Estudos com animais submetidos ao modelo de hipóxia-isquemia (HI) neonatal reproduzem achados observados em humanos, tais como transtornos de aprendizado, comprometimento tecidual nervoso e alterações bioquímicas. O ácido fólico (AF), uma vitamina que pode ser obtida diretamente da dieta, tem sido relacionado à prevenção de eventos isquêmicos, e a proteção antioxidante. O objetivo deste estudo foi investigar o papel do tratamento com ácido fólico sobre parâmetros comportamentais, bioquímicos e morfológicos de animais submetidos à HI. Foram utilizados ratos Wistar de ambos os sexos com sete dias pós-natal (DPN) divididos em quatro grupos: 1) grupo controle tratado com salina 0,9% (CTS); 2) grupo controle tratado com ácido fólico (CTAF); 3) grupo HI tratado com salina 0,9% (HIS); 4) grupo HI tratado com ácido fólico (HIAF). Uma dose intraperitoneal de ácido fólico (0,011μmol/g de peso corporal) foi administrada imediatamente antes do procedimento de HI e, após, diariamente até o 30 ou 40 DPN. No experimento 1 investigamos os efeitos do tratamento com AF sobre o comportamento motor, memória aversiva e atividade da enzima Na+,K+-ATPase. Os resultados demonstraram um efeito ansiogênico nos animais HI visto no campo aberto, prejuízo na memória aversiva no teste de esquiva inibitória e ainda diminuição na atividade da enzima Na+,K+-ATPase. No entanto, os animais HI tratados com ácido fólico não apresentaram estes efeitos, indicando uma reversão desses achados. O experimento 2 teve como objetivo investigar se o tratamento com AF influenciaria em outro tipo de memória, como a de referência e se seria efetivo na reversão da atrofia hipocampal causada pela HI. Nossos resultados indicaram que houve prejuízo no aprendizado na tarefa do labirinto aquático de Morris nos animais HI tanto na memória de referência quanto na memória de trabalho. Também, houve diminuição do volume hipocampal e área estriatal nesses animais. Todavia, observamos significativa melhora no quadro de atrofia hipocampal nos animais tratados com AF. Portanto, esses dados demonstram que o tratamento com ácido fólico desempenha um papel relevante na reversão do efeito ansiogênico, do déficit na memória aversiva, na prevenção da inibição da atividade da Na+,K+,ATPase e recuperação do volume hipocampal ocasionados pela HI neonatal. / Perinatal hypoxic-ischemic (HI) is a significant cause of mortality and morbidity in infants and young children. Folic acid is a water soluble vitamin that can be obtained through diet and has been related to the antioxidant effect, protecting ischemic events and Alzheimer's disease. The aim of this study was to investigate the role of the folic acid treatment over the behavioral, biochemical and morphologic alterations in animals submitted to neonatal HI model. Four groups of seven days-old Wistar rats, of both sexes, were used in the experiments: 1) control group treated with saline 0.9% (CT-S); 2) control group treated with folic acid (CT-FA); 3) HI group treated with saline 0.9% (HI-S); 4) HI group treated with folic acid (HI-FA). Folic acid was intraperitoneal administrated (0.011μmol/g of body weight) once before HI procedure and injections were repeated daily until the 30th or 40th postnatal day. Results were obtained from two experiments. In the first, it was investigated the effects of the FA treatment on motor performance, aversive memory and enzymatic Na+,K+-ATPase activity. Rats submitted to HI demonstrated an ansiogenic effect in the open field task, impairment in the aversive memory during avoidance test and reduction in the Na+,K+-ATPase activity. Nevertheless, when treated with folic acid, all symptoms were reverted, as observed in the animal group HI treated with folic acid. The second experiment investigated the influence of the folic acid treatment in the spatial memory, working memory and recovery of hippocampus atrophy caused by HI. Results showed impairment in the learning task during Morris’ water maze and reduction in hippocampus volume and area striatal due to HI. Folic acid treatment until the 40th postnatal day was able to reverse significantly the hippocampus atrophy. Therefore, these results demonstrate that folic acid play an important role in the recovery of the ansiogenic effect, aversive memory impairment, hippocampus atrophy and Na+,K+-ATPase activity inhibition caused by neonatal HI.

A hipóxia-isquemia (HI) neonatal é uma causa importante de deficits neurológicos. Estimativas relatam que 3-5 em cada 1.000 nascidos vivos ocorrem encefalopatia neonatal, sendo que, encefalopatia hipóxico-isquêmica (EHI) moderada ou grave acomete 0,5-1/1000 dos nascidos vivos. Aproximadamente 10 a 60% das crianças com EHI morrem, e pelo menos 25% dos que sobrevivem, apresentam deficiência permanente, como paralisia cerebral, epilepsia e dificuldades na aprendizagem. Evidências clínicas e experimentais sugerem que a exposição a estímulos nocivos no início da vida pode resultar em mudanças duradouras no processamento sensorial. Apesar da magnitude do problema, pouco se conhece sobre a modulação da dor e mecanismos envolvidos durante um processo hipóxico-isquêmico em neonatos e suas conseqüências ao longo da vida. Sendo assim, a presente tese objetivou avaliar respostas comportamentais e bioquímicas de filhotes de ratos submetidos à hipóxia/isquemia no 7°dia de vida, avaliados em diferentes idades. Ninhadas de ratos Wistar machos foram randomizadas em 6 grupos experimentais: controle, hipóxia-isquemia, isquemia, hipóxia, sham-ischemia, sham-hipóxia. O modelo experimental utilizado foi de HI unilateral descrito por Levine (1960) e adaptado por Rice e colaboradores (1981), realizando-se isquemia através da oclusão da carótida esquerda e hipóxia com câmara hipóxica de 92% de nitrogênio e 8% de oxigênio. Avaliaram-se os animais no 14° (P14), 30°(P30) e 60° (P60) dias de vida. Para avaliação da (s) resposta (s): nociceptiva térmica foram utilizados testes de tail-flick e placa quente; e alodinia mecânica utilizou-se teste de Von Frey eletrônico. Para as avaliações dos biomarcadores foram utilizados kits comerciais de BDNF e TNF por métodos ELISA e LDH por espectrofotometria. A ativação neuronal foi quantificada em lâminas de imunoistoquímica de c-fos em regiões CA1 e giro dentado de hipocampo bilateral. Foi observado que ratos com hypoxia e/ou isquemia tiveram diminuição irreversível de neurônios com ativação por c-fos em área CA1 do hipocampo, região ipsilateral do insulto. Maior sensibilidade em animais com HI em P14 foi observado no teste do Von Frey, mas não foi observada em P30 e P60. Independentemente do grupo experimental, a idade do animal desempenhou um papel significativo na resposta de comportamento nociceptivo, bem como sobre o BDNF e dos níveis séricos de TNF-α, mas não sobre os níveis séricos de LDH. Em conclusão, o insulto cerebral da HI induz uma redução significativa e irreversível sobre a ativação neuronal ipisilateral à lesão, com a evidência de uma alteração da resposta comportamental nociceptiva manifestada no curto, mas não a médio ou longo prazo. Biomarcadores de neuroplasticidade, inflamação e danos celulares apresentaram poucas alterações sobre o insulto cerebral, mas mudanças mais pronunciadas foram observadas com relação à idade. / Neonatal hypoxia-ischemia (HI) is an important cause of neurological deficits. It is estimated that 3-5 in 1000 newborns suffer neonatal encephalopathy, and moderate or severe hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) in 0,5-1/1000 of the newborns. Approximately 10 to 60% of the children with HIE die, and at least 25% of the survivors present permanent deficits such as cerebral palsy, epilepsy and learning difficulties. Clinical and experimental evidence suggest that the exposure to noxious stimuli at the beginning of the life might result in long lasting changes in sensorial processing. Despite the magnitude of the problem, few is known regarding pain modulation and its involved mechanisms during the HI process in neonates and its life lasting consequences. Hence, the present thesis aimed to evaluate behavioral and biochemical responses in rats’ litters submitted to HI during their seventh day of life, evaluated at different ages. Male Wistar rats’ litters were randomized into 6 experimental groups: control, HI, ischemia, hypoxia, sham-ischemia and sham-hypoxia. The experimental model was the one of unilateral HI described by Levine (1960) and adapted by Rice et al (1981), inducing ischemia by occlusion of the left carotid artery, and hypoxia using hypoxic chamber with nitrogen 92% and oxygen 8%. Animals were evaluated in their 14th (P14), 30th(P30) and 60th (P60) postnatal day. To assess the thermal nociceptive response the tail flick and hot plate test were employed; and mechanical allodynia was assessed by means of the digital Von Frey test. To evaluate biomarkers, commercial BDNF and TNF kits with ELISA, and LDH kits with spectrophotometry were used. Neuronal activation was quantified by c-fos immunohistochemistry in CA1 and dentate gyrus of bilateral hippocampi. It was observed that rats with hypoxia and/or ischemia had irreversible diminution of neurons with c-fos activation in the CA1 area of the hippocampus ipsilateral to the insult. Higher sensitivity in animals with HI at P14 was observed in the Von Frey test, but was not observed at P30 or at P60. Irrespective of the experimental group, animals’ age played a significant role in the nociceptive behavioral response, as well as on the BDNF and TNF-α serum levels, but not on the LDH serum levels. In conclusion, cerebral HI insult induces a significant and irreversible reduction on neuronal activation ipsilateral to the insult, with evidence of a significant alteration on the nociceptive behavioral response manifested in the short, but not in the medium or long term. Biomarkers of neuroplasticity, inflammation and cellular damage present few alterations after the cerebral insult, however more pronounced changes were observed related with age.

INTRODUÇAO: O uso da epinefrina na ressuscitação cardiopulmonar (RCP) tem sido questionado devido aos efeitos adversos como dano miocárdico e cerebral. Fármacos como azul de metileno têm sido estudados como adjuvantes, objetivando reduzir essas lesões. OBJETIVOS: Neste estudo objetivou-se avaliar o efeito da administração do azul de metileno em bôlus durante a RCP, na lesão miocárdica e cerebral. MÉTODO: Quarenta e nove ratos Wistar machos submetidos a parada cardíaca por fibrilação ventricular foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos com 11 animais: azul de metileno (GA, 2mg/kg), solução salina (GC, salina 0,9% 0,1ml), epinefrina (GE, 20mcg/kg), epinefrina + azul de metileno (GM), além do grupo sham com 5 animais. A fibrilação ventricular foi induzida por estimulação elétrica direto no ventrículo direito por 3 minutos, sendo mantidos por mais 2 minutos em anóxia. As manobras de RCP foram iniciadas com o fármaco correspondente de cada grupo, massagem torácica, ventilação e desfibrilação. Após retorno a circulação espontânea (RCE), os animais foram observados durante quatro horas. Foram coletados sangue para gasometria e troponina, tecido cardíaco e cerebral para análise histológica, marcação de TUNEL, marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo. Os grupos foram comparados por meio do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, com o teste de comparação múltipla com correção de Bonferroni quando adequado. RESULTADOS: Animais do grupo GE apresentaram 63% de RCE, enquanto o GC e GM obtiveram 40% e 45%, respectivamente, sem diferença estatística entre os grupos (p= 0,672). O grupo GA apresentou apenas 18% de RCE e foi excluído da análise. O tempo de RCP do GC foi maior comparado aos grupos GE e GM, mas sem diferença estatisticamente significativa. Os animais do grupo GM apresentaram PAM maior comparado ao grupo GC, no momento imediatamente após a RCE (P=0,007). Em todos os grupos os animais apresentaram acidose, queda da PaO2 e aumento do lactato após PCR e RCP. A mediana da troponina sérica foi maior no GC (130ng/ml) comparada ao grupo GE (3,8ng/ml), e GM (43,7ng/ml), porém sem diferença estatística. O grupo GC apresentou aumento significativo na expressão proteica dos marcadores BAX e TLR4. Não houve diferença estatística em relação a histologia e marcação de TUNEL entre os grupos submetidos a PCR. CONCLUSÃO: A utilização de azul de metileno em bolus na RCP de forma isolada apresentou resultados negativos em relação ao retorno da circulação espontânea. A utilização de azul de metileno associada a epinefrina não diminuiu a presença de lesões no cérebro e no coração decorrentes da parada cardíaca / INTRODUCTION: The use of epinephrine in cardiopulmonary resuscitation (CPR) has been questioned due to adverse effects such as myocardial and cerebral damage. Drugs such as methylene blue have been studied as adjuvants in order to reduce lesions. OBJECTIVES: The aim of this study was to evaluate the effect of methylene blue administration during CPR on myocardial and cerebral lesion. METHOD: Forty nine Wistar male rats submitted to ventricular fibrillation cardiac arrest (CA) were randomly assigned to four principal groups with 11 cases each one: methylene blue (MB, 2mg/kg), control (CTRL, 0.1ml saline 0.9%), epinephrine (EPI, 20?g/kg), epinephrine plus methylene blue (EPI+MB), and a sham group, wich have 5 cases. Ventricular fibrillation was induced by direct electrical stimulation in the right ventricle for 3 minutes and anoxia was maintained until a total of 5 minutes. CPR was initiated using the group drug, ventilation, chest compressions and defibrillation. The animals were observed for four hours after return of spontaneous circulation (ROSC). Blood samples were collected for blood gas and troponin measurements. Heart and brain tissues were harvested for the evaluation of oxidative stress, inflamation, histological and TUNEL staining. Groups were compared using the non-parametric Kruskal-Wallis test and Bonferroni post test. RESULTS: ROSC was achieved in 63% of the cases in EPI, 40% in CTRL, and 45% in EPI+MB (P=0.672). MB was excluded from analysis because of its low ROSC rate (18%). CPR duration was longer in CTRL compared to EPI and EPI+MB, without statistical significance. EPI+MB animals presented higher arterial pressure compared to the CTRL group, immediately after ROSC (P=0.007). All animals presented acidosis, decreased PaO2 and increased lactate after CA and CPR. Serum troponin was higher in CTRL (130ng/ml) compared with EPI (3.8ng/ml) and EPI+MB (43.7ng/ml), without statistical significance. CTRL presented higher BAX and TLR4 expression. There was no difference in TUNEL staining and histology among CA groups. CONCLUSION: Methylene blue in bolus during CPR did not improve outcome. Methylene blue combined with epinephrine did not decrease CA-related myocardial and cerebral lesions

A hipóxia-isquemia (HI) encefálica neonatal pode gerar sequelas neurológicas permanentes nos indivíduos que sobrevivem a este evento precoce. Dentre estas sequelas, o diagnóstico de Transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) já foi relacionado em pesquisa clínica. Sabendo que não há consenso de um modelo adequado para o estudo do TDAH em pesquisa experimental, novas abordagens que contribuam para o desenvolvimento desse modelo são necessárias. Assim, o objetivo do presente estudo foi investigar se a HI neonatal contribui para o desenvolvimento das características comportamentais relacionadas ao TDAH na fase adulta em ratos e correlacionar os resultados comportamentais com o volume da lesão encefálica. Para isso, ratos Wistar machos foram divididos em dois grupos: hipóxia-isquemia (HI, n=12) e controle (CT, n=10). O procedimento de HI consistiu na combinação da oclusão da artéria carótida comum direita no 7º dia pós-natal com exposição a uma atmosfera hipóxica (8% O2 e 92% N2, durante 90 minutos). Durante a fase adulta, ao atingir dois meses de idade, os animais foram testados no teste attentional set-shifting (ASS) para avaliar flexibilidade comportamental atencional e no teste de tolerância ao atraso da recompensa, para avaliação da escolha impulsiva. Os resultados mostraram que os animais submetidos à HI apresentaram prejuízo na função executiva, avaliado no ASS, evidenciado por uma inflexibilidade comportamental quando a regra para a execução da tarefa era mudada (p ≤ ,05 para o número de tentativas para passar dos estágios de Reversão 2 e Reversão 3, assim como o número de erros nesses estágios, além do estágio de mudança extradimensional – Teste t não-pareado). No teste de tolerância ao atraso da recompensa, não foi observada uma maior impulsividade dos animais HI, tendo os dois grupos um comportamento similar neste teste. Além disso, as avaliações do volume encefálico pelo Método de Cavalieri demonstraram uma atrofia no grupo HI no hemisfério total, córtex cerebral, substância branca, hipocampo e estriado, principalmente no lado ipsilateral à lesão (p ≤ ,05, Teste t não-pareado). Considerando esses resultados, podemos inferir que a HI neonatal é um fator ambiental que pode contribuir para o desenvolvimento das características comportamentais observadas no TDAH, e que estas são associadas a uma atrofia encefálica geral. / Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HI) can cause permanent neurological sequelae in survivors of this early event. Among these sequelae, the diagnosis of attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) has already been linked in clinical research. There is no consensus about an ideal ADHD model in experimental research, being necessary new approaches that contribute to the development of this model. Thus, the aim of this study was to investigate whether HI contributes to the development of characteristics related to ADHD in adult rats and correlate the behavioral results with brain damage volume. Male Wistar rats were divided into two groups: hypoxia-ischemia (HI, n=12) and control (CT, n=10). The HI procedure consist of a permanent occlusion of the right common carotid artery followed by a period of hypoxia (90 min; 8% O2 and 92% N2), at seventh postnatal day (PND). Two months later, animals were evaluated in attentional set-shifting test (ASS) for assessment of attentional flexibility and in the tolerance to delay of reward, for evaluation of impulsivity choice. Our results demonstrated that animals submitted to HI manifest impairments in executive function, evidenced by a behavioral inflexibility when the rule for the execution of the ASS task was changed (p ≤ ,05 for number of trials to reach the criterion in Reversion 2 and 3 stages, as well as in number of erros in these stages, in addition to the Extradimensional shift stage – Unpaired t test). In the tolerance to delay of reward, no greater impulsivity of HI animals was observed, with both groups demonstrating similar behavior in this task. Moreover, the assessments of brain volume by Cavalieri method demonstrated atrophy in HI group in total hemisphere, cerebral cortex, white matter, hippocampus and striatum, especially on the side ipsilateral to the lesion (p ≤ ,05 – Unpaired t test). Considering these results, we can infer that neonatal HI is an environmental factor that could contribute to the development of behavioral characteristics observed in ADHD which are associated to general brain atrophy.

A hipóxia-isquemia (HI) encefálica neonatal pode gerar sequelas neurológicas permanentes nos indivíduos que sobrevivem a este evento precoce. Dentre estas sequelas, o diagnóstico de Transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) já foi relacionado em pesquisa clínica. Sabendo que não há consenso de um modelo adequado para o estudo do TDAH em pesquisa experimental, novas abordagens que contribuam para o desenvolvimento desse modelo são necessárias. Assim, o objetivo do presente estudo foi investigar se a HI neonatal contribui para o desenvolvimento das características comportamentais relacionadas ao TDAH na fase adulta em ratos e correlacionar os resultados comportamentais com o volume da lesão encefálica. Para isso, ratos Wistar machos foram divididos em dois grupos: hipóxia-isquemia (HI, n=12) e controle (CT, n=10). O procedimento de HI consistiu na combinação da oclusão da artéria carótida comum direita no 7º dia pós-natal com exposição a uma atmosfera hipóxica (8% O2 e 92% N2, durante 90 minutos). Durante a fase adulta, ao atingir dois meses de idade, os animais foram testados no teste attentional set-shifting (ASS) para avaliar flexibilidade comportamental atencional e no teste de tolerância ao atraso da recompensa, para avaliação da escolha impulsiva. Os resultados mostraram que os animais submetidos à HI apresentaram prejuízo na função executiva, avaliado no ASS, evidenciado por uma inflexibilidade comportamental quando a regra para a execução da tarefa era mudada (p ≤ ,05 para o número de tentativas para passar dos estágios de Reversão 2 e Reversão 3, assim como o número de erros nesses estágios, além do estágio de mudança extradimensional – Teste t não-pareado). No teste de tolerância ao atraso da recompensa, não foi observada uma maior impulsividade dos animais HI, tendo os dois grupos um comportamento similar neste teste. Além disso, as avaliações do volume encefálico pelo Método de Cavalieri demonstraram uma atrofia no grupo HI no hemisfério total, córtex cerebral, substância branca, hipocampo e estriado, principalmente no lado ipsilateral à lesão (p ≤ ,05, Teste t não-pareado). Considerando esses resultados, podemos inferir que a HI neonatal é um fator ambiental que pode contribuir para o desenvolvimento das características comportamentais observadas no TDAH, e que estas são associadas a uma atrofia encefálica geral. / Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HI) can cause permanent neurological sequelae in survivors of this early event. Among these sequelae, the diagnosis of attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) has already been linked in clinical research. There is no consensus about an ideal ADHD model in experimental research, being necessary new approaches that contribute to the development of this model. Thus, the aim of this study was to investigate whether HI contributes to the development of characteristics related to ADHD in adult rats and correlate the behavioral results with brain damage volume. Male Wistar rats were divided into two groups: hypoxia-ischemia (HI, n=12) and control (CT, n=10). The HI procedure consist of a permanent occlusion of the right common carotid artery followed by a period of hypoxia (90 min; 8% O2 and 92% N2), at seventh postnatal day (PND). Two months later, animals were evaluated in attentional set-shifting test (ASS) for assessment of attentional flexibility and in the tolerance to delay of reward, for evaluation of impulsivity choice. Our results demonstrated that animals submitted to HI manifest impairments in executive function, evidenced by a behavioral inflexibility when the rule for the execution of the ASS task was changed (p ≤ ,05 for number of trials to reach the criterion in Reversion 2 and 3 stages, as well as in number of erros in these stages, in addition to the Extradimensional shift stage – Unpaired t test). In the tolerance to delay of reward, no greater impulsivity of HI animals was observed, with both groups demonstrating similar behavior in this task. Moreover, the assessments of brain volume by Cavalieri method demonstrated atrophy in HI group in total hemisphere, cerebral cortex, white matter, hippocampus and striatum, especially on the side ipsilateral to the lesion (p ≤ ,05 – Unpaired t test). Considering these results, we can infer that neonatal HI is an environmental factor that could contribute to the development of behavioral characteristics observed in ADHD which are associated to general brain atrophy.

A hipóxia-isquemia (HI) neonatal é uma causa importante de deficits neurológicos. Estimativas relatam que 3-5 em cada 1.000 nascidos vivos ocorrem encefalopatia neonatal, sendo que, encefalopatia hipóxico-isquêmica (EHI) moderada ou grave acomete 0,5-1/1000 dos nascidos vivos. Aproximadamente 10 a 60% das crianças com EHI morrem, e pelo menos 25% dos que sobrevivem, apresentam deficiência permanente, como paralisia cerebral, epilepsia e dificuldades na aprendizagem. Evidências clínicas e experimentais sugerem que a exposição a estímulos nocivos no início da vida pode resultar em mudanças duradouras no processamento sensorial. Apesar da magnitude do problema, pouco se conhece sobre a modulação da dor e mecanismos envolvidos durante um processo hipóxico-isquêmico em neonatos e suas conseqüências ao longo da vida. Sendo assim, a presente tese objetivou avaliar respostas comportamentais e bioquímicas de filhotes de ratos submetidos à hipóxia/isquemia no 7°dia de vida, avaliados em diferentes idades. Ninhadas de ratos Wistar machos foram randomizadas em 6 grupos experimentais: controle, hipóxia-isquemia, isquemia, hipóxia, sham-ischemia, sham-hipóxia. O modelo experimental utilizado foi de HI unilateral descrito por Levine (1960) e adaptado por Rice e colaboradores (1981), realizando-se isquemia através da oclusão da carótida esquerda e hipóxia com câmara hipóxica de 92% de nitrogênio e 8% de oxigênio. Avaliaram-se os animais no 14° (P14), 30°(P30) e 60° (P60) dias de vida. Para avaliação da (s) resposta (s): nociceptiva térmica foram utilizados testes de tail-flick e placa quente; e alodinia mecânica utilizou-se teste de Von Frey eletrônico. Para as avaliações dos biomarcadores foram utilizados kits comerciais de BDNF e TNF por métodos ELISA e LDH por espectrofotometria. A ativação neuronal foi quantificada em lâminas de imunoistoquímica de c-fos em regiões CA1 e giro dentado de hipocampo bilateral. Foi observado que ratos com hypoxia e/ou isquemia tiveram diminuição irreversível de neurônios com ativação por c-fos em área CA1 do hipocampo, região ipsilateral do insulto. Maior sensibilidade em animais com HI em P14 foi observado no teste do Von Frey, mas não foi observada em P30 e P60. Independentemente do grupo experimental, a idade do animal desempenhou um papel significativo na resposta de comportamento nociceptivo, bem como sobre o BDNF e dos níveis séricos de TNF-α, mas não sobre os níveis séricos de LDH. Em conclusão, o insulto cerebral da HI induz uma redução significativa e irreversível sobre a ativação neuronal ipisilateral à lesão, com a evidência de uma alteração da resposta comportamental nociceptiva manifestada no curto, mas não a médio ou longo prazo. Biomarcadores de neuroplasticidade, inflamação e danos celulares apresentaram poucas alterações sobre o insulto cerebral, mas mudanças mais pronunciadas foram observadas com relação à idade. / Neonatal hypoxia-ischemia (HI) is an important cause of neurological deficits. It is estimated that 3-5 in 1000 newborns suffer neonatal encephalopathy, and moderate or severe hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) in 0,5-1/1000 of the newborns. Approximately 10 to 60% of the children with HIE die, and at least 25% of the survivors present permanent deficits such as cerebral palsy, epilepsy and learning difficulties. Clinical and experimental evidence suggest that the exposure to noxious stimuli at the beginning of the life might result in long lasting changes in sensorial processing. Despite the magnitude of the problem, few is known regarding pain modulation and its involved mechanisms during the HI process in neonates and its life lasting consequences. Hence, the present thesis aimed to evaluate behavioral and biochemical responses in rats’ litters submitted to HI during their seventh day of life, evaluated at different ages. Male Wistar rats’ litters were randomized into 6 experimental groups: control, HI, ischemia, hypoxia, sham-ischemia and sham-hypoxia. The experimental model was the one of unilateral HI described by Levine (1960) and adapted by Rice et al (1981), inducing ischemia by occlusion of the left carotid artery, and hypoxia using hypoxic chamber with nitrogen 92% and oxygen 8%. Animals were evaluated in their 14th (P14), 30th(P30) and 60th (P60) postnatal day. To assess the thermal nociceptive response the tail flick and hot plate test were employed; and mechanical allodynia was assessed by means of the digital Von Frey test. To evaluate biomarkers, commercial BDNF and TNF kits with ELISA, and LDH kits with spectrophotometry were used. Neuronal activation was quantified by c-fos immunohistochemistry in CA1 and dentate gyrus of bilateral hippocampi. It was observed that rats with hypoxia and/or ischemia had irreversible diminution of neurons with c-fos activation in the CA1 area of the hippocampus ipsilateral to the insult. Higher sensitivity in animals with HI at P14 was observed in the Von Frey test, but was not observed at P30 or at P60. Irrespective of the experimental group, animals’ age played a significant role in the nociceptive behavioral response, as well as on the BDNF and TNF-α serum levels, but not on the LDH serum levels. In conclusion, cerebral HI insult induces a significant and irreversible reduction on neuronal activation ipsilateral to the insult, with evidence of a significant alteration on the nociceptive behavioral response manifested in the short, but not in the medium or long term. Biomarkers of neuroplasticity, inflammation and cellular damage present few alterations after the cerebral insult, however more pronounced changes were observed related with age.

A hipóxia-isquemia (HI) encefálica neonatal pode gerar sequelas neurológicas permanentes nos indivíduos que sobrevivem a este evento precoce. Dentre estas sequelas, o diagnóstico de Transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) já foi relacionado em pesquisa clínica. Sabendo que não há consenso de um modelo adequado para o estudo do TDAH em pesquisa experimental, novas abordagens que contribuam para o desenvolvimento desse modelo são necessárias. Assim, o objetivo do presente estudo foi investigar se a HI neonatal contribui para o desenvolvimento das características comportamentais relacionadas ao TDAH na fase adulta em ratos e correlacionar os resultados comportamentais com o volume da lesão encefálica. Para isso, ratos Wistar machos foram divididos em dois grupos: hipóxia-isquemia (HI, n=12) e controle (CT, n=10). O procedimento de HI consistiu na combinação da oclusão da artéria carótida comum direita no 7º dia pós-natal com exposição a uma atmosfera hipóxica (8% O2 e 92% N2, durante 90 minutos). Durante a fase adulta, ao atingir dois meses de idade, os animais foram testados no teste attentional set-shifting (ASS) para avaliar flexibilidade comportamental atencional e no teste de tolerância ao atraso da recompensa, para avaliação da escolha impulsiva. Os resultados mostraram que os animais submetidos à HI apresentaram prejuízo na função executiva, avaliado no ASS, evidenciado por uma inflexibilidade comportamental quando a regra para a execução da tarefa era mudada (p ≤ ,05 para o número de tentativas para passar dos estágios de Reversão 2 e Reversão 3, assim como o número de erros nesses estágios, além do estágio de mudança extradimensional – Teste t não-pareado). No teste de tolerância ao atraso da recompensa, não foi observada uma maior impulsividade dos animais HI, tendo os dois grupos um comportamento similar neste teste. Além disso, as avaliações do volume encefálico pelo Método de Cavalieri demonstraram uma atrofia no grupo HI no hemisfério total, córtex cerebral, substância branca, hipocampo e estriado, principalmente no lado ipsilateral à lesão (p ≤ ,05, Teste t não-pareado). Considerando esses resultados, podemos inferir que a HI neonatal é um fator ambiental que pode contribuir para o desenvolvimento das características comportamentais observadas no TDAH, e que estas são associadas a uma atrofia encefálica geral. / Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HI) can cause permanent neurological sequelae in survivors of this early event. Among these sequelae, the diagnosis of attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) has already been linked in clinical research. There is no consensus about an ideal ADHD model in experimental research, being necessary new approaches that contribute to the development of this model. Thus, the aim of this study was to investigate whether HI contributes to the development of characteristics related to ADHD in adult rats and correlate the behavioral results with brain damage volume. Male Wistar rats were divided into two groups: hypoxia-ischemia (HI, n=12) and control (CT, n=10). The HI procedure consist of a permanent occlusion of the right common carotid artery followed by a period of hypoxia (90 min; 8% O2 and 92% N2), at seventh postnatal day (PND). Two months later, animals were evaluated in attentional set-shifting test (ASS) for assessment of attentional flexibility and in the tolerance to delay of reward, for evaluation of impulsivity choice. Our results demonstrated that animals submitted to HI manifest impairments in executive function, evidenced by a behavioral inflexibility when the rule for the execution of the ASS task was changed (p ≤ ,05 for number of trials to reach the criterion in Reversion 2 and 3 stages, as well as in number of erros in these stages, in addition to the Extradimensional shift stage – Unpaired t test). In the tolerance to delay of reward, no greater impulsivity of HI animals was observed, with both groups demonstrating similar behavior in this task. Moreover, the assessments of brain volume by Cavalieri method demonstrated atrophy in HI group in total hemisphere, cerebral cortex, white matter, hippocampus and striatum, especially on the side ipsilateral to the lesion (p ≤ ,05 – Unpaired t test). Considering these results, we can infer that neonatal HI is an environmental factor that could contribute to the development of behavioral characteristics observed in ADHD which are associated to general brain atrophy.

A hipóxia-isquemia (HI) neonatal é uma causa importante de deficits neurológicos. Estimativas relatam que 3-5 em cada 1.000 nascidos vivos ocorrem encefalopatia neonatal, sendo que, encefalopatia hipóxico-isquêmica (EHI) moderada ou grave acomete 0,5-1/1000 dos nascidos vivos. Aproximadamente 10 a 60% das crianças com EHI morrem, e pelo menos 25% dos que sobrevivem, apresentam deficiência permanente, como paralisia cerebral, epilepsia e dificuldades na aprendizagem. Evidências clínicas e experimentais sugerem que a exposição a estímulos nocivos no início da vida pode resultar em mudanças duradouras no processamento sensorial. Apesar da magnitude do problema, pouco se conhece sobre a modulação da dor e mecanismos envolvidos durante um processo hipóxico-isquêmico em neonatos e suas conseqüências ao longo da vida. Sendo assim, a presente tese objetivou avaliar respostas comportamentais e bioquímicas de filhotes de ratos submetidos à hipóxia/isquemia no 7°dia de vida, avaliados em diferentes idades. Ninhadas de ratos Wistar machos foram randomizadas em 6 grupos experimentais: controle, hipóxia-isquemia, isquemia, hipóxia, sham-ischemia, sham-hipóxia. O modelo experimental utilizado foi de HI unilateral descrito por Levine (1960) e adaptado por Rice e colaboradores (1981), realizando-se isquemia através da oclusão da carótida esquerda e hipóxia com câmara hipóxica de 92% de nitrogênio e 8% de oxigênio. Avaliaram-se os animais no 14° (P14), 30°(P30) e 60° (P60) dias de vida. Para avaliação da (s) resposta (s): nociceptiva térmica foram utilizados testes de tail-flick e placa quente; e alodinia mecânica utilizou-se teste de Von Frey eletrônico. Para as avaliações dos biomarcadores foram utilizados kits comerciais de BDNF e TNF por métodos ELISA e LDH por espectrofotometria. A ativação neuronal foi quantificada em lâminas de imunoistoquímica de c-fos em regiões CA1 e giro dentado de hipocampo bilateral. Foi observado que ratos com hypoxia e/ou isquemia tiveram diminuição irreversível de neurônios com ativação por c-fos em área CA1 do hipocampo, região ipsilateral do insulto. Maior sensibilidade em animais com HI em P14 foi observado no teste do Von Frey, mas não foi observada em P30 e P60. Independentemente do grupo experimental, a idade do animal desempenhou um papel significativo na resposta de comportamento nociceptivo, bem como sobre o BDNF e dos níveis séricos de TNF-α, mas não sobre os níveis séricos de LDH. Em conclusão, o insulto cerebral da HI induz uma redução significativa e irreversível sobre a ativação neuronal ipisilateral à lesão, com a evidência de uma alteração da resposta comportamental nociceptiva manifestada no curto, mas não a médio ou longo prazo. Biomarcadores de neuroplasticidade, inflamação e danos celulares apresentaram poucas alterações sobre o insulto cerebral, mas mudanças mais pronunciadas foram observadas com relação à idade. / Neonatal hypoxia-ischemia (HI) is an important cause of neurological deficits. It is estimated that 3-5 in 1000 newborns suffer neonatal encephalopathy, and moderate or severe hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) in 0,5-1/1000 of the newborns. Approximately 10 to 60% of the children with HIE die, and at least 25% of the survivors present permanent deficits such as cerebral palsy, epilepsy and learning difficulties. Clinical and experimental evidence suggest that the exposure to noxious stimuli at the beginning of the life might result in long lasting changes in sensorial processing. Despite the magnitude of the problem, few is known regarding pain modulation and its involved mechanisms during the HI process in neonates and its life lasting consequences. Hence, the present thesis aimed to evaluate behavioral and biochemical responses in rats’ litters submitted to HI during their seventh day of life, evaluated at different ages. Male Wistar rats’ litters were randomized into 6 experimental groups: control, HI, ischemia, hypoxia, sham-ischemia and sham-hypoxia. The experimental model was the one of unilateral HI described by Levine (1960) and adapted by Rice et al (1981), inducing ischemia by occlusion of the left carotid artery, and hypoxia using hypoxic chamber with nitrogen 92% and oxygen 8%. Animals were evaluated in their 14th (P14), 30th(P30) and 60th (P60) postnatal day. To assess the thermal nociceptive response the tail flick and hot plate test were employed; and mechanical allodynia was assessed by means of the digital Von Frey test. To evaluate biomarkers, commercial BDNF and TNF kits with ELISA, and LDH kits with spectrophotometry were used. Neuronal activation was quantified by c-fos immunohistochemistry in CA1 and dentate gyrus of bilateral hippocampi. It was observed that rats with hypoxia and/or ischemia had irreversible diminution of neurons with c-fos activation in the CA1 area of the hippocampus ipsilateral to the insult. Higher sensitivity in animals with HI at P14 was observed in the Von Frey test, but was not observed at P30 or at P60. Irrespective of the experimental group, animals’ age played a significant role in the nociceptive behavioral response, as well as on the BDNF and TNF-α serum levels, but not on the LDH serum levels. In conclusion, cerebral HI insult induces a significant and irreversible reduction on neuronal activation ipsilateral to the insult, with evidence of a significant alteration on the nociceptive behavioral response manifested in the short, but not in the medium or long term. Biomarkers of neuroplasticity, inflammation and cellular damage present few alterations after the cerebral insult, however more pronounced changes were observed related with age.

INTRODUÇAO: O uso da epinefrina na ressuscitação cardiopulmonar (RCP) tem sido questionado devido aos efeitos adversos como dano miocárdico e cerebral. Fármacos como azul de metileno têm sido estudados como adjuvantes, objetivando reduzir essas lesões. OBJETIVOS: Neste estudo objetivou-se avaliar o efeito da administração do azul de metileno em bôlus durante a RCP, na lesão miocárdica e cerebral. MÉTODO: Quarenta e nove ratos Wistar machos submetidos a parada cardíaca por fibrilação ventricular foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos com 11 animais: azul de metileno (GA, 2mg/kg), solução salina (GC, salina 0,9% 0,1ml), epinefrina (GE, 20mcg/kg), epinefrina + azul de metileno (GM), além do grupo sham com 5 animais. A fibrilação ventricular foi induzida por estimulação elétrica direto no ventrículo direito por 3 minutos, sendo mantidos por mais 2 minutos em anóxia. As manobras de RCP foram iniciadas com o fármaco correspondente de cada grupo, massagem torácica, ventilação e desfibrilação. Após retorno a circulação espontânea (RCE), os animais foram observados durante quatro horas. Foram coletados sangue para gasometria e troponina, tecido cardíaco e cerebral para análise histológica, marcação de TUNEL, marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo. Os grupos foram comparados por meio do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, com o teste de comparação múltipla com correção de Bonferroni quando adequado. RESULTADOS: Animais do grupo GE apresentaram 63% de RCE, enquanto o GC e GM obtiveram 40% e 45%, respectivamente, sem diferença estatística entre os grupos (p= 0,672). O grupo GA apresentou apenas 18% de RCE e foi excluído da análise. O tempo de RCP do GC foi maior comparado aos grupos GE e GM, mas sem diferença estatisticamente significativa. Os animais do grupo GM apresentaram PAM maior comparado ao grupo GC, no momento imediatamente após a RCE (P=0,007). Em todos os grupos os animais apresentaram acidose, queda da PaO2 e aumento do lactato após PCR e RCP. A mediana da troponina sérica foi maior no GC (130ng/ml) comparada ao grupo GE (3,8ng/ml), e GM (43,7ng/ml), porém sem diferença estatística. O grupo GC apresentou aumento significativo na expressão proteica dos marcadores BAX e TLR4. Não houve diferença estatística em relação a histologia e marcação de TUNEL entre os grupos submetidos a PCR. CONCLUSÃO: A utilização de azul de metileno em bolus na RCP de forma isolada apresentou resultados negativos em relação ao retorno da circulação espontânea. A utilização de azul de metileno associada a epinefrina não diminuiu a presença de lesões no cérebro e no coração decorrentes da parada cardíaca / INTRODUCTION: The use of epinephrine in cardiopulmonary resuscitation (CPR) has been questioned due to adverse effects such as myocardial and cerebral damage. Drugs such as methylene blue have been studied as adjuvants in order to reduce lesions. OBJECTIVES: The aim of this study was to evaluate the effect of methylene blue administration during CPR on myocardial and cerebral lesion. METHOD: Forty nine Wistar male rats submitted to ventricular fibrillation cardiac arrest (CA) were randomly assigned to four principal groups with 11 cases each one: methylene blue (MB, 2mg/kg), control (CTRL, 0.1ml saline 0.9%), epinephrine (EPI, 20?g/kg), epinephrine plus methylene blue (EPI+MB), and a sham group, wich have 5 cases. Ventricular fibrillation was induced by direct electrical stimulation in the right ventricle for 3 minutes and anoxia was maintained until a total of 5 minutes. CPR was initiated using the group drug, ventilation, chest compressions and defibrillation. The animals were observed for four hours after return of spontaneous circulation (ROSC). Blood samples were collected for blood gas and troponin measurements. Heart and brain tissues were harvested for the evaluation of oxidative stress, inflamation, histological and TUNEL staining. Groups were compared using the non-parametric Kruskal-Wallis test and Bonferroni post test. RESULTS: ROSC was achieved in 63% of the cases in EPI, 40% in CTRL, and 45% in EPI+MB (P=0.672). MB was excluded from analysis because of its low ROSC rate (18%). CPR duration was longer in CTRL compared to EPI and EPI+MB, without statistical significance. EPI+MB animals presented higher arterial pressure compared to the CTRL group, immediately after ROSC (P=0.007). All animals presented acidosis, decreased PaO2 and increased lactate after CA and CPR. Serum troponin was higher in CTRL (130ng/ml) compared with EPI (3.8ng/ml) and EPI+MB (43.7ng/ml), without statistical significance. CTRL presented higher BAX and TLR4 expression. There was no difference in TUNEL staining and histology among CA groups. CONCLUSION: Methylene blue in bolus during CPR did not improve outcome. Methylene blue combined with epinephrine did not decrease CA-related myocardial and cerebral lesions

A hipóxia-isquemia (HI) é a principal causa de mortalidade no período perinatal e, nos sobreviventes, a incidência de comorbidades neurológicas é elevada. O encéfalo imaturo, altamente susceptível ao insulto hipóxico-isquêmico, é bastante sensível a estímulos ambientais tais como o enriquecimento ambiental (EA). Os objetivos deste estudo foram: 1) investigar o desempenho comportamental em um novo teste de memória e aprendizagem, o Ox-maze; 2) analisar a atividade das enzimas Na+,K+-ATPase, catalase (CAT) e glutationaperoxidase (GPx) no hipocampo; 3) caracterizar os neurônios piramidais da região CA1 hipocampal quanto à arborização dendrítica; 4) analisar alterações astrocíticas e sinápticas pela avaliação da imunoreatividade das proteínas GFAP e sinaptofisina usando a técnica de imunofluorescência e, 5) quantificar a densidade celular por meio de cortes semifinos da região CA1 do hipocampo de animais hipóxico-isquêmicos expostos a um ambiente enriquecido. Ratos com sete dias de idade foram divididos em quatro grupos e submetidos ou não ao procedimento cirúrgico de acordo com o grupo experimental ao qual pertenciam: controle mantido em ambiente padrão (CTAP), controle em ambiente enriquecido (CTAE), HI em ambiente padrão (HIAP) e HI em ambiente enriquecido (HIAE). Passado o período de EA (1h/dia, 6 dias/semana, 9 semanas iniciando após o desmame), os parâmetros mencionados foram avaliados nos animais. Os dados indicaram que a HI causou um prejuízo na memória e no aprendizado no teste do “OX-maze”, o qual foi revertido pelo efeito do ambiente enriquecido. A HI causou diminuição da atividade enzimática da Na+,K+-ATPase no hipocampo contralateral, assim como uma redução na imunorreatividade à sinaptofisina e nadensidade neuronal, sendo que o EA foi efetivo na recuperação da atividade da enzima Na+,K+-ATPase e dos níveis de sinaptofisina no hipocampo contralateral à lesão. As atividades de CAT e GPX não foram alteradas pela HI em nenhum dos grupos avaliados, mesmo resultado encontrado nas análises de GFAP e de padrão de arborização dendrítica. Por fim, neste estudo foi observado o importante efeito lesivo causado pela HI neonatal e o papel do EA como estratégia neuroprotetora na recuperação funcional, na atividade da Na+,K+-ATPase e na expressão de sinaptofisina. Este estudo traz avanços em busca dos mecanismos pelos quais a melhora funcional ocorre em animais HI expostos ao EA, mas pode-se verificar que não fica totalmente esclarecido como esta estratégia atua. Outros estudos são necessários para a identificação de possíveis mecanismos que atuem como mediadores da resposta funcional do EA após um evento isquêmico. / Hypoxia-ischemia (HI) is the main mortality cause in perinatal period and, in survivors, the incidence of neurological disabilities is elevated. The immature brain, highly susceptible to hypoxic-ischemic insult, is sensible to environmental stimuli, as environmental enrichment (EE). The aims of this study were to investigate: 1) behavioral performance in a new memory and learning task, the oxmaze task; 2) evaluate Na+,K+-ATPase, catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx) activities in the hippocampus; 3) characterizes dendritic arbor in pyramidal neurons from CA1 region from hippocampus; 4) analyze alterations in hippocampal synaptophysin and GFAP immmunoreactivity and, 5) analyze neuronal density alterations in hippocampus of hypoxic-ischemic rats exposed to enriched environment. Seven-day-old rats were divided into four groups: controlmaintained in standard environment (CTSE), control submitted to EE (CTEE), HI in standard environment (HISE) and HI in EE (HIEE). Past the end of EE period (1 hour/day, 6 days/week, 9 weeks), mentioned parameters were evaluated in animals. Present results indicate learning and memory in the “OXmaze” task were impaired in HI rats and this effect was recovered after EE. On the contralateral hemisphere, HI caused a decrease in Na+,K+-ATPase activity that was recovered by EE. Results also indicate that HI damage decreases hippocampal synaptophysin immunoreactivity and neuronal density, moreover EE was effective in recovering synaptophysin levels on contralateral to the lesion hippocampus. The activities of GPx and CAT were not changed by HI in any group evaluated, some result founded on GFAP immunoreactivity and dendritic arborization characterization analysis. In conclusion, the important effect of HI lesion and the role of EE like neuroprotective strategy on functional impairment and on Na+,K+-ATPase activity and synaptophysin immunoreactivity was proven. Although this study have important advances in search of mechanisms by which the functional enhancement occurs in the animals submitted to HI and exposed to EE, it can be seen that it is not completely clear how this approach works. Further studies are needed to identify possible mechanisms that act as mediators of EE functional response after an ischemic event.