Os tumores de musculatura liso do útero se desenvolvem a partir do miométrio e podem apresentar carcterísticas clínicas malignas e benignas. Dentre eles, o leiomiossarcoma (LMS) é o tumor maligno mais comum, com altas taxas de metástase e recidiva, mesmo sendo diagnosticado em estágios iniciais. Já os leiomiomas (LM) são os tumores benignos mais frequentes em mulheres em idade reprodutiva. Ambos possuem mesma diferenciação celular, porém com comportamentos clínico e biológico bastante distintos, e até o momento não se dispõe de tratamento específico ou curativo. Nesse contexto, a busca por novos alvos moleculares pode contribuir não só para um melhor entendimento dessas neoplasias, como também para a descoberta de novas terapias. Em estudo prévio foi observada a expressão aumentada de FOXO3a nos sarcomas uterinos, em comparação aos LMs e ao miométrio adjacente (MM). Além disso, sua expressão foi crescente de acordo com o potencial de malignidade do tumor. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar in vitro o efeito de terapia alvo específica para FOXO3a em células de LM e LMS. Para isto, linhagens celulares de MM (ATCC PCS-460-011), LM (THESCs - CRL-4003) e LMS (SK-UT-1 - HTB-114) foram caracterizadas quanto à expressão basal de FOXO3a (gene e proteína) e submetidas a tratamento com Genisteína e Metformina ou inativação do gene por siRNA. Os efeitos dos tratamentos foram avaliados por PCR em tempo real, Western Blot, imunocitoquímica, ensaios de proliferação, migração e apoptose. Nossos resultados mostraram que todos os tratamentos realizados interferiram na capacidade de proliferação e migração das células, com maior inibição após as 48 horas nos LMS e 72h nos LM. O efeito obtido na transfecção com siRNA apresentou maior eficiência após 48 h da transfecção nos LMS e 72h nos LM. Os efeitos da inibição de FOXO3a foram maiores na proliferação e migração dos LM, porém os resultados não foram estatisticamente significativos. Dentre as substâncias testadas, a Metformina apresentou maior efeito sobre a proliferação, migração e viabilidade das linhagens celulares. A Genisteína também apresentou efeito inibitório nas células, porém o controle com veículo também apresentou o mesmo efeito citotóxico. De modo geral, os efeitos obtidos com os fármacos, foram tempo e concentração dependentes. Em conjunto, nossos resultados sugerem um relevante do FOXO3a nos tumores de musculatura lisa uterinos, além de apresentá-lo como potencial alvo para terapia específica / Smooth muscle tumors of the uterus develop from the myometrium and may present benign and malignant clinical features. Among them, leiomyosarcoma (LMS) is the most frequent malignant tumor, with high rates of metastasis and relapse, even when diagnosed in early stages. On the other hand, leiomyomas (LM) are the most frequent benign tumors in women of reproductive age. Both have the same cellular differentiation, but with very different clinical and biological behaviors, and so far no specific or curative treatment is available. In this context, the search for new molecular targets can contribute not only for a better understanding of these neoplasms, but also for the discovery of new therapies. In a previous study, increased expression of FOXO3a in uterine sarcomas was observed, compared to LMs and adjacent myometrium (MM). In addition, its expression was increasing according to the malignancy potential of the tumor. Thus, the aim of the present study was to evaluate in vitro, the effect of specific targeted therapy for FOXO3a on LM and LMS cells. For this, MM (ATCC PCS-460-011), LM (THESCs-CRL-4003) and LMS (SK-UT-1-HTB-114) cell lines were characterized for basal expression of FOXO3a (gene and protein) and subsequently submitted to treatment with metformin and genistein, or silencing of FOXO3a by siRNA. The effects of the treatments were evaluated by real-time PCR, Western Blot, immunocytochemistry, proliferation, migration and apoptosis assays. Our results showed that all treatments interfered in the proliferation and migration capacity of the cells, with greater inhibition after 48 hours for LMS and 72 hours LM. The effect obtained in the transfection with siRNA showed higher efficiency after 48 hours of transfection in LMS and 72 hours in LM. The effects of inhibition of FOXO3a were greater in the proliferation and migration of the LM, but the results were not statistically significant. Among the substances tested, Metformin had a greater effect on proliferation, migration and viability of the cell lines. Genistein also had an inhibitory effect on the cells, but the control with the vehicle also presented the same cytotoxic effect. In general, the effects obtained with the drugs were time and concentration dependent. Together, our results suggest a relevant role of FOXO3a in uterine smooth muscle tumors, in addition to presenting it as a potential target for specific therapy

Objetivos: Investigar o dano a lipídios, proteínas e ao DNA, níveis de glicosaminoglicanos (GAGs) e as concentrações de interleucina 1-β (IL1-β) em sangue de pacientes com Mucopolissacaridose (MPS) tipo II no diagnóstico e durante a terapia de reposição enzimática (TRE) e correlacioná-los com parâmetros de estresse oxidativo, bem como analisar o efeito in vitro da genisteína sob o dano ao DNA em leucócitos de pacientes com MPS tipo IVA. Métodos: Amostras de sangue e urina de doze pacientes com MPS II no diagnóstico e sob tratamento com TRE, além de controles saudáveis foram utilizados para avaliar: índice de lipoperoxidação e oxidação de proteínas (medida a partir do conteúdo de grupamentos carbonila e SH) em plasma, GAGs urinários, níveis de IL1-β plasmáticos, bem como índice de dano ao DNA em leucócitos através do ensaio cometa, também utilizada para avaliar o dano ao DNA em leucócitos de pacientes com MPS IVA, previamente incubados em diferentes concentrações de genisteína ou em tampão fosfato salino e dimetilsulfóxido. Resultados e Discussão: Foi observada a presença de dano oxidativo a biomoléculas em sangue de pacientes com MPS II, com altos níveis de lipoperoxidação, conteúdo de grupamentos carbonila, dano ao DNA e redução de grupos sulfidrila. Houve redução no dano ao DNA e na lipoperoxidação após TRE, além de aumento de grupamentos sulfidrila, embora a terapia não tenha sido capaz de reverter o dano a carbonila. Nossos resultados sugerem que o aumento dos GAGs induz o dano aos lipídios e ao DNA. A adição in vitro de genisteína (10, 30 e 50 μM) em amostras de sangue de pacientes MPS IVA acarretou em um aumento estatisticamente significativo no índice de dano ao DNA. Conclusões: Estresse oxidativo e inflamação estão envolvidos na fisiopatologia da MPS II. Além disso, a TRE mostrou ter papel protetor contra o dano ao DNA e a lipídios. A genisteína nas doses 10, 30 e 50 μM aumentou in vitro o índice de dano ao DNA em leucócitos de pacientes MPS IVA, demonstrando citotoxicidade. / Objectives: Investigate lipid, protein and DNA damage, glycosaminoglycans (GAGs) levels and the inflammatory marker interleukin 1-β (IL1-β) concentration of mucopolysaccharidosis (MPS) II patients at the moment of diagnosis and during enzyme replacement therapy (ERT), correlate these findings with oxidative stress parameters, as well as investigate the in vitro effect of genistein on DNA injury in leukocytes from MPS IVA patients. Material and Methods: Blood and urine samples from twelve MPS II patients at diagnosis and under ERT and healthy controls were evaluated regarding the parameters: lipid peroxidation index and protein oxidation (carbonyl and SH group contents) in plasma, urinary GAGs, as well as IL-1β in plasma and DNA damage index in leukocytes. Besides, blood samples from MPS IVA patients were incubated with different concentrations of genistein or phosphate buffered saline (PBS) and dimethylsulfoxide (DMSO), and the DNA damage index in leukocytes was evaluated by the comet assay. Results and Discussion: MPS II patients presented oxidative damage to biomolecules with high levels of lipid peroxidation, carbonyl content and DNA damage, as well as a reduction on SH groups. There was a decrease in DNA damage and lipid oxidative injury after ERT, and an increase in SH levels, although this therapy was not able to reverse carbonyl content. The high levels of urinary GAGs in MPS II patients were reduced after ERT and positively correlated with DNA and lipid oxidative injury, suggesting that GAGs accumulation induce lipid peroxidation and DNA damage. MPS IVA patients blood treated in vitro with genistein (10, 30 e 50 μM) had higher DNA damage index when compared to samples treated with PBS buffer and DMSO. Conclusions: Oxidative stress and inflammation process are involved in MPS II pathophysiology, and ERT protects against DNA and lipid injury, probably by reducing GAGs accumulation. Genistein increased in vitro DNA damage in leukocytes from MPS IVA patients, demonstrating cytotoxicity.

Objetivos: Investigar o dano a lipídios, proteínas e ao DNA, níveis de glicosaminoglicanos (GAGs) e as concentrações de interleucina 1-β (IL1-β) em sangue de pacientes com Mucopolissacaridose (MPS) tipo II no diagnóstico e durante a terapia de reposição enzimática (TRE) e correlacioná-los com parâmetros de estresse oxidativo, bem como analisar o efeito in vitro da genisteína sob o dano ao DNA em leucócitos de pacientes com MPS tipo IVA. Métodos: Amostras de sangue e urina de doze pacientes com MPS II no diagnóstico e sob tratamento com TRE, além de controles saudáveis foram utilizados para avaliar: índice de lipoperoxidação e oxidação de proteínas (medida a partir do conteúdo de grupamentos carbonila e SH) em plasma, GAGs urinários, níveis de IL1-β plasmáticos, bem como índice de dano ao DNA em leucócitos através do ensaio cometa, também utilizada para avaliar o dano ao DNA em leucócitos de pacientes com MPS IVA, previamente incubados em diferentes concentrações de genisteína ou em tampão fosfato salino e dimetilsulfóxido. Resultados e Discussão: Foi observada a presença de dano oxidativo a biomoléculas em sangue de pacientes com MPS II, com altos níveis de lipoperoxidação, conteúdo de grupamentos carbonila, dano ao DNA e redução de grupos sulfidrila. Houve redução no dano ao DNA e na lipoperoxidação após TRE, além de aumento de grupamentos sulfidrila, embora a terapia não tenha sido capaz de reverter o dano a carbonila. Nossos resultados sugerem que o aumento dos GAGs induz o dano aos lipídios e ao DNA. A adição in vitro de genisteína (10, 30 e 50 μM) em amostras de sangue de pacientes MPS IVA acarretou em um aumento estatisticamente significativo no índice de dano ao DNA. Conclusões: Estresse oxidativo e inflamação estão envolvidos na fisiopatologia da MPS II. Além disso, a TRE mostrou ter papel protetor contra o dano ao DNA e a lipídios. A genisteína nas doses 10, 30 e 50 μM aumentou in vitro o índice de dano ao DNA em leucócitos de pacientes MPS IVA, demonstrando citotoxicidade. / Objectives: Investigate lipid, protein and DNA damage, glycosaminoglycans (GAGs) levels and the inflammatory marker interleukin 1-β (IL1-β) concentration of mucopolysaccharidosis (MPS) II patients at the moment of diagnosis and during enzyme replacement therapy (ERT), correlate these findings with oxidative stress parameters, as well as investigate the in vitro effect of genistein on DNA injury in leukocytes from MPS IVA patients. Material and Methods: Blood and urine samples from twelve MPS II patients at diagnosis and under ERT and healthy controls were evaluated regarding the parameters: lipid peroxidation index and protein oxidation (carbonyl and SH group contents) in plasma, urinary GAGs, as well as IL-1β in plasma and DNA damage index in leukocytes. Besides, blood samples from MPS IVA patients were incubated with different concentrations of genistein or phosphate buffered saline (PBS) and dimethylsulfoxide (DMSO), and the DNA damage index in leukocytes was evaluated by the comet assay. Results and Discussion: MPS II patients presented oxidative damage to biomolecules with high levels of lipid peroxidation, carbonyl content and DNA damage, as well as a reduction on SH groups. There was a decrease in DNA damage and lipid oxidative injury after ERT, and an increase in SH levels, although this therapy was not able to reverse carbonyl content. The high levels of urinary GAGs in MPS II patients were reduced after ERT and positively correlated with DNA and lipid oxidative injury, suggesting that GAGs accumulation induce lipid peroxidation and DNA damage. MPS IVA patients blood treated in vitro with genistein (10, 30 e 50 μM) had higher DNA damage index when compared to samples treated with PBS buffer and DMSO. Conclusions: Oxidative stress and inflammation process are involved in MPS II pathophysiology, and ERT protects against DNA and lipid injury, probably by reducing GAGs accumulation. Genistein increased in vitro DNA damage in leukocytes from MPS IVA patients, demonstrating cytotoxicity.

Objetivos: Investigar o dano a lipídios, proteínas e ao DNA, níveis de glicosaminoglicanos (GAGs) e as concentrações de interleucina 1-β (IL1-β) em sangue de pacientes com Mucopolissacaridose (MPS) tipo II no diagnóstico e durante a terapia de reposição enzimática (TRE) e correlacioná-los com parâmetros de estresse oxidativo, bem como analisar o efeito in vitro da genisteína sob o dano ao DNA em leucócitos de pacientes com MPS tipo IVA. Métodos: Amostras de sangue e urina de doze pacientes com MPS II no diagnóstico e sob tratamento com TRE, além de controles saudáveis foram utilizados para avaliar: índice de lipoperoxidação e oxidação de proteínas (medida a partir do conteúdo de grupamentos carbonila e SH) em plasma, GAGs urinários, níveis de IL1-β plasmáticos, bem como índice de dano ao DNA em leucócitos através do ensaio cometa, também utilizada para avaliar o dano ao DNA em leucócitos de pacientes com MPS IVA, previamente incubados em diferentes concentrações de genisteína ou em tampão fosfato salino e dimetilsulfóxido. Resultados e Discussão: Foi observada a presença de dano oxidativo a biomoléculas em sangue de pacientes com MPS II, com altos níveis de lipoperoxidação, conteúdo de grupamentos carbonila, dano ao DNA e redução de grupos sulfidrila. Houve redução no dano ao DNA e na lipoperoxidação após TRE, além de aumento de grupamentos sulfidrila, embora a terapia não tenha sido capaz de reverter o dano a carbonila. Nossos resultados sugerem que o aumento dos GAGs induz o dano aos lipídios e ao DNA. A adição in vitro de genisteína (10, 30 e 50 μM) em amostras de sangue de pacientes MPS IVA acarretou em um aumento estatisticamente significativo no índice de dano ao DNA. Conclusões: Estresse oxidativo e inflamação estão envolvidos na fisiopatologia da MPS II. Além disso, a TRE mostrou ter papel protetor contra o dano ao DNA e a lipídios. A genisteína nas doses 10, 30 e 50 μM aumentou in vitro o índice de dano ao DNA em leucócitos de pacientes MPS IVA, demonstrando citotoxicidade. / Objectives: Investigate lipid, protein and DNA damage, glycosaminoglycans (GAGs) levels and the inflammatory marker interleukin 1-β (IL1-β) concentration of mucopolysaccharidosis (MPS) II patients at the moment of diagnosis and during enzyme replacement therapy (ERT), correlate these findings with oxidative stress parameters, as well as investigate the in vitro effect of genistein on DNA injury in leukocytes from MPS IVA patients. Material and Methods: Blood and urine samples from twelve MPS II patients at diagnosis and under ERT and healthy controls were evaluated regarding the parameters: lipid peroxidation index and protein oxidation (carbonyl and SH group contents) in plasma, urinary GAGs, as well as IL-1β in plasma and DNA damage index in leukocytes. Besides, blood samples from MPS IVA patients were incubated with different concentrations of genistein or phosphate buffered saline (PBS) and dimethylsulfoxide (DMSO), and the DNA damage index in leukocytes was evaluated by the comet assay. Results and Discussion: MPS II patients presented oxidative damage to biomolecules with high levels of lipid peroxidation, carbonyl content and DNA damage, as well as a reduction on SH groups. There was a decrease in DNA damage and lipid oxidative injury after ERT, and an increase in SH levels, although this therapy was not able to reverse carbonyl content. The high levels of urinary GAGs in MPS II patients were reduced after ERT and positively correlated with DNA and lipid oxidative injury, suggesting that GAGs accumulation induce lipid peroxidation and DNA damage. MPS IVA patients blood treated in vitro with genistein (10, 30 e 50 μM) had higher DNA damage index when compared to samples treated with PBS buffer and DMSO. Conclusions: Oxidative stress and inflammation process are involved in MPS II pathophysiology, and ERT protects against DNA and lipid injury, probably by reducing GAGs accumulation. Genistein increased in vitro DNA damage in leukocytes from MPS IVA patients, demonstrating cytotoxicity.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-10-26T14:08:12Z No. of bitstreams: 1 marcioluizdepaula.pdf: 356960 bytes, checksum: 5867e0339760e8cd97d12ed8a70ed57e (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-12-15T12:53:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 marcioluizdepaula.pdf: 356960 bytes, checksum: 5867e0339760e8cd97d12ed8a70ed57e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-15T12:53:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marcioluizdepaula.pdf: 356960 bytes, checksum: 5867e0339760e8cd97d12ed8a70ed57e (MD5) Previous issue date: 2007-11-13 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A Esclerose Múltipla é uma doença autoimune que acomete o Sistema Nervoso Central. O modelo animal mais amplamente utilizado para o estudo desta patologia é o da encefalomielite autoimune experimental (EAE), comumente induzida em camundongos. Em estudos anteriores, observou-se que o estrógeno representa um papel central na resposta imune e nas doenças imunomediadas. Os fitoestrógenos representam uma família de compostos vegetais com propriedades estrogênicas, pois apresentam muitas similaridades estruturais com os estrógenos endógenos, inclusive ligando-se aos seus receptores. O presente trabalho teve como objetivo testar o fitoestrógeno genisteína em camundongos da linhagem C57Bl/6 com EAE. Para isto, foi inicialmente padronizado o modelo de EAE e, posteriormente, o efeito imunomodulador da isoflavona genisteína foi analisado não somente através da avaliação clínica dos camundongos como também pela produção de citocinas Th1 e Th2, além da interação dos leucócitos com o endotélio cerebral. / Multiple sclerosis (MS) is the most common non-traumatic, disabling neurological human inflammatory demyelinating disease of the CNS. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) models MS and is characterized as a CD4+ Th1 cell-mediated autoimmune disease. Recent data show that estrogen plays a pivotal role in the immune response as well as in immune-mediated diseases. Isoflavones are found in a variety of plants, especially in soy, and make up the most common form of phytoestrogens which demonstrate estrogenic properties due to their structural similarities with estrogens. Genistein is the major bioactive isoflavone. In the present report, we investigated the use of genistein for the treatment of the murine model of MS in C57Bl/6 mice. The genistein’s modulatory effects were evaluated after induction of EAE with MOG35-55, assessing not only clinical symptoms but also pro- and anti-inflammatory cytokines, and the leukocyte rolling and adherence in the CNS by performing intravital microscopy.

Introdução: A resistência do câncer de mama (CM) ao tratamento quimio/radioterápico convencional ainda representa um grande desafio, especialmente em carcinomas triplonegativos, os quais não expressam receptores de estrógeno, receptores de progesterona e oncogene (HER2)/neu. Sabe-se que o grau de resistência do CM está fortemente associado à quantidade de células-tronco tumorais (CTTs), as quais podem ser detectadas por imunofenotipagem (CD24-/CD44+). As CTTs são quiescentes e apresentam inibição de vias pró- apoptóticas. Vários compostos naturais apresentam atividade antitumoral, dentre os quais o fitoestrógeno da soja genisteína (GEN) destaca-se como amplo inibidor de tirosino-quinases. Contudo os efeitos biológicos da GEN quanto à presença de CTTs ainda são pouco conhecidos, especialmente quando associada a outros quimioterápicos. Objetivos: Avaliar os efeitos citotóxicos do fitoestrógeno GEN em populações de CTTs e não-CTTs, aliado ao tratamento in vitro com radiação ionizante (RAD) e doxorrubicina (DXR) na linhagem de CM triplo-negativo MDA-MB-231. Metodologia: Foram empregados esquemas de pré-tratamento (GEN + DXR e GEN + RAD) e pós-tratamento (DXR + GEN e RAD + GEN), utilizando 1 - 5 ?M de GEN por 24h, 1 ng/mL de DXR por 24h e 5 -10 Gy de RAD, sendo os experimentos realizados após 24h de irradiação. Ao final de cada tratamento, foram avaliados viabilidade celular, grau de sinergia, ciclo celular, apoptose e quantidade de células CD24-/CD44+. Além disso, foi feita a aquisição de células CTTs e não-CTTs a fim de analisar a expressão gênica de vias apoptóticas. O estudo investigou os mesmos parâmetros na linhagem de CM hormônio-positivo MCF-7. Resultados: O tratamento com GEN 1 ?M por 24h provocou apoptose significativa em MDA-MB-231 por bloqueio em fase G2/M, porém o aumento da dose também não alterou a viabilidade e a população CD24-/CD44+. Células MCF-7 mostraram-se resistentes à GEN, pela indução da fase S, mas foram sensíveis à RAD, pelo bloqueio em fase G0/G1. O aumento da dose de GEN nos tratamentos combinados com DXR produziu aumento na sinergia. O pré-tratamento GEN 5 ?M + DXR 1 ng/mL induziu expressão de genes apoptóticos em células CD24-/CD44+, mas não reduziu a viabilidade. Conclusões: Tratamentos combinados utilizando baixas doses de GEN e DXR em esquemas de pré e pós-tratamento são capazes de provocar apoptose e redução da viabilidade em células MDA-MB-231 sensíveis. Contudo, esses tratamentos parecem induzir a sinalização de mecanismos de sobrevivência em CTTs, incluindo supressão de vias apoptóticas. Nesse contexto, apenas os tratamentos que induzem bloqueio no ciclo celular, mas sem alterar a viabilidade, são capazes de afetar populações CTTs resistentes de MDA-MB-231. / Introduction: Conventional chemo/radiotherapy breast cancer resistance still represents a major challenge, especially in triple-negative carcinomas, which do not express estrogen receptors, progesterone receptors and oncogene (HER2)/neu. It is known that the degree of breast cancer resistance is strongly associated with the amount of cancer stem cells, which can be detected by immunophenotyping (CD24-/CD44+). Cancer stem cells remain in G0/G1 phase for a long time, and exhibit inhibition of pro-apoptotic pathways. Several natural compounds have been studied, among which is the phytoestrogen genistein (GEN) from soy bean. The GEN acts as an ample tyrosine kinase inhibitor, and its antitumor activity has been pointed out in several studies. However, the biological effects of GEN in tumor stem cells are still poorly understood, especially when combined with other chemotherapy. Objectives: To assess the cytotoxic effects of GEN phytoestrogen in tumor stem and non-tumor stem sub-populations, combined with radiation (RAD) and doxorubicin (DXR) in vitro treatments in triple-negative breast cancer cell line MDAMB-231. Methodology: We used pretreatment (GEN + DXR e GEN + RAD) and post-treatment (DXR + GEN e RAD + GEN) regimens using 1 - 5 ?M of GEN for 24 hours, 1 ng/ml DXR for 24 hours and 5 - 10 Gy of RAD, in which experiments were performed after 24 hours of irradiation. At the end of each treatment we assessed cell viability, coefficient of drug interaction, cell cycle, apoptosis and amount of CD24-/CD44+ cells. Moreover, cancer stem cells and non-cancer stem cells sub-populations were sorted in order to study the gene expression of apoptotic pathways. This study also investigated the hormone-positive breast cancer cell line MCF-7. Results: GEN 1 ?M for 24 hours caused significant apoptosis in MDA-MB-231 by blocking the G2/M phase, but increasing the dose did not alter viability and CD24-/CD44+ quantity. MCF-7 cells were resistant to GEN, by inducing S phase, but were also sensitive to the RAD, with G0/G1 block. Increasing the dose in GEN treatments combined with DXR produced increased synergistic effects. Pretreatment GEN 5 ?M + DXR 1 ng/ml induced superexpression of apoptotic genes in CD24- /CD44+ cells, but did not reduce cell viability. Conclusions: Combined treatments using low doses of DXR and GEN in pre and post treatment schemes are able to trigger apoptosis and reduce viability of MDA-MB-231 responsive cells. However, these treatments appear to induce survival signaling mechanisms in cancer stem cells, including suppression apoptotic pathways. In this context, only treatments that induce cell cycle block, but without causing decrease in cell viability, are able to affect resistant tumor stem cells in MDA-MB-231.

Made available in DSpace on 2017-07-21T19:59:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camila Juraszeck.pdf: 2382188 bytes, checksum: de4167e36249ed23da96ba41c11fe677 (MD5) Previous issue date: 2011-04-19 / Genistein has estrogenic activity and can bind to estrogen receptors (ER), so it is considered a phytoestrogen. ER have been reported in macrophages and in that sense, the estrogens modulate immune responses. Despite the sexual dimorphism of the immune responses in females and males is well established, there are few studies that elucidate the role of bioactive compounds such as genistein among the genders. We investigated the effects of genistein on mice macrophage functionality, benchmarking males and females, which are divided into three groups according to sex and stage of the estrous cycle. First we checked the cytotoxicity,employing the technique of MTT reduction, in the following compounds: genistein, quercetin and 17-estradiol in the presence or absence of lipopolysaccharide (LPS). And none of these altered cell viability. To test the functionality of macrophages, the cells were treated for 24 h with two concentrations of genistein and quercetin (5M and 10M) as well as two concentrations of 17-estradiol (0,01 and 10 M), besides the control of the vehicle, the dimethylsulfoxide (DMSO) at 0,5%. The macrophages’ funtion standarts determined by spectrophotometry were the NO production in both basal and LPS induced, the production of H2O2 induced by LPS and by light microscopy was evaluated the phagocytic ability of macrophages, which were challenged to phagocytize Zymosan particles opsonized or not, after two hours of treatments. The results show a inhibition percentage of basal NO production in macrophages treated with genistein 10M, 34% and 40% for males and females in diestrus, respectively. In the macrophages obtained from females in proestrus quercetin treatment alone (in lower and higher concentration) showed a decrease in basal NO production significantly compared to control, with inhibition of 24% and 34% respectively. As NO production induced by LPS, macrophages from males showed significant inhibition of production with all treatments (except quercetin 5 μM), while in females in diestrus, treatments genistein (5 and 10 μM) and quercetin (5 and 10 μM ), this parameter significantly decreased functional macrophages, with values corresponding respectively to 25%, 30%, 17% and 31%. Once in females in proestrus, basal NO production induced by LPS and was inhibited only by quercetin (10M). All treatments of macrophages collected from the male reduced the production of H2O2 and genistein inhibition percentage of 10M of 27%. In females in diestrus was observed that treatment with genistein 5 e 10 M and quercetin 10M inhibited respectively 29%, 32% and 37% the production of H2O2. The H2O2 production by macrophages from females in proestrus was significantly inhibited by all treatments (except estradiol 0,01 ηM and quercetin 10M), and the percentage inhibition of genistein 5 e 10M was 22%. The phagocytic activity of macrophages was not affected by treatment with genistein for either group. Our results suggest that NO production, macrophages premodulated by exposure to 17-estradiol, the effect of genistein is less pronounced, may possible be explained by downregulation of ER in ex vivo treatments. In conclusion we can infer that, the use of genistein should account for sex, and therefore variations in serum hormone concentrations of 17-estradiol (sexual cycle) in females. / A genisteína têm atividades estrogênicas, e pode se ligar aos receptores de estrogênio (RE), por isso é considerada um fitoestrógeno. RE têm sido relatados em macrófagos e nesse sentido, os estrogênios modulam as respostas imunes. Apesar do dimorfismo sexual das respostas imunes de fêmeas e machos estar bem estabelecido, existem poucos estudos que elucidem o papel de compostos bioativos como a genisteína entre os sexos. Neste estudo, investigamos os efeitos da genisteína na funcionalidade de macrófagos de ratos, avaliando comparativamente machos e fêmeas, sendo estes divididos em três grupos de acordo com o sexo e a fase do ciclo estral. Primeiramente verificamos a citotoxicidade, empregando a técnica de redução do MTT, dos seguintes compostos: genisteína, quercetina e 17-estradiol, na presença ou ausência de lipopolissacarídeo (LPS). E nenhum destes alterou a viabilidade celular. Para o ensaio da funcionalidade dos macrófagos, as células foram tratadas por 24 horas com duas concentrações de genisteína e quercetina (5M e 10M), como também duas concentrações de 17-estradiol (0,01 e 10 M), além do controle do veículo, o dimetilsulfoxido (DMSO) na concentração de 0,5%. Dos parâmetros de funcionalidade dos macrófagos, foram determinadas por espectrofotometria a produção de NO tanto basal quanto a induzida por LPS, bem como a produção de H2O2 induzida por LPS, e por microscopia de luz realizou-se a avaliação da capacidade fagocítica dos macrófagos, que foram desafiados a fagocitar partículas de Zimosan opsonizadas ou não, após tratamentos de 2 horas. Os resultados encontrados revelam uma porcentagem de inibição da produção de NO basal de macrófagos tratados com genisteína 10 M de 34% e 40%, para machos e fêmeas em diestro, respectivamente. Nos macrófagos obtidos das fêmeas em proestro apenas o tratamento quercetina (em menor e maior concentração) apresentou diminuição na produção de NO basal significativa em relação ao controle, com inibição de 24% e 34% respectivamente. Quanto a produção de NO induzida por LPS, macrófagos de machos apresentaram inibição significativa da produção com todos os tratamentos (exceto quercetina 5M), enquanto nas fêmeas em diestro, os tratamentos genisteína (5 e 10 M) e quercetina (5 e 10 M), diminuíram significativamente esse parâmetro funcional de macrófagos, com os valores correspondentes respectivamente a 25%, 30%, 17% e 31%. Já nas fêmeas em proestro, a produção de NO basal e induzida por LPS foi apenas inibida pela quercetina (10M). Todos os tratamentos dos macrófagos obtidos de machos reduziram a produção de H2O2, sendo porcentagem de inibição da genisteína 10 μM de 27%. Nas fêmeas em diestro observa-se que os tratamentos com genisteína 5 e 10M e quercetina 10 M inibiram respectivamente em 29%, 32% e 37% a produção de H2O2. A produção de H2O2 pelos macrófagos das fêmeas em proestro foi inibida significativamente por todos os tratamentos (exceto estradiol 0,01 M e quercetina 10 M), sendo que a porcentagem de inibição da genisteína 5 e 10 M foi de 22%. A atividade fagocítica dos macrófagos não foi influenciada pelo tratamento com a genisteína para nenhum dos grupos. Nossos resultados são sugestivos de que a produção de NO nos macrófagos prémodulados pela exposição ao hormônio estradiol o efeito da genisteína é menos acentuado, podendo ser explicado por possível downregulation dos RE em tratamentos ex vivo. Em conclusão podemos inferir que para o emprego da genisteína deve se levar em consideração o sexo, e por conseguinte, a variação da concentração hormonal sérica de 17-estradiol (ciclo sexual) em fêmeas.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2014-09-09T11:45:33Z No. of bitstreams: 2 Dissertacao_Lorena_Maione_Silva_Ciencias_Farmaceuticas.pdf: 516603 bytes, checksum: ec25498f249629c65bc31a3ef2bd8588 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-09T11:45:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao_Lorena_Maione_Silva_Ciencias_Farmaceuticas.pdf: 516603 bytes, checksum: ec25498f249629c65bc31a3ef2bd8588 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2012-02-28 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Genistein (GEN), isoflavone contained in soybeans, shows activity against a large number of cancers, including skin cancer. However, to be used topically it is essential the association of GEN in an appropriate formulation. The aim of this study was the development and characterization of solid lipid nanoparticles (SLN) contends genistein for topical application. A bioanalytical method was developed and validated for GEN quantification in skin layers with High Performance Liquid Chromatographer (HPLC) with UV detection. The SLN was obtained with glyceryl behenate, polysorbate 80, sorbitan trioleate and different amounts of cetylpyridinium chloride (CPC) (0.5 - 0.05%). The characteristics in terms of particle size, size distribution, zeta potential, entrapment efficiency and drug recovery were evaluated. In vitro release, passive and iontophoretic, skin permeation studies were performed. Cytotoxicity studies were carried out in melanoma cells (B16F10) with free drug and SLN with and without GEN. The analytical method was linear in the concentration range of 0.1 to 60 mg/mL. Limit of quantification was 100 ng/mL for both skin layers. Recovery of the drug ranged from 95.57 to 97.57%. The method was able to analyze the GEN without suffering interference from endogenous skin components. SLN loaded with GEN showed positive surface (+ 23 mV) and average size of 343 nm. Particles were obtained with high entrapment efficiency (93%) and drug load was 5.45%. In vitro release studies demonstrated that the release of GEN from SLN occurs in two stages with a large amount of drug released within the first six hours, followed by a slow release of the remaining drug in the lipid matrix of SLN in the following hours. When administered in the skin, during in vitro passive permeation studies, the SLN increased retention of GEN in stratum corneum and remaining skin compared with free GEN. After iontophoresis application in formulation of SLN containing GEN thirteen times more GEN was retained on stratum corneum and three times more drug was retained on remaining skin. In cellular cytotoxicity studies SLN favored the increase of interaction of drug with the cells and the cytotoxicity was concentration-dependent. Thus, GEN loaded SLN increased drug skin permeation and retention and shows to be a potential formulation for topical application. / A genisteína (GEN), isoflavona contida nos grãos da soja, apresenta atividade contra um grande número de tipos de câncer, incluindo o câncer de pele. No entanto, para ser usada topicamente é fundamental que a GEN esteja associada a uma formulação adequada. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) contendo genisteína para aplicação tópica. Para a quantificação da genisteína nas diferentes camadas da pele foi desenvolvida e validada uma metodologia bioanalítica em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detecção no UV. As NLS foram obtidas com behenato de glicerila, polissorbato 80, trioleato de sorbitano e tensoativo catiônico cloreto de cetilpiridínio (CPC) em diferentes quantidades (0,5 – 0,05%). As NLS foram caracterizadas quanto ao tamanho, PdI, potencial zeta, eficiência de encapsulação e recuperação. Foram realizados estudos in vitro de liberação e permeação cutânea passiva e iontoforética. Estudos de citotoxicidade foram realizados em linhagem de melanoma (B16F10) com fármaco livre e NLS com e sem GEN. O método de quantificação do fármaco mostrou-se linear na faixa de concentração de 0,1 a 60 μg/mL. O limite de quantificação foi de 100 ng/mL para ambas as camadas da pele. A recuperação do fármaco variou entre 95,57 a 97,57%. Ainda, o método foi capaz de analisar a GEN sem sofrer interferência dos componentes endógenos da pele. As NLS carregadas com fármaco apresentaram carga superficial positiva (+ 23 mV) e tamanho médio de 343 nm. Também foram obtidas partículas com alta eficiência de encapsulação (93%) e carga de fármaco de 5,45%. Os estudos de liberação in vitro demonstraram que a liberação da GEN a partir das NLS ocorre em duas fases, com uma grande quantidade de fármaco liberada nas seis primeiras horas, seguida por uma liberação lenta do restante do fármaco da matriz lipídica das NLS nas horas seguintes. Quando administrada na pele, nos estudos de permeação passiva in vitro, as NLS aumentaram a retenção da GEN tanto no estrato córneo quanto na pele remanescente em comparação à administração da GEN livre. Após a aplicação da iontoforese na formulação de NLS contendo GEN, treze vezes mais GEN ficou retida no EC e três vezes mais fármaco ficou retido na pele remanescente. Nos estudos de citotoxicidade, as NLS favoreceram o aumento da interação do fármaco com as células e a citotoxicidade foi concentração-dependente. Deste modo, a encapsulação da GEN em NLS aumentou a permeação e retenção do fármaco na pele, demonstrando assim, potencial para aplicação tópica.

Made available in DSpace on 2014-07-29T16:11:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Stela.pdf: 754626 bytes, checksum: 312169c0104b8d6d919af0eb6ee8cf69 (MD5) Previous issue date: 2010-03-05 / Isoflavones are flavonoids found in abundance in grains of soy (Glycine max L.) and its derivatives. These substances have estrogen like structure and weakly estrogenic action. They are used for treatment of menopause symptoms as an alternative to conventional hormone replacement therapies, because they cause fewer side effects. Soy isoflavones are amongst herbal products of great interest to obtain solid dosage forms. High assay variability of isoflavones in commercially available capsules and tablets shows the need of appropriate drug development and quality control for this herbal product. The aim of this work was drug development and quality control of soy isoflavone solid dosage forms, using standardized dry extract of soy. To evaluate the quality of the extract microbiologic and assay analysis of this drug s markers were performed. Results obtained from microbiological test did not show microbiologic contamination of the extract, as Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans and Aspergillus niger did not grow. To evaluate assay and dissolution percentage of both markers analytical methodology for quantification of daidzein and genistein by high performance liquid chromatography was developed, and also a method to analyze dissolution profile of the obtained tablets. Isocratic method was used for chromatographic analysis of the markers, with mobil phase of methanol with 0.1% of acetic acid, water with 0.1% of acetic acid and acetonitrile in proportion 64:32:4, flow of 0.7 mL/min and temperature of 30°C. At this condition, peaks were symmetric, had resolution lower than 2, with retention times of 3,13 and 3,72 for daidzein and genistein, respectively. Assay evaluation of the markers daidzein and genistein showed that concentrations in the extract were 27,8% and 11,1%, respectively. To accomplish preformulation study, thermal analysis and powder and granules flow evaluation were made. Six formulations of isoflavone tablets were developed, one by direct compression and five by wet granulation. Results of thermal analysis showed no possible extract interactions between tested excipients and extract. Wet granulation was the best method to obatain tablets, because it presented the best compressional properties with flow velocity between 4,5 and 6,7 s/100g and compressibility between 16,85% and 26,06%. GU3 formulation, which presented the best performance according to evaluated parameters, made by wet granulation, showed 92,66% and 92,76% of daidzein and genistein, respectively, disintegration of 15 minutes, and its flow was categorized as excellent. In analytical dissolution method development of isoflavone tablets solubility test was performed to define the best medium, and water with 3% of sodium lauryl sulfate dissolved the greatest amount of daidzein and genistein at tested temperature, 37°C, in comparison with the other medium. Other parameters defined through method development were paddle apparatus, stirring speed of 100 rpm and 900 mL of medium volume. Results showed the possibility to obtain promising solid dosage forms to deliver isoflavone, and optimized quality control methodologies to analyze raw material and finished product. / Isoflavonas são flavonóides encontrados em abundância nos grãos de soja (Glycine max L.). Essas substâncias têm estrutura semelhante ao estrógeno e possuem uma ação fracamente estrogênica. São utilizadas no tratamento dos sintomas da menopausa como alternativa às terapias de reposição hormonal convencionais, por provocarem menor número de efeitos colaterais. As isoflavonas de soja estão entre as matérias-primas vegetais com ações de interesse para obtenção de formas farmacêuticas sólidas. A alta variabilidade de teores de isoflavonas em cápsulas e comprimidos disponíveis comercialmente demonstra a necessidade de desenvolvimento farmacotécnico e controle de qualidade adequados para este fitoterápico. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento analítico e farmacotécnico de formas farmacêuticas sólidas de isoflavona de soja, utilizando como matéria-prima extrato seco de soja padronizado. Para verificar a qualidade do extrato foi realizada análise microbiológica e análise do teor dos marcadores. Os resultados obtidos através do ensaio microbiológico não demonstrou contaminação microbiológica do extrato, não tendo crescimento de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans e Aspergillus niger. Para avaliação do teor e da porcentagem dissolvida de ambos os marcadores foram desenvolvidas e validadas tanto metodologia analítica de quantificação de daidzeína e genisteína por cromatografia líquida de alta eficiência quanto metodologia para avaliar o perfil de dissolução dos comprimidos obtidos. Para análise cromatográfica dos marcadores foi utilizado método isocrático, com fase móvel constituída por metanol com 0,1% de ácido acético, água com 0,1% de ácido acético e acetonitrila na proporção 64:32:4 , fluxo de 0,7 mL/min e temperatura de 30ºC. Nesta condição os picos foram simétricos, tiveram resolução maior que 2, com tempos de retenção de 3,13 e 3,72 da daidzeína e genisteína, respectivamente. A avaliação do teor dos marcadores daidzeína e genisteína, demonstrou que as concentrações no extrato foram 27,8% e 11,1%, respectivamente. Em relação ao estudo de pré-formulação foi feita análise térmica e a avaliação das propriedades dos pós e grânulos. Foram desenvolvidas seis formulações de comprimidos de isoflavona, sendo uma por compressão direta e cinco por granulação úmida. Nos resultados da análise térmica não foram observadas possíveis interações dos excipientes com o extrato. O melhor método de obtenção dos comprimidos foi por granulação úmida, pois apresentou melhores propriedades compressionais com velocidade de escoamento variando entre 4,5 e 6,7 s/100g e compressibilidade entre 16,85% e 26,06%. A formulação por granulação úmida 3 foi a que apresentou melhor desempenho segundo os parâmetros analisados, apresentando teor de 92,66% e 92,76% de daidzeína e genisteína, respectivamente, desintegração de 15 minutos, e seu fluxo foi caracterizado como excelente. No desenvolvimento do método analítico para dissolução dos comprimidos de isoflavona foi feito o teste de solubilidade para definir o melhor meio, sendo o meio água com 3% de lauril sulfato de sódio o que dissolveu maior quantidade de daidzeína e genisteína na temperatura de 37ºC em comparação com os outros meios. Os demais parâmetros definidos através do desenvolvimento do método foram aparato pá, velocidade de rotação de 100 rpm e 900 mL de volume de meio. Os resultados mostraram a possibilidade de obtenção de formas farmacêuticas sólidas promissoras para veiculação de isoflavona, além de metodologias otimizadas para controle de qualidade para análise da matéria-prima e do produto acabado.

Submitted by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-03-25T16:19:05Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lívia Palmerston Mendes - 2012.pdf: 4748282 bytes, checksum: 95e0ba08ba139d722a516556a62d965e (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-03-26T12:41:01Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lívia Palmerston Mendes - 2012.pdf: 4748282 bytes, checksum: 95e0ba08ba139d722a516556a62d965e (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-26T12:41:01Z (GMT). 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Particles were in the range of 150 nm and showed a monomodal distribution. Multiple light scattering analyses presented an increase of only 2% of the backscattering profile both in the top and in the bottom of the sample, indicating a slight sedimentation and creaming behaviors, both reversible phenomena. In vitro drug release showed that GEN was completely released within 48 hours, whereas in that same period, less than 10% of PTX was released and reached almost 70% after 60 days of analysis. The results suggest that we have developed a biodegradable device for a sustained release of GEN and PTX in different stages. In vivo antitumor activity assays with Ehrlich ascites tumor (EAT) bearing mice evaluated intra-tumoral administration of the developed formulation in three different concentrations of PTX in the presence or absence of GEN. Results presented more than 90% tumor inhibition in EAT-bearing mice compared to the control group when a dose of nanostructured PTX about 5 times lower than the equivalent dose used in conventional chemotherapy was used. When a low dose of PTX (0.2 mg/kg/day) was used in the treatment, 11% tumor inhibition was achieved, but when associated with a dose of 12 mg/kg/day of GEN, there was 44% tumor inhibition and a decrease of about 58% in VEGF levels compared to animals treated with blank nanoparticles. The antiangiogenic effect of GEN was evident when associated with PTX, inhibiting formation of new vascular network formed by tortuous and congested vessels in peritoneal region of mice when compared with groups treated only with PTX. Co-encapsulation of GEN and PTX in a controlled-release multicompartimental nanosystem promoted additive effect of antiangiogenic activity associated with antitumor effect, intending to be a formulation with high potential for anticancer treatment. / Sistemas poliméricos e lipídicos nanoestruturados são capazes de melhorar o índice terapêutico dos fármacos encapsulados, principalmente quando se trata de fármacos antitumorais. Neste trabalho a co-encapsulação do paclitaxel (PTX) e da genisteína (GEN) foi obtida através do desenvolvimento de nanocápsulas poliméricas (NC) recobertas por bicamada lipídica para a liberação controlada desses fármacos. NC contendo PTX encapsulado foram obtidas através do método de deposição interfacial do polímero pré-formado. Em seguida, as NC foram recobertas por bicamada lipídica contendo GEN e suas propriedades físicoquímicas foram caracterizadas. As NC recobertas mostraram eficiência de encapsulação de aproximadamente 98% para ambos os fármacos, apresentandose na faixa de 150 nm, com distribuição monomodal. Análise das NC recobertas por multiple light scattering a 25 °C por 24 horas apresentou aumento de apenas 2% no perfil de backscattering tanto no topo quanto no fundo da amostra, indicando sutil sedimentação e cremagem, ambos fenômenos reversíveis. A cinética de liberação in vitro mostrou que a GEN foi completamente liberada nas primeiras 48 horas, enquanto que nesse mesmo período, menos de 10% do PTX foi liberado, atingindo 70% de liberação após 60 dias de análise. Esses resultados demonstram a obtenção de um dispositivo biodegradável para liberação controlada de GEN e PTX em diferentes estágios. Nos ensaios de atividade antitumoral in vivo em camundongos portadores do tumor ascítico de Ehrlich, foi avaliada a administração intra-tumoral da formulação desenvolvida com 3 concentrações diferentes de PTX na presença ou ausência de GEN. A inibição de mais de 90% do tumor comparada a um grupo controle foi alcançada com uma dose de PTX cerca de 5 vezes menor que a dose equivalente utilizada na quimioterapia convencional com PTX. Quando uma baixa dose de PTX (0,2 mg/kg/dia) foi usado para o tratamento, foi obtida uma inibição tumoral de 11%, mas, quando associada a uma dose de 12 mg/kg/dia de GEN, houve 44% de inibição do tumor e uma diminuição de cerca de 58% nos níveis do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) em comparação com animais tratados com nanopartículas sem fármaco. O efeito antiangiogênico da GEN foi evidente quando associada ao PTX, inibindo a formação de nova rede vascular formada por vasos tortuosos e congestos na região peritoneal quando em comparação com grupos tratados apenas com PTX. A co-encapsulação de GEN e PTX em um nanosistema multicompartimental de liberação controlada promoveu efeito combinado da atividade antiangiogênica aliada à atividade antitumoral, mostrando-se uma formulação com grande potencial para tratamento antineoplásico.