Intra- und extrazelluläre ß-Amyloid-Ablagerungen (Abeta) sind ein neuropathologisches Hauptmerkmal der Alzheimerschen Demenz (AD). Aktuelle Studien belegen, dass nicht Abeta-Plaques, sondern Abeta-Oligomere die Schädigung von Synapsen und Nervenzellen verursachen und dass ihre Konzentration gut mit der Schwere der kognitiven Dysfunktion korreliert. Allerdings sind Abeta-Peptide eine heterogene Gruppe schwer wasserlöslicher Peptide mit zahlreichen C- und N-terminalen Modifikationen. Dabei hängt die Tendenz von Abeta-Peptiden Oligomeren zu bilden, ihre proteolytische Resistenz und ihr neurotoxisches Potential maßgeblich von ihrer N-terminalen Struktur ab. Abeta-Peptide, die N-terminal einen Pyroglutamyl-Laktamring (pE-Abeta) aufweisen, machen einen Hauptbestandteil der Abeta-Last in den frühen Stadien der AD aus. Diese modifizierten Abeta-Peptide aggregieren schneller als unmodifiziertes Abeta, sind gegen Proteolyse geschützt und wirken als Aggregationskeim für andere Abeta-Spezies. Das Enzym Glutaminylzyklase (QC) katalysiert die n-terminale pE-Modifikation von Abeta in vitro und in vivo und wird in Neuronenpopulationen gefunden, für die ein starker Verlust von Synapsen und Neuronen im Zusammenhang mit der AD beschrieben wurde. Diese Arbeit stellt die schichtspezifische Verteilung von QC im temporalen Kortex und der hippocampalen Formation von Alzheimerpatienten und Kontrollen vergleichend dar und zeigt einen direkten Zusammenhang zwischen der Überexpression von QC und der Vulnerabilität betreffender Neuronenpopulationen auf. Darüber hinaus bestätigen die vorgestellten Ergebnisse die These, wonach QC und pE-Abeta das Potential haben, nach axonalem Transport eine Kaskade in efferenten Hirnregionen zu initiieren, an deren Ende der Verlust von Nervenzellen steht. Diese Erkenntnisse unterstützen das Interesse an QC als Gegenstand zukünftiger Grundlagenforschung und Wirkstoffentwicklungen für die Therapie der AD.:1. Einleitung 1 1.1. Fallbeispiel 1 1.2. Epidemiologie der Alzheimerschen Erkrankung 1-2 1.3. Derzeitige Pharmakotherapie 2 1.4. Neuropathologie der Alzheimerschen Demenz 3 1.5. Amyloidprozessierung 3-5 1.6. Das Enzym Glutaminylzyklase 7-8 1.7. Fragestellung 8-9 2. Material und Methoden 10 2.1. Humanes Hirngewebe von Alzheimer- und Kontrollfällen 10-11 2.2. Anfertigung von Gefrierschnitten 11 2.3. Kresylviolett-Färbung nach Nissl 12 2.4. Immunhistochemie 12-16 2.5. Vergleich von vier Anti-QC-Antikörpern 17-18 2.6. Zählmethodik 19-22 2.7. Verwendete Hard- und Software 20 3. Ergebnisse 23 3.1. Neuronendichten der untersuchten Hirnregionen in 23-24 Alzheimer- und Kontrollgehirnen 3.2. QC-Immunreaktivitat in Alzheimer- und Kontrollgehirnen 25 3.2.1. QC-Immunreaktivität im temporalen Kortex 25-26 3.2.2. QC-Immunreaktivität im entorhinalen Kortex 27-28 3.2.3. QC-Immunreaktivität im Subikulum und Ammonshorn 29-31 3.3. Stärke der QC-Immunreaktivität in Alzheimer- und Kontrollgehirnen 32 3.3.1. Stärke der QC-Immunreaktivität im temporalen Kortex 32-33 3.3.2. Stärke der QC-Immunreaktivität im entorhinalen Kortex 34-35 3.4. Schichtspezifische Verteilung der QC-Immunreaktivität im temporalen und entorhinalen Kortex in Alzheimer- und Kontrollgehirnen 36-38 3.5. QC-Immunreaktivität der Ammonshornregionen CA1 – CA4 39-40 4. Diskussion 41 4.1. Abeta-Spezies und QC in der AD 41-42 4.2. QC im temporalen Kortex 42-44 4.3. QC im entorhinalen Kortex 44-47 4.4. QC im Hippocampus 47-49 4.5. Regionale, schichtspezifische und neuronale Verteilung von QC 49-51 4.6. Ausblick 51-53 5. Zusammenfassung (Deutsch und Englisch) 54-55 6. Literaturverzeichnis 56-65 7. Anhang 66 7.1. Färbeprotokoll für Immunhistochemie 66 7.2. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 67 7.3. Lebenslauf 68 7.4. Danksagung 69 / Intra- and extracellular s-amyloid (Abeta) deposits are a major neuropathological hallmark of Alzheimer\''s disease (AD). Recent studies demonstrate that Abeta oligomers rather than Abeta plaques cause severe damage of synapses and nerve cells and in addition the concentration of Abeta oligomers correlates well with the severity of cognitive dysfunction. However, Abeta peptides are a heterogeneous group of poorly water-soluble peptides with various C- and N-terminal modifications. Biophysical properties of these peptides such as their propensity to form oligomers, their proteolytic resistance and their neurotoxic potential particularly depends on their N-terminal structure. Abeta-peptides that contain a pyroglutamyl-a-lactam ring at their N-Terminus (pE-Abeta) constitute a major component of the Abeta load in the early stages of AD. These modified Abeta-peptides aggregate faster than unmodified Abeta, are protected against proteolysis and act as aggregation seed for other Abeta-species. The enzyme glutaminyl cyclase (QC)catalyzes the cyclization of Abeta to pE-Abeta in vitro and in vivo and is found in neuronal populations for which a strong loss of synapses and neurons in the context of AD is described. This thesis presents the layer-specific distribution of QC in the temporal cortex and the hippocampal formation of Alzheimer\''s patients and controls, showing a direct correlation between the overexpression of QC and the vulnerability of respective neuronal populations. Moreover, the presented results confirm the hypothesis that QC and pE-Abeta have the potential to initiate a cascade leading to the loss of nerve cells due to axonal transport and release in efferent brain regions. These findings support the interest in QC as a subject of fundamental research and future drug developments for the treatment of AD.:1. Einleitung 1 1.1. Fallbeispiel 1 1.2. Epidemiologie der Alzheimerschen Erkrankung 1-2 1.3. Derzeitige Pharmakotherapie 2 1.4. Neuropathologie der Alzheimerschen Demenz 3 1.5. Amyloidprozessierung 3-5 1.6. Das Enzym Glutaminylzyklase 7-8 1.7. Fragestellung 8-9 2. Material und Methoden 10 2.1. Humanes Hirngewebe von Alzheimer- und Kontrollfällen 10-11 2.2. Anfertigung von Gefrierschnitten 11 2.3. Kresylviolett-Färbung nach Nissl 12 2.4. Immunhistochemie 12-16 2.5. Vergleich von vier Anti-QC-Antikörpern 17-18 2.6. Zählmethodik 19-22 2.7. Verwendete Hard- und Software 20 3. Ergebnisse 23 3.1. Neuronendichten der untersuchten Hirnregionen in 23-24 Alzheimer- und Kontrollgehirnen 3.2. QC-Immunreaktivitat in Alzheimer- und Kontrollgehirnen 25 3.2.1. QC-Immunreaktivität im temporalen Kortex 25-26 3.2.2. QC-Immunreaktivität im entorhinalen Kortex 27-28 3.2.3. QC-Immunreaktivität im Subikulum und Ammonshorn 29-31 3.3. Stärke der QC-Immunreaktivität in Alzheimer- und Kontrollgehirnen 32 3.3.1. Stärke der QC-Immunreaktivität im temporalen Kortex 32-33 3.3.2. Stärke der QC-Immunreaktivität im entorhinalen Kortex 34-35 3.4. Schichtspezifische Verteilung der QC-Immunreaktivität im temporalen und entorhinalen Kortex in Alzheimer- und Kontrollgehirnen 36-38 3.5. QC-Immunreaktivität der Ammonshornregionen CA1 – CA4 39-40 4. Diskussion 41 4.1. Abeta-Spezies und QC in der AD 41-42 4.2. QC im temporalen Kortex 42-44 4.3. QC im entorhinalen Kortex 44-47 4.4. QC im Hippocampus 47-49 4.5. Regionale, schichtspezifische und neuronale Verteilung von QC 49-51 4.6. Ausblick 51-53 5. Zusammenfassung (Deutsch und Englisch) 54-55 6. Literaturverzeichnis 56-65 7. Anhang 66 7.1. Färbeprotokoll für Immunhistochemie 66 7.2. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 67 7.3. Lebenslauf 68 7.4. Danksagung 69

Background Prostate cancer (PCa) is the most frequently diagnosed malignant disease among adult males in the USA and the second leading cause of cancer deaths in men. Due to the lack of diagnostic tools that are able to differentiate highly malignant and aggressive cases from indolent tumors, overtreatment has become very common in the era of prostate specific antigen (PSA) screening. New diagnostic methods to determine biological status, malignancy, aggressiveness and extent of PCa are urgently needed. 1H High Resolution Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H HRMAS MRS) can be used to establish PCa metabolomic profiles while preserving tissue architecture for subsequent histopathological analysis. Immunohistochemistry (IHC), as opposed to conventional histopathology methods, has the potential to provide objective, more accurate and quantitative knowledge of tissue pathology. This diagnostic- accuracy study sought to evaluate a novel approach to quantitatively identify metabolomic markers of PCa by exploring the potential of PCa immunomarkers to quantify metabolomic profiles established by 1H HRMAS MRS. Material and Methods 1H HRMAS MRS was performed on tissue samples of 51 prostate cancer patients using a 14.1 Tesla NMR spectrometer (BRUKER Biospin, Billerica, MA) with a rotor synchronized CPMG pulse sequence. Spectral intensities of 36 regions of interest were measured as integrals of curve fittings with Lorentzian-Gaussian line shapes. Immunohistochemistry (IHC) was carried out following the spectroscopy scan, using three prostate immunomarkers to identify cancerous and benign glands: P504S (Alpha-methylacyl-CoA-racemace), CK903 (high-molecular weight cytokeratin) and p63. The immunostaining quality following 1H HRMAS MRS was evaluated and compared to unscanned sections of the same sample, to verify the stability and accessibility of the proposed immunomarkers. IHC images were automatically and quantitatively evaluated, using a quantitative image analysis program (QIAP), to determine the percentage of cancerous and benign epithelia in the tissue cross- sections. The results of the program were validated by a correlation with the results of a quantitative IHC review and quantitative conventional histopathology analysis performed by an experienced pathologist. Ultimately, spectral intensities and the cancer epithelium percentage, obtained from quantitative immunohistochemistry, were correlated in order to validate PCa metabolomic markers identified by 1H HRMAS MRS. Patient outcomes and incidence of recurrence were determined by retrospective review of medical records five years after initial surgery. Categories of recurrence were correlated to spectral intensities to explore potential metabolomic markers of recurrence in the cohort. Results Immunostainings with P504S and CK903 showed excellent staining quality and accessibility following 1H HRMAS MRS, suggesting these markers to be suitable for the presented quantitative approach to determine metabolomics profiles of PCa. In contrast, the quality of p63 IHC was impaired after previously performed spectroscopy. IHC using the immunomarkers P504S and CK903 on adjacent slides was found to present a feasible quantitative diagnostic method to distinguish between benign and cancerous conditions in prostate tissue. The cancer epithelium percentage as determined by QIAP showed a significant correlation to the results of quantitative IHC analysis performed by a pathologist (p < 0.001), as well as to a quantitative conventional histopathology review (p = 0.001). The same was true for the benign epithelium percentage (p < 0.001 and p = 0.0183), validating the presented approach. Two metabolomic regions showed a significant correlation between relative spectral intensities and the cancer epithelium percentage as determined by QIAP: 3.22 ppm (p = 0.015) and 2.68 ppm (p = 0.0144). The metabolites corresponding to these regions, phosphocholine and citrate, could be identified as metabolomic markers of PCa in the present cohort. 45 patients were followed for more than 12 months. Of these, 97.8% were still alive five years after initial surgery. 11 patients (24.4%) experienced a recurrence during the follow- up time. The categories of recurrence showed a correlation to the spectral intensities of two regions, 2.33 – 2.3 ppm (p = 0.0403) and 1.28 ppm (p = 0.0144), corresponding to the metabolites phosphocreatine and lipids. Conclusion This study introduces a method that allows an observer-independent, quantitative analysis of IHC to help establish metabolomic profiles and identify metabolomic markers of PCa from spectral intensities obtained with 1H HRMAS NMR Spectroscopy. The immunomarkers P504S and CK903 have been found suitable IHC analysis following 1H HRMAS MRS. A prospective in vivo application of PCa metabolite profiles and metabolomic markers determined by the presented method could serve as highly sensitive, non- invasive diagnostic tool. This observer- independent, computer- automated, quantitative analysis could help to distinguish highly aggressive tumors from low-malignant conditions, avoid overtreatment and reduce risks and complications for cancer patients in the future. Further studies are needed to verify the identified PCa metabolomic markers and to establish clinical applicability.:Table of Contents Glossary 1 Introduction 1. 1 Prostate Cancer 1. 2 Detection of Prostate Cancer – State of the Art 1. 2. 1 Prostate- Specific Antigen Test and Digital Rectal Examination 1.2.2 Radiographic Methods in PCa Detection 1.2.3 Transrectal Core Biopsies and Histopathological Analysis 1.2.4 Histopathological Grading of Prostate Cancer: GLEASON Score 1.3 Challenges and Need for New Approaches in PCa Diagnostic Management 2 Scientific Background I: Nuclear Magnetic Resonance,1H HRMAS NMR Spectroscopy and Metabolomic Profiles 2.1 Nuclear Magnetic Resonance 2.1.1 Spin Precession 2.1.2 Magnetic Resonance 2.1.3 Chemical Shift and J- coupling 2.2 Nuclear Magnetic Resonance 2.2.1 Magic Angle Spinning and 1H HRMAS NMR Spectroscopy 2.2.2 MAS Spinning Rates and Spinning Side Bands 2. 3 Metabolomics, Metabolite Profiles and Clinical Utility 3 Scientific Background II: Immunohistochemistry of Prostate Cancer 4 Aims of the Study 5 Material and Methods 5.1 Prostate Tissue Samples and Patient Demographics 5.2 1H HRMAS NMR Spectroscopy 5.2.1 Sample Preparation 5.2.2 Spectroscopy Scan 5.2.3 Data Processing 5.3 Immunohistochemistry 5.3.1 Immunohistochemistry Material and Equipment 5.3.2. Immunohistochemistry Protocol 5. 3. 3 Prostate Immunomarker Stability after 1H HRMAS NMR Spectroscopy 5.3.4 Qualitative IHC Analysis 5. 3.5 Quantitative IHC Analysis 5.3.5.1 Quantitative IHC Slide Review 5.3.5.2 Computer-Automated Quantitative IHC Analysis 5.3 Quantitative Histopathology 5. 4 Identification of Prostate Cancer Metabolomic Markers 5. 5 Patient Outcomes and Recurrence Categories 5.6 Statistical Analysis 6 Results 6. 1 Patient demographics 6. 2 Spectroscopy Results 6. 3 Immunohistochemistry 6. 3. 1 Evaluation of Prostate Immunomarker Stability after 1H HRMAS MRS 6. 3. 2 Qualitative Immunohistochemistry 6. 4 Quantitative Immunohistochemistry 6. 4. 1 Quantitative IHC Slide Review 6. 4. 2 Computer-Automated Quantitative IHC Evaluation using QIAP 6. 5 Quantitative Histopathology 6. 6 Identification of Prostate Cancer Metabolomic Markers using QIAP 6. 7 Patient Outcomes and Recurrence 7 Discussion 8 Summary / Abstract 9 Zusammenfassung 10 References 11 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 12 Danksagung 13 Lebenslauf und Publikationsverzeichnis Appendix A.1 Immunostaining protocols A.2 Spectral Intensities Measured by 1H HRMAS MRS in 51 Samples A.3 Graphs for Correlations of Spectral Intensities and CaE% determined by QIAP in 34 Additional Regions of Interest / Einführung Prostatakrebs ist eine häufigsten Krebserkrankungen in den USA und die zweithäufigste malignom- assoziierte Todesursache männlicher Patienten weltweit. Seit der Einführung des Prostata- spezifischen Antigen (PSA)- Screeningtests wird diese Krebsart in früheren Stadien diagnostiziert und therapiert, wodurch die Mortalitätsrate in den letzten Jahren deutlich reduziert werden konnte. Da moderne diagnostische Methoden bislang jedoch nicht ausreichend in der Lage sind, suffizient zwischen hochmalignen und weniger aggressiven Varianten dieses bösartigen Krebsleidens zu unterscheiden, werden häufig auch Patienten aggressiv therapiert, deren niedriggradiges Prostatakarzinom keine klinische Relevanz gehabt hätte. Es besteht daher ein großes wissenschaftliches Interesse an der Entwicklung neuer diagnostischer Methoden zur akkuraten Bestimmung von biologischem Status, Malignität, Aggressivität und Ausmaß einer Prostatakrebserkrankung. \\\\\\\"1H High Resolution Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy\\\\\\\" (1H HRMAS MRS) ist eine vielversprechende diagnostische Methode, welche es ermöglicht, metabolomische Profile von Prostatakrebs zu erstellen, ohne die Gewebsstruktur der analysierten Proben zu zerstören. Durch anschließende histopathologische Begutachtung lassen sich die erstellten Metabolitprofile validieren und evaluieren. Im Gegensatz zu konventionellen histopathologischen Methoden können durch immunhistochemische Verfahren dabei objektivere, akkuratere und quantifizierbare histopathologische Erkenntnisse gewonnen werden. Die vorliegende Studie präsentiert einen neuentwickelten diagnostischen Ansatz zur quantitativen Bestimmung von metabolomischen Markern von Prostatakrebs, basierend auf der Durchführung von 1H HRMAS NMR Spektroskopie und quantitativer Immunhistochemie. Material und Methoden Einundfünfzig Gewebsproben von Prostatakrebspatienten wurden mittels 1H HRMAS MRS an einem 14.1 T BRUKER NMR Spektrometer unter Einsatz einer CPMG-Pulssequenz untersucht. Spektrale Intensitäten in 36 Metabolitregionen wurden gemessen. Anschließend wurden die analysierten Gewebeproben mit drei Immunfärbemarkern für sowohl malignes (P504S, Alpha-methylacyl-CoA-racemase) als auch benignes (CK903, High-molecular weight cytokeratin, und p63) Prostatagewebe angefärbt und quantitativ mit Hilfe eines Bildanalyseprogramms (QIAP) ausgewertet. Die Anwendbarkeit und Auswertbarkeit der genannten Immunomarker nach Spektroskopie wurde evaluiert und mit der Färbungsqualität von nicht- gescannten Schnitten verglichen. Die Resultate der automatischen Auswertung durch QIAP konnten durch einen erfahrenen Pathologen in einer quantitativen Analyse der Immunfärbungen sowie konventioneller histologischer Färbungen derselben Gewebsproben validiert werden. Die spektralen Intensitäten aus den Messungen mit 1H HRMAS MRS wurden mit den korrespondierenden Ergebnissen der quantitativen Auswertung der Immunfärbungen korreliert, um metabolomische Marker von Prostatakrebs zu identifizieren. Der klinische Verlauf und die Rezidivrate der Patienten wurden 5 Jahre nach der initialen Prostatektomie retrospektiv bestimmt. Rezidivkategorien wurden erstellt und mit den bestimmten spektralen Intensitäten korreliert, um metabolomische Marker für das Auftreten von Prostatakrebsrezidiven zu identifizieren. Ergebnisse Die Immunfärbungen mit P504S und CK903 zeigten exzellente Qualität und Auswertbarkeit nach vorheriger 1H HRMAS MRS. Beide Marker eigneten sich zur Durchführung von quantitativer Immunhistochemie an spektroskopierten Gewebeproben. Im Gegensatz dazu war die Qualität der Immunfärbungen mit p63 nach Spektroskopie vermindert. Quantitative Immunfärbungen unter Einsatz der Immunmarker P504S und CK903 stellten eine praktikable diagnostische Methode dar, um zwischen malignen und benignem Prostatagewebe zu unterscheiden. Der Anteil von bösartig verändertem Prostatagewebe, bestimmt durch QIAP, korrelierte signifikant mit den Ergebnissen der quantitativen Analyse der Immunfärbungen durch den Pathologen (p < 0.001), sowie mit der quantitativen Auswertung der konventionellen histopathologischen Färbung (p = 0.001). Ebenso ließ sich die Bestimmung des Anteils von benignem Gewebe mit QIAP zu den Ergebnissen der pathologischen Analyse korrelieren (p < 0.001 und p = 0.0183). Für zwei metabolomische Regionen konnte ein signifikante Korrelation zwischen relativen spektralen Intensitäten, bestimmt mit 1H HRMAS NMR Spektroskopie, und dem Anteil von malignem Epithelium in derselben Gewebeprobe, ermittelt durch QIAP, festgestellt werden: 3.22 ppm (p = 0.015) und 2.68 ppm (p = 0.0144). Die zu diesen Regionen korrespondierenden Metaboliten, Phosphocholin und Zitrat, konnten als potentielle metabolomische Marker für Prostatakrebs identifiziert werden. Die retrospektiven Analyse der klinischen Daten der Patienten fünf Jahre nach Prostatektomie ergab eine Überlebensrate von 97.8%. Elf dieser Patienten (24.4%) erlitten ein Rezidiv ihrer Erkrankung. Die bestimmten Rezidivkategorien korrelierten signifikant mit zwei metabolomischen Regionen (2.33 – 2.3 ppm, p = 0.0403 und 1.28 ppm, p = 0.0144), welche zu den Metaboliten Phosphokreatin und Lipiden korrespondierten. Schlussfolgerung Die vorliegende Studie präsentiert einen diagnostischen Ansatz zur objektiven und quantitativen Bestimmung metabolomischer Marker von Prostatakrebs unter Verwendung von 1H HRMAS MRS und Immunhistochemie. P504S und CK903 eignen sich als Immunmarker für quantitative Immunfärbungen nach vorheriger Durchführung von 1H HRMAS MRS. Die Metaboliten Phosphocholin und Zitrat konnten in der vorliegenden Patientenkohorte als potentielle metabolomische Marker für Prostatakrebs identifiziert werden. Eine mögliche in vivo Anwendung der gefundenen metabolomischen Marker könnte als hochsensitives, objektives und nicht- invasives diagnostisches Werkzeug der Prostatakrebsdiagnostik dienen. Der vorliegende untersucherunabhängige, automatisierte und quantitative diagnostischer Ansatz hat das Potential, zwischen hochmalignen und weniger aggressiven Krebsfällen zu unterscheiden und somit unnötige Risiken und Komplikationen für Prostatakrebspatienten zu reduzieren. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die identifizierten metabolomischen Marker zu verifizieren und eine klinische Anwendung zu etablieren.:Table of Contents Glossary 1 Introduction 1. 1 Prostate Cancer 1. 2 Detection of Prostate Cancer – State of the Art 1. 2. 1 Prostate- Specific Antigen Test and Digital Rectal Examination 1.2.2 Radiographic Methods in PCa Detection 1.2.3 Transrectal Core Biopsies and Histopathological Analysis 1.2.4 Histopathological Grading of Prostate Cancer: GLEASON Score 1.3 Challenges and Need for New Approaches in PCa Diagnostic Management 2 Scientific Background I: Nuclear Magnetic Resonance,1H HRMAS NMR Spectroscopy and Metabolomic Profiles 2.1 Nuclear Magnetic Resonance 2.1.1 Spin Precession 2.1.2 Magnetic Resonance 2.1.3 Chemical Shift and J- coupling 2.2 Nuclear Magnetic Resonance 2.2.1 Magic Angle Spinning and 1H HRMAS NMR Spectroscopy 2.2.2 MAS Spinning Rates and Spinning Side Bands 2. 3 Metabolomics, Metabolite Profiles and Clinical Utility 3 Scientific Background II: Immunohistochemistry of Prostate Cancer 4 Aims of the Study 5 Material and Methods 5.1 Prostate Tissue Samples and Patient Demographics 5.2 1H HRMAS NMR Spectroscopy 5.2.1 Sample Preparation 5.2.2 Spectroscopy Scan 5.2.3 Data Processing 5.3 Immunohistochemistry 5.3.1 Immunohistochemistry Material and Equipment 5.3.2. Immunohistochemistry Protocol 5. 3. 3 Prostate Immunomarker Stability after 1H HRMAS NMR Spectroscopy 5.3.4 Qualitative IHC Analysis 5. 3.5 Quantitative IHC Analysis 5.3.5.1 Quantitative IHC Slide Review 5.3.5.2 Computer-Automated Quantitative IHC Analysis 5.3 Quantitative Histopathology 5. 4 Identification of Prostate Cancer Metabolomic Markers 5. 5 Patient Outcomes and Recurrence Categories 5.6 Statistical Analysis 6 Results 6. 1 Patient demographics 6. 2 Spectroscopy Results 6. 3 Immunohistochemistry 6. 3. 1 Evaluation of Prostate Immunomarker Stability after 1H HRMAS MRS 6. 3. 2 Qualitative Immunohistochemistry 6. 4 Quantitative Immunohistochemistry 6. 4. 1 Quantitative IHC Slide Review 6. 4. 2 Computer-Automated Quantitative IHC Evaluation using QIAP 6. 5 Quantitative Histopathology 6. 6 Identification of Prostate Cancer Metabolomic Markers using QIAP 6. 7 Patient Outcomes and Recurrence 7 Discussion 8 Summary / Abstract 9 Zusammenfassung 10 References 11 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 12 Danksagung 13 Lebenslauf und Publikationsverzeichnis Appendix A.1 Immunostaining protocols A.2 Spectral Intensities Measured by 1H HRMAS MRS in 51 Samples A.3 Graphs for Correlations of Spectral Intensities and CaE% determined by QIAP in 34 Additional Regions of Interest

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) microscopy is a novel method of optical imaging for the localization and quantification of target molecules in cells and tissue specimens. The major advantages of SERS over fluorescence are quantification and spectral multiplexing due to the small line width of vibrational Raman bands. The position of the plasmon band of both hollow gold/silver nanoshells and silica-encapsulated gold nanoclusters can be tuned for maximum SERS enhancement upon red laser excitation, which is optimal for minimizing the disturbing autofluorescence of tissue. In this work, silica-encapsulated and non-encapsulated SERS particles were used for the localization of target proteins in prostate tissue specimens. Two different biofunctionalization methods were established for each type of SERS particles. The cross-linking method based on s-NHS/EDC chemistry was modified for covalently conjugating proteins to hollow gold/silver nanoshells and gold nanostars in order to minimize the aggregation of SERS nanoparticles during and after cross-linking. As an alternative to covalent conjugation chemistry, the noncovalent binding of antibodies to the SERS particles via an adapter protein (protein A/G) was established. The influence of several factors that determine the quality of results obtained by SERS imaging, such as the number of immuno-SERS conjugates, incubation time, antigen retrieval and blocking buffer, were investigated. Rapid SERS microscopy with 30 msec acquisition time per pixel was enabled by using silica-encapsulated gold nanoclusters for the localization of p63 proteins on prostate tissue specimens from healthy donors. Two-color SERS experiments for the parallel localization of PSA and p63 were performed with silica-encapsulated and non-encapsulated nanoshells. The quality of the results depends less on the nature of the surface chemistry of the nanoparticles (with or without silica encapsulation), but more on the blocking buffer and the antigen retrieval method. Silica-encapsulated gold nanoclusters were also used for the simultaneous quantification of three cytokines (IL1, IL8 and TNF- α) in a SERS-based sandwich immunoassay with a detection limit of ca. 0.3 pM. Keywords: Raman, SERS microscopy, biocompatibility of nanoparticles, cross-linking, antigen unmasking methods, antigen detection, immunohistochemistry, immunoassay.

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Aufgrund ihres sehr hohen Metastasierungsrisikos weisen Patienten mit klarzelligem Nierenzellkarzinom (kzNZK) eine sehr hohe Sterblichkeit auf. Mit den zurzeit zur Verfügung stehenden klinischen Parametern kann der Krankheitsverlauf der Patienten nach der operativen Entfernung des Primärtumors nur unzureichend vorhergesagt werden. Um das Nachsorge- und Therapieregime der Patienten zu optimieren, muss die Vorhersagegenauigkeit der bestehenden Prognosemodelle durch molekulare Marker erhöht werden. Um geeignete Gene für eine Abschätzung von Metastasierungsrisiko und krankheitsfreiem Überleben (DFS) zu identifizieren, wurden genomweite Expressionsanalysen sowohl an Lungenmetastasen (n = 24) als auch an Primärtumoren (n = 24) des kzNZK vorgenommen. Durch Vergleich von Metastasensubgruppen, die sich nach unterschiedlich langen DFS entwickelt hatten bzw. Primärtumoren, die nach unterschiedlich langen DFS Metastasen bedingten, wurden tumorintrinsische DFS-assoziierte Expressionsmuster identifiziert. Weiterhin wurden Gene identifiziert, deren Expression sich zwischen Primärtumoren unterschied, die im Krankheitsverlauf manifeste Metastasen bedingten und solchen, die dies nicht taten. Die differenzielle Expression funktionell interessanter, teilweise auch in anderen publizierten Microarraystudien an kzNZK bestätigter Gene wurde im Folgenden mittels quantitativer Polymerasekettenreaktion (qPCR) validiert. Anschließend wurde die Assoziation ausgewählter Gene mit klinischen Parametern und dem Überleben der Patienten untersucht. Ein von klinischen Parametern unabhängiger Einfluss auf den Krankheitsverlauf der Patienten wurde dabei für EDNRB und PECAM1 auf Expressionsebene (qPCR; n = 86) sowie für TSPAN7 auf Proteinebene (Immunhistochemie an „Tissue Microarrays“; n = 106) belegt. EDNRB und PECAM1 waren signifikant höher exprimiert in Primärtumoren mit günstigen klinischen Parametern (TNMI/II, G1/2, V0, N0/M0). TSPAN7 war vorwiegend in den Gefäßen der primären kzNZK nachweisbar; eine signifikant höhere Zahl TSPAN7-positiver Gefäße war ebenfalls in Tumoren mit günstigen klinischen Parametern zu verzeichnen (pT1/2, TNMI/II, N0). Überlebensanalysen zeigten ein signifikant längeres DFS für Patienten mit einer hohen im Vergleich zu solchen mit einer geringen EDNRB-Expression und für Patienten, die in beiden untersuchten Gewebestanzen der „Tissue Microarrays“ TSPAN7-positive Gefäße aufwiesen im Vergleich zu Patienten mit nur einer oder keiner TSPAN7-gefäßpositiven Stanze. Für Patienten mit einer hohen im Vergleich zu solchen mit einer geringen EDNRB- bzw. PECAM1-Expression oder mit zwei im Vergleich zu keiner oder einer TSPAN7-gefäßpositiven Gewebestanze war zudem ein signifikant längeres tumorspezifisches Überleben (TSS) zu verzeichnen. Mit Hilfe multivariater Cox-Regressionsanalysen wurde eine unabhängige günstige prognostische Relevanz für EDNRB auf das DFS sowie für EDNRB, PECAM1 und TSPAN7 auf das TSS nachgewiesen. Somit sind diese molekularen Faktoren geeignet, um die Genauigkeit der bestehenden und ausschließlich auf klinischen Parametern basierenden Prognosemodelle zu erhöhen. Für eine Abschätzung von DFS und Metastasierungsrisiko erscheint dabei insbesondere EDNRB geeignet. / Patients with clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) have an extremely poor prognosis due to their high risk of metastases. Currently used clinico-patological parameters are insufficient for reliable prediction of metastatic risk and disease free survival (DFS) after surgical resection of the primary tumor. Molecular markers are strongly needed to improve outcome prediction, and thus to optimize the follow up and treatment schedule for patients with ccRCC. To identify genes which are suitable for the prediction of metastatic risk and DFS, genome-wide expression analyses were performed on pulmonary metastases (n = 24) and primary tumors (n = 24) obtained from patients with ccRCC. Tumor-intrinsic DFS-associated expression patterns were observed by comparing subgroups of metastases, which had developed within different DFS as well as primary tumors, which had caused metastases after different DFS. Furthermore, genes differentially expressed in primary tumors, which caused macroscopic metastases and tumors, which did not were identified. The differential expression of genes with a potential function in metastatic spread, which has in part been identified in independent published microarray studies as well, were validated by quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Moreover, an independent prognostic impact on the survival of ccRCC patients was observed for the EDNRB und the PECAM1 gene expression (qPCR; n = 86) as well as for the TSPAN7 protein level (immunohistochemistry on tissue microarrays; n = 106). Primary tumors of patients with favourable clinico-pathological parameters (TNMI/II, G1/2, V0, N0/M0) showed a significantly higher EDNRB und PECAM1 gene expression than those with unfavorable parameters. TSPAN7 was predominantly detected in blood vessels of ccRCC tissues. In patients with favourable clinico-pathological parameters (pT1/2, TNMI/II, N0) a significantly higher number of TSPAN7-positive vessels was observed. Using survival analyses, a significantly longer DFS was observed for patients with a high compared to those with a low EDNRB expression as well as for patients with TSPAN7-positive vessels in both cores compared to no or one of the both cores investigated on tissue microarrays. A significantly longer TSS was observed for patients with a high EDNRB or PECAM1 expression as well as for patients with TSPAN7-positive vessles in both tissue cores investigated. Furthermore, EDNRB was an independent prognostic factor for the DFS of the patients; EDNRB, PECAM and TSPAN7 had an independent prognostic impact on the TSS. Therefore, these molecular markers are suitable to improve the accuracy of outcome prediction based on clinico-pathological parameters in ccRCC. For the prediction of DFS and metastatic risk EDNRB is particularly interesting.