Estrongiloidíase é a infecção parasitária causada pelo nematódeo Strongyloides stercoralis. Em indivíduos imunocompetentes cursa de forma crônica e assintomática na maioria dos casos; entretanto em imunocomprometidos pode assumir as formas graves como a hiperinfecção e/ou estrongiloidíase disseminada. Diante da baixa sensibilidade do diagnóstico parasitológico, vêm sendo realizadas pesquisas envolvendo o imunodiagnóstico, sobretudo voltadas para variações na obtenção das frações antigênicas heterólogas utilizando Strongyloides venezulensis como fonte de antígeno. O presente trabalho teve como objetivo aprimorar o diagnóstico sorológico da estrongiloidíase humana utilizando técnicas imunoproteômicas. Foram utilizadas amostras de fezes e soro de indivíduos imunocompetentes, divididos em três grupos de acordo com o resultado do exame parasitológico (P: positivos para S. stercoralis; OP: com outras parasitoses; N: negativos para quaisquer parasitos ou comensais) e imunocomprometidos divididos em dois grupos de acordo com o resultado do exame parasitológico (S+ID: positivos para S. stercoralis e S-ID: negativos para S. stercoralis ou qualquer parasito). As amostras de soro dos cinco grupos de pacientes foram submetidas a testes sorológicos a partir das frações antigênicas heterólogas de S. venezuelensis solúvel (TS) e de membrana (TM) utilizando as técnicas ELISA, DOT ELISA e Western-blotting. O ELISA apresentou 95% de sensibilidade em ambas frações antigênicas e 91,8% e 93,8% de especificidade para TS e TM, respectivamente. A técnica foi capaz de detectar anticorpos anti-Strongyloides em 34,4% e 28,1% em pacientes do grupo S+ID utilizando os antígenos TS e TM, respectivamente. O DOT ELISA foi executado somente com a fração TM e apresentou 95% de sensibilidade e 85,7% de especificidade detectando 28,1% de positividade no grupo S+ID. A banda de 40-35 KDa foi a única frequente em todos indivíduos do grupo P e a mais frequente em pacientes S+ID (62,5% para TS e 53,1% para TM). Géis réplicas foram realizados, excisados nas regiões de identificação proteica e submetidos a identificação de proteínas por espectrometria de massas. As proteínas mais abundantes nas frações antigênicas TS e TM foram actina e galectina. A fração TS foi purificada em coluna de afinidade para galectina, dada sua capacidade de modulação do sistema imunológico. As frações não ligada (NL) e galectina (Gal) foram utilizadas como antígenos na técnica ELISA apresentando 90% de sensibilidade e 89,8 e 75% de especificidade para NL e Gal, respectivamente. Foram positivos no ELISA 34,4% e 18,1% das amostras do grupo S+ID utilizando as frações NL e Gal, respectivamente. As técnicas sorológicas utilizando variações antigênicas constituem ferramentas alternativas importantes de diagnósticos que podem ser aplicadas à estrongiloidíase humana, sobretudo na população imunocomprometida / Strongyloidiasis is a parasitic infection caused by nematode Strongyloides stercoralis. In immunocompetent patients, it is chronic and asymptomatic in the most of cases. However, in immunocompromised patients, it can take on severe forms such as hyperinfection and / or disseminated strongyloidiasis. Due to the parasitological diagnosis\'s low sensitivity, research involving the immunoassay has been carried out, primarily focused on changes in the heterologous antigenic fractions using Strongyloides venezulensis as a source of antigen. The present work aimed to improve the serological diagnosis of human strongyloidiasis using immunoproteomic techniques. Feces and sera samples from immunocompetent patients were used and divided into three groups according to parasitological examination result (P: positive for S. stercoralis, OP: with other parasites, N: negative for any parasites or commensal). Samples from immunocompromised patients were divided into two groups according to the parasitological examination result (S+ID: positive for S. stercoralis and S-ID: negative for S. stercoralis or any parasite). Serum samples from the five groups of patients were submitted to serological tests by S. venezuelensis soluble (TS) and from membrane (TM) heterologous antigenic fractions by ELISA, DOT ELISA and Western blotting techniques. The ELISA test showed 95% sensitivity in both antigenic fractions and 91.8% and 93.8% specificity for TS and TM, respectively. This technique was able to detect anti-Strongyloides antibodies in 34.4% and 28.1% in S+ID group by using the TS and TM antigens, respectively. DOT ELISA was performed only with the TM fraction and showed 95% sensitivity and 85.7% specificity, detecting 28.1% positivity in S+ID group. The 40-35 KDa band was the only present in all P group individuals and the most frequent in S+ID patients (62.5% for TS and 53.1% for TM). Replicate gels were made, excised in the protein identification regions and submitted to protein identification by mass spectrometry. The most abundant proteins in TS and TM antigenic fractions were actin and galectin. TS antigen was purified on a galectin affinity column, due the immune modulation ability. The non-bound (NL) and galectin (Gal) fractions were used as antigens in the ELISA technique with 90% of sensitivity and 89.8 and 75% of specificity for NL and Gal, respectively. 34.4% and 18.1% of S+ID group were positive in the ELISA by NL and Gal fractions, respectively. Serological techniques using antigenic variations are an important alternative diagnostic tool and can be applied to human strongyloidiasis, especially in the immunocompromised population

A infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) pode predispor à presença de fatores de risco cardiovascular e promover a ativação do sistema imunológico, contribuindo para a formação de lesões ateroscleróticas. A existência de coinfecções, como pelo Citomegalovírus (CMV) e a ativação imunológica inespecífica poderiam intensificar o processo de inflamação crônica e acelerar os danos vasculares decorrentes desta. O objetivo principal deste estudo foi avaliar se a recorrência da infecção pelo CMV, a magnitude da resposta imunológica específica ao CMV ou da ativação inespecífica de células T e monócitos associava-se ao aumento da espessura das camadas média e íntima das carótidas (cIMT) em crianças e adolescentes coinfectados pelo HIV e CMV. Consistiu-se de um estudo longitudinal, em que 40 crianças e adolescentes coinfectados pelo HIV e CMV foram acompanhados por 2 anos. Periodicamente avaliou-se a presença de recorrência do CMV, com o uso de detecção de DNA do CMV no soro por meio da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase; a ativação imunológica perante este vírus com o ensaio do Quantiferon CMVR, a dosagem de anticorpos IgM e IgG contra o CMV. Também, nós medimos a ativação imunológica inespecífica de células T usando a dosagem do receptor I de TNF solúvel (sTNFRI) e a quantificação da presença HLADR+CD38+TCD8+; e a de monócitos por meio da dosagem de CD14 solúvel (sCD14). Para caracterizar adicionalmente as crianças estudadas, outros parâmetros foram registrados periodicamente: 1-Relativos à infecção pelo HIV: parâmetros clínicos e quantificação de linfócitos CD4+/CD8+ e de RNA-HIV; 2-Parâmetros antropométricos: Peso, estatura, circunferência abdominal e Índice de Massa Corporal (IMC); 3-Parâmetros Laboratoriais: lipoproteínas, glicemia, insulinemia, hemoglobina glicosilada e cálculo do índice HOMA IR. Devido à baixa incidência de recorrência da infeção pelo CMV (0,97/100 pessoas-mês) não foi possível analisar este fator no presente estudo. De maneira geral, na entrada do estudo aespessura da íntima/média das artérias carótidas da maioria (70%) dos adolescentes situava- se acima do Percentil 75 da distribuição de referência, sendo que durante o período de 2 anos não ocorreu incremento significativo da medida desse parâmetro arterial. Não foi identificada associação entre a magnitude da ativação da imunidade específica ao CMV e a evolução da cIMT ao longo de dois anos. Apesar de ter sido detectado que pequenos incrementos nos indicadores de ativação imunológica inespecífica (TNRFI, sCD14 e/ou HLADR+CD38+) associaram-se a discretas reduções da cIMT ao final de dois anos, a ativação imunológica de células T e monócitos não se associou ao incremento da espessura da íntima/média arterial durante esse período de tempo. Embora não tenhamos confirmado a nossa hipótese, dados obtidos nesse estudo podem se tornar referencia para planejamento de estudos mais amplos e com maior período de observação. / Human Immunodeficiency Virus (HIV) infection might predispose the presence of cardiovascular risk factors and promote the activation of the immune system contributing to the formation of atherosclerotic lesions. The presence of coinfections, such as by Cytomegalovirus, and the immunological unspecific activation may intensify the process of chronic inflammation and accelerate the vascular damage resulting from it. The main objective of this study was to evaluate whether the recurrence of CMV infection and the degree of the CMV-specific cellular immune response or the unspecific activation of T cells and monocytes were associated with the increase in the thickness of the carotid intima-media thickness (cIMT) in HIV/CMV-coinfected children and adolescents. A longitudinal study was carried out in which 40 HIV/CMV-coinfected children and adolescents were followed-up for 2 years. Periodically, it was determined the presence of CMV recurrence with the use of CMV-DNA detection in serum by Polymerase Chain Reaction; the specific immunological activation of this virus with the Quantiferon CMVR assay and the dosage of IgM and IgG antibodies against CMV. Also, we measured the nonspecific immunological activation of T cells using the soluble TNF receptor I (sTNFRI), and the presence of HLADR+CD38+TCD8+; and that of monocytes by soluble CD14 dosage (sCD14). To further characterize the studied children, other parameters were periodically evaluated: 1-HIV-related: clinical parameters and quantification of CD4+/CD8+ lymphocytes and HIV-RNA; 2-Anthropometric parameters: weight, height, abdominal circumference, and Body Mass Index (BMI); 3-Laboratory parameters: lipoproteins, fasting glucose, fasting insulinemia, glycosylated hemoglobin, and calculation of HOMA IR. Due to the low incidence of CMV recurrence (0.97/100 persons-month), it was not possible to analyze this factor in the present study. Overall, the cIMT of most (70%) adolescents were higher than the 75 percentile of the reference distribution at enrollment, and no significant increment occurred over a 2 year period. No association between the degree of CMV-specific immunity activation and the evolution of cIMT over 2 years was identified. Although it was found that small increments on the unspecific immunological activation markers (TNRFI,sCD14 and/or HLADR+CD38+) were associated with discrete reductions of the cIMT at the end of two years, the immunological activation did not associate with an increment of the carotid intima/media thickness over this time period. Even if we have not confirmed our hypothesis, the data obtained in this study can be used for planning bigger studies with a more prolonged observation period.

Os fagócitos contêm uma nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase associada à membrana, que gera superóxido e outros reativos intermediários do oxigênio. Defeitos nesta oxidase em seres humanos resultam na doença granulomatosa crônica (DGC). Mutações próximas aos sítios de splicing que interferem com o processamento do RNA mensageiro, acarretando deleção de um ou mais exons, são cada vez mais freqüentes na literatura científica, nesses casos, os mecanismos moleculares que levam a DGC nem sempre são totalmente esclarecidos, assim como o efeito do IFN-g, seja sobre o processamento da mensagem ou estabilidade dos transcritos. Com base nessas informações o objetivo geral deste trabalho é investigar o efeito do IFN-g sobre a regulação do sistema NADPH oxidase fagocítico humano. Através dos resultados obtidos, não se pode constatar melhora na produção de ânions superóxido após o tratamento com IFN-g em pacientes com defeito de splicing, no entanto detectou-se aumento da expressão do gene CYBB através de PCR convencional e através de real-time PCR além de um aumento na marcação de proteínas do spliceossoma através do FAN. / Phagocytes have a nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase (NADPH) associated to plasmatic membrane that generates superoxide and other oxygen reactive intermediates. Defects on this oxidase in humans result in a disorder called Chronic Granulomatous Disease (CGD). Mutations next to splicing sites that interfere with the mRNA processing leading to deletion of one or more exons, are even more frequent on scientific literature, in these cases, the molecular mechanisms causing CGD are not always completetly clear, as well as the effect of IFN-g on the mRNA processing or on the stability of transcripts. Based on this information our aim is to investigate the effect of IFN-g on the regulation of the human NADPH oxidase phagocyte system.. With the obtained results it wasnt possible to see an increase in anion superoxide production after the IFN-g treatment in patients with splicing defects, however it was detected an increase on the expression of CYBB gene by conventional and real-time PCR besides an increase in the marking of spliceossomal proteins by FAN.

Introdução: O sangramento colorretal é considerado um sinal de alarme e não deve ser ignorado. A perda de sangue pode não ser identificada pelo paciente, o que caracteriza a presença de sangue oculto. Este diagnóstico pode ser confirmado por testes de Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes (PSOF), através de métodos químicos ou imunoquímicos de identificação da hemoglobina. O resultado positivo de um teste de PSOF requer investigação complementar com colonoscopia, exame invasivo, de alto custo e que exige preparo intestinal. Justifica-se, portanto, a aplicação de um teste diagnóstico mais sensível e específico. No presente estudo, foram avaliados quatro diferentes testes de PSOF em 176 pacientes submetidos à colonoscopia e seus resultados foram comparados. Objetivos: 1) avaliar o grau de concordância entre os testes de PSOF e a colonoscopia. 2) avaliar a sensibilidade, a especificidade e os valores de predição dos testes químico e imunoquímico de PSOF, em pacientes submetidos à colonoscopia. Métodos: Pacientes com indicação de realizar colonoscopia foram submetidos também à PSOF pelo método químico (o-toluidina) e pelo método imunoquímico, empregando três kits comerciais disponíveis no mercado. Os pacientes foram avaliados quanto à indicação do exame colonoscópico, resultado da colonoscopia e uso de alimentos e medicamentos que pudessem interferir no resultado dos testes fecais. Fundamentado nos achados endoscópicos, a colonoscopia foi categorizada em positiva ou negativa, de acordo com a possível fonte de sangramento colorretal. O grau de concordância entre os testes de PSOF foi avaliado pelo índice Kappa. Resultados: Dos 176 pacientes, houve predomínio do sexo feminino (64,8%), com média de idade de 55,5 anos. As indicações clínicas mais frequentes para realização de colonoscopia foram alteração do hábito intestinal, doença inflamatória intestinal, dor abdominal e anemia. Os principais achados foram pólipos < 1 cm, doença diverticular não complicada do cólon e exame normal. Quarenta e quatro (25%) colonoscopias foram categorizadas como positivas quanto à fonte de sangramento colorretal. Observou-se concordância (p<0,05) entre todos os testes avaliados e a colonoscopia. O teste da o-toluidina apresentou concordância pobre (Kappa 0,03), enquanto os demais testes apresentaram concordância moderada (Kappa entre 0,43-0,48). O teste da o-toluidina revelou menor sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo em comparação aos testes imunoquímicos. Conclusões: Os testes imunoquímicos apresentaram melhores índices de concordância com a colonoscopia, quando comparados ao teste da o-toluidina. Os testes imunoquímicos revelaram maior sensibilidade, especificidade e valores de predição na detecção de sangramento colorretal / Introduction: Colorectal bleeding is considered an alarm sign and should not be ignored. Blood loss can not be identified by the patient, which characterizes the presence of occult blood. This diagnosis can be confirmed by Faecal Occult Blood Testing (FOBT), through chemical or immunochemical methods. The positive outcome of a test requires complementary research FOBT with colonoscopy, an examination of invasive, costly and requires bowel preparation. It is justifiable, therefore, the application of diagnostic tests with better sensitivity and specificity. In the present study, we evaluated four different tests of PSOF in 176 patients undergoing colonoscopy and their results were compared. Objectives: 1) evaluate the degree of concordance between the PSOF tests and colonoscopy 2) assess the sensitivity, the specificity and the prediction values of the chemical and immunochemical FOBTs, in patients undergoing colonoscopy. Methods: Patients with indication of perform colonoscopy were subjected also to FOBT by the chemical method (toluidine test) and by the immunochemical method employing three commercial kits available in the market. Patients were evaluated regarding the indication of the colonoscopic examination, colonoscopy result, and use of foods and drugs that could interfere in the results of the faecal tests. Based on the endoscopic findings, the colonoscopy was rated as positive or negative, according to the possible colorectal bleeding source. The degree of accordance between FOBTs was evaluated by the Kappa index. Results: Among the 176 patients, there was a predominance of female gender (64.8%) with an average age of 55.5 years old. The most frequent clinical indication for colonoscopy were bowel habit changes, inflammatory bowel disease, abdominal pain and anemia. The main findings of colonoscopy were polyps <1 cm, uncomplicated colonic diverticular disease and normal exam. Forty-four (25%) colonoscopies were categorized as positive as to the possible source of colorectal bleeding. There was agreement (p<0.05) between all tests evaluated and the colonoscopy. The toluidine test presented poor accordance (Kappa 0.03), while the others showed moderate concordance (Kappa 0.43-0.48). The toluidine test showed less sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value compared to immunochemical tests. Conclusions: Immunochemical tests showed the best indexes of agreement with colonoscopy, when compared to the toluidine test. The immunochemical tests have shown greater sensitivity, specificity and predictive values in detecting colorectal bleeding

A infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) pode predispor à presença de fatores de risco cardiovascular e promover a ativação do sistema imunológico, contribuindo para a formação de lesões ateroscleróticas. A existência de coinfecções, como pelo Citomegalovírus (CMV) e a ativação imunológica inespecífica poderiam intensificar o processo de inflamação crônica e acelerar os danos vasculares decorrentes desta. O objetivo principal deste estudo foi avaliar se a recorrência da infecção pelo CMV, a magnitude da resposta imunológica específica ao CMV ou da ativação inespecífica de células T e monócitos associava-se ao aumento da espessura das camadas média e íntima das carótidas (cIMT) em crianças e adolescentes coinfectados pelo HIV e CMV. Consistiu-se de um estudo longitudinal, em que 40 crianças e adolescentes coinfectados pelo HIV e CMV foram acompanhados por 2 anos. Periodicamente avaliou-se a presença de recorrência do CMV, com o uso de detecção de DNA do CMV no soro por meio da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase; a ativação imunológica perante este vírus com o ensaio do Quantiferon CMVR, a dosagem de anticorpos IgM e IgG contra o CMV. Também, nós medimos a ativação imunológica inespecífica de células T usando a dosagem do receptor I de TNF solúvel (sTNFRI) e a quantificação da presença HLADR+CD38+TCD8+; e a de monócitos por meio da dosagem de CD14 solúvel (sCD14). Para caracterizar adicionalmente as crianças estudadas, outros parâmetros foram registrados periodicamente: 1-Relativos à infecção pelo HIV: parâmetros clínicos e quantificação de linfócitos CD4+/CD8+ e de RNA-HIV; 2-Parâmetros antropométricos: Peso, estatura, circunferência abdominal e Índice de Massa Corporal (IMC); 3-Parâmetros Laboratoriais: lipoproteínas, glicemia, insulinemia, hemoglobina glicosilada e cálculo do índice HOMA IR. Devido à baixa incidência de recorrência da infeção pelo CMV (0,97/100 pessoas-mês) não foi possível analisar este fator no presente estudo. De maneira geral, na entrada do estudo aespessura da íntima/média das artérias carótidas da maioria (70%) dos adolescentes situava- se acima do Percentil 75 da distribuição de referência, sendo que durante o período de 2 anos não ocorreu incremento significativo da medida desse parâmetro arterial. Não foi identificada associação entre a magnitude da ativação da imunidade específica ao CMV e a evolução da cIMT ao longo de dois anos. Apesar de ter sido detectado que pequenos incrementos nos indicadores de ativação imunológica inespecífica (TNRFI, sCD14 e/ou HLADR+CD38+) associaram-se a discretas reduções da cIMT ao final de dois anos, a ativação imunológica de células T e monócitos não se associou ao incremento da espessura da íntima/média arterial durante esse período de tempo. Embora não tenhamos confirmado a nossa hipótese, dados obtidos nesse estudo podem se tornar referencia para planejamento de estudos mais amplos e com maior período de observação. / Human Immunodeficiency Virus (HIV) infection might predispose the presence of cardiovascular risk factors and promote the activation of the immune system contributing to the formation of atherosclerotic lesions. The presence of coinfections, such as by Cytomegalovirus, and the immunological unspecific activation may intensify the process of chronic inflammation and accelerate the vascular damage resulting from it. The main objective of this study was to evaluate whether the recurrence of CMV infection and the degree of the CMV-specific cellular immune response or the unspecific activation of T cells and monocytes were associated with the increase in the thickness of the carotid intima-media thickness (cIMT) in HIV/CMV-coinfected children and adolescents. A longitudinal study was carried out in which 40 HIV/CMV-coinfected children and adolescents were followed-up for 2 years. Periodically, it was determined the presence of CMV recurrence with the use of CMV-DNA detection in serum by Polymerase Chain Reaction; the specific immunological activation of this virus with the Quantiferon CMVR assay and the dosage of IgM and IgG antibodies against CMV. Also, we measured the nonspecific immunological activation of T cells using the soluble TNF receptor I (sTNFRI), and the presence of HLADR+CD38+TCD8+; and that of monocytes by soluble CD14 dosage (sCD14). To further characterize the studied children, other parameters were periodically evaluated: 1-HIV-related: clinical parameters and quantification of CD4+/CD8+ lymphocytes and HIV-RNA; 2-Anthropometric parameters: weight, height, abdominal circumference, and Body Mass Index (BMI); 3-Laboratory parameters: lipoproteins, fasting glucose, fasting insulinemia, glycosylated hemoglobin, and calculation of HOMA IR. Due to the low incidence of CMV recurrence (0.97/100 persons-month), it was not possible to analyze this factor in the present study. Overall, the cIMT of most (70%) adolescents were higher than the 75 percentile of the reference distribution at enrollment, and no significant increment occurred over a 2 year period. No association between the degree of CMV-specific immunity activation and the evolution of cIMT over 2 years was identified. Although it was found that small increments on the unspecific immunological activation markers (TNRFI,sCD14 and/or HLADR+CD38+) were associated with discrete reductions of the cIMT at the end of two years, the immunological activation did not associate with an increment of the carotid intima/media thickness over this time period. Even if we have not confirmed our hypothesis, the data obtained in this study can be used for planning bigger studies with a more prolonged observation period.

by Koo Po Lan. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2001. / Includes bibliographical references (leaves 120-130). / Abstracts in English and Chinese. / Acknowledgement --- p.i / Abstract --- p.ii / Abstract (Chinese version) --- p.iv / Content --- p.vii / List of Abbreviations --- p.xi / List of Figures and Tables --- p.xiii / Chapter Chapter 1 --- Introduction / Chapter 1.1 --- Saponins --- p.1 / Chapter 1.2 --- Structure of Saponin --- p.2 / Chapter 1.2.1 --- Triterpene Class --- p.2 / Chapter 1.2.2 --- Steroid Class --- p.3 / Chapter 1.2.2.1 --- Spirostanol Glycoside --- p.4 / Chapter 1.2.2.2 --- Furostanol Glycoside --- p.4 / Chapter 1.2.3 --- Steroid Alkaloid Class --- p.5 / Chapter 1.3 --- Steroidal Saponin as Anti-Tumor Drug --- p.5 / Chapter 1.4 --- Possible Anti-Tumor Action Mechanisms of Steroid Saponin --- p.6 / Chapter 1.4.1 --- Direct Cytotoxic and Growth Inhibitory Effects --- p.7 / Chapter 1.4.2 --- Immune-Modulatory Effects --- p.8 / Chapter 1.5 --- Possible Anti-Carcinogenicity Action Mechanism of Saponin --- p.9 / Chapter 1.5.1 --- Saponin Binding to Bile Acids --- p.9 / Chapter 1.6 --- Saponin as Cardioactive Drug --- p.9 / Chapter 1.7 --- Liver Cancer --- p.10 / Chapter 1.7.1 --- Prevalence of Hepatocellular Carcinoma (HCC) --- p.11 / Chapter 1.8 --- Coronary Heart Disease (CHD) --- p.12 / Chapter 1.8.1 --- Prevalence and Risk Factors of CHD --- p.12 / Chapter 1.9 --- Diosgenin --- p.14 / Chapter 1.10 --- Hong Kong (HK) Products --- p.15 / Chapter 1.10.1 --- HK-18 (Polyphyllin D) --- p.15 / Chapter 1.11 --- DI AO XIN XUE KANG (DI AO) --- p.17 / Chapter 1.12 --- Aims of My Project --- p.20 / Chapter 1.12.1 --- In Vitro Study of the Effect of HK-18 on Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line (HepG2) --- p.21 / Chapter 1.12.2 --- In Vivo Study of the Effect of HK-18 by Human Liver Tumor HepG2 Cells-Bearing Nude Mice Model --- p.21 / Chapter 1.12.3 --- In Vitro Study of the Effect of HK-18 on Multidrug- Resistant Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line (R-HepG2) --- p.22 / Chapter 1.12.4 --- Myocardial Ischemia-Reperfusion (IR) Injury in Isolated- Perfused Rat Heart Model --- p.23 / Chapter 1.12.5 --- Effect of DI AO Pretreatment on Global IR Injury --- p.26 / Chapter 1.12.6 --- Effect of DI AO Pretreatment on Isoproterenol-Induced Myocardial Injury in Rats --- p.26 / Chapter Chapter 2 --- Materials and Methods / Chapter 2.1 --- Materials --- p.28 / Chapter 2.1.1 --- Cell Lines and Culture Medium / Chapter 2.1.1.1 --- Cell Lines --- p.28 / Chapter 2.1.1.2 --- Culture Medium --- p.29 / Chapter 2.1.2 --- Chemicals --- p.30 / Chapter 2.1.3 --- Buffers and Reagents --- p.31 / Chapter 2.2 --- Methods / Chapter 2.2.1 --- In Vitro Studies --- p.33 / Chapter 2.2.1.1 --- In Vitro Cytotoxicity --- p.33 / Chapter 2.2.1.2 --- Cell Cycle Analysis by Flow Cytometry --- p.34 / Chapter 2.2.1.3 --- Maintenance of P-glycoprotein in R-HepG2 cells by Doxorubicin and HK-18 --- p.35 / Chapter 2.2.1.4 --- Assessment of DNA Fragmentation --- p.36 / Chapter 2.2.2 --- In Vivo Assessment of the Anti-Tumor Activity of HK-18 --- p.37 / Chapter 2.2.2.1 --- Animals and Tumor Inoculation --- p.37 / Chapter 2.2.2.2 --- Drug Administration --- p.37 / Chapter 2.2.2.3 --- Assessment of the Tumor Size and Tumor Weight --- p.38 / Chapter 2.2.2.4 --- Plasma Preparation --- p.38 / Chapter 2.2.2.5 --- Measurement of the Plasma Enzyme Activity --- p.39 / Chapter 2.2.3 --- Isoproterenol (ISO)-Induced Myocardial Injury (Rat Model) --- p.40 / Chapter 2.2.3.1 --- Animals --- p.40 / Chapter 2.2.3.2 --- Drug Preparations --- p.40 / Chapter 2.2.3.3 --- Animal Treatment --- p.41 / Chapter 2.2.3.4 --- Preparation of Myocardial Tissue Homogenate --- p.41 / Chapter 2.2.3.5 --- Preparation of Cytosolic Fraction of Heart Homogenates --- p.42 / Chapter 2.2.3.6 --- Myocardial Antioxidant Enzyme Activity --- p.42 / Chapter 2.2.3.6.1 --- Glutathione Reductase (GRD) --- p.42 / Chapter 2.2.3.6.2 --- Glutathione S-Transferases (GST) --- p.43 / Chapter 2.2.3.7 --- Myocardial Antioxidant Capacity --- p.43 / Chapter 2.2.3.7.1 --- Myocardial Malondialdehyde (MDA) Content --- p.43 / Chapter 2.2.3.7.2 --- Myocardial Thiol Content --- p.44 / Chapter 2.2.3.7.3 --- Tert-Butylhydroperoxide (tBHP)-Induced Thiol Depletion --- p.45 / Chapter 2.2.3.7.4 --- TBHP-Induced Thiobarbituric Acid-Reactive Substances (TBARS) Formation --- p.45 / Chapter 2.2.4 --- Myocardial Ischemia-Reperfusion (IR) Injury --- p.46 / Chapter 2.2.4.1 --- Langendorff Isolated Perfused Rat Heart --- p.46 / Chapter 2.2.4.1.1 --- Preparation of Perfusion Buffer --- p.46 / Chapter 2.2.4.1.2 --- Preparation of Isolated Rat Heart --- p.47 / Chapter 2.2.4.1.3 --- Myocardial Global Ischemia-Reperfusion Injury --- p.49 / Chapter 2.2.4.1.4 --- Contractile Force Recovery --- p.49 / Chapter 2.2.5 --- Statistical Analysis --- p.50 / Chapter Chapter 3 --- Study of HK-18 on Anti-Tumor Effect / Chapter 3.1 --- In Vitro Study of HK-18 on Human Hepatoma Carcinoma Cell Line (HepG2) --- p.51 / Chapter 3.1.1 --- The Effect of HK-18 on Cell Proliferation of HepG2 Cells by MTT Assay --- p.52 / Chapter 3.1.2 --- DNA Fragmentation Assay --- p.54 / Chapter 3.1.3 --- The Effect of HK-18 on Cell Cycle Phase Distribution --- p.57 / Chapter 3.2 --- In Vivo Study of HK-18 on HepG2-Inoculated Nude Mice --- p.61 / Chapter 3.2.1 --- Assessment of the Anti-Tumor Activity of HK-18 --- p.61 / Chapter 3.2.2 --- The Effect of HK-18 Towards Heart Tissue --- p.65 / Chapter 3.2.3 --- In Vitro Study of HK-18 on Multidrug Resistant Cell Line (R-HepG2) --- p.68 / Chapter 3.2.4 --- The Comparison of the Cytotoxicity of DOX on the Parental Cells and Resistant Cells of HepG2 --- p.69 / Chapter 3.2.5 --- The Effect of HK-18 on Cell Proliferation of R-HepG2 Cells by MTT Assay --- p.72 / Chapter 3.2.6 --- DNA Fragmentation Assay --- p.74 / Chapter 3.2.7 --- The Effect of HK-18 on Cell Cycle Phase Distribution --- p.77 / Chapter 3.2.8 --- The Relationship Between HK-18 and P-glycoprotein --- p.80 / Chapter Chapter 4 --- Study of the Cardioprotective Effect of DI AO / Chapter 4.1 --- Myocardial Ischemia-Reperfusion (IR) Injury in Isolated- Perfused Rat Heart --- p.82 / Chapter 4.1.1 --- Time Course of Global Ischemia-Reperfusion-Induced LDH Leakage --- p.82 / Chapter 4.1.2 --- Effect of DI AO Pretreatment on Global IR Injury --- p.85 / Chapter 4.1.2.1 --- LDH Leakage --- p.85 / Chapter 4.1.2.2 --- Contractile Force --- p.87 / Chapter 4.2 --- Isoproterenol-Induced Myocardial Injury in Rats --- p.89 / Chapter 4.2.1 --- Effect of DI AO Pretreatment --- p.89 / Chapter 4.2.2 --- Alternations in the Activity of Myocardial Antioxidant Enzymes --- p.91 / Chapter 4.2.3 --- Alternations in Myocardial Antioxidant Capacity --- p.94 / Chapter Chapter 5 --- Discussion / Chapter 5.1 --- The Significance of the Study of Saponin in the Treatment of Liver Cancer and Heart Injury --- p.96 / Chapter 5.2 --- Effect of HK-18 on Human Hepatocellular Carcinoma Cell --- p.101 / Chapter 5.3 --- Mechanism Study of Anti-Tumor Effect of HK-18 --- p.102 / Chapter 5.4 --- Cytotoxicity of HK-18 Toward Normal Tissue --- p.105 / Chapter 5.5 --- Effect of HK-18 on Multidrug Resistant Human Hepatocellular Carcinoma / Chapter 5.6 --- Protective Effect of DI AO Against Isoproterenol (ISO)- Induced Myocardial Injury --- p.110 / Chapter 5.7 --- Cardioprotective Effect of DI AO Against Ischemia- Reperfusion (IR) Injury --- p.111 / Chapter 5.8 --- Effect of DI AO Pretreatment on Myocardial Antioxidant Enzymes Activities and Antioxidant Capacity --- p.113 / Chapter 5.9 --- Conclusion and Future Prospect --- p.117 / Chapter Chapter 6 --- References --- p.121

A proteína Cpn60 faz parte de um grupo de proteínas altamente conservadas que estão envolvidas em funções celulares essenciais. camundongos BALB\\c foram imunizados com 5 ou 10 µg da proteína recombinante (Cpn60r) sozinha ou adicionada à vacina DTP sem hidróxido de alumínio (NADTP). A vacina DTP do Instituto Butantan (DTP) foi usada como controle. Foi avaliada a produção de citocinas por células esplênicas após reestímulo in vitro com a Cpn60r. Os animais foram desafiados após o protocolo de imunização. A Cpn60r sozinha ou misturada à vacina NADTP foi capaz de induzir níveis de anticorpos contra pertussis mais altos do que os induzidos pela DTP. Os níveis de IgG1 e IgG2a foram similares para todos os grupos. Pôde-se observar a produção de de IL-6 e IFN-&#947 nos grupos imunizados com Cpn60r. Os grupos imunizados com Cpn60r+NADTP apresentaram um índice de proteção entre 60 e 80% contra o desafio pela bactéria virulenta, semelhante ao grupo imunizado com DTP. A proteína Cpn60r é bastante promissora não somente como imunógeno, mas também como adjuvante. / The Cpn60 protein is a member of a group of higly conserved proteins linked to essencial cell functions. The Cpn60 was cloned, expressed and its immune response has been evaluated. BALB\\c mice were immunized with 5 or 10 µg of the recombinant protein (Cpn60r) alone or mixed with DPT vaccine without aluminum hidroxyde (NADPT). The DPT vaccine from Instituto Butantan was used as control. We evaluated the cytokines production by spleen cells after they have been reestimulated in vitro with Cpn60r. The animals were challenged after the immunization protocol. The Cpn60r alone or mixed with NADPT vaccine was able to induce higher antibodies levels than DPT. IgG1 and IgG2a levels were similar in all groups. We could detect levels of IL-6 and IFN-&#947 on groups immunized with Cpn60r. The groups immunized with Cpn60r+NADTP showed a 60 and 80% protection rate against the challenge with the live bacteria, similar to the group immunized with DPT. These results show the immune response of the recombinant protein that could be included in immunization protocols for pertussis.

Objetivo: Verificar o remodelamento da pele e produção de anticorpos em modelo experimental de esclerodermia em coelhos, após indução de tolerância nasal com colágeno tipo V. Métodos: Coelhas Nova Zelândia (N=12) foram imunizadas com 1mg/ml de colágeno V (Col V) em adjuvante completo de Freund e dois reforços com adjuvante incompleto de Freund. Seis coelhas imunizadas receberam uma dose diária de 25ug de Col V, iniciado via nasal (grupo tolerado) 150 dias do começo das imunizações e seis animais foram somente imunizadas (grupo imunizado). Um grupo imunizado com adjuvante de Freund serviu como controle. Biopsias de pele foram coletadas em 0, 75, 120, 150 e 210 dias e coradas pelo H&E, tricrômico de Masson e Sírius red para analise morfológica e morfométrica. Os colágenos I, III e V, além de TGFbeta e PDGF foram imunomarcados por imunofluorescência. Os soros dos animais foram coletados em 0, 150 e 210 dias para determinar anticorpos anti-colágenos I, III, IV e V e anti-nucleares. Resultados: Os animais imunizados mostraram progressivo decréscimo da derme papilar, atrofia de anexos, aumento no depósito dos colágenos I, III e V e aumento da expressão de TGFbeta e PDGF. Os tolerados apresentaram aumento dos anexos cutâneos e significante diminuição no depósito dos colágenos I, III e V, TGFbeta e PDGF. O grupo de imunizados e de tolerados apresentaram anticorpos anti-colágenos III e IV e antinucleares. Conclusões: A indução de tolerância nasal com Col V diminuiu o remodelamento da pele observado no modelo experimental de esclerodermia e inibiu a síntese de citocinas fibrogênicas. Portanto, a tolerância nasal com Col V pode ser uma opção terapêutica promissora para o controle do remodelamento cutâneo em pacientes com esclerodermia. / Objective: Our aim was to verify the skin remodeling and antibody production in experimental model of scleroderma in rabbits, after induction of tolerance by daily nasal administration of human type V collagen (Col V). Methods: Female New Zealand rabbits (N=12) were immunized with 1mg/ml of Col V in complete Freund\'s adjuvant, followed by more two boosters in incomplete Freund\'s adjuvant. Six immunized rabbits received daily nasal administrating of 25ug of Col V (tolerated group), started 150 days after the first immunization, and the others animals (N=6) were only immunized (immunized group). Finally a group of rabbits immunized with Freund\'s adjuvant served as control. Skin biopsies were collected at 0, 75, 120, 150 and 210 days, and stained with H&E, Masson\'s trichrome and Sirius red for morphological and morphometric analysis. Types I, III and V collagen, TGFbeta and PDGF were immunostained by immunofluorescence. The sera of animals were colleted at 0, 150 and 210 days to determine anti types I, III, IV and V collagen and antinuclear antibodies. Results: The immunized animals showed progressive decrease of papillary dermis, appendages atrophy, increase of types I, III and V collagen deposition and increased expression of TGF-beta and PDGF. The tolerated rabbits presented increase of cutaneous appendages and significant decrease of types I, III and V and TGF-beta and PDGF. Both immunized and tolerated rabbits presented anti types III and IV antibodies and antinuclear antibodies. Conclusions: Col V nasal tolerance reduced skin remodeling in experimental model of scleroderma and inhibited synthesis of fibrotic cytokines. Therefore, the nasal tolerance with type V collagen can be a promising therapeutic option to control the skin remodeling in patients with scleroderma.

A indução de tolerância imunológica ao aloenxerto, no contexto clínico, permanece um grande desafio para pesquisa científica de tradução. A retirada da imunossupressão em indivíduos transplantados leva à rejeição do enxerto, na grande maioria dos casos. Entretanto, um grupo muito raro de indivíduos transplantados, chamados de tolerantes operacionais (TO), consegue manter a função estável do enxerto após a retirada dos imunossupressores. O estudo desses indivíduos pode contribuir para melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na tolerância ao enxerto em humanos, assim como, para a determinação de biomarcadores desse estado de homeostase. Nosso objetivo foi determinar se o estado de tolerância operacional no transplante renal induz um perfil diferencial do componente humoral da resposta imune. Para tal, analisamos o perfil de reatividade de autoanticorpos dirigidos a peptídeos da proteína de choque térmico 60 (HSP60), de alo e autoanticorpos dirigidos às moléculas HLA, o repertório do receptor de células B (BCR) e o perfil funcional de células B supressoras CD19+CD24hiCD38hi (Bregs), comparativamente, nos indivíduos com: TO (n=5), Rejeição Crônica (RC, n=13), função estável do enxerto usando doses habituais de imunossupressores (Est, n=19) e nos indivíduos saudáveis (Sau, n=11). Não observamos um perfil diferencial claro de alo/autorreatividade de anticorpos dirigidos aos peptídeos da HSP60, nem às moléculas HLA, que diferenciasse os grupos do estudo. O estado de tolerância operacional apresentou uma diversidade do repertório do receptor de células B similar à observada em Sau e Est, enquanto o grupo RC teve uma menor diversidade desse repertório. Além disso, o grupo TO apresentou uma expansão de clones linfócitos B com expressão de 2 tamanhos distintos de CDR3 (de 16aa, família VH3 isotipo IgM, e de 5aa, família VH1 isotipo IgG), diferenciando-os dos grupos Sau, RC e Est (p<0,01 e p<0,05; e p<0,01, respectivamente para VH3M e VH1G). Os números de células B com fenótipo imunorregulador CD19+CD24hiCD38hi (Bregs) circulantes, no grupo TO e Sau, foram similares, enquanto o grupo RC apresentou menores números (p<0,05). Funcionalmente, após estímulo via CD40, o grupo TO teve capacidade de gerar células Breg ativadas para STAT3 semelhante ao grupo Sau, enquanto na rejeição crônica esta capacidade foi menor (p<0,05). Concluímos que o estado de tolerância operacional envolve, principalmente, a manutenção do perfil do componente imune humoral, similar ao apresentado por indivíduos saudáveis, em contraste com o estado de rejeição crônica. Além disso, o estado de tolerância foi o único que apresentou expansões expressivas de determinados tamanhos de CDR3, se destacando de todos os grupos. A expansão diferencial desses clones de células B pode ter uma relevância funcional no estado de tolerância operacional, além de potencial valor para o diagnóstico desse estado. Esses dados, em conjunto, nos indicam que a preservação do componente humoral da resposta imune desempenha um papel importante neste estado de homeostase no transplante humano / Operational tolerance in human kidney transplantation: repertoire of B lymphocytes and alo and autoantibodies Sta individuals (p<0.01 and p<0.05; and p<0.01, respectively for VH3M and VH1G). The circulating B cell numbers with the suppressive phenotype CD19+CD24hiCD38hi (Bregs) were similar between the OT and HI groups, while CR presented lower numbers (p<0.05). In addition, the OT group exhibited a similar capacity of generate activated cells for STAT3 to HI, whereas the CR group exhibited an impaired capacity (p<0.05). We conclude that the operational tolerance state involves the maintenance of the B cell compartment profile similar to the one observed in healthy individuals, in contrast with chronic rejection. In addition, the state of operational tolerance was the only one exhibiting expressive expansions of specific CDR3 lengths, which differentiated OT from all other groups. This indicates that the expansion of B cell populations expressing specific CDR3 lengths could play a relevant role in operational tolerance and may be potential biomarkers for OT. Taken together, we suggest that the preservation of the B cell component of the immune response can play an important role in this homeostatic state in human transplantation

A indução de tolerância imunológica ao aloenxerto, no contexto clínico, permanece um grande desafio para pesquisa científica de tradução. A retirada da imunossupressão em indivíduos transplantados leva à rejeição do enxerto, na grande maioria dos casos. Entretanto, um grupo muito raro de indivíduos transplantados, chamados de tolerantes operacionais (TO), consegue manter a função estável do enxerto após a retirada dos imunossupressores. O estudo desses indivíduos pode contribuir para melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na tolerância ao enxerto em humanos, assim como, para a determinação de biomarcadores desse estado de homeostase. Nosso objetivo foi determinar se o estado de tolerância operacional no transplante renal induz um perfil diferencial do componente humoral da resposta imune. Para tal, analisamos o perfil de reatividade de autoanticorpos dirigidos a peptídeos da proteína de choque térmico 60 (HSP60), de alo e autoanticorpos dirigidos às moléculas HLA, o repertório do receptor de células B (BCR) e o perfil funcional de células B supressoras CD19+CD24hiCD38hi (Bregs), comparativamente, nos indivíduos com: TO (n=5), Rejeição Crônica (RC, n=13), função estável do enxerto usando doses habituais de imunossupressores (Est, n=19) e nos indivíduos saudáveis (Sau, n=11). Não observamos um perfil diferencial claro de alo/autorreatividade de anticorpos dirigidos aos peptídeos da HSP60, nem às moléculas HLA, que diferenciasse os grupos do estudo. O estado de tolerância operacional apresentou uma diversidade do repertório do receptor de células B similar à observada em Sau e Est, enquanto o grupo RC teve uma menor diversidade desse repertório. Além disso, o grupo TO apresentou uma expansão de clones linfócitos B com expressão de 2 tamanhos distintos de CDR3 (de 16aa, família VH3 isotipo IgM, e de 5aa, família VH1 isotipo IgG), diferenciando-os dos grupos Sau, RC e Est (p<0,01 e p<0,05; e p<0,01, respectivamente para VH3M e VH1G). Os números de células B com fenótipo imunorregulador CD19+CD24hiCD38hi (Bregs) circulantes, no grupo TO e Sau, foram similares, enquanto o grupo RC apresentou menores números (p<0,05). Funcionalmente, após estímulo via CD40, o grupo TO teve capacidade de gerar células Breg ativadas para STAT3 semelhante ao grupo Sau, enquanto na rejeição crônica esta capacidade foi menor (p<0,05). Concluímos que o estado de tolerância operacional envolve, principalmente, a manutenção do perfil do componente imune humoral, similar ao apresentado por indivíduos saudáveis, em contraste com o estado de rejeição crônica. Além disso, o estado de tolerância foi o único que apresentou expansões expressivas de determinados tamanhos de CDR3, se destacando de todos os grupos. A expansão diferencial desses clones de células B pode ter uma relevância funcional no estado de tolerância operacional, além de potencial valor para o diagnóstico desse estado. Esses dados, em conjunto, nos indicam que a preservação do componente humoral da resposta imune desempenha um papel importante neste estado de homeostase no transplante humano / Operational tolerance in human kidney transplantation: repertoire of B lymphocytes and alo and autoantibodies Sta individuals (p<0.01 and p<0.05; and p<0.01, respectively for VH3M and VH1G). The circulating B cell numbers with the suppressive phenotype CD19+CD24hiCD38hi (Bregs) were similar between the OT and HI groups, while CR presented lower numbers (p<0.05). In addition, the OT group exhibited a similar capacity of generate activated cells for STAT3 to HI, whereas the CR group exhibited an impaired capacity (p<0.05). We conclude that the operational tolerance state involves the maintenance of the B cell compartment profile similar to the one observed in healthy individuals, in contrast with chronic rejection. In addition, the state of operational tolerance was the only one exhibiting expressive expansions of specific CDR3 lengths, which differentiated OT from all other groups. This indicates that the expansion of B cell populations expressing specific CDR3 lengths could play a relevant role in operational tolerance and may be potential biomarkers for OT. Taken together, we suggest that the preservation of the B cell component of the immune response can play an important role in this homeostatic state in human transplantation