A olanzapina é um fármaco antipsicótico atípico utilizado no tratamento da esquizofrenia. Como efeitos adversos relacionados ao seu uso encontram-se obesidade, hiperlipidemia, diabetes mellitus tipo 2 e hipertensão, podendo acarretar no desenvolvimento de síndrome metabólica. O presente trabalho tem por objetivo realizar a monitorização terapêutica em pacientes na terapia com olanzapina, estabelecendo uma possível correlação entre a dose-concentração plasmática e a potenciação do risco a reações adversas, constituindo suporte clínico na eficácia do tratamento. A análise dos parâmetros antropométricos (peso, índice de massa corpóreo, circunferência do braço, circunferência do abdome, circunferência do quadril, prega cutânea triciptal, prega cutânea biciptal, prega cutânea subescapular, prega cutânea suprailíaca, resistência, porcentagem de massa gorda e taxa metabólica basal), parâmetros hemodinâmicos (pressão arterial sistólica, pressão arterial diastólica e freqüência cardíaca) e parâmetros bioquímicos (aspartato aminotranferase, alanina aminotransferase, gama glutamiltransferase, creatinina, ácido úrico, amilase, insulina, bilirrubinas, glicemia, cálcio, sódio e potássio), perfil lipídico (colesterol total, LDLcolesterol, HDL-colesterol e triglicérides), concentração de homocisteína e proteína C reativa, são relevantes na medida em que representam marcadores importantes de alterações relacionadas a desordens metabólicas ou de risco aterosclerótico. Como a obesidade e as coronariopatias podem induzir tais alterações, é importante avaliar qual o risco que o aumento de peso induzido pela olanzapina traz para o paciente esquizofrênico. A análise estatística foi realizada utilizando-se um modelo linear de efeito misto, apropriado para análise de medidas realizadas ao longo de um período pré-estabelecido. O nível de significância foi fixado em p<0,05. / The olanzapine is an atypical antipsychotic drug used to treat schizophrenia. How adverse effects related to its use, are obesity, hyperlipidemia, diabetes mellitus type II and hypertension, may result in the development of metabolic syndrome. This study aims to carry out monitoring therapy in patients in treatment with olanzapine, establishing a possible correlation between the dose-plasma concentration and potentiation of the risk to adverse reactions, providing clinical support in the effectiveness of treatment. Analysis of anthropometric parameters (weight, body mass index, arm circumference, circumference of the abdomen, the hip circumference, triceps skinfold thickness, biciptal skin fold, subscapular skin fold, skin fold suprailíaca, strength, percentage of fat mass and metabolic rate basal), hemodynamic parameters (systolic blood pressure, diastolic blood pressure and heart rate) and biochemical parameters (aspartate aminotranferase, alanine aminotransferase, gamma glutamyl transferase, creatinine, uric acid, amylase, insulin, total bilirubin, glucose, calcium, sodium and potassium ), lipid profile (total cholesterol, LDL-cholesterol, HDL-cholesterol and triglycerides), concentration of homocysteine and C-reactive protein, are relevant in so far represent important markers of changes related to metabolic disorders and atherosclerotic risk. As obesity and coronary diseases can induce such changes, which is important to evaluate the risk that the weight gain induced by olanzapine brings to the schizophrenic patient. Statistical analysis was performed using a mixed effect linear model, suitable for analysis of measurements taken over a pre-established. The significance level was set at p <0.05.

A hiper-homocisteinemia leve é um fator de risco para doenças cerebrais e cardiovasculares embora os mecanismos subjacentes a essas alterações não estejam completamente elucidados. O objetivo principal desta tese de doutorado foi desenvolver um modelo experimental crônico quimicamente induzido de hiper-homocisteinemia leve em ratos adultos. Usando esse modelo, investigamos alguns parâmetros bioquímicos no sistema nervoso central e periférico, a fim de melhor compreender os mecanismos envolvidos na toxicidade mediada pela homocisteína. A hiper-homocisteinemia leve foi induzida em ratos Wistar através da administração subcutânea de homocisteína (0,03 μmol/g de peso corporal), duas vezes ao dia, do 30° a 60° dia de vida. Ratos controle receberam o mesmo volume de solução salina. Resultados demonstraram que animais submetidos a esse modelo apresentaram níveis plasmáticos de homocisteína de aproximadamente 30 μM. Em relação aos parâmetros bioquímicos, a hiper-homocisteinemia leve experimental induziu estresse oxidativo em plasma, córtex cerebral, coração e aorta, bem como diminuiu a atividade e o imunoconteúdo das subunidades catalíticas α1 e α2 da Na+,K+-ATPase em córtex cerebral e hipocampo de ratos adultos. Por outro lado, não foram observadas alterações nos níveis de mRNA transcrito da Na+,K+-ATPase em nenhuma estrutura cerebral estudada. A hidrólise de ATP, ADP e AMP foi significativamente diminuída em linfócitos e sinaptossomas obtidos de córtex cerebral, mas não foi alterada em soro de ratos adultos. A transcrição da ecto-5'-nucleotidase foi significativamente reduzida, mas a expressão das E-NTPDases não foi alterada em linfonodos mesentéricos de ratos submetidos à hiper-homocisteinemia leve experimental. Foi observado um aumento nos níveis de mRNA transcrito da E-NTPDase1 e ecto-5'-nucleotidase em córtex cerebral de ratos. Os níveis de ATP foram aumentados, enquanto a adenosina foi diminuída no líquor de ratos tratados com homocisteína. Em relação aos parâmetros inflamatórios, foi observado um aumento nos níveis de TNF-α, IL-1β, IL-6 e a quimiocina MCP-1 no hipocampo, enquanto os níveis de IL-1β e a IL-6 foram aumentados em córtex cerebral. Os ratos submetidos à hiper-homocisteinemia leve apresentaram um aumento na atividade da acetilcolinesterase em ambas as estruturas cerebrais testadas; o imunoconteúdo dessa enzima foi significativamente aumentado no córtex cerebral e diminuído no hipocampo, enquanto os níveis de mRNA transcrito da acetilcolinesterase não foram alterados. Perifericamente, a homocisteína aumentou os níveis de TNF-α, IL-6 e MCP-1 em coração e os níveis de IL-6 no soro, mas não alterou a atividade da enzima butirilcolinesterase. Em conjunto, os resultados deste trabalho mostram que a homocisteína promove um estado oxidativo e inflamatório central e periférico além de prejudicar a funcionalidade de enzimas cerebrais importantes. Considerando que a hiper-homocisteinemia leve é prevalente na população e tem sido considerada um fator de risco para o desenvolvimento de doenças cerebrais e cardíacas, o presente modelo experimental pode ser útil na investigação da patofisiologia de doenças causadas pela homocisteína e estratégias de prevenção. / Mild hyperhomocysteinemia is a risk factor for cerebral and cardiovascular diseases although the mechanisms underlying these alterations are not fully understood. The main objective of this doctoral thesis was to develop a chronic chemically-induced model of mild hyperhomocysteinemia in adult rats. By using this model, we investigated some biochemical parameters in the central nervous system and peripheral, in order to better understand the mechanisms involved in homocysteine-mediated toxicity. The mild hyperhomocysteinemia was induced in rats by subcutaneous administration of homocysteine (0.03 μmol/g body weight) twice a day to the 30th to 60 day of life. Control rats received the same volume of saline. Results showed that animals subjected to this model had plasma homocysteine levels of approximately 30 μM. Results demonstrated that the experimental mild hyperhomocysteinemia elicited oxidative stress in plasma, cerebral cortex, heart and aorta and decreased the activity and the immunocontent of the α1 and α2 subunits of the Na+,K+-ATPase in cerebral cortex and hippocampus of adult rats. On the other hand, no change in levels of Na+,K+-ATPase mRNA transcripts in such cerebral structures. ATP, ADP and AMP hydrolysis were significantly decreased in lymphocytes and in the synaptosomal fraction of cerebral cortex, without any alteration in serum of adult rats. The transcript of the ecto-5'-nucleotidase was significantly reduced, but the expression of E-NTPDases were not altered in mesenteric lymph nodes of hyperhomocysteinemic rats. I have been observed an increase in E-NTPDase1 and ecto-5′-nucleotidase transcripts in rat cerebral cortex. ATP levels were increased, while adenosine decreased in cerebrospinal fluid of Hcy-treated rats. In relation to inflammatory parameters, was observed an increase in TNF-α, IL-1β, IL-6 and the chemokine MCP-1 in the hippocampus, while IL-1β and IL-6 levels were enhanced in cerebral cortex. Rats subjected to mild hyperhomocysteinemia presented an increase in acetylcholinesterase activity in both cerebral structures tested; the immunocontent of this enzyme was significantly increased in the cerebral cortex and decreased in the hippocampus while levels of acetylcholinesterase mRNA transcripts were not altered. Peripherally, homocysteine increased TNF-α, IL-6 and MCP-1 levels in the heart and IL-6 levels in serum, but not altered the butyrylcholinesterase activity. Together, the results of this work show that homocysteine promotes central and peripheral oxidative and inflammatory state besides affecting the functionality of important brain enzymes. Whereas mild hyperhomocysteinemia is prevalent in the population and has been considered a risk factor for the development of brain and heart diseases, this experimental model may be useful for the investigation of patophysiology of diseases caused by homocysteine and prevention strategies.

A ciclosporina (CsA) é um agente imunossupressor freqüentemente utilizado na clínica para a prevenção da rejeição ao transplante e no tratamento de doenças auto-imunes. Apesar da ação no sistema imune, o tratamento com CsA apresenta efeitos adversos graves. Múltiplos fatores de confusão na prática clínica, incluindo fatores de risco prévios, diferenças genéticas e de resposta imune dos receptores do órgão dificultam a determinação dos efeitos adversos especificamente relacionados ao tratamento com CsA. A busca por protocolos de imunossupressão eficazes, que não afetem a qualidade de vida dos pacientes conduz a investigação do envolvimento da CsA em doenças vasculares. A doença vascular é uma das principais causas de morbidade e mortalidade entre pacientes transplantados e o tratamento com CsA parece estar envolvido neste evento. O objetivo desta tese foi investigar parâmetros bioquímicos sistêmicos envolvidos em distúrbios vasculares induzidos pelo tratamento crônico com CsA em ratos não-transplantados. Primeiramente, demonstramos que o nosso protocolo de administração de CsA foi capaz de induzir imunossupressão, com diminuição dos níveis séricos de citocinas que medeiam a resposta imunológica (IL-1α, IL-1β e IL-2), sem causar nefro e hepatotoxicidade. Além disso, verificamos um perfil bioquímico coerente com intolerância à glicose, incluindo a diminuição dos níveis séricos de insulina em jejum e alteração do teste de tolerância à glicose, sugerindo o desenvolvimento de um perfil de diabetes em ratos tratados com CsA 15 mg/kg. O tratamento com CsA também aumentou os níveis de homocisteína total (tHcy), um fator de risco para doenças cardiovasculares. Os níveis de fibrinogênio no plasma, o número de plaquetas, os níveis séricos de triglicérides, colesterol e VLDL também aumentaram com o tratamento de CsA 15 mg/kg. Além disso, demonstramos que a atividade ecto-nucleotidásica sobre nucleotídeos de adenina em soro foi inibida pelo tratamento com CsA. Ratos tratados com CsA apresentaram uma diminuição na hidrólise de ATP, ADP e AMP em soro, além de aumento dos níveis plasmáticos de ADP e redução dos níveis de adenosina (ADO). Enquanto os níveis de tHcy correlacionaram-se negativamente com a inibição da hidrólise de nucleotídeos e os níveis plasmáticos de ADO, esta correlação foi positiva para os níveis plasmáticos de ADP. Isto sugere que a inibição da atividade ectonucleotidásica pode estar relacionada ao aumento dos níveis séricos de tHcy. Além disso, a análise morfológica de ratos tratados com CsA 15 mg/kg apresentou lesão celular e resposta inflamatória envolvendo o endotélio e a camada íntima da artéria aorta. Em conclusão, as evidências obtidas nesta tese podem ser relevantes para futuros estudos que visam investigar os mecanismos de ação da CsA sobre os distúrbios vasculares que acompanham seu uso. Além disso, contribuímos para a elucidação de um método de quantificação das purinas derivadas da adenina e guanina em plasma e líquor por HPLC. Esta metodologia tem sido amplamente utilizada em amostras de humanos, ratos e camundongos, contribuindo para o esclarecimento dos mecanismos de ação das purinas. / Cyclosporine (CsA) is an immunosuppressive agent frequently used in the clinic for prevention of allograft rejection and for the treatment of autoimmune diseases. Despite its desired action on the immune system, CsA treatment may present serious adverse effects. It is difficult to distinguish, in the clinical setting, a direct effect of CsA treatment from other confounding variables, such as allograft rejection and effects due to other drug therapies. The search for effective immunosuppression protocols which does not affect the quality of life of patients is driving research to investigate the CsA involvement in vascular diseases. Vascular disease is a major cause of morbidity and mortality among transplanted recipients and CsA treatment has been consistently implicated in this event. Here, we investigate systemic biochemical parameters involved in vascular disturbances induced by chronic CsA treatment in non-transplanted rats. Firstly, we demonstrate that our CsA immunosuppressive protocol was able to induce immunosuppression by decreasing the serum levels of cytokines that mediate immunological responses (IL-1α, IL-1β and IL-2) without causing nephro and hepatotoxicity. Moreover, we demonstrate biochemical profile coherent with glucose intolerance, including decreased fasting serum insulin levels and altered glucose tolerance test, suggesting the development of a framework straight to diabetes on CsA 15 mg/kg treated group. CsA treatment also increased serum total homocysteine (tHcy) concentration, an important and independent risk factor for cardiovascular diseases. Plasma fibrinogen levels, platelet number, serum triglycerides, cholesterol and VLDL were also increased by CsA 15 mg/kg treatment. Also, we showed that ectonucleotidase activities on adenine nucleotides in serum were inhibited by CsA treatment. CsA treated rats showed a decrease in serum ATP, ADP and AMP hydrolyzes, and increased ADP and decreased ADO plasma levels. THcy levels correlated negatively with the inhibition of nucleotides hydrolyzes and ADO plasma levels, and positively with ADP plasma levels. These correlations suggest that the inhibition of serum ecto-nucleotidase activities could be related to the increase of serum tHcy levels. In addition, morphological evaluation of CsA 15 mg/kg treated rats exhibited cell injury and inflammatory response involving the endothelium and the intimal layer of aorta artery. In conclusion, the evidences obtained in this thesis may be relevant for future studies that aim to investigate the mechanisms of action of CsA on vascular disturbances that accompany patients under immunosuppressive therapy with CsA. In addition, we contribute to the elucidation of a method for quantification of adenine- and guanine-based purines in plasma and cerebrospinal fluid by HLPC. This methodology has been widely used in human, mice and rats samples, contributing to the elucidation of the mechanisms of action of purines.

Se realizó un estudio de tipo descriptivo – observacional retrospectivo de casos y controles de los niveles plasmáticos de homocisteína total en pacientes tratados con fenitoína atendidos en Consultorio Externo del Departamento de Neurocirugía del Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen durante el período Abril - Noviembre 2003. Se analizaron 45 casos en la que se evaluaron los niveles de homocisteína plasmática en pacientes tratados con fenitoína; detectándose 14 pacientes con hiperhomocisteinemia moderada que representa el 31,11%; presentándose dentro del rango de 17 a 73 años mayormente en el grupo etáreo de pacientes varones de 47 a 73. Se evaluaron también los niveles de ácido fólico en pacientes con prescripción de fenitoína, cuyos valores fueron más bajos con respecto a los pacientes que no recibían dicho medicamento. / A descriptive – observational retrospective cases and controls study of levels of total homocysteine in patients with medic prescription of phenytoin attending in Neurosurgery facility of Guillermo Almenara Irigoyen National Hospital during April – November 2003 of was carried out. It was analized 45 cases of patients in that facility during 6 months in order to assess the levels of plasmatic homcysteine, it was detected 14 patients with levels of moderate hyperhomocisteinemia, having obtained an incidence of 31, 11 %; particularly presented in male patients and between 62-73 and 47-61 years old. It was evaluated the levels of folic acid in patients have like a medic prescription the use of phenytoin, which ones were lower with regard to controls patients.

A hiperhomocisteinemia severa ou homocistinúria clássica é um erro inato do metabolismo caracterizado pela deficiência na atividade da enzima cistationina- -sintetase. Estudos mostram que perturbações bioenergéticas, inflamatórias e o estresse oxidativo parecem estar relacionados às alterações causadas pela hiperhomocisteinemia severa. Alterações em alguns desses parâmetros em encéfalo, fígado e rim de ratos submetidos a esse modelo experimental já foram observadas em estudos prévios realizados em nosso laboratório. Considerando que pacientes com hiperhomocisteinemia severa apresentam alterações musculares, o objetivo principal dessa tese foi padronizar técnicas para avaliar alguns parâmetros de metabolismo energético, estresse oxidativo e inflamação em músculo esquelético de ratos jovens. Também avaliamos a bioenergética e a atividade da enzima Na+,K+-ATPase em amígdala desses animais. A atividade da butirilcolinesterase e parâmetros inflamatórios também foram avaliados em soro. O efeito do tratamento com creatina sobre as possíveis alterações nos parâmetros bioquímicos encontradas nesse modelo experimental também foi investigado. A hiperhomocisteinemia severa foi induzida em ratos Wistar através da administração subcutânea de homocisteína ou salina (controle), do 6º ao 28º, onde as doses variam de acordo com o desenvolvimento dos animais, atingindo 0,03 μmol/g de peso corporal. Os animais receberam uma injeção intraperitoneal por dia de creatina (50 mg/Kg) concomitante com a administração de homocisteína ou salina (controle). Em relação aos parâmetros bioquímicos no músculo esquelético, mostramos que a homocisteína é capaz de diminuir tanto a viabilidade celular, como a oxidação da glicose, bem como alterar enzimas chave para a manutenção da homeostase energética, como piruvato cinase, creatina cinase e enzimas do ciclo de Krebs e da cadeia transportadora de elétrons. Além disso, a homocisteína aumentou a produção de espécies reativas e lipoperoxidação, alterou as enzimas antioxidantes e o conteúdo de glutationa reduzida, sulfidrilas, carbonilas e nitritos. Em relação aos parâmetros inflamatórios foi observado um aumento nos níveis das citocinas TNF-α, IL-1β and IL-6, proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1) em músculo esquelético e soro de ratos. Os ratos submetidos à hiperhomocisteinemia severa apresentaram um aumento na atividade da acetilcolinesterase em músculo esquelético. A enzima butirilcolinesterase não teve sua atividade alterada em soro de ratos. Em conjunto, os resultados desse trabalho mostram que a homocisteína promove perturbações no metabolismo energético, insultos oxidativos e inflamatórios, além de prejudicar a funcionalidade de enzimas importantes em músculo esquelético de ratos jovens. Em relação à amígdala, mostramos que a homocisteína é capaz de alterar enzimas essenciais da cadeia transportadora de elétrons, funções mitocondriais importantes como massa e potencial, diminuir a atividade e o imunoconteúdo da Na+,K+-ATPase e causar apoptose em amígdala de ratos jovens. A creatina foi capaz de prevenir alterações importantes em músculo esquelético, amígdala e soro desses animais submetidos ao modelo crônico de hiperhomocisteinemia severa, onde ela contribuiu para a homeostase energética celular e pôde atuar como antioxidante. Sendo usada com cautela, pode se tornar um adjuvante terapêutico promissor para minimizar sintomas característicos de pacientes homocistinúricos. / Severe hyperhomocysteinemia or classical homocystinuria is an inborn error of metabolism characterized by a deficiency in the activity of cystathionine- synthetase enzyme. Studies show that bioenergy disturbances and oxidative stress appear to be related to changes caused by severe hyperhomocysteinemia. Changes in some of these parameters in brain, liver and kidney of rats undergoing this experimental model have been observed in previous studies performed in our laboratory. Whereas patients with severe hyperhomocysteinemia have muscle disorders, the main objective of this thesis was to standardize techniques for assessing some energy metabolism parameters, oxidative stress and inflammation in skeletal muscle of young rats. We also evaluate the bioenergetics and enzyme activity of Na+, K+ -ATPase in the amygdala of these animals. The activity of butyrylcholinesterase and inflammatory parameters were also evaluated in serum. The effect of treatment with creatine on the possible changes in biochemical parameters found in this experimental model was also investigated. The severe hyperhomocysteinemia was induced in rats by subcutaneous administration of homocysteine or saline (control), 6th to 28th, and the doses vary according to the development of animals, totaling 0.03 μmol/g body weight. The animals received one intraperitoneal injection of creatine per day (50 mg/kg) with concomitant administration of homocysteine or saline (control). The biochemical parameters in the skeletal muscle, show that homocysteine can reduce both cell viability and glucose oxidation, and change the key enzymes for the maintenance of energy homeostasis, such as pyruvate kinase and creatine kinase enzymes cycle Krebs and electron transport chain. In addition, homocysteine increased ROS generation and lipid peroxidation, altered the antioxidant enzymes and the reduced glutathione content, sulfhydryl, carbonyl and nitrites. Regarding inflammatory parameters was observed increased levels of cytokines TNF-α, IL- 1β and IL-6 chemotactic protein-1 monocytes (MCP-1) in skeletal muscle and serum of rats. The rats with severe hyperhomocysteinemia showed an increase in acetylcholinesterase activity in skeletal muscle. The enzyme butyrylcholinesterase had not changed their activity in rat serum. Taken together, the results of this work show that homocysteine promotes disruption of energy metabolism, oxidative and inflammatory insults, and impair the functionality of important enzymes in skeletal muscle of young rats. Regarding the amygdala showed that homocysteine can alter essential enzymes of the carrier electrons chain significant mitochondrial functions as a mass and the potential, decrease the activity and immunocontent Na+, K+ -ATPase and cause apoptosis in amygdala of young rats. Creatine was able to prevent major changes in skeletal muscle, amygdala and serum of these animals subjected to chronic model of severe hyperhomocysteinemia, where she contributed to the energy cell homeostasis and could act as an antioxidant. Being used with caution, it can become a promising therapeutic adjuvant to minimize symptoms characteristic of homocistinurics patients.

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo de aminoácidos causado pela deficiência severa na atividade da enzima cistationina β-sintase, o que resulta no acúmulo tecidual de homocisteína e metionina. Pacientes afetados geralmente apresentam aterosclerose, retardo mental, convulsões e isquemia cerebral. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos responsáveis por estas manifestações são pouco conhecidos. A isquemia cerebral é caracterizada por uma redução grave ou pelo bloqueio completo do fluxo sanguíneo normal em alguma região do cérebro, geralmente causada por um trombo ou uma hemorragia. O estresse oxidativo parece ser um dos principais mecanismos envolvidos no dano celular induzido por isquemia e a administração de antioxidantes, em alguns casos, pode prevenir alguns desses danos. Considerando que: a) pacientes com homocistinúria apresentam alterações neurológicas e que são mais suscetíveis à isquemia, b) o estresse oxidativo parece estar envolvido na fisiopatogenia tanto da homocistinúria quanto da isquemia cerebral c) o ácido fólico reduz os níveis plasmáticos de homocisteína e pode ter efeitos antioxidantes, e) o pré-tratamento com vitaminas E e C previne os efeitos da Hcy sobre a Na+, K+-ATPase e sobre a memória, neste trabalho nós verificamos os efeitos in vivo e in vitro da homocisteína sobre fatias de hipocampo de ratos submetidas à privação de oxigênio e glicose, um modelo in vitro de isquemia cerebral, e também os efeitos do pré-tratamento com antioxidantes, vitamina E mais C e ácido fólico sobre o dano celular causado pela homocisteína. Os resultados mostraram que a homocisteína in vitro (100 e 500 μM), aumentou a liberação de lactato desidrogenase (LDH) para o meio de incubação, sugerindo um aumento no dano celular causado pela isquemia. Além disso, tanto o modelo agudo quanto o crônico de hiperhomocisteinemia aumentou a morte celular quando os animais foram sacrificados 1 hora após a administração de homocisteína. Nossos resultados também mostraram que o pré-tratamento com ácido fólico foi capaz de prevenir completamente o dano causado pela administração aguda de homocisteína, enquanto que a vitamina E preveniu apenas parte deste efeito. Estes achados podem ser relevantes para explicar, pelo menos em parte, a maior susceptibilidade dos pacientes hiperhomocisteinêmicos de apresentar eventos issquêmicos e apontam uma possível estratégia de prevenção. / Homocystinuria is an inherited metabolic disorder caused by severe deficiency of cystationine β-synthase activity, resulting in the tissue accumulation of homocysteine and methionine. Affected patients usually present atherosclerosis, mental retardation, seizures, and stroke. However, the physiopatological mechanisms are not yet fully established. Cerebral ischemia is defined as a severe reduction or blockage of normal blood flow in the brain, usually caused by thrombosis or hemorrhage. Oxidative stress seem to be one of major mechanisms involved on cellular damage induced by ischemia, and antioxidants administration, sometimes, can prevent this damage. Considering that: a) homocystinuric patients present neurological alterations and are more susceptible to ischemia, b) oxidative stress is involved on pathogenia such of homocystinuria as of cerebral ischemia, c) folic acid reduces the serum levels of homocisteine and could have antioxidant effects, c) pretreatment with vitamins E and C prevent the effects of homocysteine on Na+, K+-ATPase activity and on memory, in this work we verified the in vivo and in vitro effects of homocysteine on rat hippocampal slices exposed to oxygen and glucose deprivation, an in vitro model of cerebral ischemia, we also investigated the effects of pretreatment with antioxidants, vitamin E plus C and folic acid on cellular damage caused by homocysteine. Results showed that homocysteine in vitro (100 and 500μM), both chronic (1 h after homocysteine administration) and acute hyperhomocysteinemia increased the LDH release to the incubation medium, suggesting an increase of tissue damage caused by ischemia. Furthermore, results showed that both chronic (1 h after homocysteine administration) and acute hyperhomocysteinemia increased the cellular death. Our results also demonstrated that pretreatment with folic acid completely prevented the damage caused by acute homocysteine administration, whereas vitamin E just partially prevented such effect. These findings may be relevant to explain, at least in part, the higher susceptibility of hyperhomocysteinemic patients to bear ischemic events and point to a possible preventive treatment.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:44:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Objetivos: Estudar em ratos albinos portadores de diabetes melito induzido por estreptozotocina: 1. Valores plasmáticos de homocisteína. 2. Concentrações plasmáticas de fator von Willlebrand. 3. Valores séricos de colesterol total e frações e triglicérides. 4. Possíveis correlações entre valores plasmáticos de homocisteína, fator von Willebrand, colesterol total e frações e triglicérides. Métodos: 35 ratos (rattus norvegicus albinus), machos, adultos (peso 180-200g), com glicemias aferidas foram randomizados em três grupos: 1. Controle (n=10) - não receberam droga ou veículo; 2. “Sham” (n=10) - receberam solução (tampão citrato 0.1M, pH4.5) veículo da estreptozotocina e 3. Diabetes (n=15) - receberam estreptozotocina (Sigma® ) para indução do diabetes melito (60 mg/kg de peso) em dose única; via intraperitoneal, diluída em 0.3mL de solução veículo. Foram considerados diabéticos todos os ratos cujos valores de glicemia foram iguais ou superiores a 250mg/dL. Após 08 semanas de indução do diabetes melito os ratos foram pesados, as glicemias aferidas e anestesiados com ionembutal (Sigma® ) via intraperitoneal (50mg/kg peso). Colheu-se sangue da artéria aorta abdominal para determinação dos valores de homocisteína plasmática total seguindo metodologia descrita, através de ensaio HPLC (Shimadzu® ). O sangue restante foi centrifugado e o soro e o plasma aliquotados e congelados até determinação do fator von Willebrand (técnica de ELISA) e concentrações séricas de glicose de jejum final, colesterol total e frações HDL-, LDL- e VLDL-colesterol, triglicérides e creatinina. Os resultados foram expressos em média + desvio padrão. Para análise estatística utilizou-se a análise de variância (ANOVA), seguido do teste de comparações múltiplas de Tukey e quando necessário o teste Brown Forsythe, seguido do procedimento de comparações múltiplas de Dunnett. Para a construção dos diagramas de dispersão das variáveis calculou-se os coeficientes de correlação de Pearson. Resultados: O modelo foi reprodutível em 100% dos animais. A média dos valores de glicemia inicial foi: 88,7±5,9mg/dL (controle); 88,9±8,2mg/dL (“sham”) e 85,1±5,2mg/dL (diabetes). Através da ANOVA não houve diferença das médias de glicemia inicial entre os grupos (p=0,24). A média da glicemia final foi: 85,0±7,1mg/dL (controle); 80,9±5,0mg/dL (”sham”) e 353,5±98,2mg/dL (diabetes). Houve diferença estatisticamente significante entre o grupo diabetes e os demais (p<0,01). A média das concentrações plasmáticas de homocisteína foi: 7,9±2,3µmol/L (controle); 8,6±2,2µmol/L (“sham”) e 6,1±1,3µmol/L (diabetes), com diferença entre os grupos (p<0,01). A média dos valores do fator von Willebrand foi 0,15±0,3U/L (controle), 0,16±0,2U/L (“sham”) e 0,18±0,4U/L (diabetes), com diferença entre os grupos (p<0,05). Os valores de colesterol total tiveram médias de: 123,9±40,8mg/dL (controle); 107,0±38,6mg/dL (“sham”) e 87,5±5,9mg/dL (diabetes). A ANOVA mostrou diferença entre os grupos (p<0,05). No grupo diabetes houve correlação inversa entre glicemia final e ganho de peso, homocisteína e colesterol total, homocisteína e fração VLDL-colesterol e homocisteína e triglicérides. Conclusões: Neste estudo, utilizando como modelo biológico o diabetes melito induzido por estreptozotocina em ratos albinos, nas condições de experimento apresentadas, torna-se lícito concluir: 1. Os ratos diabéticos apresentaram valores menores de homocisteína. 2. O grupo diabetes apresentou valores maiores de fator von Willebrand. 3. Houve correlação inversa entre homocisteína e colesterol total, homocisteína e fração VLDL-colesterol e homocisteína e triglicérides. 4. Não houve correlação entre glicemia final e homocisteína, glicemia final e fator von Willebrand e homocisteína e fator von Willebrand nos ratos diabéticos. 5. Houve correlação inversa entre ganho de peso e glicemia final nos ratos diabéticos. / Purpose: To determine plasma levels of homocysteine, von Willebrand factor, triglycerides and total cholesterol and fractions, in rats with diabetes induced by streptozotocin and evaluate possible correlations among these parameters. Methods: Adult male norvegicus albino rats (n=35), weigh (180-200g) were randomized into three groups: treated group (n=15), with diabetes induced by streptozotocin; sham group (n=10), treated with saline solution and normal control group (n=10), no treated. Initial fasting glucose was determinated before diabetes induction. Diabetes was induced by a single bolus intraperitoneal injection of streptozotocin, 60mg/kg/dose, diluted in citrate buffer (0.1M, pH4.5). Diabetes was confirmed by blood glucose levels ≥250mg/dL. Eight weeks after diabetes induction, animals were weighted and blood samples were collected from abdominal aorta for plasma levels of total homocystein, von Willebrand factor, final fasting glucose, total cholesterol and fractions (HDL-, LDL- and VLDL-cholesterol), triglycerides and creatinin. The results were expressed as the mean+SD. Data were analyzed using analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey test or Brown Forsythe test followed by Dunnett test. Pearson test was used to correlate the parameters. The level of significance was set at p<0.05. Results: Disease model reproducibility was observed in 100% of tested animals. Mean plasma levels of initial fasting glucose according to animal group were: 85.1±5.2mg/dL for treated group, 88.9±8.2mg/dL for sham and 88.7±5.9mg/dL for control group. Statistical analysis (ANOVA) showed no significant difference among the three groups (p=0.24). Mean plasma levels of final fasting glucose, according to animal group were: 353.5±98.2mg/dL for treated group, 80.9±5.0mg/dL for sham and 85.0±7.1mg/dL for normal control. Statistical analysis showed that the difference between the treated group and the two other groups was statistically significant (p<0.01). Mean plasma concentration of homocystein according to animal groups was: 6.1±1.3µmol/L for treated group, 8.6±2.2µmol/L for sham and 7.9±2.3µmol/L for control group. Statistical analysis showed a significant difference in the three groups (p<0.01). Mean values for von Willebrand factor were: 0.18±0.4U/L for treated group, 0.16±0.2U/L for sham group and 0.15±0.3U/L for control group. Significant statistical difference was found among the three groups (p<0.05). Mean plasma levels of total cholesterol according to animal groups were: 87.5±5.9mg/dL for treated group, 107.0±38.6mg/dL for sham and 123.9±40.8mg/dL for control group. Significant statistical difference was found among the three groups (p<0.05). There was no statistical significant difference in the mean values of cholesterol fraction (LDL, HDL, VLDL), triglycerides and creatinin among the three groups. A negative correlation between final plasma glucose and weight gain, homocystein and total cholesterol, homocystein and VLDL-cholesterol and homocystein and triglycerides was found in the treated (diabetes) group. Conclusions: In this study, results from streptozotocin-induced diabetes rats showed: 1. Lower levels of homocystein; 2. Higher levels of von Willebrand factor; 3. Negative correlation between homocystein and total cholesterol; 4. No correlations between final fasting glucose and homocystein, final fasting glucose and von Willebrand factor and homocystein and von Willebrand factor; 5. Negative correlation between weight gain and final fasting glucose. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências / Made available in DSpace on 2012-10-23T03:34:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 238395.pdf: 1566108 bytes, checksum: 2d17804e5f120f0c40415fc3ca1b8adb (MD5) / O objetivo do estudo foi verificar a ação da homocisteína (HC) e do ácido fólico (AF), isoladamente e em conjunto, no desenvolvimento embrionário, com ênfase no padrão morfológico, neurulação e estrutura organizacional do telencéfalo (TEL) e medula espinhal embrionária (ME); para tanto, utilizamos o modelo de Gallus domesticus. Foram constituídos 5 grupos experimentais: 2 controles # Controle Fechado (GC1) e Controle Salina (GC2) # e 3 tratados # HC (G3), HC e AF (G4) e AF (G5), cada um com N=10. Ovos fertilizados foram numerados, pesados e incubados em estufa apropriada (38°C e 65% de umidade). Após 32 horas (8-9HH), foram retirados da estufa e efetuouse uma abertura na face superior mediana do ovo (1,5cm de diâmetro). Esta permitiu a visualização do embrião e o tratamento: 25Yl de salina (GC2), 10Ymol de D,L-HC/25Yl de salina (G3), 0,5Yg de AF+10Ymol de D,L-HC/25Yl de salina (G4) e 0,5Yg de AF/25Yl de salina (G5). Concluída a manipulação, a abertura era fechada com filme PVC atóxico e o ovo recolocado na estufa. O GC1 não foi submetido aos procedimentos de abertura e tratamento. Após 96 horas (23-25HH), os embriões foram dessensibilizados à 4°C e posteriormente analisados ao estereomicroscópio, para detecção de alterações do padrão morfológico, determinação do estágio de desenvolvimento (HH) e mensuração cefálica e corporal (14, 20 e 30X). Em seguida, foram fixados em formol 10% (24h) e conservados em etanol 70%, tendo a massa corporal aferida após 5 dias. A região cefálica e truncal dos embriões foi preparada para microscopia, e os cortes (8Ym) foram submetidos às técnicas de hematoxilina-eosina (HE), para descrição geral e posterior morfometria das camadas celulares do TEL e ME, e quantificação celular da notocorda e mesoderma apical à ME; técnica de Hoescht (33258), para evidenciar células em apoptose; e técnicas imuno-histoquímicas, para localizar dos filamentos intermediários vimentina e GFAP. A partir da análise estereomicroscópica, foi possível identificar que a porcentagem de embriões que apresentaram padrão morfológico normal foi de 100% em GC1 e GC2, e de 70% em G5. Já em G3 e G4 a porcentagem foi de 20 e 30%, respectivamente, e a diferença significativa entre estes dois e os demais grupos. Através da análise morfométrica realizada nos embriões, observamos que os grupos GC1 e GC2, geralmente, apresentaram valores médios superiores aos demais grupos tratados, com exceção de G5, que exibiu médias semelhantes a dos grupos controle. Em contrapartida, G3 exibiu quase sempre as menores médias, embora as diferenças não fossem significativas. Comportamento semelhante foi apresentado, quanto à morfometria das camadas celulares # ventricular e do manto #, tanto do TEL, quanto da ME. A espessura média destas camadas, foi, quase sempre, significativamente superior nos grupos controle em comparação aos grupos G3 e G4. Os cortes da região truncal exibiram abertura da região apical da ME # G4 # acompanhada de falha na fusão do mesoderma apical à ME # G3. Através das técnicas imunohistoquímicas, foi possível identificar diferenças na intensidade e localização dos filamentos intermediários vimentina e GFAP, tanto no TEL quanto na ME e adjacências, entre os grupos controle (GC1 e GC2) e tratados (G3, G4 e G5). Com relação à apoptose, foi possível evidenciá-la, no TEL e ME, somente em G4. Portanto, o tratamento com HC (G3) foi o que mais interferiu, tanto no padrão morfológico, quanto na estrutura organizacional do TEL e ME. Já o tratamento com AF (G5) não interferiu, de forma significativa, nestes mesmos parâmetros. E o AF, administrado concomitantemente com a HC (G4), não foi capaz de anular os efeitos nocivos desta substância, provavelmente, em decorrência da imaturidade metabólica dos embriões. The objective of the study was to verify the action of homocysteine (HC) and folic acid (AF), separately and in set, in the embryonic development, with emphasis in morphologic pattern, neurulation and organization of telencephalon (TEL) and embryonic spinal cord (SP); for this, we used the model of Gallus domesticus. Five experimental groups had been constituted: 2 controls # Closed Control (CG1) and Saline Control (CG2) - and 3 treated - HC (G3), HC + FA (G4) and FA (G5), each one with N=10. Fertilized eggs had been numbered, weighed and incubated at 38°C and 65% humidity. After 32h in stove (8-9HH), a window was opened on the egg´s surface (1.5 cm diameter), that allowed the visualization of embryo and the treatment: 25Yl saline (CG2), 10Ymol D, L-HC/25Yl saline (G3), 0,5Yg FA + 10Ymol D, L-HC/25Yl saline (G4) and 0,5Yg AF/25Yl saline (G5). After egg window was closed with film atoxic PVC and the eggs returned for the incubator. The CG1was not submitted to the procedures of opening and treatment. After 96 hours (23-25HH) embryos were dessensibilized at 4°C, removed from egg and analyzed to stereomicroscope (20X), for detention of alterations of morphologic pattern, determination of development stage (HH) and morphometrical analysis (14, 20 and 30X). After the embryos were fixed in formaldehyde 10% (24h) and maintained in ethanol 70%. After the corporal mass was measuared and embryos were prepared for microscopy. The serial sections (8Ym) were submitted to techniques of Hematoxylineosin (HE), for general description, morphometrical analysis of the cellular layers of the TEL and SC, and cellular quantification of notochord and apical mesoderm; Hoescht (33258) to evidence cells in apoptose; and immunohistochemistry techniques to locate of intermediate filaments vimentin and GFAP. From the stereomicroscopical analysis it was possible to identify that the percentage of embryos that had showed normal morphologic pattern in GC1 and GC2 (100%) and in G5 (70%). Already in G3 and G4 the percentage was respectively of 20 and 30% with significant difference between these two and too much groups. In morphometrical analysis of the embryos we observe that CG1 and CG2 generally had showed superior average values when compared with too much groups, with exception of G5, that showed similar averages to control groups. On the other hand, G3 almost always showed the average inferiors even so the differences were not significant. Similar behavior was presented also in the morphometrical analysis of the cellular layers - ventricular and of the mantle -, as much of the TEL how much of SC. The average thickness of these layers was almost always significantly superior in the control groups when compared with groups G3 and G4. The slices of the trunk region had shown opening of the apical region of SC - G4 # and also failure in the fusion of the apical mesoderm - G3. Through immunohistochemistry techniques it was possible to identify differences in the intensity and localization of intermediate filaments vimentin and GFAP between the control groups (GC1 and GC2) and treated groups (G3, G4 and G5), as much in the TEL how much in SC and surroundings. Apoptosis had been evidenced only in the TEL and SC of G4. The treatment with HC (G3) interfered more, as much in morphologic pattern how much in organization of TEL and SC. Although treatment with FA (G5) did not interfere of significant form in these same parameters, when managed in set with HC (G4), it was not capable to annul the harmful effect of this substance, probably due to metabolic immaturity of embryos.

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo caracterizado, bioquimicamente, pela deficiência da enzima cistationina-β-sintase, resultando no acúmulo tecidual de homocisteína. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos e vasculares característicos, como retardo mental e arteriosclerose, cuja fisiopatologia é desconhecida. No presente trabalho, avaliamos os efeitos in vitro e in vivo da homocisteína sobre alguns parâmetros bioquímicos. Primeiramente, observamos o efeito in vitro da exposição de homogeneizados de córtex parietal de ratos ao ácido fólico, avaliando a inibição causada pela homocisteína sobre a atividade da Na+,K+-ATPase de membranas plasmáticas. Nos estudos in vivo, investigamos o efeito do pré-tratamento com ácido fólico sobre a inibição das enzimas Na+,K+-ATPase e butirilcolinesterase em córtex parietal e em soro de ratos submetidos à hiperhomocisteinemia aguda, respectivamente. Considerando que a Na+,K+-ATPase é suscetível ao ataque de radicais livres, nós determinamos o efeito da hiperhomocisteinemia aguda sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo, como a formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico e o conteúdo total de grupos tióis em córtex parietal de ratos. Finalmente, investigamos o efeito do ácido fólico sobre a redução da atividade da Na+,K+-ATPase em córtex parietal e sobre o aumento do índice de dano ao DNA em sangue total de ratos submetidos à hiperhomocisteinemia crônica. Nossos resultados mostraram que a homocisteína in vitro reduz, significativamente, a atividade da Na+,K+-ATPase e que o ácido fólico previne esse efeito. Estudos cinéticos com o substrato ATP revelaram que a homocisteína inibe de forma não-competitiva a enzima Na+,K+-ATPase. Os estudos in vivo confirmaram que a hiperhomocisteinemia aguda diminui as atividades das enzimas Na+,K+-ATPase e butirilcolinesterase e que o pré-tratamento com ácido fólico também previne os efeitos causados pela homocisteína. Por outro lado, a hiperhomocisteinemia aguda não alterou os parâmetros de estresse oxidativo analisados. A hiperhomocisteinemia crônica inibiu a Na+,K+-ATPase em córtex parietal e aumentou o índice de dano ao DNA em sangue total de ratos e, novamente, o tratamento com ácido fólico previne tais efeitos. Esses resultados, em conjunto, revelam os efeitos da homocisteína sobre alguns parâmetros bioquímicos e colaboram com o entendimento da fisiopatologia da homocistinúria. Além disso, os resultados sugerem que o ácido fólico, já utilizado por alguns pacientes homocistinúricos, poderá ser uma importante ferramenta terapêutica utilizada na prevenção dos efeitos neurológicos e vasculares da homocisteína.

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo de aminoácidos causado pela deficiência severa na atividade da enzima cistationina β-sintase, o que resulta no acúmulo tecidual de homocisteína e metionina. Pacientes afetados geralmente apresentam aterosclerose, retardo mental, convulsões e isquemia cerebral. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos responsáveis por estas manifestações são pouco conhecidos. A isquemia cerebral é caracterizada por uma redução grave ou pelo bloqueio completo do fluxo sanguíneo normal em alguma região do cérebro, geralmente causada por um trombo ou uma hemorragia. O estresse oxidativo parece ser um dos principais mecanismos envolvidos no dano celular induzido por isquemia e a administração de antioxidantes, em alguns casos, pode prevenir alguns desses danos. Considerando que: a) pacientes com homocistinúria apresentam alterações neurológicas e que são mais suscetíveis à isquemia, b) o estresse oxidativo parece estar envolvido na fisiopatogenia tanto da homocistinúria quanto da isquemia cerebral c) o ácido fólico reduz os níveis plasmáticos de homocisteína e pode ter efeitos antioxidantes, e) o pré-tratamento com vitaminas E e C previne os efeitos da Hcy sobre a Na+, K+-ATPase e sobre a memória, neste trabalho nós verificamos os efeitos in vivo e in vitro da homocisteína sobre fatias de hipocampo de ratos submetidas à privação de oxigênio e glicose, um modelo in vitro de isquemia cerebral, e também os efeitos do pré-tratamento com antioxidantes, vitamina E mais C e ácido fólico sobre o dano celular causado pela homocisteína. Os resultados mostraram que a homocisteína in vitro (100 e 500 μM), aumentou a liberação de lactato desidrogenase (LDH) para o meio de incubação, sugerindo um aumento no dano celular causado pela isquemia. Além disso, tanto o modelo agudo quanto o crônico de hiperhomocisteinemia aumentou a morte celular quando os animais foram sacrificados 1 hora após a administração de homocisteína. Nossos resultados também mostraram que o pré-tratamento com ácido fólico foi capaz de prevenir completamente o dano causado pela administração aguda de homocisteína, enquanto que a vitamina E preveniu apenas parte deste efeito. Estes achados podem ser relevantes para explicar, pelo menos em parte, a maior susceptibilidade dos pacientes hiperhomocisteinêmicos de apresentar eventos issquêmicos e apontam uma possível estratégia de prevenção. / Homocystinuria is an inherited metabolic disorder caused by severe deficiency of cystationine β-synthase activity, resulting in the tissue accumulation of homocysteine and methionine. Affected patients usually present atherosclerosis, mental retardation, seizures, and stroke. However, the physiopatological mechanisms are not yet fully established. Cerebral ischemia is defined as a severe reduction or blockage of normal blood flow in the brain, usually caused by thrombosis or hemorrhage. Oxidative stress seem to be one of major mechanisms involved on cellular damage induced by ischemia, and antioxidants administration, sometimes, can prevent this damage. Considering that: a) homocystinuric patients present neurological alterations and are more susceptible to ischemia, b) oxidative stress is involved on pathogenia such of homocystinuria as of cerebral ischemia, c) folic acid reduces the serum levels of homocisteine and could have antioxidant effects, c) pretreatment with vitamins E and C prevent the effects of homocysteine on Na+, K+-ATPase activity and on memory, in this work we verified the in vivo and in vitro effects of homocysteine on rat hippocampal slices exposed to oxygen and glucose deprivation, an in vitro model of cerebral ischemia, we also investigated the effects of pretreatment with antioxidants, vitamin E plus C and folic acid on cellular damage caused by homocysteine. Results showed that homocysteine in vitro (100 and 500μM), both chronic (1 h after homocysteine administration) and acute hyperhomocysteinemia increased the LDH release to the incubation medium, suggesting an increase of tissue damage caused by ischemia. Furthermore, results showed that both chronic (1 h after homocysteine administration) and acute hyperhomocysteinemia increased the cellular death. Our results also demonstrated that pretreatment with folic acid completely prevented the damage caused by acute homocysteine administration, whereas vitamin E just partially prevented such effect. These findings may be relevant to explain, at least in part, the higher susceptibility of hyperhomocysteinemic patients to bear ischemic events and point to a possible preventive treatment.