Made available in DSpace on 2015-04-22T22:14:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Carlos Mauricio Oliveira de Almeida.pdf: 1285251 bytes, checksum: a2a3d28e3c91b115a707e039282b1f0c (MD5) Previous issue date: 2007-09-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A hepatite C é um grande problema de saúde pública atual com aproximadamente 180 milhões de pessoas infectadas no mundo todo. O HCV é um vírus RNA de fita simples, pertencente à família flaviviridae O HCV é um agente infeccioso altamente imunogênico levando ao desenvolvimento de uma intensa resposta imune humoral e celular. No entanto cerca de 80% dos pacientes evoluem para uma doença crônica, podendo desenvolver cirrose hepática ou câncer. Apenas 15-20% dos pacientes infectados apresentam ¨clearance¨ viral e evoluem para a cura. Os mecanismos pelo qual o HCV evade-se do sistema imunológico ainda não são totalmente conhecidos, mas a polarização da imunidade através da produção de citocinas parece ser uma das principais causas. Pacientes infectados pelo HCV podem apresentar várias manifestações extra-hepáticas como fadiga, depressão e distúrbios do sono. As manifestações neurológicas podem envolver o sistema nervoso periférico na forma de polineuropatias ou o sistema nervoso central como encefalopatia agudo-subaguda, acidente vascular cerebral e um comprometimento subcortical. O acometimento neurológico pode ocorrer pela própria replicação do vírus no tecido nervoso, ou indiretamente pela resposta imunológica do paciente. Estas alterações podem levar ao comprometimento da qualidade de vida, talvez secundárias as queixas de sono. O sono é um estado fisiológico-comportamental que se associa com o sistema imune e com várias citocinas como IL1, IL2, IL-6, TNF-á e IFN-ã. Pouco se sabe sobre as manifestações neurológicas, incluindo o sono, a resposta imune e o perfil de citocinas entre estes pacientes. Desta forma o objetivo do presente estudo é avaliar as manifestações neurológicas como os distúrbios do sono, a resposta imune celular e o perfil de citocinas, o genótipo viral entre esses pacientes HCV + da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas. Para a avaliação da resposta imune celular foi utilizado a fenotipagem dos leucócitos do sangue periférico e para a avaliação das citocinas Th1 e Th2 e inflamatórias o ELISA. As alterações neurológicas foram avaliadas por um questionário clínico criado para o estudo. A qualidade do sono foi avaliada pelo Questionário de Pittsburg (PSQI) e de fadiga pela escala FSS. Nossos resultados mostraram que as manifestações extra-hepáticas são muito freqüentes entre eles a fadiga, artralgias e mialgias. As queixas de sono foram tão freqüentes quanto às demais com 72,4% entre os pacientes. Os pacientes tiveram uma média de PSQI de 6,21 e de FSS de 3,16. Pacientes HCV positivos apresentam uma maior ativação de linfócitos T CD8+ e marcação para CD69+, alem de níveis elevados de citocinas IL-6, IL-12 e IL-8 do que controles saudáveis. Os pacientes com Hepatite C com queixas de sono apresentam mais fadiga e níveis aumentados de IL-4 e IL-6 podendo corresponder como um marcador de sono ruim nestes pacientes. O genótipo 1 foi o mais freqüente, seguido do genótipo 3 e do genótipo 2 na nossa região. O genótipo 1 tendeu a uma maior secreção de citocinas supressoras Th2, além de maiores níveis de ALT/AST, do que os outros genótipos, embora não atingisse valores estatisticamente significantes. O HCV foi isolado do líquor de apenas um paciente do estudo. Uma das possíveis explicações para tais manifestações neuro-psquiátricas seria uma ação conjunta do vírus sobre o SNC e a resposta imune, com a secreção de algumas citocinas como IL-4, IL-6. No entanto é necessário mais estudos sobre a ação do HCV sobre o SNC e o papel destas citocinas na produção desses sintomas.

Submitted by Geyciane Santos (geyciane_thamires@hotmail.com) on 2015-06-10T13:09:02Z No. of bitstreams: 1 Dissertação-João Paulo Diniz Pimentel.pdf: 2169155 bytes, checksum: 2ab3c00108fbcfa45f9be1e5968d2403 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-06-11T19:42:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação-João Paulo Diniz Pimentel.pdf: 2169155 bytes, checksum: 2ab3c00108fbcfa45f9be1e5968d2403 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-06-11T19:43:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação-João Paulo Diniz Pimentel.pdf: 2169155 bytes, checksum: 2ab3c00108fbcfa45f9be1e5968d2403 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-11T19:43:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação-João Paulo Diniz Pimentel.pdf: 2169155 bytes, checksum: 2ab3c00108fbcfa45f9be1e5968d2403 (MD5) Previous issue date: 2009-07-14 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / The hemophiliac patients were already victims of infections transmitted by the blood, mainly through sanguine transfusions. The hepatitis C is one of the infections that the hemophiliacs are subject, especially those that received combined of coagulation factors before the nineties (period in which this virus still had not been identified). The HCV is responsible for increase of the mortality and the cases of hepatocellular carcinoma. The objective of this study was to esteem the seroprevalence of HCV, to associate the immune response and to relationship between the genotype and viral load in the hemophiliac patients assisted in the Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas - HEMOAM. Seventy eight hemophiliac patients were assisted at Fundação HEMOAM in the period of January to December of 2008. All the participants are male and they presented age between 2 and 52 years. None of the studied patients presented reactivity in the serologic exams for HIV, HTLV, Chaga’s disease or Syphilis. However, 30,8% presented reactivity for antibodies anti-HCV and 19,2% for anti-HBC. The concentrations of the transaminases (AST and ALT) of the patients anti-HCV reagents were larger compared with those which presented the anti-HCV -. ALT still showed significant correlation with the viral load of HCV in those patients. In the evaluation of the cellular immunological response, we can verify an increase of the lymphocytes TCD8+ in the hemophiliac’s anti-HCV +. However, the activated leukocytes CD69+ didn't present significant differences among the groups. The analysis of the seric cytokines shows an increase of IL-4 and IFN -γ in the hemophiliac’s anti-HCV+ . However, when we compared these cytokines with the viral load of HCV in those patients, only the IL-4 it presented correlation. The IL-10 concentrations presented correlation with the viral load of HCV, indicating that this increase is related with the viral proliferation of HCV in those patients, in spite of they have not presented difference among the studied groups. We can end of this study saying that the hemophiliacs chances contract infections transmitted by the blood decreased after 1990. The hemophiliacs infected by HCV present a clinical picture of chronic hepatitis C and the increase of the transaminases related with the viral load of HCV. In those patients indicate the need to submit these patient ones to a treatment. The highest concentrations of IFN-γ in the hemophiliacs with anti-HCV+ were not shown efficient in the resolution of the infection. / Os pacientes hemofílicos já foram vítimas de inúmeras infecções veiculadas pelo sangue por meio de transfusões sanguíneas e a hepatite C é uma das infecções a que os hemofílicos estão sujeitos, principalmente aqueles que receberam combinados de fatores de coagulação antes dos anos 90, período no qual este vírus ainda não tinha sido identificado. O HCV pode causar complicações a estes pacientes, como o aumento da mortalidade e o aumento de casos de carcinoma hepatocelular. O objetivo deste estudo foi estimar a soroprevalência do HCV, associar a resposta imune e relacionar ao genótipo e carga viral nos pacientes hemofílicos atendidos na Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas – HEMOAM. Participaram do estudo 78 pacientes hemofílicos, que procuraram a Fundação HEMOAM no período de janeiro a dezembro de 2008. Todos os participantes são do sexo masculino e apresentaram idade entre 2 e 52 anos. Nenhum dos pacientes estudados apresentou reatividade nos exames sorológicos para HIV, HTLV, doença de Chagas ou Sífilis. No entanto, 30,8% apresentaram reatividade para anticorpos anti-HCV e 19,2% para anti-HBc. As concentrações das transaminases (AST e ALT) dos pacientes anti-HCV reativos foram maiores dos que os anti-HCV não reativos. A ALT mostrou ainda correlação significativa com a carga viral do HCV nesses pacientes. Na avaliação da resposta imunológica celular, podemos verificar um aumento dos linfócitos TCD8+ nos hemofílicos anti-HCV reativos, no entanto, os leucócitos ativados CD69+ não apresentaram diferenças significativas entre os grupos. A análise das citocinas séricas mostrou um aumento de IL-4 nos hemofílicos anti-HCV reativos e de IFN-γ sendo que quando comparamos estas citocinas com a carga viral do HCV nesses pacientes, somente a IL-4 apresentou correlação. As concentrações IL-10 apesar de não terem apresentado diferença entre os grupos estudados, elas apresentaram correlação com a carga viral do HCV indicando que este aumento está relacionado com a proliferação viral do HCV nesses pacientes. Podemos concluir deste estudo, que as chances dos hemofílicos contraírem infecções veiculadas pelo sangue diminuíram, principalmente após 1990. Os hemofílicos infectados pelo HCV apresentam um quadro de hepatite C crônica e o aumento das transaminases relacionada com a carga viral do HCV nesses pacientes indicam a necessidade de submeter estes pacientes a um tratamento. As concentrações mais elevadas de IFN-γ nos hemofílicos com anti-HCV reativos não se mostraram eficientes na resolução da infecção.

Toxoplasma gondii é apontado como causa primária de doença congênita, abortamentos e natimortalidade em humanos e animais de produção. No Brasil, genótipos atípicos do parasita podem estar relacionados com ocorrência de enfermidade severa, inclusive em indivíduos imunocompetentes. Este estudo aplicou-se à reprodução experimental de infecções por T. gondii em ovinos, com vistas a estudar aspectos relacionados à ocorrência da transmissão congênita, avaliando reinfecções produzidas por diferentes genótipos de T. gondii isolados no Brasil. Treze ovelhas soronegativas para a infecção por T. gondii foram primo-infectadas com 2x103 oocistos esporulados via oral deste parasito, Grupo 1 (4 animais) com genótipo BrI e Grupos 2 e 3 (5 e 4 animais, respectivamente) com genótipo BrIII. Após a cronificação da infecção, os animais foram emprenhados. Da mesma forma, uma segunda infecção foi realizada após 2 meses de gestação, animais dos Grupos 1 e 3 receberam oocistos de T. gondii genótipo BrIII e o Grupo 2 recebeu BrI. Semanalmente foram observados os efeitos da reinfecção comparando com um grupo controle (5 animais) não infectado, através de exames físicos, ultrassonográficos, sorológicos, hematológicos e bioquímicos. Utilizando bioensaio em camundongos, análise molecular, exames histopatológicos e imunohistoquímica, avaliou-se a infecção experimental de ovelhas e cordeiros. Verificaram-se as diferenças entre as médias dos resultados dos grupos com ANOVA dois fatores para a sorologia e ANOVA um fator, post-hoc Bonferroni ou Kruskall-Wallys, post-hoc U de Mann-Withney para os outros parâmetros, sendo considerados significativos quando p<0,05. Não foram observados abortamentos, obtiveram-se 19 cordeiros dos grupos experimentais, todos soronegativos. As ovelhas infectadas apresentaram altos títulos de IgG e hipertermia após a primo-infecção e aumento moderado após a reinfecção, com diferença estatística somente no Grupo 1. Parâmetros clínicos alterados nos grupos experimentais foram observados principalmente nos dias 21 e 28 após o desafio. Houve significância estatística comparando-se resultados de patologia clínica em infecções por genótipos diferentes em vários pontos de tempo. À necropsia, observou-se fibrina nas placentas das ovelhas infectadas, um feto mumificado em uma das ovelhas do Grupo 2 e cordeiros e ovelhas com linfoadenomegalia. PCR realizado em amostras de tecido alterado confirmou presença de T. gondii em linfonodos e coração de cordeiros do grupo 2 e coração e placenta de ovelhas do Grupo 3. Nos bioensaios em camundongos dos tecidos de cordeiros foram observados cistos cerebrais em um animal do Grupo 2, confirmados por PCR. Análises histopatológicas confirmaram taxa de transmissão de 26% nos três grupos experimentais. Exceto por uma ovelha do Grupo 1, todos os ovinos, incluindo o cordeiro positivo, estavam infectados com o isolado utilizado na primo-infecção. Observou-se maior frequência de transmissão congênita endógena em ovelhas soropositivas após reinfecção com genótipos diferentes, com alterações fisiológicas significativas em ovelhas gestantes, porém não acarretando abortamento ou malformações. A primo-infecção proporcionou imunidade cruzada contra reinfecção subsequente na maioria dos animais, aparentando maior eficácia quando utilizado genótipo BrIII / Toxoplasma gondii is considered the primary cause of congenital disease, miscarriage and stillbirth in humans and farm animals. In Brazil, non-classical genotypes may be related with severe toxoplasmosis also in immunocompetent patients. This study evaluated infections and reinfections caused by two atypical field strains of T. gondii isolated in Brazil and their consequences over congenital transmission in sheep. Thirteen Santa Ines ewes seronegative for T. gondii were prime-infected orally with 2x103 sporulated oocysts, being Group 1 from genotype BrI (4 animals), whilst Groups 2 and 3 ewes received an inoculum from genotype BrIII (5 and 4 animals, respectively). After infection chronification all animals were mated. Likewise, a second inoculation was held at 2 months pregnancy, Group 1 and 3 receiving oocysts from genotype BrIII, while Group 2 was infected with genotype BrI. Blood samples for serology, CBC, biochemistry, vital signs evaluation and abdominal ultrasound were performed weekly, comparing with a control group (5 animals). Experimental infection from ewes and lambs was evaluated thru mice bioassay, molecular analysis, histopathological and immunohistochemical tests. To analyze serology variation between groups their mean results were subjected to two-way ANOVA. The other parameters were tested using one-way ANOVA followed by Bonferroni or Kruskall-Wallys followed by Mann-Whitney U, where statistical significance was set at p<0,05. No abortion was observed and 19 lambs were born from ewes of the experimental groups presenting negative serology. Infected ewes showed high IgG titles and fever after prime-infection and moderate increase after reinfection, although only Group 1 presented statistical significance. Altered clinical values were observed from experimental groups mainly 21 and 28 days post challenge. Significant differences were detected when comparing infections from different genotypes. Post-mortem analysis revealed fibrin over placentas from ewes of all experimental groups; a mummified fetus inside an ewe from Group 2 and lymph nodes enlargement within ewes and lambs. PCR performed on altered tissues from necropsy confirmed presence of T. gondii on lymph nodes and heart of a Group 2 lamb and on placenta and heart of Group 3 ewes. Considering mice bioassays from lamb tissues, one animal from group 2 presented brain smear cysts, also PCR analysis positive. Histopathological tests corroborate a congenital transmission rate of 26% among experimental groups. Apart from one ewe from Group 1 all the other animals, including the positive lamb, were infected with the strain from the prime-infection. Therefore, it was more frequently observed endogenous congenital transmission in seropositive ewes after reinfections with different strains leading to significant physiological variations in pregnant ewes, abortion and congenital malformations absence notwithstanding. The prime-infection also provided cross protective immunity against a following reinfection for the majority of the animals, suggesting apparent better response when performed using genotype BrIII

Nosso conhecimento de nutrição em avicultura é relativamente maduro, incluindo uma completa lista de exigência de nutrientes, o estabelecimento dos níveis mínimos de cada nutriente necessários para uma máxima produtividade e os níveis e a biodisponibilidade desses nutrientes, contidos nas matérias-primas utilizadas no fábrico das rações. No entanto, não sabemos se os níveis adequados de nutrientes para um ótimo crescimento, em animais saudáveis, são adequados para uma ótima resposta imune ou imunocompetência durante um desafio infeccioso. Um dos mecanismos através dos quais a nutrição interfere na imunidade é a regulação pela disponibilidade de substrato, sendo estabelecido pelo fornecimento de nutrientes necessários para uma resposta imune. Um dos exemplos implicados nesse grupo são os aminoácidos e, dentre esses, a metionina e a arginina. A metionina é importante para a síntese protéica, para a formação de glutationa e poliaminas e é a principal fonte doadora de grupos metila para a formação do DNA. A arginina é importante para a produção de óxido nítrico nos macrófagos. O óxido nítrico tem ação bactericida, cumprindo importante papel na atividade citotóxica celular. Este trabalho teve como objetivo verificar se níveis de metionina e arginina usualmente utilizados na indústria avícola influenciam a resposta imune de frangos de corte submetidos a estímulos imunológicos. O primeiro experimento avaliou a influência da metionia, expressa em aminoácidos sulfurados totais (AAS). Na fase inicial de criação (1 a 21 dias) foram utilizados 0,72; 0,82 e 0,92% de AAS e na fase final (22 a 42 dias) 0,65; 0,75 e 0,85% de AAS. Os estímulos empregados nesse experimento foram as vacinas comumente utilizadas na indústria avícola, micobacterium avium inativado e tuberculina aviária. Como resultado tivemos que os níveis de AAS testados não influenciaram a resposta imune. Porém, as vacinas realizadas prejudicaram o desempenho dos frangos até os 21 dias de idade. De 1 a 42 dias de criação, houve uma interação entre os estímulos e os níveis de AAS, onde o maior nível de AAS do grupo não estimulado mostrou melhor ganho de peso. O segundo experimento avaliou a influência de diferentes níveis de metionina (0,31; 0,51 e 0,66% de 1 a 21 dias e 0,29; 0,49 e 0,64% de 22 a 42 dias de criação) e arginina (1,33 e 1,83% de 1 a 21 dias - 1,14 e 1,64% de 22 a 42 dias) sobre a resposta imune e sobre o desempenho de frangos de corte. O programa de estímulos foram vacinas comumente utilizadas na indústria avícola, eritrócito de carneiro a 10%, micobacterium avium inativado e tuberculina aviária. Como resultado desse experimento tivemos que os níveis de arginina testados não influenciaram o desempenho nem a resposta imune das aves, e em relação a metionina, não houve influência sobre a resposta imune humoral, mas o nível intermediário de metionina obteve melhor resposta celular. Além disso, as vacinas realizadas no primeiro dia prejudicaram o desempenho dos frangos até os 21 dias de idade. Com base nos dois estudos é possível concluir que os níveis de metionina e arginina utilizados atualmente na nutrição de frangos de corte, podem ser adequados para atender a demanda do sistema imune. Em termos de desempenho, os níveis de metionina (AAS) utilizados na agroindústria, podem ser aumentados, aliados a um bom programa sanitário. Além disso pode-se observar que os programas de vacinação, embora necessários, certamente interferem negativamente no desempenho das aves. / Our knowledge of nutrition of poultry and livestock is relatively mature, including a very complete listing of the required nutrients, a quantitative accounting of the minimal level of each nutrient that is needed to maximize production characteristics, and the levels and bioavailabilities of the essential nutrients supplied by feedstuffs. However, it is not known if the requirement values that maximize productivity in healthy, unchallenged animals are optimal for immunocompetence and disease resistance. The regulation by substract availability (diet nutrients) is one of mechanisms trough of witch nutrition interferes on immune response. Amino acids like methionine and arginine are two examples of this. Methionine is important for protein synthesis, glutathione and polyamines production and is the principal source of metil groups to DNA formation. Arginine is important to nitric oxide production by macrophages. Nitric oxide has bactericide action, playing important role in cellular citotoxic activity. This study aim to evaluate the influence of supplementation at different methionine and arginine levels on performance and the immune response in broiler chickens immunologically stimuli. First experiment evaluated methionine (as sulfur amino acids – SAA). In initial fase (1 to 21 days) the levels tested were 0.72, 0.82 and 0.92% and final fase (22 to 42 days) the levels were 0.65, 0.75 and 0.85%. The stimuli program was constituted of vaccines routinely adopted in large-scale bird husbandry, inactivated Mycobacterium avium and avian tuberculin. As results SAA levels tested not influenced immune response. Yet, vaccines administered impaired bird performance upon the 21st day of age. In total period an interaction between immunological stimuli and SAA levels was observed, at this the greatest level of ASS in no-stimulated group showed better weight gain. The second experiment tested the influence of methionine levels (0.31, 0.51 and 0.66% in initial phase and 0.29, 0.49 and 0.64% in final phase) and arginine levels (1.33 and 1.83% in initial phase and 1.14 and 1.64% in final phase) on bird performance and immune response. The stimuli program was vaccines routinely adopted in large-scale bird husbandry, inactivated Mycobacterium avium, Sheep Red Blood Cells 10% (SRBC), and avian tuberculin. It was observed that arginine levels tested influenced neither bird performance nor immune response. To methionine, no effect was observed on humoral immune response, however the intermediate methionine level caused better immune cellular response. Moreover, the vaccines administered on the first day impaired bird performance upon the 21st day of age. Based on these two experiments results it’s possible to conclude that methionine and arginine levels here tested witch are similar of those used on current poultry nutrition could be adequate to attend immune system requirements. To performance this practical levels of methionine could be increased if a god sanity program is used. Moreover, it’s possible to see that vaccination programs are necessary but certainly interfere on bird performance in a negative way.

Over one third of the human population is currently infected by one or more species of parasitic helminth, but the immune responses elicited by these infections remain poorly defined. Studies in helminth-exposed human populations and laboratory models suggest that helminth infection elicits a range of different effector cell types and that protective immunity and resistance to immune-mediated pathology depends on the balance between these responses. The aim of this thesis was to investigate how cytokines, the molecular mediators of the immune system, can be used to characterise human immune phenotype during natural and experimental helminth infection. Cytokines associated with innate inflammatory (TNFα, IL-6 and IL-9), Thl (IFNγ, IL-2 and IL-12p70), Th2 (IL-4, IL-5 and IL-13), Th17 (IL-17A, IL-21 and IL-23) and regulatory (IL-10 and TGFβ)immune phenotypes were analysed to provide the most comprehensive analysis of cytokine responses in human helminth infection conducted to-date. Using a multivariate statistical approach cytokines were analysed as combined immune profiles to reflect their complex interactions in vivo. In the first part of the study venous blood samples collected from a cross-sectional cohort of 284 Zimbabweans (age range: 3 -86 years) endemically-exposed to Schistosoma haematobium were cultured with antigens from different stages of the parasite's life-cycle(cercariae, adult worms and eggs) and the anti-schistosome vaccine candidate antigen glutathionine-S-transferase (GST). Cytokines responses were quantified in culture supernatants via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). These assays were repeated 6 weeks after clearance of infection by anti-helminthic treatment. Parasitological and demographic characterisation of the cohort before, 6 weeks, 6 and 18 months after treatment allowed cytokine responses to be related to epidemiological patterns of infection before treatment and the risk of re-infection after treatment. The main findings of this study were:Cytokine responses to the antigens of S. haematobium cercariae are more proinflammatory than those elicited by adult worms and eggs prior to treatment, reflecting the distinct proteomes and exposure patterns of the 3 life-cycle stages Young children (5-10 years old) have a more regulatory and Th17-polarised cytokine response to S. haematobium antigens than older children and adults. These responses are significantly associated with schistosome infection intensity and may contribute to the development of resistance to schistosomiasis with age and exposure to infection Anti-helminthic treatment leads to a shift in S. haematobium cercariae, egg and GST specific cytokine responses towards a more pro-inflammatory phenotype The magnitude of change in S. haematobium-specific cytokine profiles after treatment is dependent on schistosome infection intensity at the time of treatment Individuals who remain un-infected up to 18 months after treatment to clear schistosome infection have a more pro-inflammatory and IL-21-polarised response to S. haematobium antigens 6 weeks after treatment than those who become re-infected, suggesting that post-treatment cytokine profiles promote resistance to re-infection. The second part of the study assayed systemic, parasite and allergen-specific cytokine responses in 45 adults with seasonally exacerbated allergy to grass pollen who were experimentally exposed to Trichuris suis. Cytokine responses in infected individuals were compared to those of 44 un-infected controls. This aspect of the study showed that: Exposure to T. suis promotes systemic and parasite-specific Th2 and regulatory cytokine responses, but does not alter cytokine responses to environmental allergens.

A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa bacteriana causada por Mycobacterium tuberculosis (Mtb), acomete seres humanos em todo mundo, e é considerada uma das principais causas de morbidade e mortalidade dentre as doenças infecciosas. Nesse cenário, a TB ainda é vista como um grande desafio para a ciência e para medicina. Com o estudo de novos alvos moleculares para terapia e diagnóstico, por exemplo, a sinalização Notch tem sido descrita como uma via importante para a manutenção da resposta imunológica durante a infecção por Mtb. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a participação da via Notch na modulação da resposta imune durante a infecção por Mtb em humanos. Neste trabalho foram incluidos 13 pacientes com tuberculose ativa e 13 indivíduos saudáveis. Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas e avaliadas quanto à expressão de receptores Notch 1 - 2 em células T e ligantes Notch, DLL1 - 4 em subpopulações de monócitos por citometria de fluxo e expressão de genes relacionados à via Notch e resposta imune. Além disso, o plasma foi utilizado para avaliar níveis de citocinas, CD14s e CD163s. Ainda, avaliamos a função celular dependente da ativação da via Notch durante a infecção de células mononucleares de sangue periférico de indivíduos saudáveis com Mtb H37Rv in vitro. Observamos que pacientes com TB ativa apresentaram aumento na expressão de DLL4 em monócitos intermediários e não-clássicos e diminuição na expressão de Notch 2 em células T CD8+. In vitro, observamos nas culturas de PBMCs, aumento da expressão de DLL4 em monócitos intermediários e Notch 2 em células T CD4+. A expressão do ligante DLL4 em monócitos intermediários e a expressão do Notch 1 em células T CD4+ em pacientes com TB ativa se correlacionaram positivamente com o grau de lesão pulmonar. Além disso, pacientes com quadros de lesão pulmonar moderado e avançado têm maior expressão de Notch 1 em células T CD4+ quando comparados a pacientes com grau mínimo de lesão pulmonar. Pacientes com TB ativa apresentam aumento significativo nos níveis plasmáticos de IL-6, IP- 10, CD14s e CD163s e diminuição nos níveis de IFN-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-1? e RANTES. Os níveis plasmáticos de IFN-?, TNF-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-12, IL-1?, RANTES e IL-10 se correlacionaram positivamente com o maior grau de lesão pulmonar.Além disso, demonstramos que os níveis de IFN-?, IL-17A, IL-1?, IL-4 e IL-2 se relacionam com maior expressão do receptor Notch 1 em células T CD4+ , enquanto níveis plasmáticos de IP-10, CD163s e de procalcitonina se correlacionam com maior expressão de Notch 1 em células T CD8+. Evidenciamos maior tendência na expressão de HES1 em pacientes com TB ativa e células infectadas in vitro, indicando que a via Notch está sendo ativada durante a infecção por Mtb. De forma interessante, in vitro as culturas de PBMCs tratadas com inibidor farmacológico da via Notch (GSI), reduziram a produção de IL-17A, IL-2 e IL-10 e aumentaram IL-8, enquanto o tratamento com anti-hDLL4 promoveu o aumento significativo nos níveis de TNF-? e atividade fagocítica de monócitos. Em conclusão, a expressão de receptores e ligantes Notch é alterada durante a TB, em especial o ligante DLL4 em subpopulações de monócitos. Além disso, a via Notch parece ser importante na modulação de respostas pró e anti-inflamatórias. Nesse trabalho, sugerimos que a expressão de Notch 1 em células T e DLL4 em subpopulações de monócitos estão associados com a gravidade da TB. Assim, a detecção desses constituintes da via Notch em PBMCs de pacientes com TB ativa são potenciais biomarcadores para avaliar a progressão da doença. / Tuberculosis (TB) is a bacterial infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), affects humans worldwide, and is considered a major cause of morbidity and mortality among infectious diseases. In this scenario, TB is still seen as a major challenge for science and medicine. With the study of new molecular targets for therapy and diagnosis, for example, Notch signaling has been described as an important pathway for the maintenance of immune response during Mtb infection. Thus, the objective of this work was to evaluate the participation of the Notch pathway in the modulation of the immune response during Mtb infection in humans. In this study, 13 patients with active tuberculosis and 13 healthy individuals were included. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated and evaluated for Notch 1 - 2 receptor expression in T cells and Notch, DLL1 - 4 ligands in monocyte subpopulations by flow cytometry and expression of Notch - pathway related genes and immune response. In addition, plasma was used to assess levels of cytokines, CD14s and CD163s. Furthermore, we evaluated the cellular function dependent on the activation of the Notch pathway during the infection of peripheral blood mononuclear cells of healthy subjects with Mtb H37Rv in vitro. We observed that patients with active TB had increased DLL4 expression in intermediate and nonclassic monocytes and decreased expression of Notch 2 in CD8+ T cells. In vitro, we observed in the cultures of PBMCs, increased expression of DLL4 in intermediate monocytes and Notch 2 in CD4+ T cells. The expression of the DLL4 linker in intermediate monocytes and the expression of Notch 1 in CD4+ T cells in patients with active TB correlated positively with the degree of lung injury. In addition, patients with moderate and advanced lung injury have higher Notch 1 expression in CD4+ T cells when compared to patients with a minimal degree of lung injury. Patients with active TB showed a significant increase in plasma levels of IL-6, IP-10, CD14s and CD163s, and decreased levels of IFN-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-1? and RANTES. The plasma levels of IFN-?, TNF-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-12, IL-1?, RANTES and IL-10 correlated positively with the highest degree of lung injury. In addition, we demonstrated that levels of IFN-?, IL-17A, IL-1?, IL-4 and IL-2 are related to higher Notch 1 receptor expression in CD4+ T cells, whereas plasma levels of IP-10,CD163s and procalcitonin correlate with increased Notch 1 expression in CD8+ T cells. We have shown a greater trend in HES1 expression in patients with active TB and in vitro infected cells, indicating that the Notch pathway is being activated during Mtb infection. Interestingly, in vitro cultures of PBMCs treated with the Notch pharmacological inhibitor (GSI), reduced IL-17A, IL-2 and IL-10 production and increased IL-8, while anti-hDLL4 treatment promoted the significant increase in TNF-? levels and monocyte phagocytic activity. In conclusion, the expression of Notch receptors and ligands is altered during TB, especially the DLL4 linker in monocyte subpopulations. In addition, the Notch pathway appears to be important in modulating pro and anti-inflammatory responses. In this work, we suggest that Notch 1 expression in T cells and DLL4 in monocyte subpopulations is associated with TB severity. Thus, detection of these constituents of the Notch pathway in PBMCs of patients with active TB are potential biomarkers to assess disease progression.

The potentially oncogenic human pathogen BK Polyomavirus (BKPyV) was first identified in 1971 and has since been associated with a number of diseases primarily in immunosuppressed patients. Infection is established in early life and by adulthood up to 90% of populations show seroconversion for the major capsid protein VP1. Despite this infections are rarely cleared, maintaining a silent asymptomatic persistence punctuated with periods of viral shedding in the urine. The virus is non-enveloped and comprises a simple ~5.2 Kb dsDNA genome which expresses just seven known proteins, necessitating a heavy reliance on, and interactions with, host mechanisms in order to efficiently replicate and disseminate within a population. The poorly understood lifelong persistence and failure to clear infection highlights our lack of understanding of the viral life cycle and viral interactions with host processes and responses to infection. Indeed, non-enveloped viruses are thought to spread solely through infected cell lysis but such large-scale lysis should trigger an acute inflammatory response, which is rarely seen in healthy immunocompetent individuals. The research conducted for this thesis first investigates the egress of BKPyV in a non-lytic manner, presenting evidence for an active non-lytic method of viral egress that is dependent on cellular anion homeostasis. Moreover, data generated for this thesis suggests that virions egress via an unconventional secretion pathway which traffics directly from the endoplasmic reticulum (ER) to the plasma membrane in single-membraned vesicles. Further research undertook a whole cell quantitative temporal viromic (QTV) approach, post-experimentally tagging whole cell lysate peptides with isobaric labels (Tandem Mass Tagging, TMT) to provide a greater understanding of host cell proteomic changes throughout BKPyV infection in two primary human cell types over 72 hours of infection. Such an approach identified ~9000 cellular proteins, of which a surprisingly small number changed significantly in abundance in response to BKPyV infection. Of those that were changed in abundance a large proportion were related to cell cycle, revealing that BKPyV infection induces a pseudo-G2 arrest, similar to the G2/M checkpoint. Validation of TMT results in both cell types provided confidence in this robust data set, and further studies highlighted the importance of not only cell cycle status, but the activity of CDK1 for efficient viral infection and replication. Additionally, TMT generated data emphasised the lack of innate immune induction in response to BKPyV infection, suggesting BKPyV exhibits a sophisticated evasion of pathogen recognition.

Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termo-dimórfico que se apresenta na forma de hifa a 25?C e forma de levedura a 37?C. Após inalação de conídios e propágulos de hifas presentes no ambiente, o fungo encontra no hospedeiro as condições ideais para transição em levedura, capaz de causar a doença paracoccidioidomicose (PCM), primariamente pulmonar, podendo ser seguida de disseminação sistêmica. O processo infeccioso é caracterizado pelo reconhecimento de constituintes de leveduras por receptores de células do sistema imune, especialmente fagócitos, que são ativados e produzem citocinas. Neutrófilos são as primeiras células recrutadas para o local da infecção, onde combatem o patógeno, fagocitando-o e liberando mediadores e efetores, como citocinas, ROS (Espécies Reativas de Oxigênio) e NETs (Armadilhas extracelulares de neutrófilos). Esses eventos, além de fatores ambientais e genéticos, têm influência sobre a resistência do hospedeiro ao fungo e, consequentemente, sobre a progressão da doença. Um aspecto da epidemiologia da doença impressiona: a incidência de PCM é mais alta em homens do que em mulheres, especialmente na idade reprodutiva. Especula-se que a melhor resposta das mulheres ao fungo possa relacionar-se à maior concentração de estrógeno, uma vez que esse hormônio, in vitro, inibe a transição de hifa em micélio. Adicionalmente, nosso grupo verificou, em modelo murino de PCM, que machos e fêmeas divergem quanto à resposta imunitária frente ao fungo, favorecendo a resistência de fêmeas. Todavia, neutrófilos, a despeito de sua aparente relevância em infecções fúngicas, nunca foram estudados quanto ao eventual papel na determinação de diferenças de gênero constatadas na PCM. Este trabalho teve como objetivo comparar neutrófilos de homens e mulheres quanto às funções reguladoras e efetoras, quando essas células são infectadas in vitro com leveduras de P. brasiliensis (multiplicidade de infecção (MOI) 5:1). Participaram do estudo 38 homens e mulheres saudáveis, com idade entre 23 e 35 anos. Como critério de inclusão no estudo, as mulheresIX deveriam estar entre o primeiro e o 15º dia do ciclo menstrual ou utilizarem anticoncepcional à base de estrógeno na data da coleta. Os neutrófilos, purificados a partir do sangue periférico e incubados com leveduras de P. brasiliensis e, estudados quanto às habilidades de fagocitose e eliminação de leveduras, produção de citocinas e ROS desenvolvidas por células oriundas de homens e mulheres. Os resultados indicam que os neutrófilos de mulheres mataram o fungo com maior eficiência e produziram maiores concentrações de TNF. Entretanto, dentre as funções neutrofílicas testadas, algumas não foram afetadas pelo gênero do doador, como a habilidade de fagocitose e a produção de ROS. Alguns ensaios foram precedidos da adição ao meio de ?-estradiol sintético. Na presença do hormônio sintético, verificamos que (i) neutrófilos de homens limitaram o crescimento fúngico de maneira mais eficiente; (ii) neutrófilos de homens e mulheres diminuíram a produção de TGF-?. Concluímos que há diferenças entre funções de neutrófilos oriundos de homens e de mulheres frente à infecção por P. brasiliensis. Parte dos déficits funcionais detectados em neutrófilos de homens frente à infecção fúngica foi revertida pela adição de estrógeno ao meio em que se procederam os ensaios. As observações feitas neste trabalho permitem postular que os neutrófilos, sob efeito do estrógeno, contribuem para que as mulheres sejam mais resistentes à PCM. / Paracoccidioides brasiliensis is a thermo-dimorphic fungus that appears as hyphae at 25 ° C and yeast at 37 ° C. After inhalation of conidia and propagules of hyphae resident in the environment, the fungus finds in the host the ideal conditions for transition in yeast, capable of causing the disease Paracoccidioidomycosis (PCM), primarily pulmonary, and may be followed by systemic dissemination. The infectious process implies in recognition of fungal constituents by immune cell receptors, especially phagocytes, which are activated. Neutrophils, the first recruited cells to the infection focus, fight the pathogen and initiate cytokines\' releasing and effector events, such as reactive oxygen species (ROS) production and extracellular traps (NETs) formation. Together, they influence the host resistance to the fungus and, consequently, the disease course. One aspect of the PCM epidemiology is impressive: its incidence is higher in men than in women, especially during their reproductive period. It is speculated that the women\'s better response to the fungus may be related to the estrogen higher concentration they have, since this hormone, in vitro, inhibits the yeast\'s growth. Additionally, our group has previously reported that in a murine PCM model, males and females differ on the immune response to the fungus, which favors the females\' resistance. However, neutrophils, despite their apparent relevance in fungal infections, have never been studied for their possible contributive role in the gender differences found in PCM. This work aimed to compare the neutrophils regulatory and effector functions in men and women when these cells were in vitro infected with P. brasiliensis yeasts. Healthy men and women aged between 23 and 35 have participated in the study. To be included, at the date of neutrophil harvesting women should be between the first and the 15th day of the menstrual cycle or use estrogen-based contraceptives. Neutrophils purified from peripheral blood were incubated with P. brasiliensis and assessed for the capacity of phagocytosis and elimination of yeasts, as well asXI for the production of cytokine and ROS. Neutrophils from women killed the fungi more efficiently and produced higher concentrations of TNF. Nonetheless, the donor gender has not affected some tested neutrophil functions, namely phagocytosis ability and ROS production. Moreover, assays performed in the presence of synthetic ?-estradiol showed that (i) men neutrophils started to kill yeasts more efficiently than in the absence of the hormone; (ii) neutrophils from men and women decreased the production of TGF-?. We conclude that in vitro infection with P. brasiliensis unveiled differences between men and women neutrophils\' functions. Part of the functional insufficiency verified in men\'s neutrophils of fighting against the fungal infection reversed by the estrogen addition to the assay medium. The results of this work allow postulating that neutrophils contribute to the women\'s resistance to paracoccidioidomycosis.

O desenvolvimento de uma resposta imune adequada é um processo extremamente importante para a manutenção da homeostase do organismo. Uma série de processos são desencadeados a partir do primeiro contato com micro-organismos patógenos até a efetivação da resposta imune de memória. Todos esses processos envolvem a participação e a complexa atuação de mediadores como as citocinas inflamatórias e também citocinas regulatórias, que exercerão efeitos controlando o processo inflamatório. Diversos mecanismos moleculares, subjacentes à resposta inflamatória, ainda não estão totalmente compreendidos, como por exemplo o controle da expressão de genes inflamatórios exercido pela IL-10. Os processos envolvidos na resposta inflamatória são mantidos às custas do consumo de nutrientes, dentre eles podemos destacar o aminoácido glutamina, que atua em nível molecular, fornecendo nitrogênio para a formação do material genético e fonte energética para determinadas células do sistema imunológico como os macrófagos. Portanto, neste trabalho, investigamos os efeitos da IL-10 na modificação de nucleossomos, evidenciando o papel dessa citocina em regular a expressão de genes inflamatórios em macrófagos. Avaliamos também a função da glutamina, modulando a expressão de RNAm de citocinas inflamatórias e regulatórias dessas células. E por último, desenvolvemos um modelo de restrição alimentar em camundongos, nos quais avaliamos os efeitos desse modelo considerando-se alguns aspectos hematológicos e estudamos as alterações na resposta inflamatória em células esplênicas e do peritônio, bem como avaliamos a suplementação de glutamina in vitro na produção das citocinas (IL-12, TNF-alfa, IL-10) e a expressão do fator de transcrição NFkB. Os resultados compilados mostraram que a IL-10 leva a uma rápida redução da acetilação de nucleossomos, modulando a arquitetura da cromatina de genes inflamatórios como a IL-12. A glutamina modula a expressão de citocinas inflamatórias, regulando positivamente a expressão de IL-10 e Interferon beta. E a restrição alimentar induz a redução de citocinas proinflamatórias (IL-12 e TNF-&#945;), influenciadas pelo aumento da produção de IL-10 e finalmente a suplementação com glutamina não interfere nesses parâmetros nas células peritoneiais e esplênicas do grupo submetido à restrição alimentar. Conclusão: a IL-10 modula a expressão gênica através da modificação de nucleossomos em macrófagos derivados da medula; a glutamina modula a expressão de IL-10 inibindo a resposta inflamatória, e a restrição alimentar modula alguns aspectos hematológicos e possui propriedades anti-inflamatórias. / The development of an appropriate immune response is an important process to the organism\'s homeostatic maintenance. A series of processes are triggered upon the very first contact with pathogens, up to the immunological memory establishment. These processes implicate in the participation of complex mediators, such as inflammatory and regulatory cytokines that will control the inflammatory process. Some mechanisms underlying the inflammatory response are not totally understood, the control of inflammatory genes exerted by IL-10 is an example. The processes involved in the inflammatory response are kept with nutrients expense, among these nutrients we can highlight the amino acid glutamine. It acts in a molecular level, supplying nitrogen to genetic material formation and as an energy supply for immune cells such as macrophages. Thus, we investigated the IL-10 effects on nucleosome modifications evidencing this cytokine role regulating inflammatory genes expression in macrophages. We also evaluated glutamine functions modulating inflammatory and regulatory cytokines mRNA expression on these cells. Ultimately, we developed a dietary restriction animal model where we evaluated it\'s effects on selected haematological aspects, analyzing the alteration in the inflammatory response of splenic and peritoneal cells. We also evaluated in vitro glutamine supplementation assessing cytokines production (IL-12, TNF-&#945;, and IL-10) and the expression of NFkB transcription factor. The compiled results a expressive reduction in nucleosome acetylation modifying the chromatin architecture of inflammatory genes such as IL-12 and IL-6. Glutamine modulates inflammatory cytokines gene expression upregulating the expression of IL-10 and interferon beta. The dietary restriction reduces proinflammatory cytokines production (IL-12 and TNF-&#945;), these results are influenced by the upregulated IL-10 production, glutamine supplementation have no effect on these parameters in the dietary restriction group. In conclusion, we can infer that IL-10 modulates gene expression trough nucleosome modification in bone marrow derived macrophages, glutamine has a potential effect on IL-10 expression, inhibiting the inflammatory response and dietary restriction modifies hematological parameters, presenting anti-inflammatory properties.

Neste estudo avaliamos a ocorrência de fagocitose por parte de alguns tipos celulares presentes na hemolinfa do carrapato bovino B. microplus e a produção de espécies reativas de oxigênio durante a resposta imune. As técnicas empregadas para avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio foram luminescência amplificada por luminol, oxidação de fenol vermelho, microscopia de fluorescência e fluorimetria com o corante dihidrorrodamina 123 (DHR). Observamos um aumento da luminescência amplificada por luminol quando hemócitos foram incubados na presença de bactérias Micrococcus luteus ou zimosam ou PMA. Esta luminescência foi inibida por superóxido dismutase (SOD) e por catalase (CAT), enzimas antioxidantes que removem superóxido e peróxido de hidrogênio, respectivamente. LPS não elicitou aumento da luminescência dos hemócitos em relação ao controle. Através da oxidação de fenol vermelho em reação inibida por CAT, verificamos aumento nos níveis de H2O2 produzido pelos hemócitos quando estimulados com PMA e Micrococcus luteus, enquanto não houve aumento quando o estímulo foi LPS, corroborando os resultados da luminescência. Usando microscopia de fluorescência para avaliar a produção de ERO pelos hemócitos, encontramos que cerca de 25% dos hemócitos fluorescem com maior intensidade quando estimulados com zimosam, sendo esta fluorescência inibida por CAT. Através de fluorimetria usando DHR observamos um aumento na intensidade de fluorescência dos hemócitos estimulados com PMA em reação inibida por cisteína, substância redutora que remove peróxido de hidrogênio e peroxinitrito. Nosso conjunto de resultados permitem concluir que os hemócitos do carrapato bovino produzem espécies reativas de oxigênio durante a resposta imune, semelhantemente ao que ocorre em vertebrados e em invertebrados como moluscos, crustáceos e insetos. Este é o primeiro trabalho mostrando produção de ERO pelos hemócitos de aracnídeos. / The phagocytic activity and the reactive oxygen species (ROS) production during immune response of some hemocytes of the cattle tick Boophilus microplus were evaluated in this study. The ROS production was evaluated by luminol amplified luminescence, phenol red oxidation, dyhydrorhodamine (DHR) fluorescence microscopy and fluorimetry. The luminol-amplified luminescence increased when hemocytes were incubated with bacteria (Micrococcus luteus) or zymosam or phorbol 12-miristate 13 acetate (PMA). The superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), antioxidant enzymes that removes superoxide and hydrogen peroxide, respectively, inhibited this luminescence. Lipopolysaccharide (LPS) did not elicit luminescence of hemocytes in relation to controls. The catalase-inhibittable phenol red oxidation assay also showed an increase in the level of hydrogen peroxide produced by hemocytes stimulated with PMA or Micrococcus luteus. LPS did not stimulate the hemocytes, similarly to the observed by luminescence assay's. We also evaluated ROS production by fluorescence microscopy and we found approximately 25% more fluorescent hemocytes when zymosam was used. This fluorescence was inhibited by catalase. In DHR fluorimetry assay we observed an increase in the intensity of fluorescence in PMA stimulated hemocytes. This fluorescence was inhibited by cystein, a reducing agent that removes hydrogen peroxide and peroxinitrite. We conclude that hemocytes of the tick, like other invertebrate such as mollusks, crustaceans and insects and vertebrate, produce reactive oxygen species during the immune response. This is the first report of reactive oxygen species production by arachnid hemocytes.