BEZERRA, Walderly Melgaço. Expressão de uma proteína YD de Chromobacterium violaceum em sistemas heterólogos: potencial no controle de pragas e fungos. 2008. 53 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2008. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-19T11:44:51Z No. of bitstreams: 1 2008_dis_wmbezerra.pdf: 488580 bytes, checksum: 8867bb56552a329eb81d971c78c66730 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:26:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_dis_wmbezerra.pdf: 488580 bytes, checksum: 8867bb56552a329eb81d971c78c66730 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:26:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_dis_wmbezerra.pdf: 488580 bytes, checksum: 8867bb56552a329eb81d971c78c66730 (MD5) Previous issue date: 2008 / Chromobacterium violaceum is a free-living betaproteobacterium, which is found in the water and soil environments of tropical and subtropical regions. C. subtsugae, another species of the same genus, is toxic towards insects belonging to several orders. Among the genes that may be involved in the insecticidal activity displayed by these bacteria are those that encode chitinases. In addition to these chitinases, a protein containing YD repeats with potential insecticidal activity, encoded by the gene cv2776, was also identified in the genome of C. violaceum ATCC 12472. Similar proteins have also been found in the genomes of Xenorhabdus bovienii and Photorhabdus luminescens. The YD motif comprises 20 amino acids, with the consensus sequence Gx3-9YxYDx2GR(L, I or V)x3-10G, where x represents any amino acid. The protein TccC, from P. luminescens, has nine YD repeats in its sequence, as well as the protein SepC, from Serratia entomophila. SepC, along with two other toxins, SepA and SepB, are able to cause the "amber" disease in Costelytra zealandica (Coleoptera: Scarabaeidae). In the present work, the DNA coding seuquence of the gene cv2776 of C. violaceum ATCC 12472 was cloned in two different heterologous systems. In Escherichia coli, the coding sequence was expressed under control of the promoter araBAD, induced by L-arabinose. The protein rCV2776 was detected by imunoblotting in the insoluble fraction of induced E. coli cells. The rCV2776 present in the total insoluble cell fraction caused the death of Callosobruchus maculatus larvae, reducing the number of emerged adults in 78% and also decreasing the average weight of the insects. The E. coli cell fraction containing the recombinant protein also affected the vegetative growth of the phytopatogenic fungi Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii. When the fraction containing rCV2776 was incorporated at 1.% (w/v) in the medium, the inhibition percentages of the mycelium growth were 38.5% (R. solani), 60.7% (M. phaseolina) and 71.1% (S. rolfsii). In the yeast Pichia pastoris, the coding sequence was expressed under the control of the promoter PAOX, which is induced by methanol as the sole carbon source. When expressed in P. pastoris, the recombinant protein was apparently degraded by endogenous proteases and could not be detected by SDS-PAGE or Western Blotting, even when 8 mg of protein was loaded into the gel. In conclusion, the recombinant protein CV2776 present in the insoluble fraction of induced E. coli cells was effective in controlling the emergence of the cowpea weevil, as well as slowing the growth of M. phaseolina and S. rolfsii / Chromobacterium violaceum é uma betaproteobactéria de vida livre encontrada em regiões tropicais e subtropicais. C. subtsugae, bactéria do mesmo gênero, possui atividade tóxica contra insetos de diversos gêneros. Entre os genes que podem estar envolvidos no potencial inseticida dessa bactéria, destacam-se aqueles que codificam quitinases. Em adição, identificou-se também no genoma de C. violaceum ATCC 12472 uma proteína contendo repetições YD com potencial atividade inseticida, codificada pelo gene cv2776, similar àquelas produzidas por Xenorhabdus bovienii e Photorhabdus luminescens. O motivo YD compreende 20 aminoácidos, com sequência consenso Gx3-9YxYDx2GR(L, I ou V)x3-10G (x representa qualquer aminoácido). A proteína TccC, de P. luminescens, possui 9 repetições YD, assim como a proteína SepC, de Serratia entomophila. SepC, juntamente com outras duas toxinas, SepA e SepB, são suficientes para causar a doença “âmbar” em Costelytra zealandica (Coleoptera: Scarabaeidae). No presente trabalho, a região codificadora do gene cv2776 de C. violaceum ATCC 12472 foi clonada em dois diferentes sistemas de expressão heteróloga. Em Escherichia coli, o gene foi expresso sob controle do promotor araBAD, induzido por L-arabinose. A proteína rCV2776 foi detectada por ensaio de imunoblotting na fração insolúvel das células de E. coli induzidas. A rCV2776 presente na fração insolúvel das células dessa bactéria teve efeito letal sobre larvas de Callosobruchus maculatus, diminuindo em até 78% o número de insetos adultos emergidos, além de diminuir o peso médio desses insetos. Além disso, a fração celular de E. coli contendo rCV2776 mostrou-se capaz de inibir o crescimento vegetativo de três fungos fitopatogênicos, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. Quando incorporada no meio de cultura em uma concentração de 1% (m/v), essa fração causou percentuais de inibição de crescimento do micélio de 38.5% (R. solani), 60.7% (M. phaseolina) e 71.1% (S. rolfsii), respectivamente. Na levedura Pichia pastoris, a região codificadora foi expressa sob controle do promotor PAOX, que é induzido na presença de metanol como única fonte de carbono. Quando expressa em P. pastoris, a proteína recombinante foi aparentemente degradada por proteases endógenas, e não pôde ser detectada em análises de SDS-PAGE ou Western Bloting, mesmo quando foram aplicados 8,0 mg do sobrenadante concentrado e liofilizado no gel de eletroforese. Em conclusão, a proteína rCV2776 presente na fração insolúvel das células de E. coli induzidas foi efetiva em controlar a emergência do caruncho do feijão-de-corda, bem como em retardar o crescimento de M. phaseolina e S. rolfsii

A levedura Kluyveromyces marxianus, apesar de apresentar propriedades fisiológicas vantajosas para a produção heteróloga de proteínas, foi utilizada apenas poucas vezes como hospedeira na síntese dessa classe de moléculas. Em contrapartida, a sua congênere Kluyveromyces lactis possui mais de 40 sistemas de expressão desenvolvidos, inclusive comerciais. Além disso, não há literatura disponível sobre glicosilação de proteínas em K. marxianus. Levando-se isso em consideração, este trabalho visou a desenvolver sistemas para a expressão heteróloga da enzima glicose oxidase (GOX) de Aspergillus niger e de uma esterase termófila (EST) de Thermus thermophilus em K. marxianus. A linhagem K. lactis CBS 2359 foi utilizada como parâmetro de comparação em todos os sistemas de expressão construídos. Primeiramente, foi realizado um estudo fisiológico com a finalidade de selecionar, dentre três linhagens de K. marxianus pré-selecionadas a partir de informação da literatura, a que apresentasse as melhores características fisiológicas para se tornar uma hospedeira de expressão heteróloga. A linhagem selecionada foi a CBS 6556, baseando-se numa combinação das seguintes características: velocidade específica de crescimento, formação de metabólitos, rendimento de substrato em biomassa e secreção da enzima homóloga inulinase. Após, foram construídos dois sistemas de expressão epissomais. No primeiro, o gene era expresso sob controle do promotor PGK de S. cerevisiae e no segundo, sob controle de INU1 de K. marxianus. Um sistema integrativo foi utilizado, no qual a expressão era dirigida pelo promotor INU1. Estudos bioquímicos e de glicosilação foram realizados nas enzimas produzidas. Em relação aos sistemas para expressão de GOX, foram alcançados níveis de produção de 1722 U/gMS (unidades por grama de biomassa seca) em K. marxianus transformado com o sistema epissomal no qual a expressão era controlada pelo promotor INU1. As caracterizações bioquímicas da enzima mostraram que a molécula produzida apresentava propriedades semelhantes à enzima homóloga de A. niger. Além disso, os estudos de glicosilação mostraram uma menor tendência de hiperglicosilação de K. marxianus quando comparada com K. lactis. Já em relação à esterase, K. lactis apresentou maiores níveis de expressão (294 U/gMS), porém a enzima produzida em K. marxianus apresentou temperatura ótima de atividade (50 °C) ligeiramente superior à enzima produzida por sua congênere (45 °C), temperaturas abaixo da qual ocorre maior atividade da enzima homóloga (65 °C). Isso pode ser explicado pela glicosilação exercida por ambas espécies de leveduras sobre a proteína, ao contrário da homóloga, não glicosilada. Além disso, os produtos das leveduras apresentaram três padrões de glicosilação. Dessa forma, o trabalho desenvolvido alcançou seu objetivo de desenvolver esses sistemas de expressão, bem como de avaliar a síntese heteróloga de proteínas nessa levedura de destacado potencial. Os resultados obtidos devem servir à comunidade científica, no sentido de estimular e orientar futuros trabalhos que objetivem a síntese heteróloga de proteínas em microrganismos. / In spite of the advantageous physiological properties of the yeast Kluyveromyces marxianus to produce heterologous proteins, this species has not been widely explored for the synthesis of these biomolecules. On the other hand, more than 40 heterologous expression systems, including commercial ones, were developed for Kluyveromyces lactis. Moreover, there is no available literature concerning heterologous protein glycosylation in K. marxianus. Taking these facts into account, this work aimed at developing systems for the heterologous production of Aspergillus niger glucose oxidase (GOX) and of a thermophilic esterase (EST) from Thermus thermophilus in K. marxianus. The strain K. lactis CBS 2359 was utilized as a reference throughout the whole work. First, a physiological study was carried out in order to select one K. marxianus strain, out of three which had been chosen based on literature information, that exhibited the best physiological traits to be a heterologous expression host. The chosen strain was CBS 6556, based on a combination of the following properties: specific growth rate, metabolites formation, biomass yield on substrate, and secretion of the homologous enzyme inulinase. Subsequently, two episomal systems were constructed. In one of them, the heterologous gene was expressed under control of the S. cerevisiae PGK promoter, whereas in the other system, heterologous gene expression occurred under control of the K. marxianus INU1 promoter. An integrative expression system was also constructed, in which the KmINU1 promoter drove foreign gene expression. Both heterologous enzymes were characterized biochemically and also with respect to their glycosylation. The results attained with GOX led to an expression level of 1722 U/g DW (unit per gram of dry cell weight) in K. marxianus transformed with the episomal INU1-based system. The biochemical studies showed that the enzyme was very similar to the A. niger GOX. Furthermore, analysis of the glycosylation pattern showed a lower tendency of K. marxianus to hypermannosylate proteins, when compared to K. lactis. Higher levels of esterase (294 U/gDW) were obtained in K. lactis than in K. marxianus. However, the enzyme produced in the latter host presented a higher temperature for maximal activity ((50 °C), when compared to the former organism (45 °C). Both values are lower than the temperature for maximal activity of the homologous enzyme (65 °C), which can be explained by the glycans added by both yeast species to the peptide, resulting in a glycosylated protein, in contrast to the homologous esterase. Moreover, the yeast products presented three glycosylation patterns. In conclusion, the work presented in this thesis reached its aims, which were to develop these expression systems and to characterize biochemically the heterologous enzymes expressed, which included an analysis of the glycosylation pattern. The results presented here will certainly be of interest and aid the scientific community working on the expression of heterologous proteins in microorganisms.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Chromobacterium violaceum à uma betaproteobactÃria de vida livre encontrada em regiÃes tropicais e subtropicais. C. subtsugae, bactÃria do mesmo gÃnero, possui atividade tÃxica contra insetos de diversos gÃneros. Entre os genes que podem estar envolvidos no potencial inseticida dessa bactÃria, destacam-se aqueles que codificam quitinases. Em adiÃÃo, identificou-se tambÃm no genoma de C. violaceum ATCC 12472 uma proteÃna contendo repetiÃÃes YD com potencial atividade inseticida, codificada pelo gene cv2776, similar Ãquelas produzidas por Xenorhabdus bovienii e Photorhabdus luminescens. O motivo YD compreende 20 aminoÃcidos, com sequÃncia consenso Gx3-9YxYDx2GR(L, I ou V)x3-10G (x representa qualquer aminoÃcido). A proteÃna TccC, de P. luminescens, possui 9 repetiÃÃes YD, assim como a proteÃna SepC, de Serratia entomophila. SepC, juntamente com outras duas toxinas, SepA e SepB, sÃo suficientes para causar a doenÃa âÃmbarâ em Costelytra zealandica (Coleoptera: Scarabaeidae). No presente trabalho, a regiÃo codificadora do gene cv2776 de C. violaceum ATCC 12472 foi clonada em dois diferentes sistemas de expressÃo heterÃloga. Em Escherichia coli, o gene foi expresso sob controle do promotor araBAD, induzido por L-arabinose. A proteÃna rCV2776 foi detectada por ensaio de imunoblotting na fraÃÃo insolÃvel das cÃlulas de E. coli induzidas. A rCV2776 presente na fraÃÃo insolÃvel das cÃlulas dessa bactÃria teve efeito letal sobre larvas de Callosobruchus maculatus, diminuindo em atà 78% o nÃmero de insetos adultos emergidos, alÃm de diminuir o peso mÃdio desses insetos. AlÃm disso, a fraÃÃo celular de E. coli contendo rCV2776 mostrou-se capaz de inibir o crescimento vegetativo de trÃs fungos fitopatogÃnicos, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. Quando incorporada no meio de cultura em uma concentraÃÃo de 1% (m/v), essa fraÃÃo causou percentuais de inibiÃÃo de crescimento do micÃlio de 38.5% (R. solani), 60.7% (M. phaseolina) e 71.1% (S. rolfsii), respectivamente. Na levedura Pichia pastoris, a regiÃo codificadora foi expressa sob controle do promotor PAOX, que à induzido na presenÃa de metanol como Ãnica fonte de carbono. Quando expressa em P. pastoris, a proteÃna recombinante foi aparentemente degradada por proteases endÃgenas, e nÃo pÃde ser detectada em anÃlises de SDS-PAGE ou Western Bloting, mesmo quando foram aplicados 8,0 mg do sobrenadante concentrado e liofilizado no gel de eletroforese. Em conclusÃo, a proteÃna rCV2776 presente na fraÃÃo insolÃvel das cÃlulas de E. coli induzidas foi efetiva em controlar a emergÃncia do caruncho do feijÃo-de-corda, bem como em retardar o crescimento de M. phaseolina e S. rolfsii / Chromobacterium violaceum is a free-living betaproteobacterium, which is found in the water and soil environments of tropical and subtropical regions. C. subtsugae, another species of the same genus, is toxic towards insects belonging to several orders. Among the genes that may be involved in the insecticidal activity displayed by these bacteria are those that encode chitinases. In addition to these chitinases, a protein containing YD repeats with potential insecticidal activity, encoded by the gene cv2776, was also identified in the genome of C. violaceum ATCC 12472. Similar proteins have also been found in the genomes of Xenorhabdus bovienii and Photorhabdus luminescens. The YD motif comprises 20 amino acids, with the consensus sequence Gx3-9YxYDx2GR(L, I or V)x3-10G, where x represents any amino acid. The protein TccC, from P. luminescens, has nine YD repeats in its sequence, as well as the protein SepC, from Serratia entomophila. SepC, along with two other toxins, SepA and SepB, are able to cause the "amber" disease in Costelytra zealandica (Coleoptera: Scarabaeidae). In the present work, the DNA coding seuquence of the gene cv2776 of C. violaceum ATCC 12472 was cloned in two different heterologous systems. In Escherichia coli, the coding sequence was expressed under control of the promoter araBAD, induced by L-arabinose. The protein rCV2776 was detected by imunoblotting in the insoluble fraction of induced E. coli cells. The rCV2776 present in the total insoluble cell fraction caused the death of Callosobruchus maculatus larvae, reducing the number of emerged adults in 78% and also decreasing the average weight of the insects. The E. coli cell fraction containing the recombinant protein also affected the vegetative growth of the phytopatogenic fungi Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii. When the fraction containing rCV2776 was incorporated at 1.% (w/v) in the medium, the inhibition percentages of the mycelium growth were 38.5% (R. solani), 60.7% (M. phaseolina) and 71.1% (S. rolfsii). In the yeast Pichia pastoris, the coding sequence was expressed under the control of the promoter PAOX, which is induced by methanol as the sole carbon source. When expressed in P. pastoris, the recombinant protein was apparently degraded by endogenous proteases and could not be detected by SDS-PAGE or Western Blotting, even when 8 mg of protein was loaded into the gel. In conclusion, the recombinant protein CV2776 present in the insoluble fraction of induced E. coli cells was effective in controlling the emergence of the cowpea weevil, as well as slowing the growth of M. phaseolina and S. rolfsii

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / A utilizaÃÃo de microrganismos como sistemas heterÃlogos de expressÃo de proteÃnas tem se mostrado uma estratÃgia alternativa e/ou complementar aos passos tradicionais utilizados no processo de purificaÃÃo de proteÃnas. Diante deste contexto, quitinases (EC 3.2.1.14), enzimas hidrolÃticas capazes de degradar quitina, tÃm sido expressas em diferentes sistemas heterÃlogos, incluindo bactÃrias e leveduras. Quitina à um polÃmero linear composto de resÃduos de N-acetil-β-D-glucosamina (GlcNAc), sendo um importante constituinte estrutural da carapaÃa de crustÃceos e membrana peritrÃfica de insetos e, ainda, da parede celular de fungos. Este trabalho teve por objetivo expressar uma quitinase, codificada pela ORF cv3316, de Chromobacterium violaceum ATCC 12472 na levedura metilotrÃfica Pichia pastoris, estirpes GS115 e KM71H, alÃm de purificar e caracterizar a proteÃna recombinante (rCHI3316). A estirpe GS115, portando a construÃÃo (pPICZαA-CV3316), foi selecionada para os experimentos posteriores, pois apresentou um maior nÃvel de expressÃo quando comparada à cepa KM71H. Cromatografia de afinidade em coluna de nÃquel imobilizado foi utilizada para purificar a quitinase recombinante (rCHI3316), que foi eluÃda como um Ãnico pico com imidazol 0,04 M. A proteÃna purificada se mostrou homogÃnea quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida 15% em presenÃa de SDS e -mercaptoetanol (SDS-PAGE). Nessas condiÃÃes, uma Ãnica banda com massa molecular aparente de aproximadamente 87 kDa foi observada. A quitinase rCHI3316 de C. violaceum foi expressa de forma solÃvel utilizando o sistema de expressÃo P. pastoris e, alÃm disso, sua purificaÃÃo foi realizada de forma satisfatÃria. O conteÃdo de estrutura secundÃria foi estimado por espectroscopia de dicroÃsmo circular (CD), com a proteÃna submetida a diferentes temperaturas (10-90 ÂC). Na temperatura de 24 ÂC, o espectro de CD revelou a predominÃncia do conteÃdo de hÃlice alfa (38%), folha beta (26 %) e estrutura randÃmica (37%). Entre as temperaturas de 10-50 ÂC, rCHI3316 exibiu um espectro caracterÃstico de folha beta. A partir de 60 ÂC atà 90 ÂC, rCHI3316 adquiriu uma conformaÃÃo caracterÃstica de hÃlice alfa. A temperatura mÃdia para essa transiÃÃo conformacional foi calculada como sendo 59,6  1,21 ÂC. Experimentos de espectroscopia de fluorescÃncia, com excitaÃÃo a 280 e 290 nm, produziram espectros de emissÃo com comprimentos de onda mÃximos iguais a 339 e 342 nm, respectivamente. Esses valores sÃo caracterÃsticos de resÃduos de triptofano parcialmente expostos ao solvente. Atividade quitinolÃtica contra vÃrios substratos e dependÃncia de pH da atividade enzimÃtica da proteÃna pura foram avaliados. A rCHI3316 exibiu atividade hidrolÃtica sobre os substratos quitina coloidal (1.189,40 U/mgP), 4-nitrofenil N-Nâ-diacetil-β-D-quitobiosÃdeo (30.411,0 U/mgP) e 4-nitrofenil N-Nâ-Nââ-triacetilquitotriose (13.150,0 U/mgP); entretanto, nenhuma atividade enzimÃtica da rCHI3316 foi detectada frente a 4-nitofenil N-acetil-β-D-glucosaminÃdeo. A enzima exibiu atividade quitinolÃtica Ãtima (100%) em pH 5,0; quando quitina coloidal foi utilizada como substrato. Em adiÃÃo, a atividade antifÃngica contra fungos fitopatogÃnicos, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Penicillium herquei foi investigada. rCHI3316 nÃo inibiu a germinaÃÃo e o crescimento micelial dos esporos dos fungos testados, na concentraÃÃo de 0,63 mgP.ml-1. Estudos subseqÃentes deverÃo ser realizados na intenÃÃo de descobrir potenciais aplicaÃÃes desta proteÃna como uma ferramenta biolÃgica no controle de outros fungos fitopatogÃnicos bem como insetos considerados pragas. / Microorganisms are a valuable tool for the expression of proteins from a variety of sources, including plants, animals and other microorganisms. Thus, chitinases, a group of glycosil hydrolases capable to hydrolize chitin, have already been expressed and purified from different systems including bacteria and yeast. Chitin, a linear polymer of N-acetyl-β-D-glucosamine (GlcNAc), is an important structural component found in the crustacean shells, in the peritrophic membrane of insect guts as well as in the fungi cell walls. The aim of this work was to express a chitinase (encoded by the ORF CV3316) from Chromobacterium violaceum ATCC 12472, using the methylotrophic yeast Pichia pastoris strains GS115 and KM71H. Furthermore, purification and partial characterization of the recombinant protein were also achieved. The GS115 strain carrying the expression cassette pPICZαA-CV3316 was selected due to its higher expression level as compared to KM71H strain. Immobilized metal ion affinity chromatography was employed to purify the recombinant chitinase which was eluted as a single peak at 0.04 M imidazol. The homogeneity of the purified protein was confirmed as judged by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In these conditions, the recombinant chitinase migrated as a single protein band with an apparent molecular mass of about 87 kDa. Thus, a chitinase from C. violaceum ATCC 12472 was successfully expressed in P. pastoris and the soluble recombinant protein purified. The content of secondary structure was investigated by circular dichroism (CD) spectroscopy. At 24 oC the CD spectrum revealed secondary structure contents of 37% (alpha helix), 26% (beta sheet) and 38% (random coil). The CD spectra obtained in the temperature range 10-50 oC were characteristic of beta sheet. In contrast, the CD spectra generated in the range 60-90 oC were characteristic of alpha helix. The midpoint temperature of this conformational transition was 59.6 1.2 oC as calculated from the CD experimental data. Fluorescence spectroscopy was carried out with excitation at 280 and 290 nm, producing emission spectra in which the wavelengths of maximum emission were 339 and 342 nm, respectively. This behavior is characteristic of tryptophan residues in limited contact with water. Chitinolytic activity against several substrates and the pH dependency of the enzymatic activity of the pure protein were all accessed. The purified enzyme showed hydrolytic activity on the following substrates: colloidal chitin (1,189.4 U.mgP-1), 4-nitrophenyl N-Nâ-diacetyl--D-chitobioside (30,411.0 U.mgP-1) and 4-nitrophenyl β-D-N-Nâ-Nâ-triacetylchitotriose (13,150.0 U.mgP-1); and, respectively. In contrast, no activity was detected using 4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide as substrate. The enzyme presented an optimal chitinolytic activity at pH 5.0 using colloidal chitin as a substrate. Additionally, the antifungal activity against the phytopathogenic fungi, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani and Penicillium herquei was investigated. The recombinant chitinase did not inhibit the spore germination and the mycelium growth of the tested fungi, at the 0.63 mgP.ml-1 concentration. Further studies should be carried out in order to discover potential applications of this protein as a biotechnological tool in the control of other phytopathogenic fungi as well as economically important pests.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-05-26T13:43:05Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ilítia Ganaê de Oliveira Costa - 2016.pdf: 5422422 bytes, checksum: da6f13721ce50902b9fe7d9ac3713ab5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-05-26T13:43:28Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ilítia Ganaê de Oliveira Costa - 2016.pdf: 5422422 bytes, checksum: da6f13721ce50902b9fe7d9ac3713ab5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-26T13:43:28Z (GMT). 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Four families are described to this superfamily: α-expansins, β-expansins, expansins-like A and expansins-like B. The α-expansins are present in most eudicots, whereas the β-expansins are involved in cellular expansion process of the monocots family Poaceae. To analyze the sequence and to verify the functional activity of a β-expansin on filter paper, in this work a gene of β-expansin (expb11) of sugarcane was isolated, cloned and expressed in the yeast Pichia pastoris. Nucleotide sequences of expansin genes from sugarcane were initially obtained from the public SUCEST database using reference sequences of expansins from sorghum, maize and rice as query. A total of 227 ESTs were identified. These ESTs were submitted to clustering and 30 contigs and 92 singletons were obtained. Specific oligos were designed and used to capture the genomic fragment corresponding to the expb11 gene by PCR. The coding DNA fragment of expb11 was obtained by RT-PCR from the total RNA extracted from stalks of the RB867515 sugarcane cultivar. This fragment was cloned into the pGEM-T Easy vector and subcloned into the pPIC9 vector. Genomic and cDNA fragments were sequenced. The expression cassette generated by subcloning into the pPIC9 expression vector was integrated into the P. pastoris strain GS115 genome, but it has not been possible to detect a functional activity of expansin. The expb11 gene comprises 1367 bp, containing 3 introns, and its cDNA is 801 bp long, with an ORF of 776 bp. The alignment of sugarcane and sorghum sequences of expb11 showed that the two species share a 95% sequence identity along these genes and that the gene structure is highly conserved in these species. The in silico analysis of the putative EXPB11 amino acid sequence allowed the detection of two conserved domains, one similar to the GH45 family, and the other to the carbohydrate binding module (CBM). The putative EXPB11 protein has a predicted molecular weight of approximately 26.4 kDa, an isoelectric point (pI) of 4.88, and contains two glycosylation sites. Our results confirmed that the isolated and cloned expb11 gene corresponds to a β-expansin gene from sugarcane, paving the way to the expression, isolation and use of recombinant EXPB11 in the mix of enzymes and proteins for lignocellulosic biomass degradation. / Nos últimos anos tem crescido a busca por novas fontes de energia renováveis, e uma das tecnologias utilizadas é a produção de etanol a partir da biomassa lignocelulósica (etanol de segunda geração). Para a obtenção de açúcares fermentáveis a partir dessa biomassa, é necessário um complexo de enzimas e proteínas que atuarão sobre os polissacarídeos da parede celular vegetal. As expansinas são proteínas que podem auxiliar as enzimas no processo de degradação, promovendo o afrouxamento da parede celular das plantas pelo rompimento de ligações de hidrogênio entre fibras de celulose e hemicelulose. A superfamília das expansinas foi descrita principalmente em plantas, entretanto, há relatos em fungos e bactérias. São descritas 4 famílias de expansinas: α-expansinas, β-expansinas, expansinas like-A e expansinas like-B. As α e β-expansinas já são caracterizadas, desempenhando importante função no crescimento vegetal. As α-expansinas são mais presentes em plantas dicotiledôneas, enquanto que as β-expansinas estão envolvidas no processo de expansão celular de monocotiledôneas da família Poaceae. Para analisar a sequência e verificar a atividade funcional de uma β-expansina sobre bagaço de cana-de-açúcar, neste trabalho foi isolado, clonado e expresso um gene de β-expansina (expb11) de cana-de-açúcar na levedura Pichia pastoris. A sequência de nucleotídeos do gene de β-expansina da cana-de-açúcar foi obtida a partir da biblioteca de cDNA de cana-de-açúcar do projeto SUCEST. Sequências de referências de expansinas de sorgo, milho e arroz foram utilizadas para identificar ESTs de expansinas no banco de dados SUCEST. Foram identificadas 227 ESTs. Essas ESTs foram submetidas à clusterização e foram obtidos 30 contigs e 92 singletons. Após o desenho de oligonucleotídeos, o fragmento genômico correspondente ao gene expb11 foi amplificado por PCR. A região codante do gene expb11 foi obtida por RT-PCR a partir de RNA total obtido de colmo da cultivar RB867515. Esse material foi clonado no vetor pGEM-T Easy e subclonado no vetor pPIC9. Os fragmentos genômico e cDNA obtidos foram analisados por sequenciamento. O cassete de expressão gerado pela subclonagem em vetor de expressão pPIC9 foi integrado no genoma de P. pastoris linhagem GS115, mas não foi possível detectar atividade funcional da expansina. O gene expb11 possui 1367 pb, contendo 3 íntrons, enquanto o cDNA 801 pb. Pelo alinhamento das sequências genômicas do gene expb11 obtidas de cana-de-açúcar e de sorgo, foi possível se observar que estes genes possuem 95 % de identidade, e estrutura de íntrons/éxons semelhantes. Pela análise in silico da sequência de aminoácidos da proteína EXPB11 foi possível verificar que ela possui dois domínios, um similar ao da família GH45, e outro similar ao módulo de ligação ao carboidrato (CBM). A proteína EXPB11 possui peso molecular de aproximadamente 26,4 kDa, pI 4,88, e contém dois sítios de glicosilação. Os resultados obtidos através das análises in silico mostraram que o gene expb11, isolado e clonado, corresponde a um gene de β-expansina de cana-de-açúcar, e ao ser produzida, a EXPB11 recombinante poderá integrar o mix de enzimas e proteínas para a degradação de biomassa lignocelulósica.

Uma das estratégias utilizadas no desenvolvimento de novas drogas envolve a descoberta de compostos que modulem a atividade de enzimas, importantes no processo infeccioso de patógenos. Uma abordagem interessante na triagem de novos ligantes é o uso de métodos baseados na imobilização de enzimas em suportes cromatográficos acoplados a sistemas de cromatografia líquida. O uso de IMERs (Immobilized Enzyme Reactors) como uma fase estacionária acoplado a sistemas de cromatografia líquida de alta eficiência consiste em uma estratégia para triagem de compostos rápida e eficiente e tem vantagens em relação ao uso de enzimas em solução. A enzima NTPDase-1 de Trypanosoma cruzi age como um facilitador da infecção do patógeno, inibindo assim a resposta imune do hospedeiro, permitindo uma infecção silenciosa, o que sugere seu uso como um bom alvo na busca por inibidores. Neste trabalho, a enzima NTPDase-1 foi imobilizada na parede interna de capilares de sílica fundida formando ICERs (Immobilized Capillary Enzyme Reactors). Estudos das condições de uso destes biorreatores juntamente com o desenvolvimento de um método cromatográfico multidimensional, foram realizados e validados. A otimização do método cromatográfico e sua validação, apresentaram ótimos resultados em relação aos valores obtidos para os parâmetros avaliados para métodos bioanalíticos. A imobilização da enzima foi realizada com sucesso, sendo possível a detecção da atividade catalítica no sistema cromatográfico (TcNTPDase1-ICER). Foi realizado também, o estudo cinético para ATP no TcNTPDase1-ICER, obtendo-se KM de 0,317 ± 0,044 mM, que comparado com estudos em solução, KM de 0,096 mM, ainda apresenta grande afinidade pelo substrato. / One of the strategies used in the development of new drugs involves the discovery of compounds that modulate the activity of enzymes, important in the infectious pathogens process. An interesting approach in the screening of new ligands is the use of methods based on immobilization of enzymes in chromatographic supports coupled to liquid chromatography systems. The use of IMERs (Immobilized Enzyme Reactors) as a stationary phase coupled to high performance chromatographic systems consist in a strategy to a fast and efficient compounds screening and it has advantages comparing to the use of enzymes in solution. The enzyme NTPDase-1 Trypanosoma cruzi acts as a pathogen infection facilitator, thus inhibits the host immune response allowing a silent infection, suggesting its use as a good target in the search for inhibitors. In this paper, the enzyme NTPDase-1 was immobilized for the manufacturing of ICERs (Immobilized Capillary Enzyme Reactors). Studies of conditions to the use of these bioreactors in the ligands screening along with the development of a multidimensional chromatographic method were performed and validated. The chromatographic method optimization and validation, presented excellent results, relating to the obtained values, from evaluated parameters in bioanalytical methods. The enzyme immobilization was successfully performed, being possible to detect the catalytic activity in the chromatographic system (TcNTPDase1-ICER). The kinetic study for the substrate ATP was also performed in the TcNTPDase1-ICER, obtaining KM of 0.317 ± 0.044 mM, which in comparison with studies in solution KM of 0.096 mM, still presents high affinity for the substrate.

As serinoproteases de peçonha de serpentes (SVSPs) agem sobre pontos específicos do sistema circulatório, sendo consideradas promissoras para o tratamento de uma diversidade de desordens hemostáticas. No presente estudo, é descrita a expressão de uma serinoprotease de Crotalus durissus collilineatus (Collineina-1) em Pichia pastoris, bem como a purificação dessa toxina a partir da peçonha de C. d. collilineatus e a caracterização estrutural e enzimática da Collineina-1 nas formas nativa e recombinante. O cDNA que codifica a serinoprotease foi amplificado a partir da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha de C. d. collilineatus e ligado ao vetor pPICZ A. A linhagem KM71H de P. pastoris foi transformada com o plasmídeo recombinante e as colônias foram selecionadas por resistência à zeocina. A expressão heteróloga foi realizada em meio mínimo suplementado com metanol, resultando em um rendimento de 56 mg de proteína por litro de cultura. A proteína recombinante foi purificada por um protocolo baseado em técnicas cromatográficas de troca iônica e fase reversa. A purificação da serinoprotease a partir da peçonha de C. d. collilineatus foi realizada pela combinação de técnicas de cromatografia de exclusão molecular, troca iônica e fase reversa, e resultou no isolamento de duas isoformas, denominadas Collineina-1 e 2. Quando analisada por espectrometria de massas, a Collineina-1 recombinante apresentou massa molar de 28.868 Da, enquanto as enzimas Collineina-1 e 2 apresentaram massas de 29.475 Da e 29.388 Da, respectivamente. A partir do alinhamento das sequências parciais das serinoproteases, foi possível determinar 100% de identidade dos aminoácidos para a Collineina-1 nativa e recombinante. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida de aminoácidos da Collineina-1 indica uma semelhança estrutural dessa proteína com outras serinoproteases de peçonha de serpente. As enzimas nativa e recombinante mostraram efeitos similares sobre fibrinogênio bovino por clivarem preferencialmente a cadeia A do fibrinogênio, liberando o fibrinopeptídeo A. Ambas as enzimas induziram a coagulação do plasma bovino de forma dose-dependente, sendo que a Collineina-1 recombinante apresentou maior potencial coagulante, com uma dose mínima coagulante (DMC) de 0,08 mg/uL contra 0,225 mgu/L para a proteína nativa. As serinoproteases foram capazes de hidrolisar os substratos cromogênicos S-2222, S-2238 e S2302, embora ambas as enzimas tenham demonstrado maior atividade sobre o substrato S-2302. A atividade esterásica sobre o TAME foi avaliada em diferentes condições de temperatura e na presença de íons divalentes. As duas enzimas demonstraram alta termoestabilidade e tiveram a atividade inibida na presença dos íons Zn2+ e Cu2+. A cinética enzimática de ambas as serinoproteases seguiram o modelo de Michaelis-Menten. A Collineina-1 nativa apresentou um valor de Km de 1,43 mM, contra 1,682 mM para a proteína recombinante, indicando que a proteína nativa apresenta maior afinidade pelo substrato TAME. No entanto, as enzimas apresentaram valores similares de Kcat/Km (250,69 mM.min-1 para a Collineina-1 e 248,03 mM.min-1 para a rCollineina-1), sugerindo que as serinoproteases não diferem significativamente na eficiência em hidrolisar o substrato. Estes resultados demonstraram a adequação do sistema de escolha na produção heteróloga da Collineina-1, já que a proteína recombinante foi expressa com integridade funcional sobre os parâmetros avaliados. / Snake venom serine proteases (SVSPs) act on specific points of the circulatory system and are promising for the treatment of a variety of hemostatic disorders. In the present study, we describe the expression of a serine protease from Crotalus durissus collilineatus (Collineina- 1) in Pichia pastoris, the purification of the native toxin from C. d. collilineatus venom and the structural and enzymatic characterization of Collineina-1 in native and recombinant forms. The cDNA encoding the serine protease was amplified from cDNA library of C. d. collilineatus venom gland and cloned into pPICZ A vector. KM71H P. pastoris strain was transformed with the recombinant plasmid and colonies were selected by zeocin resistance. Heterologous expression was carried out in minimal medium supplemented with methanol, resulting in a yield of 56 mg of protein per liter of culture. The recombinant protein was purified by ion exchange and reverse phase chromatography. Purification of the native serine protease was accomplished by combining techniques of molecular exclusion, ion exchange and reversed phase, and resulted in the isolation of two isoforms, named Collineina-1 and 2. When analyzed by mass spectrometry, the recombinant Collineina-1 showed a molar mass of 28,868 Da, while Collineina-1 and 2 presented masses of 29,475 and 29,388 Da, respectively. The alignment of partial sequences of the enzymes resulted in 100% of amino acid identity between native and recombinant Collineina-1. The multiple alignment of deduced amino acid sequence of Collineina-1 indicates structural similarity with other snake venom serine proteases. The native and recombinant forms of the enzyme showed similar effects on bovine fibrinogen by cleaving preferentially A chain, releasing fibrinopeptide A. Both enzymes induced coagulation of bovine plasma in a dose-dependent way, though recombinant Collineina-1 presented a higher coagulant potential, with a minimum coagulant dose (MCD) of 0.08 mg/uL against 0.225 mg/uL for the native form. The serine proteases hydrolyzed S- 2222, S-2238 and S2302 chromogenic substrates, although both enzymes demonstrated increased activity upon S-2302. The esterase activity on TAME was evaluated at different temperatures and in the presence of divalent ions. Both enzymes showed high thermostability and their activity were inhibited in the presence of Zn2+ and Cu2+. The enzyme kinetics of both serine proteases followed Michaelis-Menten model. The native Collineina-1 showed a Km value of 1.43 mM, against 1.682 mM for the recombinant form, indicating that the native protein has a higher affinity for TAME substrate. However, enzymes had similar values for Kcat/Km (250.69 mM.min-1 for Collineina-1 and 248.03 mM.min-1 for rCollineina-1), suggesting that the serine proteases did not differ significantly in the efficiency to hydrolyze the substrate. These results demonstrated the adequacy of the system of choice in producing the snake venom serine protease, since the recombinant protein was expressed with functional integrity on the evaluated parameters.

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T16:05:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Temer_Beatriz_M.pdf: 9784134 bytes, checksum: 1bdd018cb932c19745ec5d68cf0f0755 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Um dos principais desafios a serem superados para que a produção de etanol lignocelulósico seja viável é a obtenção de um micro-organismo capaz de fermentar pentoses e hexoses de maneira eficiente. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o principal micro-organismo utilizado nas fermentações industriais, devido à sua alta eficiência no consumo de glicose e tolerância às altas concentrações de etanol. Entretanto, linhagens selvagens dessa levedura não são capazes de consumir pentoses naturalmente. Desta maneira, a expressão heteróloga de genes que possibilitem o consumo de pentoses em S. cerevisiae é uma abordagem interessante que vem sendo desenvolvida por diversos grupos de pesquisa. A xilose é o açúcar de cinco carbonos presente em maior porcentagem nos materiais lignocelulósicos e é consumida pelos organismos através de duas vias principais, a via da xilose isomerase (XI) e a via oxi-redutiva. A bactéria Propionibacterium acidipropionici, industrialmente interessante por produzir ácido propiônico, foi estudada neste trabalho com relação à sua capacidade de consumir xilose. A partir dos ensaios de fermentação realizados, foi possível comprovar que ela é capaz de consumir este açúcar na msma proporção que a glicose. A análise de dados genômicos de P. acidipropionici indicou que a via da XI é a utilizada para o consumo de xilose. Assim, o gene xylA, que codifica a XI de P. acidipropionici, foi expresso em uma linhagem industrial de S. cerevisiae. Após a realização de testes fermentativos foi possível constatar que a linhagem construída não apresentou consumo de xilose. Apesar da expressão do gene xylA ser comprovada, não foi possível detectar atividade enzimática da XI, resultados que fornecem indícios de que a proteína pode não estar sendo sintetizada ou, caso esteja sendo sintetizada, não é funcional. Mais de 36 XIs provenientes de organismos diferentes já foram expressas em S. cerevisiae, dentre essas apenas 12 foram funcionalmente expressas. As causas da não funcionalidade na maioria das tentativas de expressão heteróloga das XIs são desconhecidas. Entretanto, alguns trabalhos afirmam que esse fenômeno pode estar relacionado ao enovelamento incorreto da xilose isomerase em S. cerevisiae. Desta forma, a expressão de genes que codificam chaperonas específicas é uma estratégia promissora para a obtenção de uma xilose isomerase funcional / Abstract: One of the main challenges to be overcome to enable the production of lignocellulosic ethanol is the development of a microorganism capable of fermenting pentoses and hexoses efficiently. Currently the yeast Saccharomyces cerevisiae is the main microorganism used in industrial fermentations due to its high efficiency in glucose uptake and tolerance to high concentrations of ethanol; however, it is not able to consume pentoses naturally. Thus the heterologous expression of genes that allow the pentose consumption in S. cerevisiae is an interesting approach that has been developed by several research groups. Xylose is the main component in lignocellulosic biomass, and is consumed by organisms through two main pathways, the xylose isomerase (XI) pathway and the oxy-reductive pathway. The bacterium Propionibacterium acidipropionici is industrially interesting for its production of propionic acid, and was studied in this work with respect to its ability to consume xylose. Fermentation assays conducted proved that these bacteria can consume xylose in the same proportion as glucose. The analysis of genomic data from P. acidipropionici indicated that the XI pathway is used to ferment xylose, in this manner the xylA gene encoding this species XI was expressed in an industrial strain of S. cerevisiae. After conducting fermentation tests it was found that the strain developed was not able to consume xylose even though the XI gene was expressed in the yeast. Moreover, it was not possible to detect enzymatic activity of XI, indicating that the protein is probably not being synthesized or it is not functional. Over 36 XIs from different organisms have been expressed in S. cerevisiae, among these only 12 were functionally expressed. The causes of non-functionality in most attempts at heterologous expression of the XIs are unknown, however, some studies claim that this event may be related to the absence of chaperones, which assist the correct folding of proteins. Thus the expression of genes that encode specific chaperone is a promising strategy to obtain functional expression of these XIs / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Um dos eventos mais importantes durante o amadurecimento da banana é a degradação do amido, concomitante com o acúmulo de açúcares solúveis. Várias enzimas, que supostamente atuam na degradação do amido, já tiveram sua atividade/proteína específica detectadas nesta fase na banana. Entre elas a α-amilase, a β-amilase, as amido-fosforilases, as α-glicosidases e as isoamilases. A síntese do amido e, normalmente, sua degradação, ocorrem dentro do amiloplasto, que possui duas membranas a serem transpostas antes do acesso ao grânulo de amido ou aos produtos da ação de outras enzimas. Uma das isoformas da β-amilase em banana possui um peptídeo de transporte predito em sua seqüência, necessário para transpor estas membranas e entrar no amiloplasto. Uma maneira de contornar a dificuldade em estabelecer a real importância de cada enzima na degradação do amido é isolar os grânulos e as enzimas e submetê-lo à atividade seqüencial das enzimas supostamente responsáveis pela degradação. O ideal é utilizar a enzima endógena, mas o processo de purificação de enzimas em frutos é demorado e nem sempre bom em termos de pureza, quantidade e atividade. Estudos baseados na expressão heteróloga de genes da β-amilase permitiriam melhor compreender os mecanismos de atuação dessa enzima presente na polpa da banana. Assim, foram feitos ensaios de expressão heteróloga em Pichia pastoris na tentativa de produzir essa enzima em quantidade suficiente para purificação, aplicação nos grânulos de amido e produção de anticorpos policlonais. Foram testadas várias condições de indução da proteína, tais como aeração, temperatura, pH, concentração de metanol e tempo de indução, bem como a montagem de uma nova construção gênica com tag de histidina no vetor de expressão pPICZαA com confirmação do fenótipo dos transformantes positivos. Porém, a obtenção de β-amilase recombinante com atividade não foi bem sucedida, necessitando talvez de alterações nesses padrões de indução. / One of the most important events that occurs during ripening of banana is the starch degradation concomitantly with the accumulation of soluble sugars. Several enzymes, known by acting on starch degradation, had their activity and/or specific protein detected at this stage of banana. These include the α-amylase, the β-amylase, the starch-phosphorylases, the α-glucosidase and the isoamilases. The synthesis and starch degradation occur inside of the amyloplast that contain two membranes which has to be reach before accessing the starch granule or the products of the other enzymes. One of the isoforms of β-amylase in bananas has a transit peptide predicted in the sequence, required to access the amyloplast. To establish the real importance of each enzyme in the starch degradation it is necessary to isolate the granules and enzymes and submit them to the sequential activity to confirm the supposed degradation. The idea is to use the endogenous enzyme, but the process of purification of the enzyme in fruits demands a lot of time and the results of purity, quantity and activity are not guaranteed. Studies based on heterologous expression of the β-amylase genes allow us to understand the mechanisms of action of this enzyme present in the pulp of banana. Thus, tests were carried out with heterologous expression in Pichia pastoris in order to produce this enzyme in sufficient quantity to purification, and then, applied on starch granules and produce a polyclonal antibody. We tested different conditions of protein induction such as aeration, temperature, pH, methanol concentration and induction time, as well as the new genic construction with the histidine tag with an expression vector pPICZαA confirming the phenotype of positive transformants. However, recombinant β-amylase with activity was not obtained successfully, necessitating changes in these patterns of induction.

Content: Unhairing process brought serious pollution, and enzyme application for replacing polluting chemicals in unhairing process attracted much attention in recent years. However, the unhairing enzymes haven’t been accepted widely in actual production due to low purity, complex composition and poor stability. To solve these problems, unhairing enzyme is suggested to be improved by genetic modification in this research. The High-keratinase-producing gene (KerT), which was extracted from B. amyloliquefaciens TCCC11319, was introduced into the B.subtilis WB600 by heterologous expression. Because Bacillus subtilis WB600 is deficient in six extracellular proteases, this process successfully reduced the collagenolytic protease content in crude broth as well as improved the keratinase content. Meantime, the recombinant KerT produced by B.subtilis WB600 had the obviously unhairing effect to remove hairs. The results showed that the collagen degradability of recombinant KerT was slightly and it did not cause any adverse effects on the hide quality. This research will contribute to the development of unhairing enzyme, and the novel unhairing enzyme might be applied as the key factor for the advanced cleaning biotechnology in leather production process. Take-Away: 1. The keratinase gene KerT was firstly reported and analyzed which was extracted from B. amyloliquefaciens TCCC11319. 2. The collagenolytic protease activity of unhairing enzyme was successfully inhibited by heterologous expression of kerT. 3. The unhairing effect of this novel unhairing enzyme was similar to current Sulphur-lime method without damaging hide structure.