Orientador: Eduardo Daruge / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-20T03:43:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_FernandoLuizde_M.pdf: 2531028 bytes, checksum: e7c56f987e1226379d235481f152843f (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: Através de estudos realizados, sabe-se que existem dois grupos de indivíduos, no que diz respeito à existência de fatores grupo-específicos na saliva humana. O primeiro grupo denominado secretor constitui aproximadamente 80% e o segundo grupo constitui aproximedemente 20% da população. No presente trabalho, estão sendo utilizadas 200 amostras de saliva humana "in natura", coletadas de alunos dos cursos de graduação da FOP- Unicamp, EFOA-Alfenas e doadores voluntários, distribuidas em quatro lotes distintos. As amostras foram submetidas ao processo de desnaturação, isto é, ao banhomaria durante 20 minutos a fim de se eliminar outras proteínas não interessantes nestes exames. Após a centrifugação da saliva, retirou-se o sobrenadante para a' realização dos testes de inibição da hemaglutinação. Os resultados finais demonstram uma pequena diferença em relação aos autores consultados, demonstrando que a determinação dos fatores grupo-específicos na saliva apresen.ta grande' interesse pericial, na possibilidade de se determinar a existência ou não de vínculo genético entre ascedentes e descendentes, uma vez que, os secretores apresentam-se em caráter dominante e os não secretores com caráter recessivo / Abstract: Not informed. / Mestrado / Odontologia Legal e Deontologia / Mestre em Ciências

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T13:46:36Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 277021 bytes, checksum: b140d81ef2bf2924ec3c8af245e6a87d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T13:46:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 277021 bytes, checksum: b140d81ef2bf2924ec3c8af245e6a87d (MD5) Previous issue date: 2003-03-13 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A dengue é uma doença febril, exantemática aguda considerada a mais importante arbovirose que afeta o homem. O diagnóstico laboratorial da dengue é realizado após suspeita clínica e as técnicas imunoenzimáticas, principalmente ELISA, são as mais difundidas, detectando anticorpos das classes IgM e IgG. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de uma técnica de hemaglutinação passiva de fácil execução, rápida e eficiente na detecção de anticorpos antidengue em sangue humano total. As próprias hemácias do paciente foram utilizadas como antígeno figurado, sendo o anti- soro contra hemácias humanas produzido em coelhos e purificado por precipitação e cromatografia. As imunoglobulinas G obtidas foram digeridas com o uso de papaína para a obtenção de fragmentos Fab. Após a separação, os fragmentos foram ligados às partículas virais de dengue, previamente purificadas em gradiente de densidade contínuo de tartarato de sódio e potássio, utilizando o glutaraldeído como agente acoplador. Demonstrou-se que a estratégia de conjugação dos fragmentos Fab à partícula viral é factível com uso de glutaraldeído, contudo, há necessidade do desenvolvimento de estudos para a verificação do grau de eficiência de conjugação. O método de conjugação adotado não impediu os fragmentos Fabs de se ligarem às hemácias e nem os anticorpos antidengue de reconhecerem seus epítopos na partícula viral. A utilização de anticorpos monoclonais, ou sistemas de expressão para proteínas virais assim como para fragmentos de anticorpos facilitariam as etapas de montagem do conjugado, além de otimizar o funcionamento da técnica. Em conclusão, a detecção de anticorpos antidengue em amostras de soro e hemácias foi possível a partir do método proposto. / Dengue is an acute febrile illness considered the most important arthropod-borne viral disease affecting humans. Currently most laboratory diagnoses of dengue are made after some clinical observations and use of immunoenzimatic techniques, notably ELISA can reliably detect small amounts of IgM and IgG classes of antibodies and have deserved worldwide acceptance. However, ELISA is a somewhat laborious, time-consuming technique and requires a expensive equipment. The present work was carried out to develop a feasible, inexpensive, quick and efficient passive hemaglutination technique for detection of anti-dengue antibodies in human whole blood, using the patient's blood cells as figured antigen. Antiserum against human erythrocytes was produced in rabbits and the IgG was purified by precipitation and chromatographic methods. IgG was then fractioned by papain digestion to yield Fab fragments. After separation, these fragments were linked by glutaraldehyde to the dengue viral particles successfully purified following a protocol which included centrifugation through a sodium and potassium tartarate density- gradient. However, the glutaraldehyde-mediated step need further work to establish an efficient degree of conjugation. The method did not alter either the Fab binding to erythrocytes or the recognition of viral epitopes by anti-dengue antibodies. Possibly, the use of monoclonal antibodies or a suitable system for protein expression could improve the conjugation step and help to optimize the routine testing of samples. In conclusion, a simple technique has been demonstrated to be suitable for detection of anti-dengue antibodies in samples of human blood or erythrocytes plus serum.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:07:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3008_1.pdf: 2118312 bytes, checksum: b78da92894d4b94e6a02c39c3fdb694b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Palythoa caribaeorum é um cnidário colonial, abundante no litoral pernambucano. Durante a maré baixa produz um muco que protege contra a dessecação. Embora seja conhecida a composição básica deste muco, nenhuma proteína até hoje foi isolada e caracterizada. Desta forma, este trabalho se propôs a desenvolver uma metodologia de processamento e purificação que permitisse a obtenção de uma amostra com relevante conteúdo protéico, baixa viscosidade e alta solubilidade, a qual fosse possível a sua aplicação em colunas cromatográficas comerciais, além de testar atividade farmacológica. Para isto, amostras foram coletadas nos meses de Março/09, Janeiro e Maio/10 na praia de Porto de Galinhas-PE. Mar/09 e Jan/10 foram submetidas à homogeneização mecânica enquanto Mai/10 passou por uma liquidificação. Após centrifugação, o sobrenadante de Jan/10 (Jan/10B) passou por uma diluição nas proporções 1/6 e 1/12. Mai/10 foi submetido à diluição 1/3 logo após liquidificação. Jan/10B e Jan/101/12 passaram ainda por tratamento químico com uréia 6M e ácido acético 1%, e éter/etanol e clorofórmio/metanol, respectivamente. Por último, alíquotas de Mar/09B, Jan/10B e Mai/101/3, foram submetidas à precipitação protéica com sulfato de amônio. As frações obtidas em todos os procedimentos foram dialisadas. Em seguida, foram realizadas dosagem protéica, atividade hemaglutinante, eletroforeses, cromatografias, além de inibição das atividades hemaglutinante e hemorrágica. Os resultados mostraram que a metodologia mais eficaz na preparação da amostra foi a liquidificação seguida de diluição 1/3 e precipitação protéica em faixas curtas de concentração de sal. A partir da fração F3-Mai/101/3, obtida por esta metodologia, uma lectina de 34 KDa (PcmL- 1) foi parcialmente purificada, através de uma cromatografia de afinidade em coluna Con A Sepharose 4B, seguida de cromatografia de troca aniônica em coluna Resource Q. Além disso, o muco de P. caribaeorum mostrou ser uma fonte importante de lectinas xilose e lactose-específicas, e possíveis inibidores de proteases

Orientador: Jose Camillo Novello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T20:22:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_DanielaDiogenesde_M.pdf: 3678329 bytes, checksum: b2979d9021832e5cf620da29d174d33d (MD5) Previous issue date: 1979 / Resumo: As lectinas constituem um grupo de proteínas que possuem a capacidade de se ligarem especificamente e reversivelmente a determinados carboidratos. Identificadas em vegetais e animais, são também encontradas em venenos ofídicos. Quando isoladas de venenos de serpentes, essas proteínas ligam-se a 'beta¿-galactosídeos e induzem aglutinação de eritrócitos, agregação de plaquetas e são mitogênicas para linfócitos. Uma lectina específica para 'beta¿galactosídeos foi purificada do veneno de Bothrops jararacussu através de cromatografia de afinidade em D-galactose, e foi denominada BjcuL. A análise do perfil de massa molecular em SDS-PAGE a 15% mostrou que BjcuL é um homodímero composto de subunidades de 15kDa. Quando submetido à coloração para carboidratos após SDS-PAGE, a proteína mostrou reação negativa, sugerindo que BjcuL não é uma glicoproteína. BjcuL aglutina eritrócitos tripsinizados de porco e boi, em concentrações mínimas de 0,5 'mu¿g/ml e 2,0 'mu¿g/ml, respectivamente. A hemaglutinaçao de eritrócitos porcinos induzida por 4,0 'mu¿g/ml de BjcuL é inibida especificamente por lactose 0,8 mM, galactose 3,2 mM e rafinose 3,2 mM. EDTA 0,2 mM e EGTA 0,1 mM também inibem a atividade hemaglutinante de BjcuL, o que revela a dependência de cátions divalentes. A associação das subunidades da lectina de B. jararacussu é essencial para sua atividade hemaglutinante, pois BjcuL reduzida com DTT não exibem esta atividade sobre eritrócitos porcinos... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Lectins are polyvalent carbohydrate-binding proteins which agglutinate red blood cells. Identified in plants and animals, have also been found in snake venoms. These proteins bind to lactose moieties and induce agglutination of erythocytes, aggregation of platelets and are mitogenic to lymphocytes. A galactose-specific lectin in Bothrops jararacussu venom (BJcuL) was adsorbed on a immobilized D-galactose column and eluted with 0.1 M lactose. On SDS-PAGE, under reducing conditions (0.1 M DTT), the fraction eluted showed a single band of 15 kDa, and under non reducing conditions, a major band of 30 kDa. This protein appeared not to be a glycoprotein because it gave negative reaction to the Schiff¿s reagent following treatment with periodate. Trypsined erythrocytes from pig and cow were agglutinated by BJcuL, with end points of approximately 0.5 'mu¿g/ml and 2.0 'mu¿g/ml, respectively. The hemagglutination of trypsined pig erythrocytes induced by 4.0 'mu¿g/ml of BJcuL was inhibited specifically in the presence of 0.8 mM lactose, 3.2 mM galactose, 3.2 mM raffinose. BJcuL demonstrated a requirement for divalent cation, since 0.2 mM EDTA or 0.1 mM EGTA, completely inactivated the lectin induced hemagglutination activity. The association of subunits via interchain disulfide bonds is essencial for lectin activity, since DTT-reduced BJcuL showed no hemagglutination activity against pig erythrocytes... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T13:13:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kassab_BaykiHussein_M.pdf: 2921430 bytes, checksum: ce6acbd70d8b56f04ccb974ccdfe3c4f (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: As lectinas são proteínas ou glicoproteínas com a capacidade de aglutinar eritrócitos e outras células, precipitar polissacarídeos e outras glicoproteínas por possuírem um (ou mais) centro de ligação, específico e reversível, a carboidratos. As lectinas podem ser encontradas em animais, vegetais e microorganismos. BMooL é uma lectina específica para galactosídeos, e foi purificada do veneno da serpente Bothrops moojeni através da cromatografia de afinidade em D-Iactose. O perfil eletroforético (SDS-P AGE) mostrou que BMooL é um homodímero com subunidades de 14 kDa. A proteína apresentou reação positiva quando submetida a coloração para carboidrato, sendo portanto uma glicoproteína. Dentre os eritrócitos testados, BMooL apresentou maior afinidade por eritrócitos humanos tripsinizados do tipo A, B e O, em concentrações mínimas respectivas de 0,50 ug/ml, 0,96 /. ug/ml e 0,96 ug/ml. Eritrócitos tripsinizados de cavalo e pato não foram aglutinados na presença desta lectina. A atividade hemaglutinante com 2,0 ug/ml de BMooL sobre eritrócitos humanos tripsinizados do tipo A é inibida com 0,8 mM de lactose, 1,56 mM de galactose e 1,56 mM de rafinose. A atividade hemaglutinante de BMooL demonstrou ser dependente de Ca²+, pois foi inibida na presença de EDT A e EGT A. A associação das subunidades é uma condição fundamental para a atividade hemaglutinante de BMooL, pois quando reduzida com DTT, a lectina não mantém tal atividade. A composição de aminoácidos da lectina permitiu verificar que BMooL é uma proteína que contém em maior proporção resíduos de aminoácidos hidrofílicos como Asx (14%), Glx (13%) e Lys (8,0%) e aminoácidos não polares como Leu (8,1%). Em testes de agregação plaquetária com plasma humano, na presença de colágeno como agonista das agregações, a lectina não demonstrou nenhuma modulação significante nas plaquetas em concentrações de até 40,0 ug/ml. A função das lectinas em venenos ofidicos ainda não está bem esclarecida, a atividade hemaglutinante não reflete diretamente o papel dessas proteínas. O estudo da estrutura e de outras atividades biológicas que as lectinas apresentam, faz-se necessário para um melhor entendimento das interações lectina-carboidrato, que participam da grande maioria das interações biológicas existentes / Abstract: Lectins are proteins or glycoproteins which agglutinate erythrocytes and other cells and polysaccharides, since they have one or more specific carbohydrate-binding sites. Lectins are widely distributed in plants, as well as in animaIs and microorganisms. They have also been found in the venom of snakes. A lactose-specific lectin, BMooL, was purified from the crude venom of Bothrops moojeni by affinity chromatography on an immobilized D-Iactose column. The SDS-P AGE, under reduction conditions, showed that BMooL is a homodimer of 14kDa subunits. The protein appeared to be a glycoprotein once it showed a positive reaction to the Schiff' s reagent. Among the assayed erythrocytes, BMooL had more affinity to trypsined A, B and O types of human erythrocytes with end points of approximately 0.50 ug/ml, 0.96 ug/ml and 0.96 ug/ml, respectively. On the other hand, trypsined erythrocytes from horses and ducks did not agglutinate in the presence of this lectin. The hemagglutination of trypsined A type human erythrocytes induced by 2.0 ug/ml of BMooL was inhibited specifically in the presence of 0.8 mM lactose, 1.56 mM galactose and 1,56 mM raffinose. BMooL activity is a Ca²+dependence since EDTA and EGTA inactivated the lectin induced hemagglutination. Subunits association is a fundamental condiction for the hem agglutination activity of the lectin, since when reduced by DTT, BMooL have no effect on trypsined human erythrocytes. The detennination of BMooL aminoacid composition showed that it have a high content of acidic residues such as Asx (14%), Glx (13%) and Lys (8%) and non-polar amino acids as Leu (8,1 %). On collagen-induced platelet aggregation assays with human plasma, 40,0 ug/ml lectin showed no significant modulation in the platelet. The role of these lectins in the snake venoms remains unc1ear, the hemagglutination activity does not direct reflect the function of these proteins. Strucutural and other biological activities studies are needed for a more detailed understanding about the carbohydrate-Iectin interactions, which take part in the majority of the biological interactions described up to now / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Os vírus da Influenza Equina (EIV) (H3N8 e H7N7) pertencem à família Orthomyxoviridae, gênero Influenza A. Apesar de existirem poucos relatos de infecção humana pelo EIV, é conhecido o risco zoonótico e infecção interespécies. Serviços de vigilância epidemiológica da OIE e WHO informam que o subtipo H3N8 é isolado de surtos que ocorrem mundialmente, enquanto o subtipo H7N7, menos patogênico, não é isolado desde 1980, sendo então considerado um vírus extinto. Embora o EIV seja endêmico em nosso meio, há poucos trabalhos nacionais que tenham versado sobre a avaliação atual de anticorpos (Ac) anti-EIV presentes nos equídeos do Estado de São Paulo, o que motivou a realização do presente estudo. Os objetivos do presente trabalho foram: 1) avaliar a ação de diferentes tratamentos de soro descritos pela OIE e WHO para a remoção de inibidores inespecíficos da hemaglutinação em soros de 10 equinos vacinados (H3N8 A/Equi/Kentucky/1/1997), sendo eles: a) TPH: tripsina, metaperiodato de potássio seguido de adsorção de hemácias; b) KH: kaolin 20% seguido de adsorção de hemácias; e c) RDEH: RDE seguido de adsorção de hemácias; 2) avaliar a presença de Ac contra os vírus H3N8 e H7N7, em 84 equídeos não vacinados do Estado de São Paulo; 3) comparar a frequência de Ac contra H3N8 entre equídeos amostrados do estado de SP e de um painel de soros de equídeos do município de Mossoró - RN, região onde não há estudos sobre a circulação do EIV. Constatou-se que não houve diferença estatística entre os tratamentos de soro para a remoção de inibidores inespecíficos da hemaglutinação (p>0,05; confiança de 95%), todavia o tratamento RDEH apresentou resultados mais consistentes, corroborando a recomendação da OIE e da WHO de utilizar preferencialmente este tratamento. O perfil sorológico dos animais amostrados de SP sugere que circule o subtipo H3N8 e que o subtipo H7N7 circule de forma subclínica nos equídeos, o que é sustentado por outros trabalhos realizados no Brasil. Há evidências no Brasil sobre a detecção de anticorpos em equinos contra o subtipo H7N7, mesmo não havendo o isolamento deste no mundo desde 1980. No painel de soros do RN, onde a espécie Equus asinus era maioria, verificou-se a igualdade estatística entre as frequências de Equus caballus e Equus asinus positivos no teste de HI para o subtipo H3N8 (p>0,05; confiança de 95%), dado inédito em nosso meio. A frequência dos equídeos positivos no teste de HI para o subtipo H3N8 foi estatisticamente maior (p<0,05; confiança de 95%) em SP do que em RN. / The Equine influenza Virus (EIV) (H3N8 and H7N7) belong to Orthomyxoviridae family and Influenza A genus. Although there are few reports of human infection with EIV zoonotic and interspecies infection risk is known. OIE and WHO services on epidemiological surveillance report that H3N8 subtypes are isolated and characterized from worldwide outbreaks while H7N7 subtype less pathogenic has not being isolated since 1980 considered an extinct virus. Although the EIV is endemic in our country there are few national studies that had versed on the current evaluation of horses antibodies (Ab) from São Paulo State which motivated the present study. The study objectives were: 1) to evaluate the effects of different serum treatments described by OIE and WHO for the removal of nonspecific inhibitors of hemagglutination in 10 vaccinated (H3N8 - A/Equi/Kentucky/1/1997) horses sera being: a) TPH: trypsin, potassium metaperiodate followed by adsorption of erythrocytes b) KH: kaolin 20% followed by adsorption of erythrocytes and c) RDEH: RDE followed by adsorption of erythrocytes; 2) investigate the presence of antibodies against H3N8 and H7N7 viruses in 84 unvaccinated equines in São Paulo State; 3) compare the frequency of antibodies against H3N8 sampled between São Paulo State and a panel of equines sera from Mossoró - RN where there are no studies on EIV circulation. There was no statistical difference between the treatments for serum nonspecific inhibitors of hemagglutination removal (p>0.05; 95% confidence) however RDEH treatment showed results more consistent confirming OIE and WHO recommendation to use this treatment with priority. The serological profile of SP samples suggests H3N8 subtype circulates in those animals and H7N7 subtype might circulate in a subclinical form in equines, which is supported by other studies conducted in Brazil. There is evidence of antibodies detection against equine H7N7 subtype in Brazil, even without since 1980 isolation in the world. In animals from RN State which had Equus asinus representing a major fraction there was statistical equal frequencies of Equus caballus and Equus asinus positivity in HI test against H3N8 subtype (p>0.05; 95% of confidence), as unprecedented in the world. The frequency of positive equine against H3N8 subtype on HI test in SP was statistically higher (p<0.05; 95% of confidence) than in RN.

Os vírus da Influenza Equina (EIV) (H3N8 e H7N7) pertencem à família Orthomyxoviridae, gênero Influenza A. Apesar de existirem poucos relatos de infecção humana pelo EIV, é conhecido o risco zoonótico e infecção interespécies. Serviços de vigilância epidemiológica da OIE e WHO informam que o subtipo H3N8 é isolado de surtos que ocorrem mundialmente, enquanto o subtipo H7N7, menos patogênico, não é isolado desde 1980, sendo então considerado um vírus extinto. Embora o EIV seja endêmico em nosso meio, há poucos trabalhos nacionais que tenham versado sobre a avaliação atual de anticorpos (Ac) anti-EIV presentes nos equídeos do Estado de São Paulo, o que motivou a realização do presente estudo. Os objetivos do presente trabalho foram: 1) avaliar a ação de diferentes tratamentos de soro descritos pela OIE e WHO para a remoção de inibidores inespecíficos da hemaglutinação em soros de 10 equinos vacinados (H3N8 A/Equi/Kentucky/1/1997), sendo eles: a) TPH: tripsina, metaperiodato de potássio seguido de adsorção de hemácias; b) KH: kaolin 20% seguido de adsorção de hemácias; e c) RDEH: RDE seguido de adsorção de hemácias; 2) avaliar a presença de Ac contra os vírus H3N8 e H7N7, em 84 equídeos não vacinados do Estado de São Paulo; 3) comparar a frequência de Ac contra H3N8 entre equídeos amostrados do estado de SP e de um painel de soros de equídeos do município de Mossoró - RN, região onde não há estudos sobre a circulação do EIV. Constatou-se que não houve diferença estatística entre os tratamentos de soro para a remoção de inibidores inespecíficos da hemaglutinação (p>0,05; confiança de 95%), todavia o tratamento RDEH apresentou resultados mais consistentes, corroborando a recomendação da OIE e da WHO de utilizar preferencialmente este tratamento. O perfil sorológico dos animais amostrados de SP sugere que circule o subtipo H3N8 e que o subtipo H7N7 circule de forma subclínica nos equídeos, o que é sustentado por outros trabalhos realizados no Brasil. Há evidências no Brasil sobre a detecção de anticorpos em equinos contra o subtipo H7N7, mesmo não havendo o isolamento deste no mundo desde 1980. No painel de soros do RN, onde a espécie Equus asinus era maioria, verificou-se a igualdade estatística entre as frequências de Equus caballus e Equus asinus positivos no teste de HI para o subtipo H3N8 (p>0,05; confiança de 95%), dado inédito em nosso meio. A frequência dos equídeos positivos no teste de HI para o subtipo H3N8 foi estatisticamente maior (p<0,05; confiança de 95%) em SP do que em RN. / The Equine influenza Virus (EIV) (H3N8 and H7N7) belong to Orthomyxoviridae family and Influenza A genus. Although there are few reports of human infection with EIV zoonotic and interspecies infection risk is known. OIE and WHO services on epidemiological surveillance report that H3N8 subtypes are isolated and characterized from worldwide outbreaks while H7N7 subtype less pathogenic has not being isolated since 1980 considered an extinct virus. Although the EIV is endemic in our country there are few national studies that had versed on the current evaluation of horses antibodies (Ab) from São Paulo State which motivated the present study. The study objectives were: 1) to evaluate the effects of different serum treatments described by OIE and WHO for the removal of nonspecific inhibitors of hemagglutination in 10 vaccinated (H3N8 - A/Equi/Kentucky/1/1997) horses sera being: a) TPH: trypsin, potassium metaperiodate followed by adsorption of erythrocytes b) KH: kaolin 20% followed by adsorption of erythrocytes and c) RDEH: RDE followed by adsorption of erythrocytes; 2) investigate the presence of antibodies against H3N8 and H7N7 viruses in 84 unvaccinated equines in São Paulo State; 3) compare the frequency of antibodies against H3N8 sampled between São Paulo State and a panel of equines sera from Mossoró - RN where there are no studies on EIV circulation. There was no statistical difference between the treatments for serum nonspecific inhibitors of hemagglutination removal (p>0.05; 95% confidence) however RDEH treatment showed results more consistent confirming OIE and WHO recommendation to use this treatment with priority. The serological profile of SP samples suggests H3N8 subtype circulates in those animals and H7N7 subtype might circulate in a subclinical form in equines, which is supported by other studies conducted in Brazil. There is evidence of antibodies detection against equine H7N7 subtype in Brazil, even without since 1980 isolation in the world. In animals from RN State which had Equus asinus representing a major fraction there was statistical equal frequencies of Equus caballus and Equus asinus positivity in HI test against H3N8 subtype (p>0.05; 95% of confidence), as unprecedented in the world. The frequency of positive equine against H3N8 subtype on HI test in SP was statistically higher (p<0.05; 95% of confidence) than in RN.

A finalidade desse trabalho foi a análise de aspectos estruturais e biológicos de uma lectina do veneno de B. atrox, denominada galatrox. A purificação da galatrox envolveu dois passos cromatográficos, sendo o primeiro por afinidade em coluna de agarose-lactose e o segundo referente a aplicação do material retido no gel de agarose-lactose (LacR), em coluna de Sephadex G-25. As etapas de purificação foram monitoradas por leitura de absorbância em 280nm e SDS-PAGE. Preparações de galatrox foram submetidas à digestão in situ com tripsina e a massa molecular e o sequenciamento dos peptídeos obtidos foram determinados por espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS e ESI-CID-MS/MS). A seqüência N-terminal de aminoácidos da galatrox foi obtida pela reação automatizada de Edman (PROCISE-419®). A atividade lectínica dessa proteína foi caracterizada por meio de testes de aglutinação de eritrócitos humanos, na presença ou ausência de diferentes carboidratos como lactose (4mM) e galactose (20mM), EDTA (5mM) e aquecimento (100ºC/10min). A desgranulação mastocitária foi determinada pela liberação de -Hexosaminidase por células RBL-2H3 sensibilizadas com IgE anti-DNP(dinitrofenil) e estimuladas com galatrox, veneno bruto, fração não retida na coluna de agarose-lactose (Lac-nR), HSA-DNP (controle positivo) ou PBS (controle negativo). O nível de indução de apoptpse e/ou necrose de células RBL-2H3 tratadas com galatrox foi avaliado pela marcação com anexina V-FITC e/ou iodeto de propídeo e analisado por citometria de fluxo (FACScanto®) com o auxílio do software (CBA-DIVA®). A camptotecina foi utilizada como referência de apoptose/necrose. A atividade edematogênica foi testada em camundongos pela injeção intraplantar de galatrox; fração Lac-nR, veneno bruto e PBS. Análise por SDS-PAGE indicou que as preparações de galatrox eram homogêneas e continham bandas de 14.000 e 28.000 de massa molecular relativa em condições redutoras ou não, respectivamente. A seqüência N-terminal foi correspondente aos seguintes aminoácidos: NNXPQDWLPMNGLXYKIFD, e a seqüência de alguns aminoácidos internos corresponderam a KDFSWEWTDR e GHSEVWLGLWDK. A atividade hemaglutinante dessa lectina foi dose-dependente e inibida por EDTA (5mM), aquecimento (100ºC/10min) e lactose (32mM, 16mM, 8mM, 4mM, 2mM, 1mM, 0,5mM). Ao contrário do veneno bruto e da fração Lac-nR, esta lectina não foi edematogênica e nem promoveu apoptose e necrose de células RBL- 2H3. A galatrox induziu uma discreta desgranulação mastocitária em comparação com o veneno bruto e a fração Lac-nR. Com base nos dados obtidos sugere-se que a galatrox é uma lectina homodímérica com 28.000 de massa molecular relativa, ligante de -galactosídeos e que apresenta similaridade estrutural com outras lectinas tipo-C do veneno de Bothrops ssp. Além disso, a galatrox comportou-se como um fraco agente pró-inflamatório e não induziu efeitos apoptótico e necrótico significantes. Finalmente, esse trabalho poderá contribuir para o melhor entendimento do impacto biológico da presença de lectinas no veneno e nos envenenamentos, bem como na geração de novos produtos biotecnológicos. / The aim of this work was the analysis of structural and biological aspects of a B. atrox venom lectin, named galatrox. The galatrox purification involved two chromatographic steps, starting with an affinity column of Lactosyl-Sepharose followed by application of the retained material on a Lactosyl-Sepharose gel (LacR) in Sephadex G-25 column. The purification steps were monitored by absorbance at 280nm and SDSPAGE. Galatrox samples were submitted to digestion in situ with trypsin and the sequencing mass of the obtained peptides were determined by mass spectrometry (MALDI-TOF-MS and ESI-CID-MS/MS). The N-terminal sequence of amino acids from galatrox was obtained by automatized Edman degradation (PROCISE-491®). The lectin activity of this protein was characterized by human erytrocytes agglutination test in presence or absence of different carbohydrates as lactose (4mM) and galactose (20mM), EDTA (5mM) and heat. The mast cells degranulation was determined by -hexosaminidase release in RBL-2H3 cells sensibilized with anti-DNP IgE and challenged with galatrox, crude venom in a non retained fraction in Lactosyl-Sepharose (Lac-nR) , HAS-DNP (positive control) or PBS (negative control). The apoptosis and/or necrosi induced level in treated RBL- 2H3 cells with galatrox was evaluated using AnnexinV and/or Propidium iodide and analysed by flow citometry (FACSCanto®) with the help software (CBA-DIVA®). The camptotecin was used with apoptosi/necrosi reference. The edematogenic was tested in mice by the intraplantar injection of galatrox, Lac-nR fraction, crude venom and PBS. SDS-PAGE analyse indicated that the galatrox preparations were homogenous and contained a single band of 14,000 or 28,000 relative molecular weight showed in reducting or non-reducting conditions, respectively. N-terminal amino acid sequence was determined as following: NNXPQDWLPMNGLXYKIFD, and some internal amino acid sequence was obtained which correspond to KDFSWEWTDR and GHSEVWLGLWDK. The hemagglutination activity of this lectin was dose dependent and inhibited by EDTA (5mM), heating (100ºC/10min) and lactose (32mM, 16mM, 8mM, 4mM, 2mM, 1mM, 0,5mM). In the other hand, the crude venom and Lac-nR fraction, this lectin was not edematogenic nor promoted apoptosis and necrosi of RBL-2H3 cells. The galatrox induced a discret mast cells degranulation compared with crude venom and Lac-nR fraction. Based in obtained datas is suggested that galatrox is a homodimeric lectin with relative molecular mass of 28,000, -galactoside bindings and that shows structural similarity with other Ctype lectins from Bothrops ssp. venom. Even more the galatrox showed to be a weak proinflamatory agent and did not induced significant apoptotic and necrotic effect. Finally this work would contribute to better understanding of the biological impact that the lectin presence in venom and in poisonings as well in the generation of a new biotechnological products.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-12-22T15:43:12Z No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Lia Muniz Barretto Fernandes.pdf: 1185581 bytes, checksum: a574788d65eeda6abbf9b9ce1dcc5ee9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-22T15:43:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Lia Muniz Barretto Fernandes.pdf: 1185581 bytes, checksum: a574788d65eeda6abbf9b9ce1dcc5ee9 (MD5) / Doença de Newcastle é uma enfermidade viral aguda, altamente contagiosa, que acomete aves de várias espécies, considerada como uma das doenças mais importantes para a indústria avícola moderna. Ferramentas para diagnóstico e controle estão disponíveis para galinhas, porém ainda não foram desenvolvidos testes específicos para avestruzes. O presente trabalho visou padronizar testes sorológicos para a detecção de anticorpos contra a Doença de Newcastle em avestruzes e avaliar a situação soroepidemiológica de plantéis do estado da Bahia e de São Paulo. A padronização da técnica da Inibição da Hemaglutinação revelou interferência do tipo de eritrócito utilizado e demonstrou a necessidade do uso de hemácias da mesma espécie ou, alternativamente, de perus. Testes de ELISA indiretos foram desenvolvidos ou modificados para a utilização nesta espécie e, apesar de apresentarem alta correlação entre si, demonstraram baixa correlação com a HI. Foram desenvolvidos ainda os testes “western blot” e “dotblot”, que podem auxiliar na avaliação da resposta imune e facilitar a implantação de programas de controle. As amostras séricas analisadas revelaram a presença de anticorpos e, a ausência de vacinação dos animais avaliados, reforça a hipótese de que as avestruzes estão em contato com o vírus vacinal ou vírus de campo.

Orientadores: Maria Lourdes Barjas-Castro, Carlos Lenz Cesar / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T15:31:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes_HeloisePockel_M.pdf: 11930391 bytes, checksum: ee8655790477f44b4f7a68132905dc0c (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A membrana eritrocitária contém proteínas e glicoproteínas imersas em uma bicamada lipídica que possui um comportamento viscoelástico. Algumas glicoproteínas contém ácido siálico, que é o principal responsável pelas cargas negativas na superfície da hemácia que quando em solução cria um potencial elétrico (Ç) repulsivo. A carga elétrica negativa da superfície eritrocitária influencia na distribuição dos íons da solução ao redor da célula formando uma dupla camada de íons. A primeira, conhecida como camada compacta de cargas ou "Stern" é formada por íons rigidamente ligados à hemácia e a segunda camada é composta por íons distribuídos difusamente e conhecida como camada difusa. O objetivo deste estudo foi medir o potencial zeta (Ç), a espessura da dupla camada das cargas iónicas (DLC) ao redor da hemácia, e a força de agregação eritrocitária com diferentes meios potencializadores da aglutinação utilizando pinça óptica. (...continua) / Abstract: The red blood cell (RBC) membrane contains proteins and glycoproteins embedded in a fluid lipid bilayer that confers viscoelastic behavior. Sialylated glycoproteins of the RBC membrane are responsible for a negatively charged surface, which creates a repulsive electric zeta potential (Z) between the cells.The compact layer of charge or Stern consists of ions rigidly bonded to the cell and the double layer includes ions diffusely distributed around the cell. The aim of this study was to measure the RBC double layer thickness of the charge (DLC) around the cell, zeta potential (Z) and cell aggregation force in agglutination potentiator solutions, using optical tweezers. (¿to be continue) / Mestrado / Mestre em Farmacologia