are one of the largest families of membrane receptor coded by the human genome and certainly the biggest family of receptors. Localized at the plasma membrane, they are responsible for a wide variety of cellular responses. Activation of GPCRs by ligands has been traditionally associated with change in protein conformation, switching from an inactive to an active state. However, some observations were inconsistent with this theory suggesting the presence of several active conformations of the receptor. These different conformations could be active in some signalling or regulatory pathways and inactive in others. This phenomenon, originally called biased agonism, is now described as the functional selectivity of GPCRs ligands. In theory, this type of selectivity could lead to the development of drugs that therapeutic action without activating signalling pathways responsible for side effect. The delta opioid receptor (DOR) is a GPCR involved in chronic pain management. However, analgesic action of its ligands is subject to tolerance that develops over the course of long-term treatment, limiting their clinical use. This thesis focuses on functional selectivity of DOR ligands to assess the possibility of reducing the effects of tolerance produced by these molecules. First, we determined that DORs adopt ligand-specific active conformations with distinct ability to activate different signalling pathways and regulatory responses. Second, we established that DORs constitutively associate with Gαi heterotrimeric subunits, and that different receptor ligands induce distinct conformational changes within these signalling complexes. These observations are inconsistent with a two-state model of receptor activation, pointing instead the presence of multiple active conformations. Finally, we demonstrated that conformations stabilized by different agonists distinctively interact with βarrestin2, such that the agonist who promoted a transient receptor interaction with this regulatory protein produced more recycling, less desensitization and less acute analgesic tolerance than the ligand who promoted a stable DOR-βarrestin2 interaction. Taken together, the results presented in this thesis show DORs adopt ligand-specific conformations that support ligand-specific profiles of analgesic tolerance. This type of functional selectivity of opioid ligands could be eventually exploited in the development of novel therapeutic agents with longer analgesic actions.

Le récepteur V2 (V2R) de la vasopressine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), jouant un rôle fondamental dans le maintien de l’homéostasie hydrosodique. À l’instar de nombreux RCPGs, il est capable d’interagir avec plusieurs types de protéines G hétérotrimériques et possède des voies de signalisation peu explorées aux mécanismes mal compris. Ces voies non canoniques font l’objet des travaux exposés dans ce mémoire. Il s’agit d’explorer les caractéristiques et mécanismes de la signalisation de V2R via G12, et de la voie d’activation d’ERK 1/2 par transactivation du récepteur de l’insulin-like growth factor 1, IGF1R. Par des études de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), nous exposons la capacité de V2R à interagir avec la sous-unité Gα12 ainsi que la modulation de la conformation de l’hétérotrimère G12 par l’agoniste de V2R, l’arginine-vasopressine. Ces travaux dévoilent également la modulation de l’interaction entre Gα12 et son effecteur classique RhoA, suggérant un engagement de RhoA, ainsi que la potentialisation via Gα12 de la production d’AMP cyclique. À l’aide de diverses méthodes d’inhibition sélective, nos résultats précisent les mécanismes de la transactivation. Ils supportent notamment le rôle initiateur de l’activation de Src par V2R et l’absence d’implication des ligands connus d’IGF1R dans la transactivation. La métalloprotéase MMP 3 apparaît par ailleurs comme un bon candidat pour réguler la transactivation. Ce projet met en lumière des modes de signalisation peu explorés de V2R, dont l’implication physiologique et physiopathologique pourrait s’avérer significative, au-delà d’un apport fondamental dans la compréhension de la signalisation des RCPGs. / Vasopressin V2 receptor is a G protein coupled receptor (GPCR) responsible for the homeostatic regulation of water and sodium recapture from the urine to the bloodstream. Akin to numerous GPCRs, this receptor can interact with more than one heterotrimeric G protein subtype, and is still associated with some poorly explored signaling pathways with indefinite mechanisms. These non-canonical pathways are the focus of this project. This work aims at unveiling the characteristics and mechanisms underlying G12 mediated signaling by V2R and ERK 1/2 activation through the transactivation of the tyrosine kinase Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R). Using bioluminescence resonance energy transfer (BRET) experiments, we reveal V2R’s ability to interact with the Gα12 subunit, as well as the modulation of G12 heterotrimer’s conformation in response to V2R agonist arginine vasopressin (AVP). AVP-induced modulation of Gα12’s interaction with its classical effector RhoA upon stimulation with AVP suggests the engagement of RhoA, and our data also reveals that Gα12 potentiates AVP-induced cAMP production. Using diverse selective inhibition strategies, our results further define the mechanism of transactivation. Our data support a starter position of AVP-induced Src activation and discard IGF1R known agonists as the potential autocrine/paracrine factor responsible for IGF1R activation. Furthermore, our results suggest that the metalloproteinase MMP 3 is a good candidate for IGF1R transactivation. This project sheds light on lesser known signaling pathways involving V2R, which could reveal important on a physiological and pathophysiological scale, besides bringing a better understanding of the principles of GPCR signaling.

In addition to a central circadian clock in the suprachiasmatic nucleus (SCN), zebrafish (Danio rerio) have local clock systems in their peripheral tissues. These peripheral tissues express a complement of clock genes that can be synchronized with the 24 h light/dark cycle and thus may be entrained by light. To date, teleost multiple tissue (tmt) opsin identified from Fugu rubripes and Danio rerio is the only opsin that has been proposed as a candidate to mediate this cellular photoentrainment (Moutsaki et al., 2003). Here we report the discovery of a multigene family of tmt opsins found not only in the teleost fishes, but in vertebrates,including amphibians, birds, reptiles, and some mammals. Phylogenetic analysis demonstrated that this gene family consists of three main classes, tmtI, tmtII and tmtIII, with each duplicating further to give two paralogues in the zebrafish genome. Their predicted amino acid sequences contain most of the characteristic features for the function of a photopigment opsin, as well as seven transmembrane segments indicative of a G protein coupled receptor (GPCR) superfamily. Significantly, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) reveals that the tmt opsin genes in zebrafish are both temporally and spatially regulated. To investigate if these tmt photopigments mediate light-activated currents in cells, each opsin was expressed in vitro and the responses characterised by calcium imaging, whole-cell patch clamp electrophysiology, UV-Vis spectrophotometric analysis, and bioluminescence reporter assay. Collectively, these data suggest that some of the opsin photoproteins signal via Gi-type G protein pathway. Interestingly, the spectral analysis obtained shows that most tmt opsins tested are UV-sensitive when reconstituted in vitro with 11-cis and all-trans retinal, indicating an intrinsic bistable dynamics. Using site directed mutagenesis on one of the tmt opsins, tmt10, the potential spectral tuning sites involved in UV detection were tested. As part of this study, tmt opsin cDNAs were isolated from three populations of Mexican tetra (Astyanax mexicanus): surface, Pachon and Steinhardt. This allowed for a direct comparison between the tmt opsins present in the dark adapted species (cavefish) versus those of the light adapted species (zebrafish). It is hoped that the findings from this project will contribute to our understanding of non-visual light detection in fish and the evolution of their non-image forming photoreception.

L'adaptation à l'environnement est essentielle à la survie cellulaire et des organismes en général. La capacité d'adaptation aux variations en oxygène repose sur des mécanismes de détection de l'hypoxie et une capacité à répondre en amorçant un programme d'angiogenèse. Bien que la contribution du facteur induit par l'hypoxie (HIF) est bien définie dans l'induction d'une telle réponse, d'autres mécanismes sont susceptibles d'être impliqués. Dans cette optique, les études démontrant l'influence du métabolisme énergétique sur le développement vasculaire sont de plus en plus nombreuses. L'un de ces composés, le succinate, a récemment été démontré comme étant le ligand du GPR91, un récepteur couplé aux protéines G. Parmi les différents rôles attribués à ce récepteur, notre laboratoire s'intéressa aux rôles du GPR91 dans la revascularisation observée suite à des situations d'hypoxie dont ceux affectant la rétine. Il existe cependant d'autres conditions pour lesquelles une revascularisation serait bénéfique notamment suite à un stress hypoxique-ischémique cérébral. Nos travaux ont pour objectifs de mieux comprendre le rôle et le fonctionnement de ce récepteur durant le développement et dans le cadre de pathologies affectant la formation de vaisseaux sanguins. Dans un premier temps, nous avons déterminé le rôle du GPR91 dans la guérison suite à un stress hypoxique-ischémique cérébral chez le nouveau-né. Nous montrons que ce récepteur est exprimé dans le cerveau et en utilisant des souris n'exprimant pas le GPR91, nous démontrons que dans un modèle d'hypoxie-ischémie cérébrale néonatal l'angiogenèse prenant place au cours de la phase de guérison dépend largement du récepteur. L'injection intracérébrale de succinate induit également l'expression de nombreux facteurs proangiogéniques et les résultats suggèrent que le GPR91 contrôle la production de ces facteurs. De plus, l'injection de ce métabolite avant le modèle d'hypoxie-ischémie réduit substantiellement la taille de l'infarctus. In vitro, des essaies de transcription génique démontrent qu'à la fois les neurones et les astrocytes répondent au succinate en induisant l'expression de facteurs bénéfiques à la revascularisation. En considérant le rôle physiologique important du GPR91, une seconde étude a été entreprise afin de comprendre les déterminants moléculaires régissant son activité. Bien que la localisation subcellulaire des RCPG ait traditionnellement été considérée comme étant la membrane plasmique, un nombre de publications indique la présence de ces récepteurs à l'intérieur de la cellule. En effet, tel qu'observé par microscopie confocale, le récepteur colocalise avec plusieurs marqueurs du réticulum endoplasmique, que celui-ci soit exprimé de façon endogène ou transfecté transitoirement. De plus, l’activation des gènes par stimulation avec le succinate est fortement affectée en présence d'inhibiteur du transport d'acides organiques. Nous montrons que le profil de facteurs angiogéniques est influencé selon la localisation ce qui affecte directement l'organisation du réseau tubulaire ex vivo. Finalement, nous avons identifié une région conservée du GPR91 qui agit de signal de rétention. De plus, nous avons découvert l'effet de l'hypoxie sur la localisation. Ces travaux confirment le rôle de régulateur maître de l'angiogenèse du GPR91 lors d'accumulation de succinate en condition hypoxique et démontrent pour la première fois l'existence, et l'importance, d'un récepteur intracellulaire activé par un intermédiaire du métabolisme. Ces données pavent donc la voie à une nouvelle avenue de traitement ciblant GPR91 dans des pathologies hypoxiques ischémiques cérébrales et soulèvent l'importance de tenir compte de la localisation subcellulaire de la cible dans le processus de découverte du médicament. / The ability to adapt to the changing environment is essential for the survival of cells and organisms in general. The capacity to adjust to variations in oxygen content not only relies on the ability to sense hypoxia but also depends the time required to induce an angiogenic process. Notwithstanding the important contribution of the hypoxia inducible factor (HIF) in this response, other mechanisms are likely to be involved. Studies that have demonstrated the influence of metabolic compounds on vascular development are increasingly abundant. One of those compounds, succinate, has recently been indentified as the ligand of GPR91, a G-protein-coupled receptor. Amongst the roles of this receptor, our group has been interested in determining its contribution in revascularisation observed following hypoxic events in the retina. Other pathological conditions could benefit from the contribution of GPR91 including cerebral hypoxia-ischemia. Our objective is to better understand the role of this receptor during development and in pathological conditions affecting blood vessel formation. We first, determined the role of GPR91 in revascularisation following cerebral hypoxia-ischemia in the newborn. We show the expression of the receptor in the cerebral cortex. Using mice devoid of GPR91, we demonstrate that angiogenesis normally taking place during the recovery phase is largely dependent upon GPR91. Intracerebral injection of succinate induces the expression of several proangiogenic growth factors by activating GPR91. Furthermore, injection of succinate before cerebral H-I model substantially reduces the infarct size. In vitro, gene transcription shows that neurons and astrocytes respond to succinate and produce factors beneficial to revascularisation. Considering the important physiological role of GPR91, a second study was initiated to better determine the molecular determinants controlling the receptor's activity. The plasma membrane has classically been considered the typical GPCR's location of action but several new publications indicate the presence of such receptors within the cell. We observe, by confocal microscopy, the colocalisation of GPR91 (endogenous or transfected) with several marker of the endoplasmic reticulum. In addition, the gene induction observed when stimulated with succinate is severely affected in presence of the compound probenicid, an organic anion transporter inhibitor. We also demonstrate that the profile of genes expressed is largely dependent on the localisation of the receptor and consequently affects the organization of the tubular network ex vivo. Finally, we have identified a conserved region of GPR91 that acts as a retention signal. Lastly, we have uncovered the consequence of hypoxia affecting the post-translational modification of GPR91 and its change in location from the ER to the plasma membrane. This work confirms the role of GPR91 as a master regulator of angiogenesis in situations where succinate accumulates and demonstrated for the first time the existence, and importance, of an intracellular receptor activated by a metabolic intermediate. These results pave the way for future treatment targeting GPR91 in cerebral hypoxic ischemic pathologies and demonstrate the importance of taking into account the subcellular localisation in the drug discovery process.

Das Körpergewicht und die Nahrungsaufnahme werden unter anderem vom Hypothalamus reguliert. Dort werden Hormonelle Signale der Peripherie und neuronale Signale integriert. Die G-Protein gekoppelten Melanocortinrezeptoren 3 und 4 (MC3R und MC4R) werden von ihren Agonisten, den Melanocortinen aktiviert und durch den inversen Agonisten/Antagonisten Agouti-Related Peptide (AgRP) inaktiviert. Als weiterer Downstream-Mediatoren der MC4R-Aktivierung wurden kürzlich Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) und dessen Rezeptor TrkB (Tropomyosin-Related –Kinase) identifiziert. Mutationen im MC4R gelten als häufigste monogenetische Ursache für Adipositas. Da viele dieser Mutationen aber in vitro funktionell nicht relevant sind, wurde ein Amosäurevergleich von orthologen MC4R aus 70 verschiedenen Spezies erstellt. Funktionsverlustmutationen waren häufiger an koservierten Positionen, während Mutationen ohne Effekt überwiegend an schwach konservierten Positionen zu finden waren. Funktionelle Charakterisierung der von in Mausmodellen identifizierten Punktmutationen I194F und Y302C ergaben eine gute in-vivo/in-vitro Korrelation. Desweiteren wurden in der Normalbevölkerung in normalgewichtigen Personen identifizierte MC4R-Punktmutationen funktionell charakterisiert. Die Mutationen R7C, A70T, T112K, Q156R, M200V, V166I und R236H hatten keinen Effekt auf die Rezeptorfunktion, die H158R. Mutation zeigte eine hohe Basalaktivität, die aber durch AgRP erniedrigt werden konnte. Die in adipösen Patienten gefundenen Mutationen S136F und S139R wiesen einen kompletten Funktionsverlust auf, erstere verursachte zudem sogar einen dominant-negativen Effekt bei Koexpression mit dem Wildtyprezeptor. Für den MC3R wurde das zum Translationsstart bevorzugte Startcodon identifiziert. Für die Rezeptortyrosinkinase TrkB konnte in Hefe-2-Hybridscreens der neue Interaktionspartner Sept3 identifiziert werden. Dieses Protein bindet phosphorylierungsunabhängig an die intrazelluläre Juxtamembrandomäne. / Bodyweight and food intake are regulated by the hypothalamus which integrates peripheral hormonal and neural signals. The G-protein-coupled melanocortin-receptors 3 and 4 (MC3R and MC4R) are activated by melanocortins or inhibited by agouti-related pepetide (AgRP) and signal via the cAMP pathway. Brain-derived neurotrophic Factor (BDNF) was recently shown to signal downstream the MC4R via its receptor TrkB (tropomyosin-related kinase). Mutations in the MC4R are the most common cause of monogenetic obesity. However, many of these mutations are not functionally relevant in vitro. Here, an amino acid alignment of orthologous MC4R from over 70 species was used to evaluate reported mutations. Loss-of-function mutations were predominantly located at highly conserved positions whereas mutations without effect were located at non-conserved positions. Functional characterization of MC4R point mutations I194F (partial loss of function) and Y302C (complete loss of function) identified in mouse models showed good in vitro/in vivo correlation. Furthermore mutations found in normal weight persons were characterized: R7C, A70T, T112K, Q156K, M200V, V166I and R236H had no effect on receptor function in vitro, whereas the H158R Mutation showed high constitutive activity, which however could be diminished by AgRP. The mutations S136F and S139F identified in obese patients were characterized as complete loss-of-function mutations, the former additionally caused a dominant-negative effect on wildtype MC4R in vitro. For the MC3R the preferred start-codon for initiation of translation was identified. For TrkB Sept3 could be identified as a new interaction partner in a yeast-2-hybrid screen. This Protein belonging to the septin family binds to the intracellular juxtamembrane domain of TrkB independent of phosphorylation of the Shc-binding site.

The gastrointestinal tract (GIT) regulates nutrient uptake, secretes hormones and has a crucial gut flora and enteric nervous system. Of relevance for these functions are the G protein-coupled receptors (GPCRs) and the solute carriers (SLCs). The Adhesion GPCR subfamily is known to mediate neural development and immune system functioning, whereas SLCs transport e.g. amino acids, fatty acids (FAs) and drugs over membranes. We aimed to comprehensively characterize Adhesion GPCR and SLC gene expression along the rat GIT. Using qPCR we measured expression of 78 SLCs as well as all 30 Adhesion GPCRs in a twelve-segment GIT model. 21 of the Adhesion GPCRs had a widespread (≥5 segments) or ubiquitous (≥11 segments) expression. Restricted expression patterns were characteristic for most group VII members. Of the SLCs, we found the majority (56 %) of these transcripts to be expressed in all GIT segments. SLCs were predominantly found in the absorption-responsible gut regions. Both Adhesion GPCRs and SLCs were widely expressed in the rat GIT, suggesting important roles. The distribution of Adhesion GPCRs defines them as a potential pharmacological target. FAs constitute an important energy source and have been implicated in the worldwide obesity increase. FAs and their ratios – indices for activities of e.g. the desaturase enzymes SCD-1 (SCD-16, 16:1n-7/16:0), D6D (18:3n-6/18:2n-6) and D5D (20:4n-6/20:3n-6) – have been associated with e.g. overall mortality and BMI. We examined whether differences in FAs and their indices in five lipid fractions contributed to obesity susceptibility in rats fed a high fat diet (HFD), and the associations of desaturase indices between lipid fractions in animals on different diets. We found that on a HFD, obesity-prone (OP) rats had a higher SCD-16 index and a lower linoleic acid (LA) proportions in subcutaneous adipose tissue (SAT) than obesity-resistant rats. Desaturase indices were significantly correlated between many of the lipid fractions. The higher SCD-16 may indicate higher SCD-1 activity in SAT in OP rats, and combined with lower LA proportions may provide novel insights into HFD-induced obesity. The associations between desaturase indices show that plasma measurements can serve as proxies for some lipid fractions, but the correlations seem to be affected by diet and weight gain.