A glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH) é a primeira enzima do processo oxidativo da via das pentoses fosfato e apresenta diversas aplicações industriais. Foram avaliadas as influências de algumas variáveis sobre a produção de G6PDH. No Processo Descontínuo variaram-se a concentração da fonte de carbono, relação carbono-nitrogênio, concentração de aminoácidos e nucleotídeos , pH e a vazão de ar fornecida. A variação na atividade enzimática indicou que as condições do meio são importantes na obtenção desta enzima, tendo sido obtida atividade específica máxima de 86 U/g cél e produtividade de 10,5 U/L.h. No Processo Descontínuo-Alimentado variaram-se o sistema de adição e os nutrientes alimentados. A atividade específica máxima obtida foi 72 U/g cél e a produtividade foi 47 U/L.h. Os resultados indicaram o controle da concentração de glicose em 5g/L para uma melhor produtividade e a necessidade de maiores estudos a fim de otimizar o processo. / The glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) is the first enzyme of the pentose phosphate pathway, converting glucose-6-phosphate into 6-phosphogluconate. Besides its importance in biochemistry and medical studies, this enzyme is used in several analytical methods, industrial and commercial application. In this work the influence of several variables in the production of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase in batch and fed-batch processes were studied. In batch cultures the variables were the glucose concentration (10 and 20 g/L), the C:N ratio (3.5 and 6.7 g/g), the aminoacids and nucleotides concentrations (10 and 20 mg/L), pH (4.6 and 5.7) and the aeration (0, 0.8, 1.7 and 2.2 vvm). It was observed that the G6PDH activity varied according to the conditions of the culture. Specific Activity value of 86 U/g cell and productivity of 10,5 U/L.h were attained when the test was carried out as follows: 30oC, pH 5.7, 400 rpm, 2.2 vvm, C:N ratio of 6.7, glucose concentration of 10 g/L, aminoacids (Tryptophan and Hystidine) and nucleotides (Adenine and Uracil) concentrations of 20 mg/L. Nevertheless, the fed-batch process was more efficient and productive than the batch process. The productivity obtained in the best fed-batch condition (glucose addition by an increasing exponential mode) was 47 U/L.h, more than four folds the productivity of the batch culture. So that, by maintaining the glucose concentration in the medium below 5 g/L, the productivity should be improved. However, more studies are needed for optimizing the G6PDH production in a Fed-Batch process. In the fed-batch cultures the feeding conditions and kind of feeding were studied. It was observed that the best fed-batch G6PDH specific activity (72 U/g of cell when the glucose was added in a decreasing linear mode) was lower than that attained in the batch cultures.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:54:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jessica.pdf: 1060153 bytes, checksum: f96dc99a3a3b3f62efb2fa8880dc28d9 (MD5) Previous issue date: 2013-04-08 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Background: The understanding of malaria disease has greatly improved in the last few years. Despite decades of research against the disease, it continues to be a major public health problem. The genetic component of malaria susceptibility is complex and evaluating these determinants of susceptibility and deciphering the mechanisms involved may lead to the discovery of new vaccines or targets for pharmacological agents. Main. Molecular characterization of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) and hemoglobin profile in patients with vivax malaria from Manaus-AM. Methods. For molecular characterization of G6PD were performed RFLP-PCR technique and qRT-PCR in 162 patients. Hemoglobin profile was determined by Highperformance liquid chromatography in 178 patients. Results. The hemoglobin profle showed 106 AA (92.7%), 09 AS (5.05%) e 04 AC (2.25%). These results demonstrated a lower frequency of severe malaria in AC (25%). Our results demonstrated the presence of nine (09) AS and four (04) AC, totaling 7.30% of the patients. Our results showed a lower frequency of severe malaria in AC group. This correlation among hemoglobin genotypes showed significant correlation between AA and AC (Neutrophils (p = 0.019), Band neutrophils (p = 0.049), Eosinophils (p = 0.046), Mean Cell Volume (p=0.004), Mean Cell Hemoglobin (p =0.008), there was no correlation between AA and the AS. The RDW was our only correlation between AA v/s AS (p=0.039) and AA v/s AC (p=0.019). The parasitaemia fever was the most frequent event in our study patients, occurring at 92.30% (12/13) of patients with AS/AC. The parasite density was lower in patients with AS (9352.35 ± 11622.78) and AC (11604.80 ± 11931.85) when compared with AA genotype (32431.57 ± 88719.63), but without statistical significance (p = 0.854). Of male presented 15.85% (13/82) for A− and 6.10% (05/82) Chatham variants, while 11.25% (09/80) of female presented A− in heterozygous and 1.25% (1/80) in homozygous. Male with G6PD A− demonstrated a higher frequency of severe malaria (OR=2.01, p=0.020) and strongly associated with previous malaria episodes (OR=2.35, p=0.004). When compared with G6PD wild type, male patients A− presented high platelet (p=0.009), lactate dehydrogenase (p<0.001) and direct bilirubin (p=0.045), while decreased in Gamma-Glutamyl transpeptidase (p=0.035). Both gender presented decreased of erythrocytes (p=0.002) (p=0.015), hemoglobin (p=0.017) (p=0.031) and hematocrit (p=0.013) (p=0.020), male and female, respectively. We observed decreased hemoglobin (p=0.018), hematocrit (p=0.014), platelets (p=0.003), reticulocyte count (p<0.001) and glucose level (p=0.031) among male patients in severe malaria with G6PD A− compared to severe malaria patients with wild type allele. Conclusion. These results reveal important roles for malaria s hemoglobin genotypes clinical patients outcomes, and studies are warranted to determine their involvement in severe malaria as well as it possible mechanism of action. In summary, few G6PD mutations studies were performed from Amazonian communities. Additional G6PD deficiency surveys in both these areas of high P. vivax endemicity would be valuable, particularly focused in areas of high population density. / Introdução. A compreensão da doença malária tem aumentado muito nos últimos anos. Apesar de décadas de pesquisa contra a doença, esta continua a ser um dos principais problemas de saúde pública. Um dos desafios na luta contra esta doença é avaliar suscetibilidade genética e decifrar os mecanismos envolvidos para utilizá-los como novos alvos contra a malária. Objetivo. Caracterizar molecularmente a Desidrogenase da Glicose 6-Fosfato (G6PD) e determinar o perfil de hemoglobinas em pacientes com Malária vivax de Manaus-AM. Metodologia. A caracterização molecular da G6PD foi realizada pelas técnicas de RFLP-PCR e q-RT-PCR em 162 pacientes. O perfil de hemoglobinas por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) em 178 pacientes. Os achados clínicos, hematológicos e bioquímicos foram associados com as hemoglobinas variantes e as mutações para a G6PD na tentativa de identificar possíveis biomarcadores de gravidade clínica da malária vivax. Resultados. O perfil de hemoglobina apresentou 106 AA (92,7%), 09 AS (5.05%) e 04 AC (2.25%). Malária grave acometeu 25% em AC e 44.4% em AS. Diminuição significativa dos valores de Neutrófilos (p=0,019); VCM (p=0,004) e HCM (p=0,008) e aumento de Bastonetes (p=0,049) e Eosinófilos (p=0,046), ocorreram apenas nos pacientes AC. RDW apresentou elevado em ambos, AS (p=0,039) e AC (p=0,019) quando comparados AA. A parasitemia febril foi o evento clínico mais freqüente 92,30% nos pacientes AS/AC. A densidade parasitária foi menor nos AS (9.352,4±11.622,8) e AC (11.604,8±11.931,9 ), quando comparado com AA (32.431,6 ± 88.719,6), porém, sem significância estatística (p=0,854). O estudo molecular para G6PD demonstrou 15,85% (13/82) para as mutações 202A/376G (A-) concomitantemente nos homens e pela primeira vez descrita na Região Amazônica, a mutação 1003A (Chatham) em 6,10% (05/82), enquanto nas mulheres 11,25% (09/80) heterozigostas e 1,25% (1/80) homozigostas para a A-. Homens A- demonstraram associação significativa para malária grave (RR=2,01, p=0,020) e episódios anteriores de malária (RR=2,35, p=0,004), aumento de plaquetas (p=0,009), lactato desidrogenase (p<0,001) e bilirrubina direta (p=0,045) e diminuição da gama-glutamil transferase (p=0,035). Ambos os gêneros, homens e mulheres, apresentaram diminuição das hemácias (p=0,002) (p=0,015), hemoglobina (p=0,017) (p=0,031) e hematócrito (p=0,013) (p=0,020), respectivamente. Foi demonstrado decréscimos significativos para hemoglobina (p=0,018), hematócrito (p=0,014), plaquetas (p=0,003), reticulócitos (p<0,001) e glicose (p=0,031) entre homens A- com malária grave quando comparado com homnes normais para G6PD com malária grave. Conclusão. Acreditamos que com o aumento do número de participantes para o estudo do perfil de hemoglobina, conseguiremos aprofundar o conhecimento de como os seres humanos se adaptaram a esta terrível doença, enfatizando algumas hipóteses importantes para fornecer caminhos que levem a uma solução duradoura e até permanente para a Malária. Além disso, poucos estudos das mutações para G6PD foram realizados em comunidades amazônicas. Outras pesquisas sobre a deficiência de G6PD em áreas de alta endemicidade para P. vivax seria valioso, especialmente focado em áreas de alta densidade populacional.

As bioconversões executadas com enzimas, que requerem NADP ou NADPH, são limitadas pela eficiência com que esta substância é mantida na forma particular requerida pelo catalisador ao longo de toda a reação, assim como pela sua recuperação no final do processo. Neste trabalho, foram caracterizadas as enzimas Glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) e Glutamato desidrogenase (GLUDH), além do estudo do reciclo NADP/NADPH em sistema constituído por essas enzimas. Determinou-se a temperatura (30ºC) e pH ótimo da G6PDH (pH 7,5), assim como a temperatura (40ºC) e o pH ótimo (pH 8,0) da GLUDH, além dos volumes e concentrações dos substratos utilizados na hidrólise enzimática. No caso da reação acoplada descontínua, a duração foi de 90min, às temperaturas de 30ºC e 40ºC, utilizando-se o cofator solúvel ou imobilizado. Em ambas as condições, mais de 85% das concentrações iniciais de G6P e NH4+, respectivamente, substratos da G6PDH e GLUDH, foram convertidas, sendo o reciclo NADP/NADPH mantido durante toda a reação. No caso da reação bienzimática em reator contínuo, não foi possível chegar ao estado estacionário da reação e a conversão dos subsratos G6P e NH4+ variaram de acordo com o período do teste. / The Bioconversion performed with enzymes that require NADPH or NADP are limited by the efficiency with which this substance is maintained in the particular form required by the enzyme throughout the reaction, as well as for his recovery at the end of the process. The main aim of this work was to study the NADP/NADPH recycling through a bienzyme coupled reaction constituted by glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and glutamate dehydrogenase (GLUDH). The reaction was carried out in the discontinuous or continuous mode. The discontinuous process, which was carried out with soluble or immobilized NADP at 30&#176;C or 40&#176;C, had a total duration of 90min. Independently on the temperature used, around 85% of the initial concentration of glucose 6-phosphate (G6P) and ammonia were consumed, being the recycle of NADP/NADPH maintained throughout the reaction. In the continuous process, the addition of G6P and ammonia into the membrane reactor was made by turns of 2h. During the 15h-process the NADP/NADPH recycling was attained and the mean consumption yield of ammonia and G6P neared 30% and 60%, respectively.

As bioconversões executadas com enzimas, que requerem NADP ou NADPH, são limitadas pela eficiência com que esta substância é mantida na forma particular requerida pelo catalisador ao longo de toda a reação, assim como pela sua recuperação no final do processo. Neste trabalho, foram caracterizadas as enzimas Glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) e Glutamato desidrogenase (GLUDH), além do estudo do reciclo NADP/NADPH em sistema constituído por essas enzimas. Determinou-se a temperatura (30ºC) e pH ótimo da G6PDH (pH 7,5), assim como a temperatura (40ºC) e o pH ótimo (pH 8,0) da GLUDH, além dos volumes e concentrações dos substratos utilizados na hidrólise enzimática. No caso da reação acoplada descontínua, a duração foi de 90min, às temperaturas de 30ºC e 40ºC, utilizando-se o cofator solúvel ou imobilizado. Em ambas as condições, mais de 85% das concentrações iniciais de G6P e NH4+, respectivamente, substratos da G6PDH e GLUDH, foram convertidas, sendo o reciclo NADP/NADPH mantido durante toda a reação. No caso da reação bienzimática em reator contínuo, não foi possível chegar ao estado estacionário da reação e a conversão dos subsratos G6P e NH4+ variaram de acordo com o período do teste. / The Bioconversion performed with enzymes that require NADPH or NADP are limited by the efficiency with which this substance is maintained in the particular form required by the enzyme throughout the reaction, as well as for his recovery at the end of the process. The main aim of this work was to study the NADP/NADPH recycling through a bienzyme coupled reaction constituted by glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and glutamate dehydrogenase (GLUDH). The reaction was carried out in the discontinuous or continuous mode. The discontinuous process, which was carried out with soluble or immobilized NADP at 30&#176;C or 40&#176;C, had a total duration of 90min. Independently on the temperature used, around 85% of the initial concentration of glucose 6-phosphate (G6P) and ammonia were consumed, being the recycle of NADP/NADPH maintained throughout the reaction. In the continuous process, the addition of G6P and ammonia into the membrane reactor was made by turns of 2h. During the 15h-process the NADP/NADPH recycling was attained and the mean consumption yield of ammonia and G6P neared 30% and 60%, respectively.

O objetivo desse trabalho foi avaliar a expressão de genes envolvidos no transporte de monocarboxilatos (Mct1, Mct2, Mct3 e Mct4) e de genes específicos da oogênese (Bmp15, Gdf9 e Has2) em complexos cumulus-oócito (CCOs) selecionados pelo teste BCB. Após seleção morfológica com base no grau de compactação das células do cumulus (CCs) e no grau de homogeneidade do citoplasma, os CCOs foram corados com 26 μM BCB (azul cresil brilhante) por 90 min e divididos em dois grupos: BCB+, que apresentavam o ooplasma corado de azul, e BCB-, com ooplasma não corado. Foram utilizados dois grupos controles não expostos ao BCB: o grupo holding foi submetido às mesmas condições que os grupos corados e o outro grupo controle foi diretamente submetido à maturação in vitro (MIV), após a seleção morfológica dos CCOs. A expressão gênica relativa foi determinada por RT-PCR em CCOs coletados antes e ao final da maturação. A expressão também foi avaliada, separadamente, em oócitos desnudos (ODs) e células do cumulus (CCs) antes e após a maturação. A análise dos transcritos demonstrou que houve aumento significativo (p < 0,05) na expressão relativa de Gdf9 e Bmp15 nos grupos BCB+, BCB- e holding antes da MIV, enquanto Has2 teve aumento significativo (p < 0,01) após a MIV apenas no grupo controle. Os outros genes analisados (Mct1, Mct2 e Mct4) mantiveram-se estáveis durante a maturação. O aumento na abundância relativa de alguns transcritos durante a MIV pode ser atribuído as condições de incubações durante o teste BCB. Nossos resultados demonstraram, pela primeira vez, a expressão de Mct1, 2 e 4 em CCOs bovinos. Enquanto o mRNA de Mct1 e Mct4 estava presente em ODs e em CC, o Mct2 foi detectado somente em CCs. Não detectamos a expressão de transcritos de Mct3 em CCOs. As diferenças na expressão dessas três isoformas sugerem um papel único para esses transportadores durante a maturação. / The aim of this study was to determine the relative expression of genes involved in transport of monocarboxylates (Mct1, Mct2, Mct3 e Mct4) and oogenesis specific genes (Bmp15, Gdf9 and Has2) in immature and mature bovine cumulus-oocyte complexes (COC) after selection by BCB. Immature COCs underwent morphological selection and were stained with 26 mM BCB for 90 min. Based on ooplasm staining, oocytes were distributed in two groups BCB+ (blue color) and BCB- (non-stained). The holding control group was exposed to the same incubation conditions as stained COCs, but without BCB. Control group was submitted to in vitro maturation (IVM) immediately after morphological selection. mRNA expression was investigated by RT-PCR in COCs before and after IVM. No relationship was observed in the relative expression of Has2, Gdf9, Bmp15 or Mct1, 2 and 4 transcripts between BCB- and BCB+ COCs. Transcripts analysis showed that Gdf9 and Bmp15 in BCB+, BCB- and holding groups were upregulated (p < 0.05) before IVM, while Has2 was up-regulated (p < 0.01) after IVM in the control group. Others genes remained stable during maturation (Mct1, 2 and 4). The increase in relative abundance of some transcripts during IVM may be attributed to incubation conditions during the BCB test. Our results showed, for the first time, Mct1, 2 and 4 expression in bovine COCs. Mct1 and Mct4 transcripts were present in denuded oocytes and cumulus cell, while Mct2 was detected only in cumulus cells. These differences between the three isoforms in localization suggest unique roles for each in monocarboxylate transport during maturation.

O objetivo desse trabalho foi avaliar a expressão de genes envolvidos no transporte de monocarboxilatos (Mct1, Mct2, Mct3 e Mct4) e de genes específicos da oogênese (Bmp15, Gdf9 e Has2) em complexos cumulus-oócito (CCOs) selecionados pelo teste BCB. Após seleção morfológica com base no grau de compactação das células do cumulus (CCs) e no grau de homogeneidade do citoplasma, os CCOs foram corados com 26 μM BCB (azul cresil brilhante) por 90 min e divididos em dois grupos: BCB+, que apresentavam o ooplasma corado de azul, e BCB-, com ooplasma não corado. Foram utilizados dois grupos controles não expostos ao BCB: o grupo holding foi submetido às mesmas condições que os grupos corados e o outro grupo controle foi diretamente submetido à maturação in vitro (MIV), após a seleção morfológica dos CCOs. A expressão gênica relativa foi determinada por RT-PCR em CCOs coletados antes e ao final da maturação. A expressão também foi avaliada, separadamente, em oócitos desnudos (ODs) e células do cumulus (CCs) antes e após a maturação. A análise dos transcritos demonstrou que houve aumento significativo (p < 0,05) na expressão relativa de Gdf9 e Bmp15 nos grupos BCB+, BCB- e holding antes da MIV, enquanto Has2 teve aumento significativo (p < 0,01) após a MIV apenas no grupo controle. Os outros genes analisados (Mct1, Mct2 e Mct4) mantiveram-se estáveis durante a maturação. O aumento na abundância relativa de alguns transcritos durante a MIV pode ser atribuído as condições de incubações durante o teste BCB. Nossos resultados demonstraram, pela primeira vez, a expressão de Mct1, 2 e 4 em CCOs bovinos. Enquanto o mRNA de Mct1 e Mct4 estava presente em ODs e em CC, o Mct2 foi detectado somente em CCs. Não detectamos a expressão de transcritos de Mct3 em CCOs. As diferenças na expressão dessas três isoformas sugerem um papel único para esses transportadores durante a maturação. / The aim of this study was to determine the relative expression of genes involved in transport of monocarboxylates (Mct1, Mct2, Mct3 e Mct4) and oogenesis specific genes (Bmp15, Gdf9 and Has2) in immature and mature bovine cumulus-oocyte complexes (COC) after selection by BCB. Immature COCs underwent morphological selection and were stained with 26 mM BCB for 90 min. Based on ooplasm staining, oocytes were distributed in two groups BCB+ (blue color) and BCB- (non-stained). The holding control group was exposed to the same incubation conditions as stained COCs, but without BCB. Control group was submitted to in vitro maturation (IVM) immediately after morphological selection. mRNA expression was investigated by RT-PCR in COCs before and after IVM. No relationship was observed in the relative expression of Has2, Gdf9, Bmp15 or Mct1, 2 and 4 transcripts between BCB- and BCB+ COCs. Transcripts analysis showed that Gdf9 and Bmp15 in BCB+, BCB- and holding groups were upregulated (p < 0.05) before IVM, while Has2 was up-regulated (p < 0.01) after IVM in the control group. Others genes remained stable during maturation (Mct1, 2 and 4). The increase in relative abundance of some transcripts during IVM may be attributed to incubation conditions during the BCB test. Our results showed, for the first time, Mct1, 2 and 4 expression in bovine COCs. Mct1 and Mct4 transcripts were present in denuded oocytes and cumulus cell, while Mct2 was detected only in cumulus cells. These differences between the three isoforms in localization suggest unique roles for each in monocarboxylate transport during maturation.

O objetivo desse trabalho foi avaliar a expressão de genes envolvidos no transporte de monocarboxilatos (Mct1, Mct2, Mct3 e Mct4) e de genes específicos da oogênese (Bmp15, Gdf9 e Has2) em complexos cumulus-oócito (CCOs) selecionados pelo teste BCB. Após seleção morfológica com base no grau de compactação das células do cumulus (CCs) e no grau de homogeneidade do citoplasma, os CCOs foram corados com 26 μM BCB (azul cresil brilhante) por 90 min e divididos em dois grupos: BCB+, que apresentavam o ooplasma corado de azul, e BCB-, com ooplasma não corado. Foram utilizados dois grupos controles não expostos ao BCB: o grupo holding foi submetido às mesmas condições que os grupos corados e o outro grupo controle foi diretamente submetido à maturação in vitro (MIV), após a seleção morfológica dos CCOs. A expressão gênica relativa foi determinada por RT-PCR em CCOs coletados antes e ao final da maturação. A expressão também foi avaliada, separadamente, em oócitos desnudos (ODs) e células do cumulus (CCs) antes e após a maturação. A análise dos transcritos demonstrou que houve aumento significativo (p < 0,05) na expressão relativa de Gdf9 e Bmp15 nos grupos BCB+, BCB- e holding antes da MIV, enquanto Has2 teve aumento significativo (p < 0,01) após a MIV apenas no grupo controle. Os outros genes analisados (Mct1, Mct2 e Mct4) mantiveram-se estáveis durante a maturação. O aumento na abundância relativa de alguns transcritos durante a MIV pode ser atribuído as condições de incubações durante o teste BCB. Nossos resultados demonstraram, pela primeira vez, a expressão de Mct1, 2 e 4 em CCOs bovinos. Enquanto o mRNA de Mct1 e Mct4 estava presente em ODs e em CC, o Mct2 foi detectado somente em CCs. Não detectamos a expressão de transcritos de Mct3 em CCOs. As diferenças na expressão dessas três isoformas sugerem um papel único para esses transportadores durante a maturação. / The aim of this study was to determine the relative expression of genes involved in transport of monocarboxylates (Mct1, Mct2, Mct3 e Mct4) and oogenesis specific genes (Bmp15, Gdf9 and Has2) in immature and mature bovine cumulus-oocyte complexes (COC) after selection by BCB. Immature COCs underwent morphological selection and were stained with 26 mM BCB for 90 min. Based on ooplasm staining, oocytes were distributed in two groups BCB+ (blue color) and BCB- (non-stained). The holding control group was exposed to the same incubation conditions as stained COCs, but without BCB. Control group was submitted to in vitro maturation (IVM) immediately after morphological selection. mRNA expression was investigated by RT-PCR in COCs before and after IVM. No relationship was observed in the relative expression of Has2, Gdf9, Bmp15 or Mct1, 2 and 4 transcripts between BCB- and BCB+ COCs. Transcripts analysis showed that Gdf9 and Bmp15 in BCB+, BCB- and holding groups were upregulated (p < 0.05) before IVM, while Has2 was up-regulated (p < 0.01) after IVM in the control group. Others genes remained stable during maturation (Mct1, 2 and 4). The increase in relative abundance of some transcripts during IVM may be attributed to incubation conditions during the BCB test. Our results showed, for the first time, Mct1, 2 and 4 expression in bovine COCs. Mct1 and Mct4 transcripts were present in denuded oocytes and cumulus cell, while Mct2 was detected only in cumulus cells. These differences between the three isoforms in localization suggest unique roles for each in monocarboxylate transport during maturation.

Objetivos: A deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) está associada a um maior risco de encefalopatia bilirrubínica e de crise hemolítica aguda grave desencadeada por drogas como a primaquina e a dapsona. Conhecer a prevalência dessa deficiência enzimática em área onde a malária e a hanseníase ainda estão presentes e conhecer a prevalência das principais mutações traz subsídios para planejamento de estratégias com vistas à redução de riscos associados a esta deficiência enzimática. Métodos: Estudo descritivo transversal conduzido em uma região do centro-oeste do Brasil. Exame de triagem para deficiência de G6PD foi realizado em 3573 recémnascidos. Exame confirmatório foi necessário em 188 crianças triadas como possíveis portadores de deficiência. Nas crianças em que foi confirmada a deficiência de G6PD foi feita pesquisa das mutações G202A (G6PD A-) e C563T (G6PD Mediterrâneo) por PCR. Resultados: A deficiência de G6PD foi confirmada em 63 crianças, sendo 60 meninos (95,2%) e três meninas (4,8%). O percentual de exames falso-positivos na fase de triagem foi de 66,5%, estando o percentual de falso-positivos associado à temperatura e tempo de transporte das amostras. Entre as crianças que confirmaram deficiência de G6PD, foi mais frequente a história de anemia em familiares e de icterícia neonatal. Houve associação entre hematócrito baixo e deficiência enzimática, mas não com hemoglobina, contagem de reticulócitos ou neutrófilos. A prevalência da deficiência de G6PD (IC95%) foi de 1,76% (1,37; 2,24) entre os recém-nascidos triados e de 3,34% entre os meninos (2,58; 4,25). A mutação C563T não foi identificada em nenhuma criança, mas a mutação G202A estava presente em 58 crianças - 92,06% (IC95%: 83,29 - 97,03): 56/60 meninos e em 2/3 meninas homozigotas. Foi identificado um menino com Kernicterus portador da mutação G202A em hemizigose. Conclusão: O elevado percentual de falso-positivos na etapa de triagem, o tempo necessário entre coleta e confirmação da presença de deficiência enzimática, associado ao alto custo da triagem universal, não apoiam a inclusão da triagem de deficiência de G6PD no programa de triagem neonatal brasileiro. Na região avaliada, a prevalência observada em meninos indica que a triagem de deficiência de G6PD deva ser realizada antes do uso de drogas como a primaquina e a dapsona somente em meninos. Foi elevada a prevalência da mutação G202A, de classe III, sendo esta mutação associada a uma menor morbidade. A identificação de um menino com Kernicterus com deficiência de G6PD indica que há necessidade de se planejar estratégias para minimizar o risco dessa morbidade associada à deficiência enzimática / Objective: Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency is associated with an increased risk of bilirubin encephalopathy in neonates and acute hemolytic crisis triggered by drugs such as primaquine and dapsone. In an area where malaria and Hansen\'s disease are still present, knowing the prevalence of this enzyme defect and determining the prevalence of major mutations is important for planning strategies for reducing the risks associated with this enzyme deficiency. Methods: Sectional study was conducted in a Midwestern region of Brazil. Screening for G6PD deficiency was performed in 3,573 neonates. Confirmatory tests were necessary for 188 positively screened children. After confirmation, PCR investigation was utilized to identify the mutations. Results: G6PD deficiency was confirmed in 63 children: 60 boys (95.2%) and 3 girls (4.8%). The percentage of false-positive cases in the screening phase, 66.5% and was associated with the temperature and transportation time of the samples. Family history of anemia and jaundice was more frequent among the children with confirmed G6PD deficiency. An association between a low hematocrit and enzyme deficiency was observed. However, there was no association with hemoglobin reticulocyte or neutrophils counts. The prevalence of G6PD deficiency (CI95%) was 1.76% (1.37; 2.24) among all screened neonates and 3.34% (2.58; 4.25) among male children. The C563T mutation was not identified in any child. The G202A mutation was present in 58 children - 92.06% (CI95%: 83.29 - 97.03), 56/60 boys and 2/3 homozygous girls. One boy with a hemizygous G202A mutation was identified as having Kernicterus. Conclusion: The high percentage of false-positive results when first screening for G6PD deficiency; the long delay time between the test and result; along with the high cost of the this screening test, are all factors that do not support adding this test to the already established Brazilian neonatal screening programs. The prevalence observed among boys does indicate that screening for G6PD deficiency should be performed in this region before the use of drugs such as primaquine and dapsone only in boys. This study found a high prevalence of the G202A mutation, a Class III variant associated with lower morbidity. The identification of a G6PD deficient boy with Kernicterus reinforces the necessity for strategies to abolish the morbidity associated with this enzyme deficiency

A utilização de resíduos agrícolas visando à produção de insumos por via biotecnológica tem se mostrado importante uma vez que estes resíduos são fontes renováveis de carbono. A fração hemicelulósica destes resíduos apresenta como componente principal a xilose, que pode ser utilizada como substrato em processos de bioconversão para a obtenção de produtos com valor agregado. Um destes produtos é a enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), primeira enzima da via das pentoses fosfato que pode ser utilizada como reagente analítico em análises quantitativas, sobretudo em estudos bioquímicos e médicos. O presente trabalho visou estudar o processo de purificação dessa enzima empregando a extração em sistemas de duas fases aquosas convencional (sem integração) e integrado ao rompimento celular, em duas escalas, reduzida e ampliada. A enzima foi produzida por Candida guilliermondii FTI 20037 cultivada em meio constituído de hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz, sob condições pré-determinadas. Inicialmente, foram realizados ensaios para avaliar o efeito das variáveis volume de suspensão celular, velocidade de agitação do moinho de esferas de vidro e tempo sobre o rompimento das células. Os valores destas variáveis foram, então, estabelecidos em: 100 mL, 400 rpm e 25 minutos, respectivamente. Posteriormente, a influência da massa molar de PEG e comprimento de linha de amarração sobre a extração da G6PD foram investigados no sistema convencional (homogeneizado obtido a partir do rompimento celular, em presença ou ausência de fragmentos) e integrado (rompimento na presença dos componentes da extração), empregando-se a metodologia do planejamento experimental. Nos ensaios realizados em escala reduzida, sob condições otimizadas, alcançou-se um fator de purificação na fase rica em sal (FPf), ou fase fundo, de 2,8 e em maior escala, ou seja, em moinho de rompimento, de 1,3. Com isso, realizou-se o estudo cinético e termodinâmico empregando a enzima presente no homogeneizado antes da purificação e após purificada no processo integrado em escala reduzida, nas seguintes condições: TLL 40% e PEG 1500 mol/L. Os valores determinados para os parâmetros cinéticos foram Km, 0,07 e 0,05 mM, Vm, 34,8 e 19,1 U/L e dos parâmetros termodinâmicos &#916;G, -13,71 e -13,64 KJ/mol; &#916;H, -2,49 e -2,50 KJ/mol; &#916;S, 37,02 e 36,77 J/mol.K; Ea, 24,18 e 15,02 KJ/mol, da enzima presente no homogeneizado celular antes e após purificação, respectivamente. / The employment of agricultural residues aiming the attainment of biotechnological products has been shown its importance since these residues are renewable and low cost sources of carbon. The hemicellulosic fraction of these residues presents xylose as main component, which can be utilized as substrate for different bioconversion processes for the acquisition of high value products. As an example, glucose-6-phosphate dehydrogenase, the first enzyme of pentose phosphate pathway which can be used as analytical reagent in several quantitative analysis, mainly in biochemical and medical studies. The present work contemplated the study of glucose-6-phosphate (G6PD) purification process by a conventional aqueous two phase systems extraction and integrated with cell disruption, in two scales, reduced and increased. The enzyme was obtained from cells of Candida guilliermondii FTI 20037 grown in hemicellulosic rice straw hydrolysate, using conditions established in previous work. Initially, assays in bead mill were performed to determine the effect of cell suspension volume, agitation speed and time on cell disruption. The determined conditions were: 100 mL, 400 rpm and 25 minutes, respectively. After this, the influence of molar mass of PEG and tie line lenght (TLL) on the G6PD recovery were investigated in the conventional system (with previous disrupted cells, with or without cell fragments) and integrated (disruption in the presence of extraction components), using the experimental design methodology. In the reduced scale assays, in optimized conditions, a purification factor in salt rich phase (FPf), or bottom phase, of 2,8 was reached while in the increased scale, this means in bead mill, a FPf of 1,3 was attained. In addition, kinetic and thermodynamic studies were performed, employing the enzyme present in the homogenate before and after purification in reduced scale, in the following conditions: TLL of 40% and PEG 1500 mol/L. The established values for the kinetics parameters were Km, 0,07 and 0,05 mM, Vm, 34,8 and 19,1 U/L and of thermodynamics &#916;G, -13,71 and -13,64 KJ/mol; &#916;H, -2,49 and -2,50 KJ/mol; &#916;S, 37,02 and 36,77 J/mol.K; Ea, 24,18 and 15,02 KJ/mol, of the enzyme present in the homogenate before and after purification respectively.

Este trabalho tem como finalidade estudar e estabelecer alguns parâmetros no processo fermentativo descontínuo alimentado de uma levedura recombinante Saccharomyces cerevisiae W303-181, visando aumentar a obtenção da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Foram feitas a padronização e otimização do preparo de inóculo de S. cerevisiae recombinante. Foram três as condições estudadas. Reduziu-se o tempo de preparo do inóculo de 114 h, da primeira condição, para e 64 e 48 h para a segunda e terceira condições, respectivamente. Essas duas últimas condições mostraram-se adequados para dar continuidade com os processos fermentativos. Foi feito um estudo de otimização da concentração de micronutrientes (adenina, histidina, triptofano e uracila) no meio de cultivo usando a metodologia de superfície de resposta. Concluiu-se que, ao empregar o meio de cultivo cujas concentrações dos micronutrientes tenham sido otimizadas, a atividade específica de G6PDH atingiu 7927 U/L, 3,2 vezes maior que para o meio controle. Estudou-se a influência da constante de tempo (K), na síntese de G6PDH em processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e decrescente, utilizando meio de cultivo otimizado e não otimizado. Os valores estudados de K para vazão de alimentação exponencialmente crescente foram 0,2, 0,3, 0,5, 0,7 e 0,8 h-1 e, para a decrescente, foram 0,2, 0,5 e 0,8 h-1. Dentre os cultivos com vazão exponencialmente crescente e com meio de cultivo não otimizado, encontrou-se para K=0,2 h-1 uma atividade enzimática (558 U/L) 4,1 vezes maior que para a levedura selvagem. Dentre os cultivos nas vazões exponencialmente crescente e decrescente, encontrou-se para a vazão crescente e K=0,2 h-1 os maiores níveis de produção de G6PDH (847 U/L). Foram estudados a influência da concentração inicial de glicose e o tempo de alimentação do processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e K=0,2h-1. Verificou-se que a concentração inicial de glicose não favoreceu a formação de biomassa ou a produção de enzimas. Contudo, determina e as máximas velocidades específicas de crescimento celular e de produção de G6PDH, com as maiores velocidades correspondendo às menores concentrações iniciais. Por fim, foi estudada a influência da concentração de leucina na síntese da G6PDH e verificou-se que teores de leucina entre 0-240 mg/L não influenciaram o crescimento celular ou a produção de enzima nos cultivos estudados. / The purpose of this work is to study and to establish some parameters in the fed-batch process of a recombinant strain of Saccharomyces cerevisiae, aiming to increase the production the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). The recombinant S. cerevisiae inoculum preparation was standardized and optimized. Tree methods were studied. The inoculum preparation time was reduced to 114 h, from first method, to 64 and 48 h to second and third methods, respectively. These two last methods were adequate in order to proceed with the fermentation process. It was evaluated the best micronutrients (adenine, histidine, tryptophan and uracil) concentration in the cultivation medium to produce G6PDH, using a response surface methodology. We concluded that using cultivation medium witch optimized micronutrients concentration, the G6PDH activity reach 7927 U/L, 3.2 fold higher than to not optimized medium. The influence of time constant (K) on the G6PDH synthesis was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing and decreasing feeding rates, using optimized medium cultivation and not optimized medium. The values for K at increasing rates were 0.2, 0.3, 0.5, 0.7 and 0.8 h-1, and for decreasing rates were 0.2, 0.5 and 0.8 h-1. Among K values for exponentially increasing rates with not optimized cultivation medium, K=02 h-1 shows higher G6PDH production (558U/L), 4.1 fold higher than wild yeast. Among cultivations proceeded with exponentially increasing and decreasing feeding rates and using a optimized medium, increasing rate and k=0.2 h-1 shows the higher G6PDH production (847 U/L) too. The initial glucose concentration and feeding time was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing feeding rate with K=0.2 h-1. It was verified that initial glucose concentration do not favored mass or G6PDH production. Although, it determines the maximum G6PDH production and the maximum growth rates, with higher rates at lowest initial glucose concentration. At the end, the influence of leucin at G6PDH production was evaluated. It was verified that concentrations values between 0-240 mg/L did not showed influence at cell growth or G6PDH production, at the studied cultivations.