O transplante de ilhotas, como tratamento do diabetes mellitus tipo 1 (DM1) “lábil”, tem progredido consideravelmente ao longo dos últimos 12 anos. Nesse período, aproximadamente 750 pacientes foram transplantados em diversos centros, com resultados promissores. No entanto, é evidenciada uma grande disparidade entre os centros de transplantes em relação ao sucesso do isolamento e aos desfechos póstransplante. Alguns fatores podem explicar estas disparidades, como características do doador, qualidade do isolamento e o local da infusão das ilhotas. O isolamento das ilhotas é a fase mais complexa de todo o processo, devendo ser totalmente padronizada. O isolamento é feito com uma enzima de digestão, com auxílio físico e mecânico. A enzima Liberase HI era a enzima de escolha para a digestão do pâncreas, pois proporcionava uma boa quantidade e qualidade de ilhotas. No entanto, esta foi retirada do mercado em 2007, pois havia o risco de transmissão de encefalopatia espongiforme. Novas enzimas têm sido utilizadas e estão sendo testadas para a digestão do pâncreas; entretanto, não existe um consenso de qual enzima de digestão é mais eficiente no isolamento de ilhotas humanas.Devido à implantação do Laboratório de Biologia das Ilhotas Pancreáticas Humanas no Hospital de Clínicas de Porto Alegre e a necessidade da definição da enzima mais eficiente a ser utilizada no isolamento das ilhotas, consideramos adequada a realização de uma meta-análise sobre o tema. Esta metaanálise será útil para a tomada de decisão de outros Centros de isolamento e transplante de ilhotas pancreáticas. Para realizar a meta-análise foi feita a busca dos artigos nos sites Embase, Cochrane e PubMed. Dos 755 artigos encontrados, 16 artigos preencheram os critérios de elegibilidade e foram incluídos na meta-análise do tipo comparação de tratamentos múltiplos (MTC). Nossos resultados revelaram que as enzimas Vitacyte e Liberase MTF foram associadas a um pequeno aumento no rendimento das ilhotas [equivalentes de ilhotas (IEQ) /g pâncreas] quando comparadas com a Sevac [diferença média padronizada (95% intervalo de credibilidade) = -2.11 (- 4.09 a -0.29) e -2.20 (-4.26 a -0.31), respectivamente]. Contudo, as demais comparações de enzimas não mostraram nenhuma diferença significativa em relação ao rendimento de ilhotas. Além disso, nos desfechos pureza e viabilidade não foi verificado diferenças significativas entre nenhuma das enzimas de digestão analisadas. Assim, a nossa metaanálise MTC sugere que as enzimas de digestão disponíveis para o isolamento de ilhotas possuem eficiência semelhante em relação a rendimento de ilhotas, pureza e viabilidade. / Islet transplantation, as a treatment for brittle type 1 diabetes mellitus (DM1), has progressed considerably over the last 12 years. In this period, approximately 750 patients were transplanted in different centers, with promising results. However, a large disparity is observed among transplantation centers regarding the success of isolation and post-transplant outcomes. Some factors may explain these disparities, such as donor‘s characteristics, quality of the isolation and local of islet infusion. Islet isolation is the most complex phase of all process, and must be completely standardized. Isolation is performed using a digestion enzyme, with physical and mechanical aid. The Liberase HI enzyme was the enzyme of choice for pancreas digestion because it provided a good quantity and quality of islets. Nevertheless, this enzyme was withdrawn from the market in 2007 because there was a risk of transmission of bovine spongiform encephalopathy. New enzymes have been used and tested for pancreas digestion; however, there is no consensus about which is the digestion enzyme more efficient in human islet isolation. Due to the implementation of the Laboratory of Biology of Human Pancreatic Islets at Hospital de Clínicas de Porto Alegre and to the necessity to define the most efficient enzyme for being used in islet isolation, we consider appropriate to conduct a meta-analysis on the issue. This meta-analysis will be helpful for decision-making in other Centers of pancreatic islet transplantation. To carry out the meta-analysis we performed a comprehensive search for all entries in Pubmed, Embase and Cochrane libraries. Of 755 articles retrieved, 16 articles fulfilled the eligibility criteria and were included in a mixed-treatment comparison (MTC) meta-analysis. Our results revealed that Vitacyte and Liberase MTF were associated with a small increase in islet yield (islet equivalent number/g pancreas) when compared with Sevac enzyme [standardized mean difference (95% credible interval) = -2.11 (-4.09 to -0.29) and -2.20 (-4.26 to -0.31), respectively]. However, all other enzyme comparisons did not show any significant difference regarding islet yield. Moreover, percentages of purity and viability were not significantly different among any of the analyzed digestion enzymes. Thus, our MTC meta-analysis suggests that the digestion enzymes currently being used for islet isolation works with similar efficiency regarding islet yield, purity and viability.

Em homens, os níveis de testosterona e de testosterona biodisponível (livre e a ligada à albumina) declinam com a idade, apresentando elevado risco de desenvolver resistência à insulina e diabetes tipo II. Já foi demonstrada a ação clássica (efeito genômico) da testosterona sobre a síntese e a liberação de insulina em pâncreas de rato. Os objetivos do presente trabalho são determinar: 1) a ação não clássica específica da testosterona, da nandrolona e de outros esteróides sexuais sobre a secreção de insulina em ilhotas pancreáticas isoladas de ratos machos adultos; 2) a influência de aminoácidos sobre esta ação; 3) a ação da testosterona sobre o transporte de aminoácidos; 4) a participação dos canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L e dos canais KATP na ação da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2+; 5) a participação da via da fosfolipase C na ação da testosterona sobre a captação de 45Ca2+. As ilhotas foram isoladas de pâncreas de 3 ratos Wistar machos (pesando 180-220g) por experimento pela técnica de Lacy e Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). Nos experimentos de secreção de insulina, amostras de 10μL de ilhotas isoladas foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 3 minutos em presença ou não de testosterona (1μM), T-BSA (1μM), nandrolona (1μM), 17 -estradiol (10 nM) ou progesterona (1μM) em um incubador metabólico Dubnoff em tampão KRb-HEPES com glicose 3 mM a 37ºC, pH 7,4 e gaseificação constante com carbogênio (O2:CO2; 95:5; v/v). Nos experimentos com glutamina, lisina, alanina e leucina, as ilhotas eram incubadas por mais 3 minutos com estes aminoácidos. A incubação foi interrompida em banho de gelo. Os tubos com as ilhotas eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante coletado e a insulina quantificada por radioimunoensaio. No experimento de captação de aminoácido, as ilhotas isoladas (10μL) foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 15, 30 ou 60 minutos com 0,2 μCi de [1-14C] ácido a-metil aminoisobutírico mais testosterona (1μM). Após o final da incubação os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G. O sobrenadante (meio externo) era preservado. As ilhotas era transferidas para tubos Eppendorff contendo 1 mL de água destilada (meio interno). Os tubos com as ilhotas eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 100 μL de cada frasco e do respectivo meio externo para contagem da radioatividade. Os resultados foram expressos pela relação entre a radioatividade contida no tecido (meio interno) e no meio de incubação (meio externo). Nos experimentos de captação de 45Ca 2+, as ilhotas isoladas (50μL) eram pré-incubadas por 45 ou 50 minutos com 0,2 μCi 45Ca2+, novamente pré-incubadas por 10 minutos com nifedipina (1μM), diazoxida (100μM), glibenclamida (25μM), ou tolbutamida (10μM) e incubadas com ou sem testosterona (0,1μM) ou nandrolona (0,1μM) por 1 minuto. No experimento com U73122 (2μM), as ilhotas eram pré-incubadas por mais 15 minutos com este fármaco e incubadas com ou sem testosterona (1μM) por 1 minuto. Para a interrupção da incubação, utilizou-se 1 mL de tampão frio com cloreto de lantânio (10 mM) Após, os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante desprezado e as ilhotas lavadas duas vezes com a solução de cloreto de lantânio. As ilhotas eram transferidas para tubos tipo Eppendorff contendo 1 mL de água destilada. Os tubos eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 50 μL de cada frasco para contagem da radioatividade. A testosterona e a nandrolona estimularam a secreção de insulina após incubação de 3 minutos, através do fechamento de canais K+ ATP tendo, como conseqüência, o aumento da captação de Ca2+ e a exocitose do hormônio. A testosterona ligada à albumina, que não entra na célula e interage com receptor de membrana, também estimulou a secreção de insulina em 3 minutos, sugerindo um efeito de membrana dos andrógenos. Em nossas condições experimentais, o 17- -estradiol e a progesterona não mostraram efeito sobre a secreção de insulina. A ação androgênica sobre a secreção de insulina ocorreu somente na ausência de glicose ou em concentrações sublimiares (3mM). A testosterona não estimulou a captação do aminoácido metilaminoisobutírico [14C]. A L-alanina estimulou a secreção de insulina. Porém, quando associadas testosterona e alanina somente, houve redução na secreção. Também foi observado que uma mistura de aminoácidos (MIX- glutamina, lisina, leucina e alanina,) em diferentes concentrações proporcionais foi efetiva na secreção de insulina. Houve aumento significativo na secreção de insulina quando associados testosterona e a concentração 2x maior dos aminoácidos. Também, os andrógenos aumentaram a captação de Ca2+ em 60 segundos. A ação da testosterona sobre a captação de Ca2+ ocorreu em concentrações limiares de glicose (5 e 8 mM), porém não em concentrações elevadas (11 mM). Quando a testosterona foi incubada na presença de nifedipina (bloqueador de canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L), seu efeito estimulatório sobre a captação de 45Ca2+ foi anulado. Ocorreu inibição da ação androgênica quando a testosterona foi incubada em presença de diazoxida, a qual aumenta a probabilidade de abertura do canal K+ ATP. O efeito da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2 é análogo à ação das sulfoniluréias (glibenclamida e tolbutamida), as quais inibem o canal K+ ATP. Ambos os efeitos indicam que a ação da testosterona envolve o fechamento do canal K+ ATP e conseqüente despolarização da membrana da célula . O inibidor da fosfolipase C, o U73122, bloqueou a ação estimulatória de testosterona sobre a captação de 45Ca2+. Nossa conclusão para estes achados seria que a testosterona e a nandrolona, na presença de baixas concentrações de substratos energéticos como a glicose e aminoácidos, estimulariam a liberação da insulina para modular os efeitos catabólicos dos contra-reguladores e, assim, manter a homeostase. O mecanismo de secreção da insulina pelos andrógenos envolve a ativação de PLC via ligação ao receptor de membrana acoplado à proteína Gq, o fechamento de K+ ATP e a entrada de Ca2+ através de canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo L. / In men, testosterone and bioavailable testosterone levels ( free and and albumin-bound) decline with age, with high risk of developing insulin resistance and type 2 diabetes. It has been already shown the classic action of testosterone (genomic effect) on the insulin synthesis and release in rat pancreas. The objective of this survey is to determine: 1) the specific non-classical action of testosterone, nandrolone and other sex steroids on insulin secretion in isolated pancreatic islets from adult male rats; 2) aminoacids influence on this action; 3) testosterone action on amino acid transport; 4) the participation of L-type voltagegated Ca2+ channels and KATP channels in the testosterone and nandrolone action on the 45Ca2+ uptake; 5) the participation of phospholipase C via in the testosterone action on the 45Ca2+ uptake. The islets were isolated from the pancreas of 3 male Wistar rats (weighing between 180 and 200g) per experiment by the technique of Lacy and Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). In the experiments of insulin secretion, samples of 10μL of isolated islets were preincubated for 30 minutes and incubated for 3 minutes in the presence or absence of testosterone (1μM), T-BSA (1μM), nandrolone (1μM), 17 -estradiol (10 nM) or progesterone (1μM) in a Dubnoff metabolic incubator in KRb-HEPES buffer with 3 mM glucose at 37ºC, pH 7,4 and constant gasification constante with carbogen (O2:CO2; 95:5; v/v). In experiments with glutamine, lysine, alanine and leucine, the islets were incubated for another 3 minutes with these amino acids. The incubation was stopped in an ice bath. The tubes containing the islets were centrifuged for 2 minutes at 45xG, the supernatant collected and insulin measured by radioimmunoassay. In the experiment of amino acid uptake, isolated islets (10μL) were pre-incubated for 30 minutes and incubated for 15, 30 or 60 minutes with 0,2 μCi of [1-14C] a-metyl aminoisobutyric plus testosterone (1μM). After the end of incubation, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G. The supernatant (environment) was preserved. The islets were transferred to Eppendorff tubes containing 1mL of distilled water (internal environment). The tubes with islets were frozen for 24 hours and after this sonicated for 30 seconds. Samples of 100 μL were removed from each bottle and respective environment for radioactivity counting. Results were expressed by the relation between the radioactivity contained in the tissue (internal environment) and the incubation environment (external environment) . In the experiments of 45Ca 2+ uptake, the isolated islets (50μL) , were pre-incubated for 45 or 50 minutes with 0,2 μCi 45Ca2+, preincubated again for 10 minutes with nifedipine (1μM), diazoxide (100μM), glibenclamide (25μM), or tolbutamide (10μM) and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. In this experiment with U73122 (2μM), the islets were pre-incubated for more 15 minutes with this drug and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. For the interruption of incubation, it was used a cold 1mL buffer with lanthanum chloride (10mM). After, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G, the supernatant discarded and the islets washed twice with lanthanum chloride solution. The islets were transferred to Eppendorf tubes containing 1ml of distilled water. The tubes were frozen for 24 hours and after it, sonicated for 30 seconds. Samples of 50 μL were taken from each bottle for radioactivity counting. In isolated pancreatic islets of rats, testosterone and nandrolone have stimulated insulin secretion, after a 3-minute incubation period, closing the K+ ATP channels, having as consequence the increase of Ca2+ inflow and the hormone exocytosis. Testosterone conjugated to bovine serum albumin, which is not membrane permeable and interacts with the receptor of membrane, also stimulated insulin secretion in 3 minutes, suggesting an androgen membrane effect. In our experimental conditions, 17- -estradiol and progesterone have not demonstrated effects in insulin secretion. Testosterone has not stimulated the uptake of methylaminoisobutyric acid [1-14C]. L-alanine has stimulated insulin secretion. However, when testosterone was associated only with alanine, insulin secretion has decreased. It has also been noted that an aminoacid mixture (MIX-alanine, glutamine, lysine and leucine) in different proportional concentrations has been effective in insulin secretion. When associated, testosterone and MIX, there has been an increase in insulin secretion when the concentration of amino acids has been 2 times higher. Also, the androgens have increased the 45Ca2+ uptake in 60 seconds. However, the androgenic action has occurred only in absence of glucose or at sub stimulatory concentrations (3 mM). The action of testosterone on 45Ca2+ uptake has occurred at stimulatory glucose concentrations (5 and 8 mM), but not in high concentrations (11 mM). When testosterone has been incubated in the presence of nifedipine (Ca2+ type L channel blocker), its stimulatory effect on 45Ca2+ uptake has been nullified. When it was used diazoxide to produce the opening of K+ ATP channels, it has occurred the inhibition of androgenic action. The testosterone and nandrolone effect is analogous to the action of sulphonilureias (glibenclamida and tolbutamida), which inhibit the K+ ATP channel. Both effects show that testosterone action involves the K+ ATP channel closing and consequent membrane depolarization of cell. The presence of U73122, which inhibits the activation of PLC, has inhibited the testosterone action on 45Ca2+ uptake. Our conclusion for these results would be that testosterone and nandrolone, in the presence of low concentrations of energetics substrates as glucose and amino acids would stimulate the insulin liberation for modulating the catabolic effects of counter-regulators and, then, sustaining homeostasis. It can also be observed that the associated mechanism involves a Gq protein-coupled membrane receptor-binding, the PLC activation, the K+ ATP closing and Ca2+ entry through the voltage-dependent L-type calcium channels.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-26Bitstream added on 2014-06-13T19:49:32Z : No. of bitstreams: 1 000750938.pdf: 1775034 bytes, checksum: c641a43dad9d97c0e823027882ca517f (MD5) / A manutenção da homeostase energética é, sem duvida, o aspecto fisiológico mais importante para a garantia de sobrevivência animal. Doenças crônicas como câncer são capazes de alterar esta homeostase, agravada principalmente pela presença do tumor. O conjunto de sintomas envolvidos neste quadro de desequilíbrio metabólico, comum a diversas doenças, foi agrupado e caracterizado como uma síndrome metabólica denominada caquexia que, entre outros fatores, leva à progressiva perda de peso, perda de tecido muscular e adiposo, e está frequentemente associado a sintomas de anorexia e inflamação sistêmica. Na caquexia induzida por câncer, o desequilíbrio no metabolismo de carboidratos é um sintoma frequente, especialmente alterações no perfil secretório de insulina. Da mesma forma, a presença tumoral gera um estado de inflamação sistêmica que há algum tempo tem sido apontada como principal responsável pela alteração funcional de diversos órgãos, acarretando na progressão da síndrome. No entanto, não há trabalhos na literatura que correlacionem o papel da inflamação sistêmica gerada pelo desenvolvimento tumoral com a alteração no metabolismo de carboidratos, principalmente aquelas relacionadas à secreção de insulina. Em resultados anteriores evidenciamos que camundongos portadores do tumor sólido de Ehrlich (TSE) exibiram drástica diminuição na capacidade secretória de insulina, hipoinsulinemia, maiores sensibilidade a este hormônio e tolerância à glicose. Deste trabalho, inúmeras possibilidades de estudo surgiram, dentre elas a investigação do quadro inflamatório na ilhota como possível causador das alterações na secreção de insulina. Diante da escassez de trabalhos nesta área e diante da importância da adequada secreção de insulina e da homeostase glicêmica na melhora da sobrevida de portadores de doenças malignas, foi proposta do presente estudo avaliar... / The maintenance of energy homeostasis is one of the most crucial physiological tasks to ensure long-term survival in animals. Chronic diseases, as cancer, are capable to lead to homeostasis imbalance mainly by tumor presence and the cluster of symptoms involved in this process was named cachexia. Cancer cachexia is a metabolic syndrome characterized by a marked weight loss, loss of muscle and adipose tissues and is frequently associated with anorexia and systemic inflammation. Alterations in carbohydrate metabolism are frequent in cancer cachexia, especially insulinemic alterations. In the same way, tumor presence promotes severe systemic inflammation in the host, and it was demonstrated that this is responsible for functional alterations in many organs leading to cachexia progression. However, there are no studies that correlate the role of systemic inflammation with the alterations in carbohydrate metabolism, mainly related with alterations in insulin secretion. In previous studies we demonstrated that solid Ehrlich carcinoma-bearing mice (SET) showed drastic decrease in insulin secretion, hipoinsulinemia, increase in insulin sensitivity and glucose tolerance. With these results, numerous opportunities for study appeared, among then the establishment of inflammatory response in islets. Considering the lack of studies in this area and considering the importance of proper insulin secretion and glicemic homeostasis to the survival of cancer patients, we evaluated inflammatory response components in pancreatic islets of solid Ehrlich tumor-bearing mice in order to seek consistent information about possible mechanisms involved in alterations in insulin secretion in SET group. For this, pancreatic islets of control (CTL) and SET bearing mice were analyzed 14 days after tumor inoculation for determination of the expression of the proinflammatory citokynes TNF-α, IL-1β, IFNγ, IFN-α, IL-6 e IL-8, and ...

A reposição de ilhotas pancreáticas é uma forma eficaz de se restabelecer a homeostase glicêmica em pacientes com diabetes mellitus tipo 1 com controle metabólico instável (“DM1 lábil”). Entretanto, ao longo do processo de isolamento, a partir do pâncreas do doador em morte encefálica (ME) e posterior enxerto no receptor, perdas importantes, tanto no número quanto na qualidade das ilhotas, limitam a eficácia do procedimento de transplante. Frequentemente, transplantes sequenciais de dois ou até três pâncreas são necessários para se atingir a independência de insulina exógena. Mesmo que centros transplantadores já reportem boas taxas de sucesso, utilizando apenas um doador por paciente, a escassez de doadores ainda é um forte limitador dessa terapêutica, dificultando a adoção da reposição de ilhotas como prática clínica de rotina para o tratamento de pacientes com DM1 lábil. Entre os fatores responsáveis pela perda das ilhotas, pode-se destacar o intenso estresse inflamatório produzido pela ME do doador. Semelhantemente ao que ocorre com ilhotas pancreáticas, estudos clínicos e experimentais evidenciam que a ME induz danos teciduais irreversíveis em vários outros órgãos e tecidos destinados a transplante, tais como o coração, pulmões, rins e fígado. Órgãos provenientes de doadores vivos, em geral, resultam em desfechos pós-transplante mais favoráveis quando comparados às taxas de sucesso obtidas com órgãos derivados de doadores cadavéricos. Estudos recentes demonstram que a Exendin-4, um análogo do glucagon-like peptide-1 (GLP-1), possui propriedades anti-inflamatórias, pró-proliferativas e de redução da apoptose de células β pancreáticas. Interessantemente, esse mesmo análogo também apresentou efeitos protetores em diversos modelos animais de doenças hepáticas. Sendo assim, nós hipotetizamos que a administração dessa droga a doadores cadavéricos poderia amenizar os danos causados pela ME nas ilhotas pancreáticas e no tecido hepático, preservando a qualidade desses tecidos para uso em transplantes. A fim de testar a hipótese sugerida, desenvolveram-se dois estudos em modelo murino de ME. A administração de Exendin-4 a animais com ME foi avaliada em relação a diversos parâmetros de dano e qualidade teciduais, além de marcadores inflamatórios e expressão gênica de genes ligados a inflamação e estresse. Grupos de animais que não sofreram ME ou que sofreram ME mas não receberam a droga foram utilizados como controles nesses experimentos. Os resultados gerados indicam que a administração de Exendin-4 a ratos em ME melhora a viabilidade e a função de ilhotas pancreáticas isoladas. Isso foi acompanhado por uma redução na expressão gênica da citocina pró-inflamatória Interleukin-1 beta (Il1b) no tecido pancreático. Além disso, o tratamento com Exendin-4 também modulou a expressão de genes que codificam para proteínas de controle do estresse oxidativo celular, a superoxide dismutase-2 (Sod2) e a uncoupling protein-2 (Ucp2). Genes relacionados ao estresse do retículo endoplasmático, C/EBP Homologous Protein (Chop) e Heat Shock 70kDa Protein 5 (Hspa5), também conhecido como immunoglobulin heavy-chain binding protein (BiP), tiveram suas expressões reduzidas em ilhotas isoladas de animais tratados. Recentemente, tem sido demonstrado que o estresse do retículo endoplasmático participa no mecanismo de morte celular da célula β induzida por citocinas. Assim, nós sugerimos que o efeito protetor da Exendin-4 contra os danos causados pela ME provavelmente se dê através de uma diminuição da inflamação e do estresse oxidativo no ambiente pancreático, o que se traduz em uma menor ativação do estresse do retículo endoplasmático na célula β, consequentemente, reduzindo a morte celular nas ilhotas isoladas. Em ressonância com os efeitos benéficos observados nas ilhotas, animais tratados também apresentaram níveis reduzidos de marcadores de dano hepático circulantes, além de uma diminuição significativa nas taxas de apoptose no tecido hepático. Os resultados aqui apresentados, portanto, sugerem que a administração de Exendin-4 a doadores cadavéricos de múltiplos órgãos tem o potencial para minimizar os efeitos deletérios causados pela ME nas ilhotas pancreáticas e no fígado. O GLP-1, uma incretina gastrointestinal secretada pelas células L do intestino delgado, estimula a secreção de insulina dependente de glicose nas células β pancreáticas. Estudos recentes demonstram que o GLP-1 é capaz de proteger as células β do estresse oxidativo e dos danos inflamatórios, os quais são considerados fatores importantes não apenas na mediação dos danos teciduais induzidos pela ME, mas também na patogênese do diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Tal efeito estimulatório dependente de glicose pode ser explorado como uma estratégia terapêutica alternativa para o tratamento de pacientes com DM2, por reestabelecer a homeostase glicêmica e eliminar o risco de hipoglicemia associada à injeção exógena de insulina. Recentemente, vários ensaios clínicos confirmaram os efeitos benéficos de análogos do GLP-1, que incluem um melhor controle glicêmico e perda de peso, resultando na aprovação de tais análogos para o tratamento clínico do DM2. No entanto, os mecanismos moleculares que medeiam a estimulação da secreção de insulina pelo GLP-1 não são totalmente conhecidos. Isso gera a necessidade do desenvolvimento de estudos bioquímicos detalhados para elucidação das vias de transdução de sinal intracelulares responsáveis pela execução dos efeitos estimulatórios do GLP-1 na secreção de insulina. Devido à dependência de glicose para a ativação do seu efeito estimulatório, nós hipotetizamos que o GLP-1 possa atuar na regulação da atividade bioenergética de metabolismo da glicose na célula β. Utilizando-se da linhagem celular clonal secretora de insulina, BRIN-BD11 e ilhotas isoladas de camundongos, nós demonstramos que a sinalização através do receptor do GLP-1 (GLP-1R) promove a glicólise e, consequentemente, aumenta o conteúdo de ATP intracelular. Os dados deste estudo sugerem que isso provavelmente seja mediado pela ativação da mammalian Target of Rapamycin (mTOR), resultando na acumulação do fator de transcrição Hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1α), que por sua vez promove um aumento na expressão gênica de genes que codificam para enzimas da via glicolítica. Sugere-se que essa indução na taxa glicolítica possa reforçar o acoplamento metabólico entre estímulo e secreção, resultando no aumento da secreção de insulina dependente de glicose mediada por GLP-1. / Replacement of pancreatic islets is an effective way to restore glucose homeostasis in patients with type 1 diabetes mellitus with unstable metabolic control ("T1DM labile"). However, along the isolation procedure from brain dead organ donors and later recipient engraftment, significant losses, both in number and quality of islets take place, limiting the effectiveness of islet transplantation as a whole. Often, sequential transplants of two or three donors are necessary in order to achieve exogenous insulin independence. Even with recent advances and transplant centers already reporting good success rates using only one donor per patient, the shortage of donors is still a strong limitation of this therapy, hindering the adoption of islets reposition as routine clinical practice for the treatment of patients with T1DM labile. Several factors are responsible for islets loss, including intense inflammatory stress produced by the donor’s brain death (BD). Similarly to what happens with pancreatic islets, clinical and experimental studies show that BD induces irreversible tissue damage in several other organs and tissues destined for transplantation, such as heart, lungs, kidneys and liver. In general, organs from living donors result in more favorable post-transplant outcomes when compared to organs procured from cadaveric donors. Recent studies indicate that Exendin-4, a glucagon-like peptide-1 (GLP-1) analog, has anti-inflammatory, proliferative and anti-apoptotic properties in pancreatic β cells. Interestingly, this analog has also shown protective effects in several animal models of liver disease. Thus, we hypothesized that administration of this drug to cadaveric donors could mitigate damage caused by BD in the pancreatic islets and liver tissue. Such treatment could preserve islets and liver quality for use in transplantation and possibly improve outcomes. In order to test the suggested hypothesis, we developed two studies using a rat model of BD. Administration of Exendin-4 to animals that underwent experimental BD was evaluated against various parameters of tissue damage and quality, as well as inflammatory markers and gene expression of genes linked to inflammation and stress. Groups of animals that did not undergo BD or that underwent BD, but have not been given the drug were used as controls in these experiments. Results generated in these studies indicate that administration of Exendin-4 to brain dead rats improves the viability and function of isolated pancreatic islets. This was accompanied by a decrease in gene expression of the pro-inflammatory cytokine Interleukin-1 beta (Il1b) in the pancreatic tissue. In addition, treatment with Exendin- 4 also modulated the expression of genes encoding cellular oxidative stress control proteins, the superoxide dismutase-2 (Sod2), and uncoupling protein-2 (Ucp2). Genes related to stress of the endoplasmic reticulum (ER), C/EBP Homologous Protein (Chop) and Heat Shock 70kDa Protein 5 (Hspa5), also known as heavy-chain binding protein immunoglobulin (BiP), were found to be reduced in islets isolated from treated animals. Recently, ER stress has been shown to participate in the mechanism of β cell death induced by pro-inflammatory cytokines. Thus, we suggest that the protective effect of Exendin-4 against damage caused by BD probably occurs through a decrease in inflammation and oxidative stress in the pancreatic environment, which translates into a lower activation of ER stress in the β cells, hence reducing cell death of isolated islets. In resonance with the beneficial effects observed in islets, treated animals also showed reduced levels of circulating liver damage markers, and a significant decrease in the rate of apoptosis in the liver. Our results, therefore, suggest that administration of Exendin-4 to cadaveric organ donors has the potential to minimize the deleterious effects caused by BD in the pancreatic islets and liver. GLP-1, a gastrointestinal incretin secreted by the L-cells of the small intestine, stimulates insulin secretion in a glucose-dependent manner from pancreatic β cells. Recent studies have shown that GLP-1 is able to protect β cells from oxidative stress and inflammatory damage, which are considered important factors not only in mediating tissue damage induced by BD, but also in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Such glucose-dependent stimulatory effect can be exploited as an alternative therapeutic strategy for the treatment of patients with T2DM in order to reestablish glucose homeostasis and to eliminate the risk of hypoglycemia associated with exogenous insulin injection. Recently, several clinical trials have confirmed the beneficial effects of GLP-1 analogs, which include better glycemic control and weight loss, resulting in the approval of such analogs for the clinical treatment of T2DM. However, the molecular mechanisms that mediate stimulation of insulin secretion by GLP-1 are not fully characterized. Thus, detailed biochemical studies aiming at elucidating intracellular signal transduction pathways responsible for the execution of GLP-1 stimulatory effects on insulin secretion are of high interest. Due to glucose-dependence for activation of its stimulatory effect, we hypothesized that GLP-1 may act in the regulation of β cell bioenergetics and glucose metabolism. Using the clonal rat insulin-secreting cell line BRIN-BD11, and isolated mouse islets, we have demonstrated that signaling via the GLP-1 receptor (GLP-1R) promotes glycolysis and consequently increases intracellular ATP content. Our data suggest that this is likely mediated by activation of the mammalian Target of Rapamycin (mTOR), resulting in the accumulation of the transcription factor Hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1α), which, in turn, promotes gene expression of genes that encode for glycolytic enzymes. We suggest that such increase in the glycolytic rate strengthens coupling between metabolic stimulus and secretion, ultimately resulting in exacerbated glucose-induced insulin secretion.

O transplante de ilhotas, como tratamento do diabetes mellitus tipo 1 (DM1) “lábil”, tem progredido consideravelmente ao longo dos últimos 12 anos. Nesse período, aproximadamente 750 pacientes foram transplantados em diversos centros, com resultados promissores. No entanto, é evidenciada uma grande disparidade entre os centros de transplantes em relação ao sucesso do isolamento e aos desfechos póstransplante. Alguns fatores podem explicar estas disparidades, como características do doador, qualidade do isolamento e o local da infusão das ilhotas. O isolamento das ilhotas é a fase mais complexa de todo o processo, devendo ser totalmente padronizada. O isolamento é feito com uma enzima de digestão, com auxílio físico e mecânico. A enzima Liberase HI era a enzima de escolha para a digestão do pâncreas, pois proporcionava uma boa quantidade e qualidade de ilhotas. No entanto, esta foi retirada do mercado em 2007, pois havia o risco de transmissão de encefalopatia espongiforme. Novas enzimas têm sido utilizadas e estão sendo testadas para a digestão do pâncreas; entretanto, não existe um consenso de qual enzima de digestão é mais eficiente no isolamento de ilhotas humanas.Devido à implantação do Laboratório de Biologia das Ilhotas Pancreáticas Humanas no Hospital de Clínicas de Porto Alegre e a necessidade da definição da enzima mais eficiente a ser utilizada no isolamento das ilhotas, consideramos adequada a realização de uma meta-análise sobre o tema. Esta metaanálise será útil para a tomada de decisão de outros Centros de isolamento e transplante de ilhotas pancreáticas. Para realizar a meta-análise foi feita a busca dos artigos nos sites Embase, Cochrane e PubMed. Dos 755 artigos encontrados, 16 artigos preencheram os critérios de elegibilidade e foram incluídos na meta-análise do tipo comparação de tratamentos múltiplos (MTC). Nossos resultados revelaram que as enzimas Vitacyte e Liberase MTF foram associadas a um pequeno aumento no rendimento das ilhotas [equivalentes de ilhotas (IEQ) /g pâncreas] quando comparadas com a Sevac [diferença média padronizada (95% intervalo de credibilidade) = -2.11 (- 4.09 a -0.29) e -2.20 (-4.26 a -0.31), respectivamente]. Contudo, as demais comparações de enzimas não mostraram nenhuma diferença significativa em relação ao rendimento de ilhotas. Além disso, nos desfechos pureza e viabilidade não foi verificado diferenças significativas entre nenhuma das enzimas de digestão analisadas. Assim, a nossa metaanálise MTC sugere que as enzimas de digestão disponíveis para o isolamento de ilhotas possuem eficiência semelhante em relação a rendimento de ilhotas, pureza e viabilidade. / Islet transplantation, as a treatment for brittle type 1 diabetes mellitus (DM1), has progressed considerably over the last 12 years. In this period, approximately 750 patients were transplanted in different centers, with promising results. However, a large disparity is observed among transplantation centers regarding the success of isolation and post-transplant outcomes. Some factors may explain these disparities, such as donor‘s characteristics, quality of the isolation and local of islet infusion. Islet isolation is the most complex phase of all process, and must be completely standardized. Isolation is performed using a digestion enzyme, with physical and mechanical aid. The Liberase HI enzyme was the enzyme of choice for pancreas digestion because it provided a good quantity and quality of islets. Nevertheless, this enzyme was withdrawn from the market in 2007 because there was a risk of transmission of bovine spongiform encephalopathy. New enzymes have been used and tested for pancreas digestion; however, there is no consensus about which is the digestion enzyme more efficient in human islet isolation. Due to the implementation of the Laboratory of Biology of Human Pancreatic Islets at Hospital de Clínicas de Porto Alegre and to the necessity to define the most efficient enzyme for being used in islet isolation, we consider appropriate to conduct a meta-analysis on the issue. This meta-analysis will be helpful for decision-making in other Centers of pancreatic islet transplantation. To carry out the meta-analysis we performed a comprehensive search for all entries in Pubmed, Embase and Cochrane libraries. Of 755 articles retrieved, 16 articles fulfilled the eligibility criteria and were included in a mixed-treatment comparison (MTC) meta-analysis. Our results revealed that Vitacyte and Liberase MTF were associated with a small increase in islet yield (islet equivalent number/g pancreas) when compared with Sevac enzyme [standardized mean difference (95% credible interval) = -2.11 (-4.09 to -0.29) and -2.20 (-4.26 to -0.31), respectively]. However, all other enzyme comparisons did not show any significant difference regarding islet yield. Moreover, percentages of purity and viability were not significantly different among any of the analyzed digestion enzymes. Thus, our MTC meta-analysis suggests that the digestion enzymes currently being used for islet isolation works with similar efficiency regarding islet yield, purity and viability.

Em homens, os níveis de testosterona e de testosterona biodisponível (livre e a ligada à albumina) declinam com a idade, apresentando elevado risco de desenvolver resistência à insulina e diabetes tipo II. Já foi demonstrada a ação clássica (efeito genômico) da testosterona sobre a síntese e a liberação de insulina em pâncreas de rato. Os objetivos do presente trabalho são determinar: 1) a ação não clássica específica da testosterona, da nandrolona e de outros esteróides sexuais sobre a secreção de insulina em ilhotas pancreáticas isoladas de ratos machos adultos; 2) a influência de aminoácidos sobre esta ação; 3) a ação da testosterona sobre o transporte de aminoácidos; 4) a participação dos canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L e dos canais KATP na ação da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2+; 5) a participação da via da fosfolipase C na ação da testosterona sobre a captação de 45Ca2+. As ilhotas foram isoladas de pâncreas de 3 ratos Wistar machos (pesando 180-220g) por experimento pela técnica de Lacy e Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). Nos experimentos de secreção de insulina, amostras de 10μL de ilhotas isoladas foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 3 minutos em presença ou não de testosterona (1μM), T-BSA (1μM), nandrolona (1μM), 17 -estradiol (10 nM) ou progesterona (1μM) em um incubador metabólico Dubnoff em tampão KRb-HEPES com glicose 3 mM a 37ºC, pH 7,4 e gaseificação constante com carbogênio (O2:CO2; 95:5; v/v). Nos experimentos com glutamina, lisina, alanina e leucina, as ilhotas eram incubadas por mais 3 minutos com estes aminoácidos. A incubação foi interrompida em banho de gelo. Os tubos com as ilhotas eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante coletado e a insulina quantificada por radioimunoensaio. No experimento de captação de aminoácido, as ilhotas isoladas (10μL) foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 15, 30 ou 60 minutos com 0,2 μCi de [1-14C] ácido a-metil aminoisobutírico mais testosterona (1μM). Após o final da incubação os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G. O sobrenadante (meio externo) era preservado. As ilhotas era transferidas para tubos Eppendorff contendo 1 mL de água destilada (meio interno). Os tubos com as ilhotas eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 100 μL de cada frasco e do respectivo meio externo para contagem da radioatividade. Os resultados foram expressos pela relação entre a radioatividade contida no tecido (meio interno) e no meio de incubação (meio externo). Nos experimentos de captação de 45Ca 2+, as ilhotas isoladas (50μL) eram pré-incubadas por 45 ou 50 minutos com 0,2 μCi 45Ca2+, novamente pré-incubadas por 10 minutos com nifedipina (1μM), diazoxida (100μM), glibenclamida (25μM), ou tolbutamida (10μM) e incubadas com ou sem testosterona (0,1μM) ou nandrolona (0,1μM) por 1 minuto. No experimento com U73122 (2μM), as ilhotas eram pré-incubadas por mais 15 minutos com este fármaco e incubadas com ou sem testosterona (1μM) por 1 minuto. Para a interrupção da incubação, utilizou-se 1 mL de tampão frio com cloreto de lantânio (10 mM) Após, os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante desprezado e as ilhotas lavadas duas vezes com a solução de cloreto de lantânio. As ilhotas eram transferidas para tubos tipo Eppendorff contendo 1 mL de água destilada. Os tubos eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 50 μL de cada frasco para contagem da radioatividade. A testosterona e a nandrolona estimularam a secreção de insulina após incubação de 3 minutos, através do fechamento de canais K+ ATP tendo, como conseqüência, o aumento da captação de Ca2+ e a exocitose do hormônio. A testosterona ligada à albumina, que não entra na célula e interage com receptor de membrana, também estimulou a secreção de insulina em 3 minutos, sugerindo um efeito de membrana dos andrógenos. Em nossas condições experimentais, o 17- -estradiol e a progesterona não mostraram efeito sobre a secreção de insulina. A ação androgênica sobre a secreção de insulina ocorreu somente na ausência de glicose ou em concentrações sublimiares (3mM). A testosterona não estimulou a captação do aminoácido metilaminoisobutírico [14C]. A L-alanina estimulou a secreção de insulina. Porém, quando associadas testosterona e alanina somente, houve redução na secreção. Também foi observado que uma mistura de aminoácidos (MIX- glutamina, lisina, leucina e alanina,) em diferentes concentrações proporcionais foi efetiva na secreção de insulina. Houve aumento significativo na secreção de insulina quando associados testosterona e a concentração 2x maior dos aminoácidos. Também, os andrógenos aumentaram a captação de Ca2+ em 60 segundos. A ação da testosterona sobre a captação de Ca2+ ocorreu em concentrações limiares de glicose (5 e 8 mM), porém não em concentrações elevadas (11 mM). Quando a testosterona foi incubada na presença de nifedipina (bloqueador de canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L), seu efeito estimulatório sobre a captação de 45Ca2+ foi anulado. Ocorreu inibição da ação androgênica quando a testosterona foi incubada em presença de diazoxida, a qual aumenta a probabilidade de abertura do canal K+ ATP. O efeito da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2 é análogo à ação das sulfoniluréias (glibenclamida e tolbutamida), as quais inibem o canal K+ ATP. Ambos os efeitos indicam que a ação da testosterona envolve o fechamento do canal K+ ATP e conseqüente despolarização da membrana da célula . O inibidor da fosfolipase C, o U73122, bloqueou a ação estimulatória de testosterona sobre a captação de 45Ca2+. Nossa conclusão para estes achados seria que a testosterona e a nandrolona, na presença de baixas concentrações de substratos energéticos como a glicose e aminoácidos, estimulariam a liberação da insulina para modular os efeitos catabólicos dos contra-reguladores e, assim, manter a homeostase. O mecanismo de secreção da insulina pelos andrógenos envolve a ativação de PLC via ligação ao receptor de membrana acoplado à proteína Gq, o fechamento de K+ ATP e a entrada de Ca2+ através de canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo L. / In men, testosterone and bioavailable testosterone levels ( free and and albumin-bound) decline with age, with high risk of developing insulin resistance and type 2 diabetes. It has been already shown the classic action of testosterone (genomic effect) on the insulin synthesis and release in rat pancreas. The objective of this survey is to determine: 1) the specific non-classical action of testosterone, nandrolone and other sex steroids on insulin secretion in isolated pancreatic islets from adult male rats; 2) aminoacids influence on this action; 3) testosterone action on amino acid transport; 4) the participation of L-type voltagegated Ca2+ channels and KATP channels in the testosterone and nandrolone action on the 45Ca2+ uptake; 5) the participation of phospholipase C via in the testosterone action on the 45Ca2+ uptake. The islets were isolated from the pancreas of 3 male Wistar rats (weighing between 180 and 200g) per experiment by the technique of Lacy and Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). In the experiments of insulin secretion, samples of 10μL of isolated islets were preincubated for 30 minutes and incubated for 3 minutes in the presence or absence of testosterone (1μM), T-BSA (1μM), nandrolone (1μM), 17 -estradiol (10 nM) or progesterone (1μM) in a Dubnoff metabolic incubator in KRb-HEPES buffer with 3 mM glucose at 37ºC, pH 7,4 and constant gasification constante with carbogen (O2:CO2; 95:5; v/v). In experiments with glutamine, lysine, alanine and leucine, the islets were incubated for another 3 minutes with these amino acids. The incubation was stopped in an ice bath. The tubes containing the islets were centrifuged for 2 minutes at 45xG, the supernatant collected and insulin measured by radioimmunoassay. In the experiment of amino acid uptake, isolated islets (10μL) were pre-incubated for 30 minutes and incubated for 15, 30 or 60 minutes with 0,2 μCi of [1-14C] a-metyl aminoisobutyric plus testosterone (1μM). After the end of incubation, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G. The supernatant (environment) was preserved. The islets were transferred to Eppendorff tubes containing 1mL of distilled water (internal environment). The tubes with islets were frozen for 24 hours and after this sonicated for 30 seconds. Samples of 100 μL were removed from each bottle and respective environment for radioactivity counting. Results were expressed by the relation between the radioactivity contained in the tissue (internal environment) and the incubation environment (external environment) . In the experiments of 45Ca 2+ uptake, the isolated islets (50μL) , were pre-incubated for 45 or 50 minutes with 0,2 μCi 45Ca2+, preincubated again for 10 minutes with nifedipine (1μM), diazoxide (100μM), glibenclamide (25μM), or tolbutamide (10μM) and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. In this experiment with U73122 (2μM), the islets were pre-incubated for more 15 minutes with this drug and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. For the interruption of incubation, it was used a cold 1mL buffer with lanthanum chloride (10mM). After, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G, the supernatant discarded and the islets washed twice with lanthanum chloride solution. The islets were transferred to Eppendorf tubes containing 1ml of distilled water. The tubes were frozen for 24 hours and after it, sonicated for 30 seconds. Samples of 50 μL were taken from each bottle for radioactivity counting. In isolated pancreatic islets of rats, testosterone and nandrolone have stimulated insulin secretion, after a 3-minute incubation period, closing the K+ ATP channels, having as consequence the increase of Ca2+ inflow and the hormone exocytosis. Testosterone conjugated to bovine serum albumin, which is not membrane permeable and interacts with the receptor of membrane, also stimulated insulin secretion in 3 minutes, suggesting an androgen membrane effect. In our experimental conditions, 17- -estradiol and progesterone have not demonstrated effects in insulin secretion. Testosterone has not stimulated the uptake of methylaminoisobutyric acid [1-14C]. L-alanine has stimulated insulin secretion. However, when testosterone was associated only with alanine, insulin secretion has decreased. It has also been noted that an aminoacid mixture (MIX-alanine, glutamine, lysine and leucine) in different proportional concentrations has been effective in insulin secretion. When associated, testosterone and MIX, there has been an increase in insulin secretion when the concentration of amino acids has been 2 times higher. Also, the androgens have increased the 45Ca2+ uptake in 60 seconds. However, the androgenic action has occurred only in absence of glucose or at sub stimulatory concentrations (3 mM). The action of testosterone on 45Ca2+ uptake has occurred at stimulatory glucose concentrations (5 and 8 mM), but not in high concentrations (11 mM). When testosterone has been incubated in the presence of nifedipine (Ca2+ type L channel blocker), its stimulatory effect on 45Ca2+ uptake has been nullified. When it was used diazoxide to produce the opening of K+ ATP channels, it has occurred the inhibition of androgenic action. The testosterone and nandrolone effect is analogous to the action of sulphonilureias (glibenclamida and tolbutamida), which inhibit the K+ ATP channel. Both effects show that testosterone action involves the K+ ATP channel closing and consequent membrane depolarization of cell. The presence of U73122, which inhibits the activation of PLC, has inhibited the testosterone action on 45Ca2+ uptake. Our conclusion for these results would be that testosterone and nandrolone, in the presence of low concentrations of energetics substrates as glucose and amino acids would stimulate the insulin liberation for modulating the catabolic effects of counter-regulators and, then, sustaining homeostasis. It can also be observed that the associated mechanism involves a Gq protein-coupled membrane receptor-binding, the PLC activation, the K+ ATP closing and Ca2+ entry through the voltage-dependent L-type calcium channels.

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T07:06:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arantes_VanessaCristina_D.pdf: 1696436 bytes, checksum: 2db258b560bf7ee0ec64de7441adfe76 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Em animais, a desnutrição intra-uterina exerce efeitos marcantes sobre o desenvolvimento fetal e pós-natal. Sabe-se que animais desnutridos apresentam níveis elevados de ácidos graxos plasmáticos e esses, por sua vez, são responsáveis por alterar a secreção de insulina. Neste trabalho, verificamos a expressão do fator de transcrição PDX-1, da p38/SAPK2, o metabolismo da glicose e a secreção de insulina em ilhotas de ratos mantidos durante o período fetal e da lactação com uma dieta normoprotéica (17% de proteína) ou hipoprotéica (6% de proteína). Cultivamos as ilhotas por 48 horas em meio de cultura contendo 5.6 mM/L de glicose, na ausência ou presença de0.6 mM/L de ácido palmítico. A secreção de insulina em ilhotas isoladas em resposta 16,7 mmol/L de glicose foi reduzida em ratos desnutridos, no entanto, quando na presença de ácido graxo, observou-se um aumento. Em 2.8 mmol glicose/L,houve diminuição do metabolismo da glicose em ilhotas de desnutridos .Entretanto, quando estimuladas com 16.7 mmol/L de glicose, tanto as ilhotas de desnutridos como as do controle, apresentaram acentuada redução na oxidação da glicose, na presença de ácido graxo. Os níveis de mRNA do PDX-1 e da insulina aumentaram significativamente quando na presença de ácido graxo em ambos os grupos. O efeito do ácido palmítico sobre a expressão protéica de PDX-1 e da p38/SAPK2 apresentou-se similar em ambos os grupos, mas o aumento foi muito mais evidente em ilhotas de desnutridos. Esses resultados demonstram a complexa relação entre nutrientes no controle da secreção de insulina e mostram queos ácidos graxos desempenham um papel importante na homeostasia da glicose, por afetar mecanismos moleculares e as vias de acoplamentsecreção de insulina / Abstract: A severe reduction in insulin release in response to glucose is consistently noticed in protein-deprived rats and is attributed partly to the chronic exposure to elevated levels of free fatty acids. Since the pancreatic and duodenal transcription factor homeobox 1 (PDX-1) is important for the maintenance of B-cell physiology, and since PDX-1 expression is altered in the islets of rats fed a low protein diet, we assessed PDX-1 and insulin mRNA expression, as well as PDX-1 and p38/SAPK2 protein expression, in islets from young rats fed low (6%; LP) or normal (17%; C) protein diets and maintained for 48 h in culture medium containing 5.6 mmol glucose/L with or without 0.6 mmol palmitic acid/L. We also measured glucoseinduced insulin secretion and glucose metabolism. Insulin secretion by isolated islets in response to 16.7 mmol glucose/L was reduced in LP compared to C rats. In the presence of free fatty acids, there was an increase in insulin secretion in both groups At 2.8 mmol glucose/L, the metabolism of this sugar was reduced in LP islets, regardless of the presence of this fatty acid. However, when challenged with 16.7 mmol glucose/L, LP and C islets showed a severe reduction in glucose oxidation in the presence of free fatty acid. The PDX-1 and insulin mRNA were significantly higher when free fatty acid was added to the culture medium in both groups of islets.The effect of palmitic acid on PDX-1 and p38/SAPK2 protein levels was similar in LP and C islets, but the increase was much more evident in LP islets. These results demonstrate the complex interrelationship between nutrients in the control of insulin release and support the view that fatty acids play an important role in glucose homeostasis by affecting molecular mechanisms and stimulus/secretion coupling pathways / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jose Roberto Bosqueiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T17:39:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Quallio_Silvana_M.pdf: 957537 bytes, checksum: 0c375a9b9290585b85244a414a6ea02d (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Introdução e objetivos: O aumento nos níveis de glicose circulante é o principal estímulo para a secreção de insulina. A insulina se liga a receptores de membrana desencadeando diversas respostas celulares. Qualquer alteração na sensibilidade à insulina pode levar a disfunções fisiológicas como a resistência à insulina observada em pacientes diabéticos tipo 2 (T2DM). Experimentalmente, essa condição patológica pode ser mimetizada pela administração de altas doses de glicocorticóides, provendo assim um bom modelo para seu estudo. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a plasticidade das ilhotas pancreáticas submetidas à variação na necessidade secretória de insulina por indução de resistência periférica ao hormônio por tratamento com dexametasona e posterior interrupção do tratamento. Métodos: Ratos wistar com 90 dias de vida foram tratados com dexametasona (1mg/kg, ip) por 5 dias consecutivos (DEX). Em outro grupo (DEX10), os animais foram tratados da mesma maneira e avaliados 10 dias após o último dia da administração de dexametasona. Ratos controle (CTL) receberam administração de NaCl 0,9% apenas. As ilhotas foram isoladas pelo método da colagenase. A expressão de proteínas foi feita por immunoblotting. As análises morfométricas foram realizadas microscopicamente. Resultados: O grupo DEX exibiu marcante resistência periférica à insulina, que foi revertida após o período de 10 dias no grupo DEX10. As ilhotas do grupo DEX apresentaram alterações funcionais e morfológicas como aumento da secreção de insulina estimulada por secretagogos, da área, da densidade e tendência de aumento na massa de células ß ao contrário do grupo DEX10. O conteúdo de proteínas relacionadas ao ciclo celular como a CD2 e CDK4 e a fosforilação da AKT aumentou em ilhotas do grupo DEX, mas retornou aos níveis do CTL em ilhotas DEX10. Conclusão: Estes resultados mostram a plasticidade do pâncreas endócrino haja vista a habilidade de se adaptar a situações que exigem maior ou menor demanda de insulina / Abstract: Introduction and aims: Insulin binds to plasma membrane receptors leading to a variety of cellular responses. Malfunction in any of the insulin cell signalling pathways in target tissues may lead to several conditions and diseases, like hyperglycemia, insulin resistance and type 2 diabetes mellitus (T2DM). These effects may be experimentally reproduced using high doses of glucocorticoids, providing thus a good model for the study of T2DM. The aims of this study were to evaluate the plasticity of pancreatic islets subject to variation on the need for insulin secretory induction of peripheral resistance to the hormone by treatment with dexamethasone and subsequent treatment interruption. Methods: Male wistar rats (90 days old) were treated with dexamethasone (1mg/kg, ip) for 5 consecutive days (DEX). In another group (DEX10), the animals were treated in the same way and assessed 10 days after the last day of administration. Control rats (CTL) received equivalent volume of vehicle. Protein expression was assayed trough immunoblotting. Morphometric analyses were done using a optical microscope and specific digital analysis programs. Results: DEX group showed marked peripheral insulin resistance, reverted after the recovering period in the DEX10 group. DEX islets showed functional and morphological changes, like increased insulin secretion, superficial area, population density, and a tendency for increase in the total mass content of beta cell. Cell cycle proteins CD2 and CDK4 and AKT phosphorylation were increased in the DEX group when compared to CTL group. All these effects were reverted in the group DEX10. Conclusions: These results show that the endocrine pancreas possess a plasticity regarding the capacity of pancreatic islets to adapt themselves to situations where a higher or lower demand for insulin is needed. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Glicose e oxigênio desempenham um importante papel na regulação do metabolismo celular. Dada a importância de ambos no metabolismo - o primeiro como fonte de carbono preferencial da maior parte das células, e o segundo como aceptor final de elétrons na cadeia respiratória, em diversos organismos desenvolveram-se métodos adequados para detectar sua presença de modo a ajustar o metabolismo em função de sua disponibilidade. Neste trabalho foi realizado o estudo da expressão, no nível transcricional, dos genes envolvidos nas vias metabólicas primárias e genes envolvidos em morte celular, em células humanas, com o intuito de determinar as alterações no metabolismo energético em resposta a condições de hipóxia e anóxia, por meio da técnica de microarrays de cDNA. Utilizamos, inicialmente, células normais de fibroblasto humano ASl98 e células de fibroblasto humano MRC-5 imortalizadas por transfecção por SV40, e por fim células provenientes de ilhotas pancreáticas humanas, para a elaboração de um protocolo de cultura celular em que as mesmas crescessem aderidas a microcarregadores Cytodex I. Numa segunda etapa, células de ilhotas pancreáticas humanas foram cultivadas em suspensão, aderidas aos microcarregadores, num biorreator, sendo então realizada a análise do perfil transcricional dos genes escolhidos, frente às condições de baixa tensão de oxigênio. É apresentada a análise da expressão gênica de aproximadamente 160 genes na qual foram verificados um comportamento de indução daqueles envolvidos no metabolismo de lipídios e alguns na morte celular e um comportamento inicial de indução, e posterior inibição, do metabolismo primário como um todo. Em vista dos dados obtidos é de interesse ressaltar que essas células deveriam ser mantidas em saturações de oxigênio acima de 5% para evitar o efeito deletério observado na baixa concentração de oxigênio sobre a viabilidade celular, em termos da indução de alguns genes envolvidos na morte celular e da repressão geral dos relacionados ao metabolismo energético. Também foi verificado que, em saturações de oxigênio de até 10%, as células adotaram um padrão transcricional que indicou uma resposta ao estresse por falta de oxigênio, este por sua vez reflete-se na viabilidade celular, característica crucial para o sucesso do transplante clínico de ilhotas. / Glucose and oxygen have important roles on the regulation of cellular metabolism. Due to their importance in metabolism, the former as the preferential carbon source and the later as the final electron acceptor of the respiratory chain, many organisms have developed suitable processes to detect their presence in order to adjust the cellular metabolism to their availability. In this work, we have studied, in human cells and at the transcriptional level, the expression of genes involved in primary metabolism pathways and some of those related to cell death, aiming to resolve alterations in the energetic metabolism as a response to hypoxic and anoxic conditions, by means of cDNA microarrays. We initially used AS198 human fibroblastic normal cells and MRC-5 human fibroblastic cells immortalized by SV40, and later on cells from human pancreatic islets, to develop a cell culture protocol in which they would grow on the surface of Cytodex 1 microcarriers. As a second step, cells from human pancreatic islets were cultured on microcarriers in suspension inside a bioreactor. This culture was then used to carry out the transcriptional profile analysis of selected genes in response to low levels of oxygen. This work presents the analysis of gene expression of approximately 160 genes that can be divided into two distinct groups. The first group, the expression of which is induced, comprises genes involved in lipid metabolism and some of those related to cell death. The expression of the second group, consisting of diverse genes of the primary metabolism, suffers an initial induction followed by repression. Given the data acquired it is interesting to note that the human pancreatic islets should be maintained under at least 5% dissolved oxygen to avoid the deleterious effects on cell viability observed at lower oxygen concentrations, resulting in the induction of some genes involved in cell death and the repression of those related to energetic metabolism. It was also verified that, under oxygen saturation of at least 10%, these cells adopted a transcriptional profile that indicated a response to the stress created by the lack of oxygen, which would in turn reflect on cell viability, a crucial characteristic for success in clinical islet transplantation.

Orientador: Débora Cristina Damasceno / Resumo: Introdução: O período de vida neonatal é considerado um período crítico para o desenvolvimento pancreático. Portanto, a administração de streptozotocin (STZ) após o nascimento causa necrose em células beta pancreáticas. Neste estudo utilizando modelo experimental de diabete induzido por STZ no período neonatal, os animais apresentaram recuperação parcial das células da ilhota pancreática, e diabete de intensidade moderada na vida adulta. Para melhor compreensão de como este mecanismo acontece nós investigamos a relação entre PDX-1, Ngn-3, BMP-2 e -7 em diferentes momentos ao longo do primeiro mês de vida. Materiais e método: Ratas fêmeas recém-nascidas receberam STZ no dia do nascimento para indução do diabetes, e as ratas controle receberam veículo. Os animais foram eutanaziados em diferentes momentos da vida: D5, D10, D15 e D30. O sangue foi coletado para dosagem de insulina e sérica e o pâncreas foi coletado e processado para analises imunoistoquimicas de PDX-1, Ki-67, Ngn-3, BMP-2 e -7 e co-localização de células imunomarcadas para insulina e glucagon. Resultados: Os animais diabéticos apresentaram umaporcentagem diminuída de PDX-1 nuclear (nos dias D5, D15 e D30), com aumento de células se proliferando aos 5 e 10 dias de vida e maior imunomarcação de Ngn-3 nuclear em todos os momentos nas células das ilhotas pancreáticas. Além disso, a proporção de imunomarcação para BMP-2 e BMP-7 foi aumentada nas células das ilhotas pancreáticas nos grupos diabéticos quando comparado a... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Background: The neonatal period of life is a critical window for the pancreatic development. Then, as streptozotocin (STZ) administration after birth causes necrosis in beta (β)-pancreatic cell. In this STZ-induced diabetic model, the rats present a partial recovery of pancreatic islet cell, and mild diabetes status at adulthood. To better understand how this occur we investigate the relationship between PDX-1, Ngn-3, BMP-2 and -7 in different moments in first month of their life. Materials and method: Female newborn rats received STZ at birth for diabetes induction, and control received the vehicle. The animals were euthanized at different life days: D5, D10, D15, and D30. Blood was collected for insulin measurement and pancreas was collected and processed for immunohistochemical analysis of PDX-1, Ki-67, Ngn-3, BMP-2 and –7 and co-localization for labeling of insulin and glucagon. Results: The diabetic animals presented a lower immunostaining of PDX-1 (on D5, D15 and D30), a higher labeling of cell proliferation on D5 and D10 and higher immunostaining of nuclear Ngn-3 in all moments in pancreatic islet cell. Besides, the ratio for BMP-2 and –7 immunostaining was increased in pancreatic islet cell in diabetic groups compared to respective control. Conclusion: During neonatal period, PDX-1, Ngn-3, BMP-2 and –7 participate in intricate approach for physiological pancreatic remodeling in control and diabetic rats. However, diabetic animals present a reduced capability for β-cel... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor