Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Marília Freitas (marilia@bce.unb.br) on 2015-10-29T12:33:32Z No. of bitstreams: 1 2014_NestorFabianLeytonCastro.pdf: 3484643 bytes, checksum: 3f92622240d0f7e59822aca3974ed379 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-02-12T21:00:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_NestorFabianLeytonCastro.pdf: 3484643 bytes, checksum: 3f92622240d0f7e59822aca3974ed379 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-12T21:00:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_NestorFabianLeytonCastro.pdf: 3484643 bytes, checksum: 3f92622240d0f7e59822aca3974ed379 (MD5) / A hipóxia ocorre quando as células são expostas a baixas tensões (< 5%) de oxigênio. Isto afeta o metabolismo, a expressão de genes, a secreção e resposta a hormônios e pode garantir a sobrevivência ou algumas vezes iniciar uma cascata apoptótica. O fator 1 induzível por hipóxia (HIF-1) humano regula a transcrição de inúmeros genes envolvidos na resposta à hipóxia e tem importante papel em processos fisiológicos e patológicos. Ele é um heterodímero formado pelas subunidades HIF-1α e HIF-1β, também chamada de transportador nuclear de arilhidrocarbono (ARNT). Em condições de normóxia, o HIF-1 é hidroxilado pelas prolilhidroxilases (PHDs) e marcado para degradação pelo proteasoma. Porém, quando as células se encontram sob hipóxia, as PHDs são inibidas e assim ocorre o acúmulo do HIF-1. Alterações no estado redox podem ter efeito na ativação do HIF-1 e foi verificado que condições de estresse oxidativo podem levar à ativação deste fator. O estresse oxidativo ocorre quando as moléculas antioxidantes e os mecanismos de defesa celular são incapazes de proteger a célula dos efeitos das espécies reativas de oxigênio (EROs) as quais atacam moléculas biológicas vitais, tais como lipídeos, DNA dentre outras. As EROs incluem os radicais livres derivados de oxigênio, entre essas o íon superóxido (O2●-), o radical hidroxila (●OH-), e outras moléculas que embora não possuam elétrons livres são muito reativas devido à sua instabilidade, como o peróxido de hidrogênio (H2O2). Para estudar os efeitos do HIF-1 sob condições de estresse oxidativo, escolhemos a levedura Saccharomyces cerevisiae, também conhecida como levedura de padeiro. A utilização da levedura S. cerevisiae tem provado ser muito útil como um modelo de sistema in vivo para estudar a ação de fármacos, a expressão de proteínas heterólogas e a função básica de fatores de transcrição humanos. Foram usadas três linhagens mutantes, EG103αβ a qual expressa as duas subunidades do fator de transcrição HIF-1, EG103αΔβ que expressa a subunidade beta truncada e a linhagem EG103M2 que possue o vetor vazio. O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta ao estresse oxidativo dessas linhagens de leveduras para aprofundar o conhecimento sobre a regulação da atividade de HIF-1. O crescimento das linhagens foi investigado e os resultados mostraram que a linhagem EG103αβ teve um crescimento menor que as outras duas linhagens (EG103αΔβ e EG103M2) em normóxia. Quando tratada com várias concentrações de H2O2 o crescimento da linhagem EG103αβ diferiu do controle não tratado somente nas concentrações de 1 e 2 mM, quando houve uma diminuição do crescimento. Essa resposta foi similar àquela das outras duas linhagens. Então não foi uma resposta específica da linhagem EG103αβ, indicando que a expressão do HIF-1 não alterou a sensibilidade da resposta ao H2O2. Ao tratar as células com alguns agentes oxidantes como Menadiona (MD), hidroperóxido de cumene (CHP) e terc-butilhidroperóxido (t-BHP) os resultados mostraram que a linhagem EG103αβ apresentava uma susceptibilidade menor à MD na concentração 50 μM, em comparação com as outras linhagens. O uso do inibidor da catalase ATZ (10 mM) e H2O2 0,5 mM mostrou que a susceptibilidade da linhagem EG103αβ aumentou em relacão ao controle tratado somente com H2O2. Nas duas outras linhagens o aumento da susceptibilidade ocorreu com uma concentração menor de ATZ (2 mM) e H2O2 0,5 mM. Isto indica que talvez a linhagem EG103αβ tenha maiores concentrações de catalase em relação às outras duas linhagens. O uso do inibidor da síntese de glutationa, butionina-sulfoximina (BSO) não mostrou uma resposta diferenciada da linhagem EG103αΔβ à exposição ao H2O2. O uso do quelante de ferro, deferoxamina (DFO) também mostrou uma ação de proteção contra o dano oxidativo na linhagem EG103αβ, indicando um papel da ausência de ferro na proteção pelo HIF-1. Medidas dos níveis de glutationa (GSH-eq) e da enzima superóxido dismutase devem ser repetidas para conclusão definitiva de seu papel na linhagem EG103αβ. Em conclusão, os resultados indicam que a expressão das subunidades que compõem o HIF-1 humano em leveduras reduz seu crescimento, aumenta sua resistência à menadiona e talvez os níveis de catalase e faz com que um quelante de ferro tenha papel protetor nestas células. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Hypoxia occurs when cells are exposed to low oxygen tensions (<5%). It affects the metabolism, gene expression, secretion and response to hormones and can ensure the survival or sometimes initiate an apoptotic cascade. The human hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) regulates the transcription of numerous genes involved in the response to hypoxia and plays an important role in physiological and pathological processes. HIF-1 is a heterodimer formed by the HIF-1α and HIF-1β subunits, the latter also called arylhydrocarbone nuclear transporter (ARNT). In normoxic conditions, HIF-1 is hydroxylated by prolylhidroxilases (PHDs) and marked for degradation by the proteasome. However, when cells are under hypoxia, the PHDs are inhibited and HIF-1 accumulates. Changes in the redox state may have an effect on HIF-1 activation and oxidative stress conditions have been to lead to the activation of this factor. Oxidative stress occurs when the antioxidant molecules and cellular defense mechanisms are unable to protect the cell from the effects of reactive oxygen species (ROS) which attack vital biological molecules such as lipids, DNA and others. ROS include free radicals derived from oxygen, among these the superoxide ion (O2●-), o hydroxyl radical (●OH-), and other molecules that although not having free electrons are very reactive due to its instability, such as hydrogen peroxide (H2O2). To study the effects of HIF-1 under conditions of oxidative stress, we chose the yeast Saccharomyces cerevisiae, also known as Baker's yeast. The use of S. cerevisiae has proven to be very useful as an in vivo model system to study the action of drugs, the expression of heterologous proteins and the basic function of human transcription factors. The three mutant strains, EG103αβ which expresses the two subunits of HIF-1 transcription factor, EG103αΔβ, expressing the truncated beta subunit and EG103M2 strain that possesses an empty vector were used. The objective of this study was to evaluate the oxidative stress response of the yeast strains to increase knowledge about the regulation of HIF-1 activity. The growth of the strains was investigated and the results showed that the strain EG103αβ had a slower growth than the other two strains (EG103αΔβ and EG103M2) under normoxia. When treated with various concentrations of H2O2 the growth of EG103αβ differed from the untreated control only at concentrations of 1 and 2 mM, when there was a decline in growth. This response was similar to that of the other two strains. So it was not a specific response of EG103αβ, indicating that HIF-1 expression did not change the sensitivity response to H2O2. By treating the cells with certain oxidizing agents such as Menadione (MD), cumene hydroperoxide (CHP) and tert-butylhydroperoxide (t-BHP) the results showed that the strain EG103αβ has lower susceptibility to 50 uM MD concentrations, compared to the other strains. The use of the catalase inhibitor ATZ (10 mM) and 0.5 mM H2O2 showed that the susceptibility of EG103αβ increased compared to the control treatment only with H2O2. In the other two strains increased susceptibility was observed with a smaller concentration of ATZ (2 mM) and 0.5 mM H2O2. This indicates that EG103αβ has higher catalase levels in comparison to the other two strains. The use of the inhibitor of glutathione synthesis, buthionine sulfoximine (BSO) showed that EG103αΔβ responded similarly to the other two strains. The use of the iron chelator, deferoxamine (DFO) showed a protective effect against oxidative damage in EG103αβ, indicating a role of iron absence in the protection by HIF-1. Measures of glutathione levels (GSH-eq) and superoxide dismutase should be repeated for definitive conclusion of their role in the EG103αβ lineage. In conclusion, the results indicate that the expression of the subunits that make up the human HIF-1 reduces yeast growth, increases its resistance to menadione and perhaps levels of catalase and makes an iron chelator a protective agent in these cells.

Made available in DSpace on 2016-08-12T18:48:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-26. Added 1 bitstream(s) on 2016-08-12T18:50:54Z : No. of bitstreams: 1 000865249_20170310.pdf: 411293 bytes, checksum: f8c1d02bfb772bbd81e4a7df20358928 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-03-10T13:07:29Z: 000865249_20170310.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-03-10T13:08:14Z : No. of bitstreams: 1 000865249.pdf: 1415116 bytes, checksum: f43ae6a121d2b64591e3365fbace0d36 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Durante a gravidez diabética, a hiperglicemia materna pode prejudicar o desenvolvimento embrionário por uma associação de hipóxia e estresse oxidativo. Deste modo, nossa hipótese é de que a combinação desses mecanismos esteja envolvida no desenvolvimento pancreático alterado. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do estresse oxidativo e hipóxia no organismo materno sobre o desenvolvimento pancreático fetal em condições hiperglicêmicas. Foram utilizados ratos da linhagem Wistar que foram aleatoriamente distribuídos em: Controle (C); Diabete moderado (DM) e Diabete grave (DG). O diabete foi induzido em ratos pela administração de streptozotocin. As ratas foram acasaladas e, no 18º e 21º dias de prenhez, foram avaliados parâmetros como hiperglicemia e marcadores de hipóxia e de estresse oxidativo maternos. Nos mesmos momentos, os fetos foram coletados para análise das ilhotas pancreáticas. Foram encontradas alterações na tríade hormonal (insulina, glucagon e somatostatina) e marcadores de proliferação celular (PDX-1 e ki67) e morte celular (caspase-3). Essas alterações foram mais evidentes nos fetos advindos do grupo diabete grave. Além disso, a morfologia das ilhotas pancreáticas fetais e localização correta das células endócrinas foram claramente alteradas. Também houve correlação positiva entre glicemia, estresse oxidativo e hipóxia no organismo materno dos grupos diabéticos. Estes mecanismos também foram positivamente correlacionados com a redução no número de ilhotas e de células por ilhota nos descendentes. Portanto, a presença de estresse oxidativo e hipóxia, induzidos por alterações glicêmicas maternas, causou prejuízo no desenvolvimento pancreático fetal. Este fato demonstra que é necessário um rígido controle glicêmico materno para prevenir complicações embriofetais e perinatais / In diabetic pregnancy, hyperglycemia may impair embryonic development by a combination of hypoxia and oxidative stress. Therefore, we hypothesized that a combination of these factors was involved in the impaired pancreatic development in the offspring. Thus, the objective of the present study was to evaluate maternal oxidative stress and hypoxia status on fetal pancreatic development in hyperglycemic conditions. Wistar rats were randomly assigned into three groups: control (C); mild diabetes (MD) and severe diabetes (SD). Diabetes was induced by the beta-cytotoxic drug (streptozotocin) in rats. The female rats were mated and at days 18 (early period of maximum fetal development) and 21 (at term) of pregnancy the maternal hyperglycemia, hypoxia and oxidative stress markers were evaluated. In the fetus, the pancreatic islets were analyzed. The results showed alterations in pancreatic hormone triad (insulin, glucagon and somatostatin), beta cell marker (PDX-1), proliferation (ki67) and apoptosis (caspase-3), which were more pronounced in the SD group. Furthermore, the morphology of the fetal pancreatic islets was clearly changed. There was a positive correlation between blood glucose, oxidative stress and hypoxia of the mothers and the reduction in the number of islets and number of cells per islet in the fetuses from the diabetic groups. Therefore, oxidative stress and hypoxia induced by maternal hyperglycemia led to impairment of fetal pancreatic development. These observations indicate that a rigid glycemic control in diabetic pregnancy is required to prevent the embryofetal and perinatal complications / FAPESP: 11/23642-2

Orientador: Marlos Gonçalves Sousa / Banca: Aparecido Antonio Camacho / Banca: Patrícia Mendes Pereira / Resumo: Este trabalho teve como objetivo caracterizar os valores sanguíneos de lactato em cães com degeneração valvular mitral em fases distintas da doença e correlacioná-los com as variáveis eletrocardiográficas, radiográficas, ecodopplercardiográficas e de pressão arterial, averiguando o seu valor como indicador diagnóstico da hipoperfusão tecidual em cães com insuficiência cardíaca. Foram avaliados 44 cães, distribuídos em grupo controle, composto por cães hígidos e os grupos Ia, Ib, II e IIIa, compostos por cães com insuficiência cardíaca congestiva classe Ia, Ib, II e IIIa respectivamente. A análise das concentrações séricas de lactato identificou valores estatisticamente superiores nos cães da classe II comparativamente aos animais controle, o mesmo ocorrendo com os animais da classe IIIa comparativamente aos animais controle, classe Ia e classe Ib. Contudo, os cães da classe II apresentaram resultados semelhantes aos animais incluídos na classe Ia e Ib e os cães da classe IIIa não apresentaram quaisquer diferenças significativas com os animais classe II. Houve correlação positiva do lactato sanguíneo e diâmetro interno do ventrículo esquerdo, fração de encurtamento e relação átrio esquerdo/aorta. Da mesma forma, identificou-se correlação positiva entre o lactato sanguíneo e frequência cardíaca, VHS e amplitude da onda P. Foi observada correlação negativa do lactato sanguíneo com a pressão arterial sistólica. Na análise de sensibilidade e especificidade o lactato jugular apresentou a maior área sob a curva ROC, sendo identificada a concentração de lactato sanguíneo de 3,25 mmol/L como a de maior sensibilidade e especificidade para diferenciar cães saudáveis de cães com ICC. Os resultados mostram que o lactato sanguíneo aumenta à medida que progride o quadro de insuficiência cardíaca congestiva / Abstract: This study was aimed at characterizing the concentration of serum lactate in dogs with varying stages mitral valve degeneration, searching for a correlation between such parameter and the electrocardiographic, radiographic, echocardiographic and blood pressure data, as to investigate its value as a diagnostic indicator of tissue hypoperfusion in dogs with heart failure. The analyses of the serum concentration of lactate disclosed results estatistically higher in dogs belonging to CHF class II as compared to control animals, as well as between class IIIa dogs as compared to controls, class Ia, and class Ib dogs. However, the results of class II dogs were similar to those of classes Ia and Ib animals. Also, no difference was documented between the results of classes II and IIIa dogs. A positive correlation was identified between serum lactate concentration and the left ventricular internal diameter, fractional shortening, and left atrium-to-aorta ratio. A positive correlation was also observed between serum lactate and mean heart rate, VHS, and P wave amplitude. A negative correlation was documented between serum lactate and systolic blood pressure. A larger area under the ROC curve was disclosed for the jugular lactate, which showed the concentration of 3,25 mmol/L to provide the highest sensibility and specificity in differentiating healthy dogs from those presenting CHF. The results support that blood lactate increases as heart failure worsens / Mestre

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Infant human brains show hypomyelination, astrogliosis and impairments in cortical development after perinatal hypoxic-ischemic insults. Robinson and colleagues, using a model of hypoxia-ischemia (HI) in which they clamped the uterine arteries of pregnant rats, showed astrogliosis, oligodendroglial death and axonal rupture in the offspring. In this work we evaluated the expression of 23 cyclic nucleotide 3 phosphodiesterase (CNPase) in motor cortex and cerebellum and the NADPHdiaphorase (NADPH-d) distribution in the cerebellum of rats submitted to this HI model. Rats in the 18th gestation day were anesthetized, the uterine horns were exposed and the four uterine arteries were clamped for 45 minutes. Sham controls had the uterine horns exposed, but no arteries were clamped. Gestation proceeded after surgery. Only full term animals were used. A third group of animals were not submitted to the surgical procedure (NM). Animals were anesthetized and perfused with 4% paraformaldehyde at 9, 23 and 90 days. Coronal prosencephalus and parassagital cerebellum sections were submitted to CNPase immunohistochemistry. Additionally, parassagital cerebellum sections were submitted to NADPH-d hystochemistry. We observed a decrease in CNPase immunoreactivity in the cingulum of HI animals at all ages compared with NM and Sham animals. At P9 a lower number of CNPase+ cells in the cingulum and motor cortex of HI animals was observed. At P23 we observed a lower number of CNPase+ cells and fibers in the motor cortex and a greater number of cells in the cingulum of HI animals. A lower number of CNPase+ fibers were observed in the HI animals in the motor cortex at P90. In the cerebellum, at P9, CNPase+ fibers and cells were observed in more distal positions in the folium 1 of Sham and NM than in HI animals. The immunoreactivity to CNPase was altered in the white matter and in the fibers in the gray matter of HI animals at P23 and P90. The cerebelar white matter of HI animals showed a greater number of NADPH-d+ cells than that of control groups at both P9 and P23. At P23 the labeling was observed in the body as well as in the processes. Purkinje cells of Sham animals showed NADPH-d+ labeling in the body and dendritic arborization at folium 1, meanwhile animals of HI group did not show this labeling in the body, but the dendritic arborization had a widespread strong labeling. HI animals at P23 showed NADPHd+ cells in the molecular layer of cerebellum folia 1, 6 and 10. Sham or NM animals did not show NADPH-d+ cell in this region. This pattern was maintained up to P90. Our results showed impairments in oligodendroglial cells that may have been caused by reductions in the number of progenitors, alterations in migration patterns and/or delays in differentiation. We also showed that perinatal HI altered the distribution of NADPH-d+ cells during cerebelar development and that some alterations persist into adulthood, which suggests a permanent impairment. These alterations could lead to motor deficits in young adult HI rats, which, if present, could be used in devising new therapeutic strategies. / Crianças que sofrem insultos hipóxico-isquêmicos perinatais têm hipomielinização, astrogliose e desenvolvimento cortical alterado. Robinson e cols., usando um modelo de hipóxia-isquemia (HI) por obstrução das artérias uterinas na rata grávida, mostraram astrogliose, morte de oligodendrócitos e ruptura axonal na prole. Neste trabalho avaliamos a expressão de 23nucleotídeo 3fosfodiesterase (CNPase) no córtex e cerebelo e a distribuição da NADPH-diaforase (NADPH-d) no cerebelo de ratos submetidos a este modelo de HI. Ratas no 18 dia de gestação foram anestesiadas, os cornos uterinos expostos e as 4 artérias uterinas obstruídas por 45 minutos (Grupo HI). Animais controle tiveram os úteros expostos sem sofrer a obstrução (Grupo Sham). Após a cirurgia a gestação prosseguiu. Somente animais nascidos a termo foram utilizados. Um terceiro grupo de animais não foi operado (Grupo NM). Após anestesia e perfusão-fixação com paraformaldeído 4% aos 9, 23 e 90 dias pós-natais, cortes coronais do prosencéfalo e parassagitais do cerebelo foram obtidos em criótomo e submetidos à imunohistoquímica para CNPase. Adicionalmente, cortes parassagitais do cerebelo obtidos em criótomo foram submetidos à histoquímica para NADPH-d. Observamos uma diminuição da imunorreatividade à CNPase no cingulum dos animais HI comparados aos animais NM e Sham em todas as idades. Em P9, nos animais HI, há menor número de células CNPase+ no cingulum e córtex motor. Aos 23 dias, há um menor número de células e fibras CNPase+ no córtex motor e mais corpos celulares no cingulum dos animais HI. Aos 90 dias, os animais HI apresentaram menos fibras no córtex motor que os animais controle. No cerebelo, observamos corpos celulares e fibras CNPase+ em regiões mais distais na folha 1 nos animais NM e Sham que nos animais HI aos 9 dias. A imunorreatividade à CNPase estava alterada na substância branca e nas fibras na substância cinzenta nos animais HI tanto aos 23 quanto aos 90 dias. A substância branca nos animais HI apresentaram maior numero de células marcadas para NADPH-d que os animais controle aos 9 e 23 dias, sendo que em P23 a marcação se encontrava tanto no corpo celular quanto nos prolongamentos. As células de Purkinje na folha 1 apresentaram marcação para NADPH-d+, tanto no corpo celular quanto na árvore dendrítica, nos animais NM e Sham, enquanto nos animais HI somente a árvore dendrítica apresentava marcação. Animais do grupo HI aos 23 dias apresentaram células NADPH-d+ na camada molecular das folhas 1, 6 e 10, sendo que animais dos grupos controle não apresentaram células NADPH-d+ nesta região. Este padrão de marcação se manteve nos animais adultos (P90). Nossos resultados mostram alterações na oligodendroglia que podem ser causadas por um menor número de células progenitoras, problemas na migração aos destinos finais e/ou atraso na diferenciação. Mostramos também que a HI perinatal altera a distribuição das células NADPH-d+ durante o desenvolvimento do cerebelo, com algumas destas alterações mantidas na vida adulta, indicando um dano permanente nesta estrutura. Estas alterações poderão resultar em distúrbios motores nos ratos adultos jovens que sofrerem HI perinatal, constituindo então um modelo interessante para desenvolver novas estratégias terapêuticas.

O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito de diferentes tempos de hipóxia ambiental e da recuperação da hipóxia sobre as atividades gliconeogênica e neoglicogeniogênica, assim como, a atividade e a expressão da fosfoenolpiruvato carboxiquinase no músculo do C. granulatus alimentados com dietas ricas em proteínas ou carboidratos. Também, determinar sob as mesmas condições experimentais, outras vias do metabolismo do lactato em C. granulatus. Para este estudo foram utilizados caranguejos C. granulatus, alimentados com dietas ricas em proteínas ou carboidratos, submetidos a hipóxia ambiental (4,5% de O2) durante 8 horas e períodos de recuperação após a hipóxia, em normóxia, de 3 e 24 horas. Foram utilizados 16 animais por dieta experimental, subdivididos em 4 animais por período experimental (normóxia, hipóxia, 3 horas de recuperação e 24 horas de recuperação). No presente trabalho, aumentos na incorporação de 14C-lactato em glicose e na atividade da enzima PEPCK no músculo mandibular foram constatados às 8 horas de hipóxia. Os valores de lactato e de glicose circulantes estão elevados, porém a concentração de glicogênio muscular diminuiu marcadamente. em ambos os grupos experimentais (HP e HC). Nos animais alimentados com a dieta HC a expressão da PEPCK aumentou significativamente. Nos caranguejos que receberam a dieta HP, não foi necessário o aumento da expressão de PEPCK, somente sua atividade, em resposta a hipóxia ambiental de 8 horas. em C. granulatus o lactato desapareceu lentamente da hemolinfa durante o período de recuperação pós-hipóxia. Contudo, nos animais que receberam a dieta HP a restauração dos níveis de lactato hemolinfático ocorreu mais rapidamente que naqueles mantidos com a dieta HC. O retorno à normóxia diminui marcadamente a incorporação do 14C-lactato em glicose nos caranguejos mantidos com a dieta HC, quando comparada aos valores obtidos em hipóxia. Esta diminuição foi acompanhada pela redução na expressão e na atividade da PEPCK. No grupo HP a atividade gliconeogênica, a atividade e expressão da PEPCK mantiveram-se elevadas no período de recuperação da hipóxia. A incorporação do 14C-lactato em glicogênio aumentou, em ambas dietas, após 24 horas de recuperação da hipóxia. Os resultados do presente trabalho sugerem que a gliconeogênese e a neoglicogeniogênese, no músculo mandibular, são importantes mecanismos na metabolização do lactato gerado no período de hipóxia e que e a expressão da PEPCK na isoforma mitocondrial é controlada pelo teor de oxigênio no meio e pela composição da dieta administrada aos caranguejos, sendo este um mecanismo adaptativo do C. granulatus em situações de anoxia e hipóxia ambiental.

Made available in DSpace on 2018-08-23T21:50:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12427_Tese - Suzanny Oliveira Mendez.pdf: 3561701 bytes, checksum: 0f0fd989fd5e8dceb41830e39d57ae5c (MD5) Previous issue date: 2018-05-30 / O carcinoma epidermoide de cavidade oral (CEC oral) é causa significativa de mortalidade e morbidade e está relacionado, principalmente, ao uso do álcool e cigarro. Ademais, é o mais frequente tipo de câncer da área da cabeça e do pescoço, apresenta agressividade no crescimento, um alto grau de invasão, acometimento de linfonodos cervicais e prognósticos ruins. O CEC oral também apresenta regiões hipóxicas, nas quais ocorre elevada expressão de Hypoxia-Inducible Factor 1&#945; (HIF1&#945;), que se associa com coativadores transcricionais e promove a expressão de mais de 100 genes envolvidos em mecanismos específicos de sobrevivência celular em baixas concentrações de oxigênio, dentre esses: Jumonji Domain-Containing Protein 1A (JMJD1A), Plasminogen Activator Inhibitor-1 (PAI-1), Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGFA), Carbonic Anhydrase 9 (CAIX), Glucose Transporter 1 (GLUT1) e N-myc Down-Regulated Gene 1 (NDRG1). A resposta das células à hipóxia também pode ser induzida por metais, como o cobalto e o níquel, que são constituintes do cigarro e mimetizam uma situação de depleção de oxigênio, por inibição da Prolyl Hydroxylase 3 (PHD3) e do Factor Inhibiting HIF-1 (FIH1). Estas, além da JMJD1A, são dioxigenases de Fe(II)-e-2-oxoglutarato-dependentes e perdem suas funções biológicas através da substituição do Fe2+, acoplado ao núcleo metálico dos seus sítios catalíticos, por Co2+ e Ni2+. Poucos marcadores genéticos de resposta ao tratamento e evolução clínica foram identificados para o CEC oral e apesar do crescente avanço em técnicas terapêuticas, a sobrevida dos pacientes acometidos pela doença pouco aumentou nas últimas décadas. Baseado nessas informações, o presente trabalho teve como objetivo avaliar as expressões dos genes PHD3, FIH1, HIF1&#945;, JMJD1A, VEGFA, PAI-1, GLUT1, CAIX e NDRG1, por meio de RT-qPCR, em linhagem celular de carcinoma epidermoide de cavidade oral (SCC-9) submetida por 24 horas a diferentes concentrações de CoCl2, NiCl2, à normóxia e à câmara de hipóxia. Além disso, o efeito do cobalto e do níquel sobre a viabilidade celular da SCC-9 foi analisado através de citometria de fluxo, segundo a concentração e o tempo de exposição. Por fim, as concentrações de Fe2+, Co2+ e Ni2+ presentes no meio de cultura das células foram avaliadas mediante espectrometria de emissão óptica com plasma acoplado (ICP-OES). Após exposição aos metais se verificou que os genes relacionados à via de hipóxia foram diferencialmente expressos. Em normóxia, os genes mais expressos foram CAIX, HIF1&#945;, GLUT1, PAI-1, FIH1, NDRG1, JMJD1A, PHD3 e VEGFA. Já na exposição à câmara de hipóxia se observou que a expressão de NDRG1 foi consideravelmente maior do que a expressão dos demais genes analisados, seguida da expressão de GLUT1, PAI-1, CAIX, FIH1, HIF1&#945; e PHD3; já as expressões de VEGFA e JMJD1A foram notoriamente menores quando comparadas com as demais. Nos resultados de citometria de fluxo se verificou diferença significativa na viabilidade da SCC-9 quando incubada com 100&#956;M, 1000&#956;M e 2000&#956;M de CoCl2 e com 2000&#956;M de NiCl2. Contudo, em todas as concentrações utilizadas de CoCl2 e NiCl2 a viabilidade celular foi maior do que 79% e 83%, respectivamente. Nos resultados de ICP-OES se observou que as concentrações em mg/L de ferro e cobalto e de ferro e níquel diferiram estatisticamente entre os tratamentos com CoCl2 e NiCl2. Ademais, a concentração de Fe2+ pouco variou ao longo de todos os tratamentos com cloreto de cobalto e com cloreto de níquel; já a concentração de Co2+ no meio de cultura foi menor do que a de Ni2+. Esses resultados colaboram para o entendimento do mecanismo molecular de hipóxia e da ação do cobalto e do níquel, constituintes do cigarro, no carcinoma epidermoide de cavidade oral.

Orientador: Selma Giorgio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T05:53:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Degrossoli_Adriana_D.pdf: 32093196 bytes, checksum: 3de303f2f8a58bbae17d157ead572ede (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Diversas patologias provocam mudanças na pressão parcial de oxigênio, tornando o microambiente tecidual hipóxico. O interesse em analisar as alterações fenotípicas de células em hipóxia deve-se a necessidade de entender os mecanismos patológicos e a resistência aos tratamentos e ao desenvolvimento de terapias celulares. Células como os macrófagos adaptam-se a hipóxia modificando o metabolismo e a produção de citocinas. As lesões causadas pelo parasita intracelular Leishmania amazonensis são hipóxicas e o cultivo de macrófagos (células hospedeiras da Leishmania) em hipóxia induz redução da infecção com o parasita e modula a expressão de proteínas do choque térmico, indicando alterações funcionais e estruturais em ambiente hipóxico. Neste trabalho avaliamos os mecanismos responsáveis pela resistência destas células ao parasita em hipóxia e as modificações dos macrófagos causadas por este microambiente. Macrófagos cultivados em hipóxia não apresentam alterações na produção de óxido nítrico (NO) e na expressão da sua enzima produtora, óxido nítrico sintase (iNOS). Além disso, macrófagos knockout para enzima iNOS, que não produzem NO, são capazes de reduzir a infecção por L. amazonensis semelhante a macrófagos selvagens, o que sugere que o efeito leishmanicida da hipóxia não se deve ao NO. A liberação das citocinas TNF-a, IL-6, IL-12 e IL- 10 pelos macrófagos é alterada quando estes são cultivados em microambiente hipóxico. A produção destas moléculas pelos macrófagos infectados com L. amazonensis é semelhante em hipóxia e normóxia, indicando que estas citocinas não participam do efeito leishmanicida. O metabolismo energético dos macrófagos infectados, avaliado pela produção de ATP, não é modificado pela hipóxia, indicando que este fator não está envolvido na morte do parasita em macrófagos cultivados em hipóxia. Embora macrófagos fagocitem menos partículas inertes em hipóxia do que macrófagos em normóxia, a fagocitose do parasita vivo não é alterada pela hipóxia, sugerindo que o processo fagocítico também não está relacionado à diminuição da infecção pela hipóxia. Macrófagos cultivados em hipóxia aumentam a produção de ROS em relação a normóxia, mas a produção de ROS por macrófagos infectados com L. amazonensis em hipóxia não é alterada. Mas a inibição do efeito leishmanicida pelos antioxidantes N-acetilcisteína e Ebselen sugere que ROS tem papel na resistência dos macrófagos a L. amazonensis em hipóxia. A expressão de duas isoformas do fator transcricional hypoxia-inducible factor (HIF) (HIF-1alfa e 2alfa) é induzida em macrófagos cultivados em ambiente hipóxico e, interessantemente, em macrófagos infectados com L. amazonensis, mesmo quando estes são cultivados em normóxia. A inibição do HIF-1alfa pelo cloreto de cobalto impediu a sobrevivência do parasita dentro do macrófago, indicando que este fator é importante na manutenção do macrófago como célula hospedeira da L. amazonensis. Nossos resultados também demonstraram que a hipóxia alterou a capacidade proliferativa dos linfócitos T e o processamento e apresentação de antígeno de L. amazonensis pelos macrófagos. Assim, concluímos que a hipóxia induz alterações funcionais e estruturais nos macrófagos e que ROS são importantes para o efeito leishmanicida da hipóxia. Palavras-chave: Leishmania, macrófagos, hipóxia / Abstract: Regions of low oxygen tension (hypoxia) are common features of inflamed/infected tissues. The analyses of cell phenotypic alterations by hypoxia are helpful for understanding of the pathological mechanisms and treatment resistance and for the development of cellular therapies. Macrophages, cells involved in the clearance of microorganisms from infected tissues, are influenced by oxygen tension changing metabolism and cytokines production. Lesions caused by intracellular protozoan Leishmania amazonensis are hypoxic and macrophages (host cells for Leishmania) cultured in hypoxia are resistant to the infection and change heat shock proteins expression, suggesting functional and structural alterations of these cells in hypoxic microenvironment. In the present work we evaluated mechanisms involved in the macrophage resistance to the parasite as well as macrophages phenotypic alterations in hypoxia. Macrophages cultured in hypoxia did not show alterations in nitric oxide (NO) production and oxide nitric synthase (iNOS) enzyme expression. Furthermore, iNOS knockout macrophages lacking NO production are also able to reduce L. amazonensis infection as wild type macrophages, what suggests the leishmanicidal effect of hypoxia is not related to NO. The cytokines TNF-a, IL-6, IL-12 e IL-10 release is altered when macrophages are cultured in hypoxia. However, the production of these cytokines by L. amazonensis-infected macrophages in hypoxia is similar to normoxia, indicating these cytokines do not participate of the leishmanicidal effect of hypoxia. The energetic metabolism of infected macrophages, evaluated through ATP production, is not modified by hypoxia, suggesting this factor is not responsible for parasite death by macrophages cultured in hypoxia. Although the uptake of inert particles by macrophages in hypoxia is lower than in normoxia, living L. amazonensis phagocytosis by macrophages is not altered by hypoxia. This result suggests that phagocytic process is also not related to low infection in hypoxia. Cultured macrophages in hypoxia have shown higher ROS production than in normoxia, but the ROS production by L. amazonensis-infected macrophages is not altered by hypoxia. Indeed, the inhibition of leishmanicidal effect of hypoxia by antioxidants N-acetylcystein and Ebselen suggests ROS play a role in the macrophage resistance to L. amazonensis in hypoxia. The expression of two isoforms of the transcriptional factor hypoxia-inducible factor (HIF) (HIF- 1alpha e 2alpha) is induced in macrophages cultured in hypoxia and, interestingly, in L. amazonensis-infected macrophages in normoxia and hypoxia. The inhibition of HIF-1alpha by cadmium chloride impaired survival of intracellular parasite, suggesting this factor is important for macrophages as host cell for L. amazonensis. Our results also demonstrated hypoxia altered the proliferative capacity of T lymphocytes and the L. amazonensis antigen presentation by macrophages. We conclude hypoxia induces macrophages functional and structural alterations and ROS are important for the leishmanicidal effect of hypoxia. Keywords: Leishmania, macrophages, hypoxia / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Muitos animais enfrentam situações de baixa pressão parcial de oxigênio (hipóxia) ao longo da vida, seja por condições ambientais (tocas, altas altitudes) ou clínicas (insuficiência cardíaca, respiratória ou metabólica). Sabe-se que a queda regulada da temperatura corporal (Tc), chamada anapirexia, induzida pela hipóxia tem tanto importância fisiológica quanto para a clínica, entretanto apenas nas últimas décadas alguns pesquisadores têm se dedicado mais intensamente ao estudo dos mecanismos envolvidos neste fenômeno. Estes estudos, em geral, não levaram em conta a fase do dia durante a realização dos experimentos nem durante a análise dos resultados. Considerando que a Tc apresenta um ritmo diário e circadiano com padrão robusto, é possível que a anapirexia seja alterada de acordo com o momento do dia em que o animal é exposto à hipóxia. Diante disso, tal hipótese foi testada no presente estudo e, para isso, os animais foram expostos à hipóxia em diferentes fases do dia e foi registrada a Tc, o consumo de oxigênio (VO2) e o índice de perda de calor (IPC). Estes protocolos foram realizados sob duas temperaturas ambientes (Tas; 26 e 19&#176;C), pois se sabe que a anapirexia também pode ser alterada pela Ta. Em ambas Tas, foi visto que animais expostos à hipóxia no início da fase de escuro apresentam amplitude maior de queda de Tc em relação àqueles expostos no início da fase de claro e, tal diferença deve-se, ao menos em parte, à inibição induzida pela hipóxia da maior termogênese encontrada nestes animais durante a noite. O IPC mensurado no final do intervalo hipóxico parece não ter muita importância para as diferenças nas respostas anapiréticas. Além disso, todas as amplitudes anapiréticas foram maiores nos animais testados sob o frio, independente da fase do dia. Assim, os resultados indicam que a fase do dia interfere na anapirexia induzida por hipóxia aguda e que essa resposta é maior em menores Tas em qualquer momento do dia. / Several animals face reduced oxygen partial pressure (hypoxia) throughout their lives, due to environmental (burrows, high altitudes) or clinical conditions (cardiac, respiratory or metabolic failures). Its known that the hypoxia-induced decrease in body temperature (Tb), named anapyrexia, is a regulated process of adaptive importance. However only in the past few decades researchers have been studied the mechanisms involved in this phenomenon. These studies, in general, did not take the phase of the day into account during the experiments or during the analyses of their results. Considering that Tb shows circadian and diary rhythm with a robust pattern, it is possible that anapyrexia can be altered depending on to the moment of the day in which the animal is exposed to hypoxia. Thus, the present study tested this hypothesis exposing animals to hypoxia in different phases of Day and Tb, oxygen consumption (VO2) and heat loss index (HLI) were measured. These protocols were conducted in two ambient temperatures (Tas; 26&#176;C and 19&#176;C), because it is known that anapyrexia can be altered by Ta. In both Tas, it was observed that animals exposed to hypoxia during the beginning of the dark phase presented bigger anapyrexic amplitude than those exposed during the beginning of the light phase. This difference may be due, at least in part, to the inhibition induced by hypoxia of the biggest thermogenesis found during dark phase. HLI measured at the end of the hypoxia exposure seems to have no influence in the different anapyretic responses. Moreover, the cold condition induced bigger anapyretic responses independent on the phase of day. Thus, the results indicate the phase of day influences the hypoxia-induced anapyrexia and this response is bigger in lower ambient temperatures at any moment of the light-dark cycle.

A osteoartrose (OA) de joelho é uma das doenças osteomioarticulares mais comuns no mundo, afetando 2693 em cada 100.000 mulheres e 1770 em cada 100.000 homens. Embora o treinamento de força (TF) seja amplamente recomendado para a melhoria das debilidades físicas encontradas em pacientes com OA, o uso de cargas entre 70-85% da força dinâmica máxima (FDM) pode ser limitado não somente pela dor, mas também pela própria etiologia da doença, representando uma limitação para esta prática. O treinamento de força associado à oclusão vascular (TFOV) baseia-se na execução do TF em intensidades entre 20 e 50% da FDM, combinado à oclusão do fluxo sanguíneo através do uso de torniquetes. Estudos têm mostrado que a magnitude das mudanças na força e massa musculares após um período de treinamento com esta técnica é similar as causadas pelo TF de alta intensidade (70-85% FDM) sem adição da oclusão vascular. O objetivo do presente trabalho foi investigar a eficácia da associação da oclusão vascular ao TF como modelo de intervenção não farmacológica para melhoria da dor, força muscular, funcionalidade e qualidade de vida em pacientes diagnosticadas com OA de joelho. Diante disso, 48 participantes mulheres foram randomicamente distribuídas em três grupos: treinamento de força de baixa intensidade (TFB), treinamento de força de alta intensidade (TFA) ou treinamento de força de baixa intensidade associado à oclusão vascular (TFOV) e receberam treinamento duas vezes por semana durante doze semanas. No período basal e após a intervenção, as pacientes passaram por avaliações físicas (testes de funcionalidade e força), responderam questionários de qualidade de vida e de dor (índice WOMAC \"Western Ontario and McMaster Universities Osteoarthritis Index\" e SF-36 \"The Short Form 36 Health Survey\") e exame de imagem da área da secção transversa (AST) do músculo quadríceps por meio de tomografia computadorizada. Durante o período de treinamento, quatro pacientes do grupo TFA foram excluídas do protocolo por dor no joelho. Após a intervenção, no WOMAC, apenas os grupos TFOV e TFB apresentaram diminuições significativas na dor (p=0,0358 e p=0,0044, respectivamente), nos demais domínios, o único grupo que apresentou diminuições significativas de escore foi o TFOV (rigidez: p=0,0167 e funcionalidade p=0,0358). Nos testes de funcionalidade, os grupos TFOV e TFA apresentaram aumentos significativos no desempenho do \"Timed-stands test\" (p=0,0251 e p=0,003), no \"Timed-up-and-go\" não foram encontradas melhoras significantes nos grupos. Com relação a força, apenas os grupos TFOV e TFA aumentaram significativamente os valores no leg-press (p<0,0001) e na extensão de joelhos (p<0,0001). Comportamento similar foi encontrado no aumento da AST, grupos TFOV e TFA apresentaram aumentos significativos (p<0,0001). A melhora de qualidade de vida foi significante nos três grupos quando analisamos a somatória dos domínios do WOMAC (TFOV: p=0,0173; TFA: p=0,0438; TFB: p=0,0301), porém o SF-36 não foi capaz encontrar melhoras significativas nos grupos. Dessa forma, concluímos que o TFOV apresenta-se como uma estratégia relevante e segura de intervenção não farmacológica para mulheres acometidas por OA sintomática de joelhos, constituindo um modelo de tratamento capaz de induzir adaptações funcionais e morfológicas de grande interesse para esta população / Osteoarthritis (OA) of the knee is one of the most common articular disease worldwide, affecting 100,000 women in 2693 and 1770 in every 100,000 men. Although strength training (ST) is widely recommended for improving the physical weaknesses found in patients with OA, using loads between 70-85% of maximal dynamic strength (MDS) can be limited not only by pain, but also by the own etiology of the disease, representing a limitation of this practice. Strength training associated with vascular occlusion (STVO) is based on the execution of the ST at intensities between 20 and 50% of MDS, combined with the occlusion of blood flow through the use of tourniquets. Studies have shown that the magnitude of changes in strength and muscle mass after a period of training this technique is similar to those caused by high-intensity ST (MDS 70-85%) without the addition of the vascular occlusion. The objective of this study was to investigate the efficacy of the combination of vascular occlusion to the ST as non pharmacologic intervention model for improving pain, muscle strength, functionality and quality of life in patients diagnosed with knee OA. Thus, 48 women participants were randomly divided into three groups: strength training low intensity (STL), strength training, high intensity (STH) or low-intensity strength training associated with vascular occlusion (STVO) and trained two times per week for twelve weeks. At baseline and after the intervention, the patients underwent physical assessments (tests of functionality and strength), answered questionnaires on quality of life and pain (WOMAC index \"Western Ontario and McMaster Universities Osteoarthritis Index\" and SF-36 \"The Short form 36 Health Survey \") and the cross section area (CSA) of the quadriceps muscle was assessed using computed tomography. During the training period the STH group, four patients were excluded from the protocol due to knee pain. After the intervention, the WOMAC, only the STVO and STL groups showed significant decreases in pain (p=0.0358 and p=0.0044, respectively), in other domains, the only group that showed significant decreases in score was the STVO (stiffness: p= 0.0167 and p = 0.0358 functionality). In functionality testing, the STVO and STH groups showed significant increases in performance \"Timed-stands test\" (p=0.0251 and p=0.003), the \"Timed-up-and-go\" were not significant improvements found in groups. Regarding strength, only the STVO and STH groups significantly increased values in leg press (p<0.0001) and knee extension (p<0.0001). Similar behavior was found in increased AST and STH STVO groups showed significant increases (p<0.0001). The improvement of quality of life was significant in all three groups when analyzing the sum of the domains of WOMAC (STVO: p=0.0173; STH: p=0.0438; STL: p=0.0301), but the SF-36 was not able to find significant improvements in groups. Thus, we conclude that the STVO presents itself as a relevant and safe strategy of non-pharmacological intervention for women suffering from symptomatic knee OA, constituting a model of treatment capable of inducing functional and morphological adaptations of great interest to this population

Glicose e oxigênio desempenham um importante papel na regulação do metabolismo celular. Dada a importância de ambos no metabolismo - o primeiro como fonte de carbono preferencial da maior parte das células, e o segundo como aceptor final de elétrons na cadeia respiratória, em diversos organismos desenvolveram-se métodos adequados para detectar sua presença de modo a ajustar o metabolismo em função de sua disponibilidade. Neste trabalho foi realizado o estudo da expressão, no nível transcricional, dos genes envolvidos nas vias metabólicas primárias e genes envolvidos em morte celular, em células humanas, com o intuito de determinar as alterações no metabolismo energético em resposta a condições de hipóxia e anóxia, por meio da técnica de microarrays de cDNA. Utilizamos, inicialmente, células normais de fibroblasto humano ASl98 e células de fibroblasto humano MRC-5 imortalizadas por transfecção por SV40, e por fim células provenientes de ilhotas pancreáticas humanas, para a elaboração de um protocolo de cultura celular em que as mesmas crescessem aderidas a microcarregadores Cytodex I. Numa segunda etapa, células de ilhotas pancreáticas humanas foram cultivadas em suspensão, aderidas aos microcarregadores, num biorreator, sendo então realizada a análise do perfil transcricional dos genes escolhidos, frente às condições de baixa tensão de oxigênio. É apresentada a análise da expressão gênica de aproximadamente 160 genes na qual foram verificados um comportamento de indução daqueles envolvidos no metabolismo de lipídios e alguns na morte celular e um comportamento inicial de indução, e posterior inibição, do metabolismo primário como um todo. Em vista dos dados obtidos é de interesse ressaltar que essas células deveriam ser mantidas em saturações de oxigênio acima de 5% para evitar o efeito deletério observado na baixa concentração de oxigênio sobre a viabilidade celular, em termos da indução de alguns genes envolvidos na morte celular e da repressão geral dos relacionados ao metabolismo energético. Também foi verificado que, em saturações de oxigênio de até 10%, as células adotaram um padrão transcricional que indicou uma resposta ao estresse por falta de oxigênio, este por sua vez reflete-se na viabilidade celular, característica crucial para o sucesso do transplante clínico de ilhotas. / Glucose and oxygen have important roles on the regulation of cellular metabolism. Due to their importance in metabolism, the former as the preferential carbon source and the later as the final electron acceptor of the respiratory chain, many organisms have developed suitable processes to detect their presence in order to adjust the cellular metabolism to their availability. In this work, we have studied, in human cells and at the transcriptional level, the expression of genes involved in primary metabolism pathways and some of those related to cell death, aiming to resolve alterations in the energetic metabolism as a response to hypoxic and anoxic conditions, by means of cDNA microarrays. We initially used AS198 human fibroblastic normal cells and MRC-5 human fibroblastic cells immortalized by SV40, and later on cells from human pancreatic islets, to develop a cell culture protocol in which they would grow on the surface of Cytodex 1 microcarriers. As a second step, cells from human pancreatic islets were cultured on microcarriers in suspension inside a bioreactor. This culture was then used to carry out the transcriptional profile analysis of selected genes in response to low levels of oxygen. This work presents the analysis of gene expression of approximately 160 genes that can be divided into two distinct groups. The first group, the expression of which is induced, comprises genes involved in lipid metabolism and some of those related to cell death. The expression of the second group, consisting of diverse genes of the primary metabolism, suffers an initial induction followed by repression. Given the data acquired it is interesting to note that the human pancreatic islets should be maintained under at least 5% dissolved oxygen to avoid the deleterious effects on cell viability observed at lower oxygen concentrations, resulting in the induction of some genes involved in cell death and the repression of those related to energetic metabolism. It was also verified that, under oxygen saturation of at least 10%, these cells adopted a transcriptional profile that indicated a response to the stress created by the lack of oxygen, which would in turn reflect on cell viability, a crucial characteristic for success in clinical islet transplantation.