Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-09-17T17:22:34Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Maria das Graças de Oliveira Brito.pdf: 956170 bytes, checksum: e5dfa4d2a845741fe78f494dc079422b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T17:22:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Maria das Graças de Oliveira Brito.pdf: 956170 bytes, checksum: e5dfa4d2a845741fe78f494dc079422b (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq;) Bolsa de Estudo da Capes; Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Doenças Tropicais (CNPq/MCT). / Introdução: A leishmaniose cutânea (LC) é uma endemia em expansão. Tem-se mostrado que a resposta imune inflamatória é fundamental na gênese das ulcerações: (1) Intenso infiltrado inflamatório na lesão, com poucos parasitas, (2) produção elevada de IFN- e TNF- in situ, (3) correlação direta entre quantidade de linfócitos ativados e tamanho da úlcera, (4) tratamento com antimonial na fase pré-ulcerativa não impede o aparecimento da úlcera. Estes dados sustentam a necessidade de se associar ao tratamento específico, medicamentos que modulem a resposta imune. A pentoxifilina surge como potencial terapêutico por inibir a produção de TNF- , citocina pró-inflamatória. Objetivo: Avaliar em um ensaio clínico controlado de fase III a influência da pentoxifilina associada ao antimonial na resposta imune em pacientes com leishmaniose cutânea. Metodologia: Ensaio clínico randomizado, duplo-cego, placebo controlado de 17 pacientes com LC atendidos no posto de saúde de Corte de Pedra (BA). Todos confirmados por PCR ou cultura. Incluídos pacientes apresentado de 1 a 3 lesões ulceradas com 1 a 3 meses de evolução, entre 18 e 65 anos. Todos foram tratados com antimonial pentavalente (Sbv) (20mg/Kg/dia por via intravenosa) associado com placebo ou pentoxifilina (400mg - 3 vezes ao dia) por 20 dias. A cura foi definida por critério clínico: cicatrização total das lesões 60 dias após término do tratamento. As concentrações de TNF- , CCL-3, CXCL-9 e CXCL-10 foram determinadas em sobrenadantes de culturas de células mononucleares estimulada com antígeno de Leishmania pela técnica de Elisa. Resultados: Falha terapêutica foi observada em 14% dos pacientes tratados com a associação e em 45% do grupo controle (p = 0,05) . Os valores de TNF- ,CCL-3, CXCL-9 e CXCL-10 foram mensurados antes e quinze dias (D15) após início de tratamento. Em ambos os grupos houve diminuição de CCL- 3 e TNF- e aumento dos níveis de CXCL-9 e CXCL-10 no D15. No entanto, a queda dos níveis de TNF- foi maior no grupo da pentoxifilina (p = 0,004). Conclusão: Associação com a pentoxifilina aumentou a taxa de cura da LC, associado a inibição na produção de TNF- a. / Salvador

Made available in DSpace on 2012-05-07T15:02:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000008.pdf: 645663 bytes, checksum: 1fdb98e2621023f13d0c6a16004b1cbd (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / A segurança e a eficácia da imunoterapia antienvenenamento ofídico estão intimamente relacionadas à pureza e a uma cuidadosa determinação da potência do soro (atividade biológica). A metodologia atualmente utilizada apresenta importantes limitações, as quais este trabalho objetiva contribuir. A mesma é adotada como oficial pela Farmacopéia Brasileira, tendo sido preconizada em 1996 pela Portaria nº 174/MS. Observações preliminares deste estudo identificaram, principalmente, um alto índice de invalidação de ensaios e uma baixa repetibilidade e reprodutibilidade, representado por diferenças significativas no ensaio de potência nos resultados obtidos pelo INCQS e pelos laboratórios produtores, enfatizando a necessidade de aperfeiçoar a metodologia analítica para a determinação da potência do soro antibotrópico. De acordo com as recomendações do “Workshop on the Standardization and Control of Antivenoms”, coordenado pela “Quality Assurance and Safety of Biologicals Unit” da OMS em 2001, o estabelecimento de venenos e antivenenos de referência é essencial para a padronização destes ensaios e para permitir a comparação lote a lote, assim como a comparação entre laboratórios. Neste trabalho, apresentamos os resultados de um estudo interlaboratorial para o estabelecimento de veneno e antiveneno botrópico de referência, visando o aperfeiçoamento do controle da qualidade dos soros antibotrópicos, com ênfase na metodologia analítica para a determinação da potência, com a participação de todos os laboratórios brasileiros produtores de soro antibotrópico. Este estudo foi realizado em duas etapas. A primeira compreendeu a reavaliação da potência do lote nº 05 do Veneno Botrópico de Referência BRA/BOT/05, a avaliação da potência do candidato a Soro Antibotrópico de Referência Nacional BRA/ANTIBOT/01, e a avaliação da aplicabilidade de um controle da dose desafio de veneno referente a cinco vezes o valor de dose letal média (5 DL50). A segunda etapa compreenderá a comparação da metodologia de determinação da potência do Soro Antibotrópico pela determinação da Dose Efetiva Média – DE50 (Potência Absoluta) com a metodologia da Potência Relativa frente ao Soro Antibotrópico de Referência, através da determinação da potência de amostras codificadas. Esta monografia, entretanto irá tratar apenas do estabelecimento do veneno e antiveneno de referência. Os resultados obtidos permitiram a avaliação das precisões intraensaios, interensaios e interlaboratorial, a freqüência de ensaios inválidos assim como as diferentes interpretações dos laboratórios, INCQS e produtores nacionais à monografia do Soro Antibotrópico da Farmacopéia Brasileira. / Safety and efficacy of antivenom immunotherapy are closely related with purity and an accurate potency determination (biological activity) of the antivenom. The murine lethality assay, still in use, present several limitations and is not a fully validated methodology. Preliminary data shows a high incidence of invalid assays and a low repeatability and reproducibility of potency assays, evidenced by significant differences between INCQS and manufacturers, indicating the need for improvement of the analytical methodology. According to the recommendations of the “Workshop on the Standardization and Control of Antivenoms”, sponsored by the Quality Assurance and Safety of Biologicals Unit of WHO at 2001, the establishment of local venom reference preparations and standard antivenom preparations are essential to standardize these assays and to allow batch to batch comparisons as well as comparisons between different laboratories. In this work, we present the results of an interlaboratorial study - with the participation of all Brazilian manufacturers - for the establishment of the lot 05 of the Brazilian Bothropic Reference Venom and lot 01 of the Brazilian Reference Antivenom, looking forward the improvement of quality control of Bothrops antivenom. This study was done in two steps. The first one consisted in the potency evaluation of the lot 05 of the Brazilian Bothropic Reference Venom, the potency evaluation of the lot 01 of the Brazilian Bothropic Reference Antivenom and the evaluation of the use of a control of the challenge dose of five times the median lethal dose (5 LD50). The second step consisted on the comparison between the absolute and the relative (parallel line assay) potency evaluation of commercial Bothrops antivenom, using the Brazilian Bothropic Reference Antivenom, in a blind assay. This monograph will focus only in the establishment of Brazilian Reference Bothropic Venom and Antivenom. These results allowed us to evaluate the intra-assay; inter-assay and inter-laboratorial precision, the incidence of invalid assays, and showed that each laboratory interpret differently the Bothrops Antivenom monograph of Brazilian Pharmacopoeia.

Made available in DSpace on 2016-08-12T18:48:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-12-03. Added 1 bitstream(s) on 2016-08-12T18:51:10Z : No. of bitstreams: 1 000864610.pdf: 3089089 bytes, checksum: e31156d3741c67e09c6b97faabdaf165 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Photobacterium damselae subsp. piscicida (Phdp) é importante agente causal de septicemia e pseudotuberculose, respectivamente nas fases aguda e crônica em peixes marinhos. O método de imunização e tratamento das infecções bacterianas em peixes é limitado à imunização ativa, com demanda bioenergética celular para gerar a resposta imune humoral. O uso de antibióticos na água, como forma terapêutica, resulta em resíduos na carne do peixe e no consumidor final humano, favorecendo o desenvolvimento da resistência microbiana. Este estudo teve como objetivos a produção e purificação de anticorpos IgY policlonais, extraídos da gema do ovo de galinha e específicos para as proteínas citoplasmáticas e de membrana bacteriana de Phdp e seus efeitos no controle da sepse aguda em Rachycentron canadum infectados experimentalmente. Os resultados demonstram redução do acúmulo de células na inflamação aguda induzida, pela inoculação da bactéria homóloga na cavidade celomática e na atividade respiratória de leucócitos sanguíneos nos grupos que receberam anticorpos IgY 48 horas e 15 dias antes do desafio. Verificou-se ainda redução da disseminação bacteriana em fígado, rim, baço e coração que foi correlacionada com a diminuição das lesões renais e hepáticas e demonstrada no perfil bioquímico e histopatológico. Os resultados são promissores no que tange ao uso da imunoglobulina Y como método profilático e na imunoterapia de infecções bacterianas em organismos aquáticos / The Photobacterium damselae ssp. piscicida is an important causative agent of septicemia and pseudotuberculosis in the acute and chronic phases in marine fish, respectively. The method for immunization and treatment of bacterial infections in fish is limited to the active immunization, which demands cellular bioenergy to generate humoral immune response. The use of antibiotics in the water as a form of therapy results in residues in the meat that will be consumed by humans, favoring the development of microbial resistance. Thus, the aim of the study was to produce and purify polyclonal IgY, specific for membrane proteins of P. damselae ssp. piscicida (PMBphdp), extracted from the yolk of laying hens, and to observe its effects on the control of acute sepsis in experimentally infected Rachycentron canadus. The results showed reduction of cell accumulation in acute inflammation induced by inoculation of the homologous bacteria in the coelomic cavity and decrease in the respiratory activity of blood leukocytes in groups receiving IgY antibodies at 48 hours and 15 days before the challenge. It was also observed the reduction of bacterial dissemination to the liver, kidney and heart which was correlated with the decrease in liver and kidney damage, which was demonstrated by the biochemical and histopathological profile. The results are promising regarding the use of immunoglobulin Y as prophylactic method and for immunotherapy of microbial infections in aquatic organisms

Orientador: Mirela Tinucci Costa / Coorientador: Célio Lopes Silva / Banca: Joice Lara Maia Faria / Banca: Noeme Sousa Rocha / Banca: Hélio José Montassier / Banca: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Resumo: A mastectomia é o procedimento terapêutico mais frequentemente empregado para tratar tumores mamários de cadelas e o sucesso depende do estádio do tumor no momento da intervenção. Estudos em modelos animais mostram que as proteínas de choque térmico (HSP) têm a capacidade de induzir imunidade inata tumor-específica e resulta na regressão do tumor. Sendo assim, este estudo teve como objetivos avaliar a eficácia do imunomodulador DNA-HSP65+proteína-HSP65 no tratamento de cadelas com tumores mamários malignos, seu potencial imunoestimulatório e investigar o aparecimento de efeitos adversos. Fizeram parte do experimento 21 cadelas com tumores mamários malignos. Destas 13 foram tratadas com o imunoterápico e oito submetidas a mastectomia da cadeia mamaria afetada. As cadelas (n= 13) receberam até três aplicações do imunomodulador, via intratumoral, no tumor de maior volume, com intervalo médio de 15 dias. O potencial imunoestimulatório do imunomodulador foi investigado através da citometria de fluxo pela comparação do numero de células natural killer ativadas, células B e T, CD4 e CD8, monócitos, monócitos ativados, macrófagos e células dendríticas; da proliferação espontânea de células mononucleares e da produção de anticorpos anti-HSP65 pelo teste ELISA antes do tratamento e 15 dias após o termino do mesmo. Seis cadelas (46,1%) apresentaram regressão em pelo menos um dos tumores da cadeia mamária, e uma (7,7%) no tumor que recebeu a aplicação do imunoterápico. Quando se consideram todas as mamas acometidas por tumores (n= 40), nove (22,5%) apresentaram regressão tumoral, 19 (47,5%) progressão e 12 (30%) se mantiveram estáveis. Três cadelas vieram a óbito durante o experimento; uma mastectomizada e duas tratadas com o imunoterápico. O imunoterapico não... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mastectomy is a therapeutic procedure most often used to treat breast tumors in bitches and success depends on the tumor stage at the time of intervention. Studies in animal models show that the heat shock proteins (HSP) have the ability to induce tumorspecific innate immunity and results in tumor regression. Thus, this study aimed to evaluate the efficacy of immunomodulatory DNA-HSP65 + HSP65 protein in the treatment of dogs with malignant mammary tumors, and investigate its potential immunostimulatory the appearance of adverse effects. The experiment consisted of 21 dogs with malignant mammary tumors Of these 13 were treated with immunotherapy undergo mastectomy and eight of the affected mammary chain. Female dogs (n = 13) received three applications of the immunomodulator, intratumoral, in the greater volume tumor, with a mean interval of 15 days between applications. The potential immunostimulatory was investigated by flow cytometry by comparing the number of activated natural killer cells, T and B cells, CD4 and CD8 lymphocytes, monocytes, activated monocytes, macrophages and dendritic cells, the proliferation of mononuclear cells and spontaneous production anti-HSP65 antibody by ELISA before treatment and 15 days after the end. Six dogs (46.1%) had regression at least in one tumor of the mammary chain, and one dog (7.7%) in the tumor that received intratumoral application. When you consider all breast tumors (n = 40), nine (22.5%) had tumor regression, 19 (47.5%) progression and 12 (30%) remained stable. Three dogs died during the experiment, one after mastectomy and two after immunotherapy. The immunotherapy did not cause significant systemic immune stimulation. There was an increase of anti- HSP65 after treatment and the proliferation of leukocytes, although... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Flávio Ruas de Moraes / Coorientador: Julieta Rodini Engrácia de Moraes / Coorientador: Hélio Jose Montassier / Coorientador: João Martins Pizauro Junior / Banca: Fernanda Nogueira Valentin / Banca: Tereza Cristina Ribeiro Dias Koberstein / Banca: Solange de Paula Ramos / Banca: Marcello Pardi de Castro / Resumo: Photobacterium damselae subsp. piscicida (Phdp) é importante agente causal de septicemia e pseudotuberculose, respectivamente nas fases aguda e crônica em peixes marinhos. O método de imunização e tratamento das infecções bacterianas em peixes é limitado à imunização ativa, com demanda bioenergética celular para gerar a resposta imune humoral. O uso de antibióticos na água, como forma terapêutica, resulta em resíduos na carne do peixe e no consumidor final humano, favorecendo o desenvolvimento da resistência microbiana. Este estudo teve como objetivos a produção e purificação de anticorpos IgY policlonais, extraídos da gema do ovo de galinha e específicos para as proteínas citoplasmáticas e de membrana bacteriana de Phdp e seus efeitos no controle da sepse aguda em Rachycentron canadum infectados experimentalmente. Os resultados demonstram redução do acúmulo de células na inflamação aguda induzida, pela inoculação da bactéria homóloga na cavidade celomática e na atividade respiratória de leucócitos sanguíneos nos grupos que receberam anticorpos IgY 48 horas e 15 dias antes do desafio. Verificou-se ainda redução da disseminação bacteriana em fígado, rim, baço e coração que foi correlacionada com a diminuição das lesões renais e hepáticas e demonstrada no perfil bioquímico e histopatológico. Os resultados são promissores no que tange ao uso da imunoglobulina Y como método profilático e na imunoterapia de infecções bacterianas em organismos aquáticos / Abstract: The Photobacterium damselae ssp. piscicida is an important causative agent of septicemia and pseudotuberculosis in the acute and chronic phases in marine fish, respectively. The method for immunization and treatment of bacterial infections in fish is limited to the active immunization, which demands cellular bioenergy to generate humoral immune response. The use of antibiotics in the water as a form of therapy results in residues in the meat that will be consumed by humans, favoring the development of microbial resistance. Thus, the aim of the study was to produce and purify polyclonal IgY, specific for membrane proteins of P. damselae ssp. piscicida (PMBphdp), extracted from the yolk of laying hens, and to observe its effects on the control of acute sepsis in experimentally infected Rachycentron canadus. The results showed reduction of cell accumulation in acute inflammation induced by inoculation of the homologous bacteria in the coelomic cavity and decrease in the respiratory activity of blood leukocytes in groups receiving IgY antibodies at 48 hours and 15 days before the challenge. It was also observed the reduction of bacterial dissemination to the liver, kidney and heart which was correlated with the decrease in liver and kidney damage, which was demonstrated by the biochemical and histopathological profile. The results are promising regarding the use of immunoglobulin Y as prophylactic method and for immunotherapy of microbial infections in aquatic organisms / Doutor

Orientador: Marcos A. Tambascia / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-21T13:01:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Volpini_WalkyriaMaraGoncalves_D.pdf: 5363845 bytes, checksum: 243c0673aa5598aa9f2ef16ee01cd643 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: O camundongo NOD é um modelo espontâneo de diabetes auto-imune, cuja expressão clínica de síndrome hiperglicêmica é mais freqüente em fêmeas (em torno de 60%) do que em machos (< 10%), entre a 20ª e 25ª semanas de vida. Uma infiltração linfomononuclear progressiva das ilhotas de Langerhans (insulite), iniciada na 5ª semana de vida, em ambos os sexos, precede o desenvolvimento clínico do diabetes. A doença é mediada por células T CD4+ e CD8+ com auto-reatividade anticélula ß. A Ciclofosfamida (Cl), administrada a animais NOD de oito semanas de vida, induz o diabetes clínico em machos e o acelera em fêmeas, por provável depleção de células T supressoras dos mecanismos diabetogênicos. Este modelo (DMID-CI) é um instrumento experimental para aplicação de protocolos terapêuticos, descritos, sobretudo, em fase inicial do processo auto-imune. O objetivo deste estudo foi o de testar a eficiência de uma imuno-intervenção no DMID-CI do camundongo NOD, em fase avançada de insulite, com anticorpos monoclonais (AcMos) depletantes antiCD4 e antiCD8, estratégia pouco documentada na literatura. Foi caracterizado, inicialmente, o perfil de evolução da insulite, induzida em dois modelos de administração de ciclofosfamida (uma e duas doses de 200 mg/kg/dose, no intervalo de 14 dias) para definir-se a janela terapêutica adequada. A análise histológica da insulite, em NOD machos e fêmeas, semelhante em ambos modelos, demonstrou um momento preciso de progressão rápida de insulite em estádios avançados (invasivo/destrutiva), com paralela diminuição de ilhotas normais ou com periinsulite. Este momento consistiu de um intervalo, situado entre o T e o 14° dias após a primeira dose de Cl, considerado como o de estabelecimento do processo imunopatológico no pâncreas. A expressão do DMID clínico foi, porém, significativamente aumentada duas semanas após a segunda dose da droga (80% em ambos os sexos). A insulite, induzida por Cl, apresentou evolução fenotípica (análise imuno-histoquímica) similar à desenvolvida espontaneamente em camundongos NOD, com predomínio de células T CD4+ em estádios iniciais e aumento da proporção de CD8+ em fase avançada. A prevenção do DM1D-CI clínico foi alcançada, de forma similar, através de imunoterapia isolada com AcMos depletantes antiCD4 (YTS-191) e antiCD8 (YTS-169), iniciada em momento critico de progressão de insulite invasivo/destrutiva (10° dia após a primeira dose de CI). O sucesso terapêutico foi obtido com protocolo de curta duração (10 dias) e de baixas doses totais de AcMos (0,5 a 1,25 mg/camundongo). O tratamento com antiCD4 impediu a evolução da insulite para os estádios finais, os quais não foram, porém, bloqueados por antiCD8. A estratégia terapêutica utilizada demonstrou o potencial interesse clínico dos AcMos antiCD4+ e amiCD8+ no bloqueio de subpopulações T executoras da destruição auto-imune das células ß. / Abstract: The NOD (non obese diabetic) mouse is a model of spontaneous autoimmune diabetes, in which expression of the hyperglycemic syndrome occurs between 20 and 25 weeks of age and is more common in females (about 60%) than in males (< 10%). A progressive infiltration of the islets of Langerhans by lymphomononuclear cells (insulitis) preceeds the development of the clinical diabetes condition in both sexes. This diabetes is mediated by CD4+ and CD8+ T cells with autoreactivity against 6 cells. Cyclophosphamide (CY) administered to eight week-old NOD mice induces clinical diabetes in males and accelerates its development in females, probably by depleting the T suppressor cells of diabetogenic mechanisms. CY-induced insulin-dependent diabetes mellitus model (CY -IDDM) provides a useful experimental approach for investigating the application of therapeutic protocols in the initial phase of the autoimmune process. The aim of the present study was to examine the role of an intervention in advanced insulitis phase of CY-IDDM in NOD mice with depleting anti-CD4 and anti-CD8 monoclonal antibodies (MoAbs). The evolution of the insulitis induced by cyclophosphamide was initially characterized by administering two doses of 200 mg/kg separated by a 14-day interval in order to determine the appropriate therapeutic window. The histological analysis of insulitis in male and female NOD mice yelded similar results for both sexes and showed that the period of rapid progression of advanced invasive/destructive insulitis was paralleled by a reduction in the number of normal or peri-insulitis islets. This period of insulitis development ocurred between the 7th and the 14m day after the first CY injection and was considered to represent the establishing of the immunopathologic process in the pancreas. The clinical expression of IDDM was significantly increased within two weeks after the second CY dose (80% in both sexes). Based on immunohistochemical analysis the CY-induced insulitis showed a phenotypic evolution similar to that spontaneously developed in NOD mice with the predominance of CD4+ T cells in the initial phase and an increased proportion of CD8+ T cells in the advanced phase. CY-induced IDDM could be prevented by treating the mice with depleting anti- CD4 and anti-CD8 MoAbs. This treatment was initiated at a critical moment in the progress of the invasive/destructive insulitis (10 days after the first CY dose). Therapeutic success was achieved with in a short time (10 days) and at low total doses of MoAbs (0.5 to 1.25 mg/mouse). Anti-CD4 but not anti-CD8 MoAbs prevented the insulitis from evolving to its final stages. These results clearly indicate the potential clinical usefulness of anti-CD4 and anti-CD8 MoAbs in abolishing or neutralizing the activity of specific subpopulations involved in the autoimmune destruction of ß cells. / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Ciências Médicas

Orientadores : Maria Helena Andrade Santana, Ricardo de Lima Zollner / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-29T06:07:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zanin_MariaHelenaAmbrosio_D.pdf: 3129739 bytes, checksum: 3bf129235472299864d6a448f93f8cab (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A importância farmacológica dos gangliosídios tem crescido nos últimos anos devido à identificação desses compostos como antígenos, produzindo anticorpos antigangliosídios que podem estar envolvidos em algumas doenças autoimunes ou neuropatias. Os estudos na literatura dos gangliosídios abrangem desde suas propriedades e funções nas membranas neuronais assim como a sua farmacologia no sistema nervoso central, quando injetados na forma pura em animais e humanos. Entretanto, o estudo de seus efeitos no sistema imunológico, quando associados aos lipossomas, ainda é escasso, o que motivou o desenvolvimento dessa pesquisa. Este trabalho compreendeu a preparação e caracterização de lipossomas multilamelares compostos de dipalmitoilfosfatidilcolina, colesterol, dihexadecilfosfato e gangliosídios, monossialogangliosídio (GM1) e Mist (mistura de GM1 21%, dissialogangliosídio (GD1a) 40%, dissialogangliosídio (GD1b) 16%, trissialogangliosídio (GT1b) 19%) e avaliação do efeito imunológico destes lipossomas quando injetados em camundongos. Os animais testados foram camundongos do tipo Balb/c, os quais receberam seis doses de lipossomas a cada duas semanas, perfazendo um total de doze semanas. Após este período os animais foram sacrificados e seus soros submetidos a testes ELlSA para avaliação da produção de anticorpos antigangliosídios, classes IgM e IgG. Em termos de significância estatística os lipossomas livres de gangliosídios e os associados à Mist não apresentaram imunogenicidade e alguns soros de animais tratados com lipossomas associados ao GM1 apresentaram algumas classes de imunoglobulinas. Porém, em termos de avaliação para diagnóstico de anticorpos, todas as formulações foram consideradas não imunogênicas quando considerada as unidades arbitrárias / Abstract: The pharmacological importance of gangliosides has increased in the last few years due to the identification of these compounds as antigens, producing antiganglioside antibodies, which may be involved in autoimmune diseases or neuropathy. Studies in ganglioside literature encompass their properties and functions in the neuronal membranes as well as their pharmacology in the central nervous system upon injection in pure ganglioside form in animais and humans. However, as associated to the liposomes, the studies of their effects on the immunological system are still scarce, which motivated the development of this research. This work includes the preparation and characterization of multilamellar liposomes consisting of dipalmitoyl phosphatidyl choline, cholesterol, dihexadecylphosphate and gangliosides, monosialoganglioside (GM1) and Mist (mixture of GM1 21%, disialoganglioside (GD1a) 40%, disialoganglioside (GD1b) 16%, trisialoganglioside (GT1b) 19%) and evaluation of immunologic effect of hese liposomes as administered in mice. The animais tested were Balb/c mice, which were treated with six liposome doses at 2 week-intervals during twelve weeks. After this period the animais were sacrificed and their sera were assayed by ELlSA tests in order to evaluate the production of antiganglioside antibodies of IgM and IgG classes. With respect to the statistical significance, the liposomes without gangliosides and the ones associated to the Mist were non immunogenic and some of animal sera, which were treated with liposomes associated to the GM1, showed some Immunoglobulin classes. H oweve r, in terms of evaluation of the antibody diagnostic, ali of liposome formulations were considered non immunogenic in regard to the arbitrary units / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Orientador: Ricardo Zollner / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-19T15:16:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cunha_LudmilaSiqueiraMedinada_D.pdf: 2573991 bytes, checksum: bbc4fec53735053895cf6758ff5de1dc (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: A primeira parte do estudo restringiu-se ao estabelecimento do modelo BRO "in vivo". Para isto, empregamos a linhagem de células BRO e sua sublinhagem transfectada BRO mdr1.1, utilizando a técnica de xeno-enxertos em camundongos atímicos. Estes animais foram observados por sucessivas passagens e avaliados quanto à resposta apresentada aos agentes citotóxicos vincristina e doxorubicina, sempre comparados com testes "in vitro" das mesmas células. Estas linhagens celulares também foram avaliadas "in vitro" e "ex-vivo" quanto à expressão da 170-Pgp e aos fatores de resistência empregando-se as técnicas de imunoperoxidase e citotoxicidade com MTT. A análise final destas informações permite afirmar que o modelo BRO pode ser utilizado no estudo da resistência a múltiplas drogas até a segunda passagem, o que corresponde ao período de tempo de 6 semanas como xeno-enxertos. A droga vincristina foi escolhida para os estudos "in vivo" devido ao elevado nível de resistência apresentado pelas células BRO mdr 1.1. A segunda parte do trabalho concentrou-se na avaliação do modelo no estudo de novos agentes reversores, bepridil e cremofor. Numa primeira fase verificou-se a efetividade da reversão destes agentes e sua citotoxicidade "in vitro". Foi possível estabelecer as doses ideais para a obtenção do efeito de reversão da MDR. As concentrações não citotóxicas de cremofor mostraram uma reversão da resistência marcadamente menor que as obtida com bepridil. Estes dados indicaram a realização de testes de reversão "in vivo" apenas com bepridil. A farmacocinética desta droga para camundongos foi estabelecida através de HPLC e cintilação líquida. Um esquema combinando vincristina e bepridil, utilizados na MTD, foi estabelecido e testado em camundongos atímicos portando tumores BRO mdr 1.1 sem um resultado efetivo de regressão tumoral, provavelmente devido aos baixos níveis plasmáticos do reversor alcançados, somados aos altos fatores de resistência presentes na segunda passagem. A terceira parte do estudo consistiu na avaliação da radioimunoterapia como outra metodologia para se atingir as células portadoras do fenótipo MDR neste modelo. Para tanto, as linhagens celulares foram testadas quanto à sua radiosensibilidade em ensaio clonogênico e em teste de citotoxicidade com SRB. Os resultados foram similares, não se detectando diferenças significativas entre as radiosensibilidades de linhagens resistentes e sensíveis. A partir destes dados realizou-se a biodistribuição do anticorpo monoclonal MRK16 após a marcação deste com o radioisótopo 131I, não havendo captação preferencial do monoclonal pelos tumores resistentes, como também não detectamos resposta tumoral a radioimunoterapia. O baixo número de epitopos de 170-Pgp encontrados na superfície das células BRO mdr1.1 pelas técnicas de citometria de fluxo e imunocompetição de Scatchard justifica a falha desta abordagem terapêutica. O modelo "in vivo" focalizado nesta pesquisa não poderá ser empregado na avaliação das modalidades terapêuticas que utilizem anticorpos monoclonais (isolados ou como imunoconjugados) de ultrapassar o fenômeno da resistência a múltiplas drogas, mas permanece útil na determinação do potencial de reversão e no estudo da toxicidade das drogas selecionadas pelos modelos "in vitro" como agentes reversores da MDR, criando condições mais seguras para o emprego clínico. O modelo desenvolvido abre, também, uma nova opção no estudo comparativo entre tumores intrinsecamente resistentes e os que apresentam resistência a múltiplas drogas adquiridas, por se tratar de um tumor desenvolvido a partir de células transfectadas com o gene MDR1. Numa perspectiva otimista destes estudos antevemos uma solução definitiva para estes tumores até hoje sem possibilidade de tratamento eficaz com quimioterapia / Abstract: Multidrug resistance has been one of the most active research areas during last decade because its growing clinical importance. Expression of the MDR1 (170-Pglycoprotein) gene is an active effux pump that decreases the intracellular accumulation of some of the major anticancer drugs such as anthracyclines, vinca alkaloids, and epipodophyllotoxins. Our study stablished an "in vivo" model using BRO cell line and its transfected subline BROmdr1.1. The MDR phenotype was detected until the second passage as xenografts or 6 weeks in cell culture by citotoxity MTT test with vincristine and doxorubicin but also by imunostainning using 3 monoclonal antibodies (C219, JSBI and MRK16). We have studied antitumor activity of vincristine and doxorubicin in nude mice bearing the second passage of BRO and BROmdr1.1. It was possible to define resistant factors for each drug. New reversal agents, cremophor and bepridil, were tested "in vitro". Bepridil presented higher reversal effect and was select to "in vivo" studies, but the doses nedded to achieved complete reversal "in vitro" could not be reached "in vivo". BROmdr1.1 xenografts were treated with monoclonal antibodies labelled with isotopes. The absence of response probably was because it was not possible to concentrate de isotope in the resistant tumors due the small number of epitopes that this cell line presented at Scatchard test. This model can be used to study new reversal agents for MDR phenotype "in vivo", Its toxicity, pharmacokinetics and reversal activity, before going further on human trials / Doutorado / Doutor em Medicina Interna

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2016-12-09T12:24:56Z No. of bitstreams: 1 TES_ANDRE_POISL_FAY_COMPLETO.pdf: 12654104 bytes, checksum: ad2a22881e2edf0bfef5f136f9a5e457 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-09T12:24:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TES_ANDRE_POISL_FAY_COMPLETO.pdf: 12654104 bytes, checksum: ad2a22881e2edf0bfef5f136f9a5e457 (MD5) Previous issue date: 2016-02-22 / Objective: This study aims to characterize PD-L1 expression in tumor tissue from low incidence genitourinary malignancies and to correlate levels of PD-L1 expression with clinico-pathological features as well as survival outcomes. Methods: Formalin-fixed paraffin-embedded specimens were obtained from patients with non-clear cell renal cell carcinoma (non-ccRCC) and adrenocortical carcinoma (ACC). PD-L1 expression was evaluated by immunohistochemistry (IHC) in both tumor cell membrane and tumor infiltrating mononuclear cells (TIMC). Comparisons between PD-L1 expression and clinico-pathological features were evaluated using unpaired t-test and Fisher?s exact test. Kaplan-Meier method and log-rank test were used to assess association between PD-L1 expression and survival outcome in both histologies. Results: Among 101 patients with non-ccRCC, 11 (10.9%) were considered PD-L1+ in tumor cells: 2/36 (5.6%) of chromophobe RCC, 5/50 (10%) of papillary RCC, 3/10 (30%) of Xp11.2 translocation RCC and 1/5 (20%) of collecting duct carcinoma. On the other hand, PD-L1 positivity by TIMC was observed in 57 (56.4%) patients: 13/36 (36.1%) of chromophobe RCC, 30/50 (60%) of papillary RCC, 9/10 (90%) of Xp11.2 translocation RCC and 5/5 (100%) of collecting duct carcinoma). PD-L1+ in both tumor cell membrane and TIMC cells were associated with shorter time to recurrence (p=0.02 and p=0.03, respectively). Among 28 patients with surgically treated ACC, 3 (10.7%) were considered PD-L1 positive on tumor cell membrane. On the other hand, PD-L1 expression in TIMC was performed in 27 specimens and PD-L1 positive staining was observed in 19 (70.4%) patients. PD-L1 positivity in either tumor cell membrane or TIMC was not significantly associated with higher stage at diagnosis, higher tumor grade, excessive hormone secretion, or survival. Conclusion: In summary, Non-ccRCC and ACC can express PD-L1 on both tumor cell membrane and immune cells and it may represent a potential target for therapeutic interventions. / Objetivo: este estudo visa caracterizar a express?o de PD-L1 em amostras tumorais de pacientes com neoplasias genito-urin?rias de baixa incid?ncia e correlacionar seus n?veis de express?o com caracter?sticas e desfechos cl?nicos. M?todos: blocos de parafina foram obtidos de pacientes com carcinoma de c?lulas renais (CCR) de c?lulas n?o claras e carcinoma do c?rtex da adrenal. A express?o de PD-L1 foi avaliada por imuno-histoqu?mica na membrana das c?lulas tumorais e nas c?lulas mononucleares infiltradas no tumor (CMIT). Compara??es entre a express?o de PD-L1 e caracter?sticas cl?nico-patol?gicas foram analisadas utilizando teste t n?o pareado e teste exato de Fisher. Metodologia de Kaplan-Meier e teste de log-rank foram utilizados para avaliar a associa??o entre a express?o de PD-L1 e desfechos de sobrevida nas duas histologias. Resultados: Entre 101 pacientes com CCR de c?lulas n?o claras, 11 (10.9%) foram considerados PD-L1 positivo (+) na membrana das c?lulas tumorais: em 2/36 (5.6%) dos tumores de c?lulas crom?fobas, 5/50 (10%) de tumores papilares, 3/10 (30%) dos tumores com transloca??o Xp11.2 e em 1/5 (20%) dos tumores do ducto coletor. Por outro lado, positividade de PD-L1 em CMIT foram observadas em 57 (56.4%) dos pacientes: em 13/36 (36.1%) dos tumores de c?lulas crom?fobas, 30/50 (60%) de tumores papilares, 9/10 (90%) dos tumores com transloca??o de Xp11.2 e em 5/5 (100%) dos tumores do ducto coletor. PD-L1+ em ambos, membrana da c?lulas tumorais e CMIT, foram associados com um tempo mais curto at? recorr?ncia de doen?a em pacientes com CCR de c?lulas n?o claras (p=0.02 e p=0.03, respectivamente). Entre os 28 pacientes com tumores do c?rtex da gl?ndula adrenal, 3 (10.7%) foram considerados positivos na membrana das c?lulas tumorais. Por outro lado, a express?o de PD-L1 em CMIT foram realizadas em 27 pacientes e PD-L1+ foi observado em 19 (70.4%) pacientes. Positividade para PD-L1 em ambos, membrana da c?lulas tumorais e CMIT, n?o foi associado com maior est?gio cl?nico ao diagn?stico, alto grau tumoral, produ??o excessiva de horm?nios ou sobrevida. Conclus?o: Em suma, CCR de c?lulas n?o claras e carcinoma do c?rtex da adrenal expressam PD-L1 na membrana da c?lula tumoral e em infiltrados inflamat?rios e isto pode representar um poss?vel alvo para interven??es terap?uticas.

A asma alérgica é uma doença pulmonar de inflamação crônica caracterizada por uma resposta imune do tipo Th2 e uma das principais abordagens terapêuticas para o seu tratamento no futuro, poderia ser a imunoterapia baseada na modulação da resposta imune Th2 para um perfil Th1 e anti-inflamatório. Nosso grupo já demonstrou a eficácia de uma imunoterapia, baseada em um plasmídeo de DNA contendo o gene hsp65 de M. Leprae (DNAHsp65) em modelo murino de asma alérgica. No entanto, apesar dos excelentes resultados, o grupo está procurando outras alternativas imunoterapêuticas, usando a Hsp65 micobacteriana, para futura utilização clinica na área de saúde humana e veterinária. Efeitos benéficos na prevenção e tratamento de doenças alérgicas vêm sendo obtidos com o uso de probióticos. Nossa hipótese é de que uma nova formulação terapêutica, como o probiótico Lactococcus lactis expressando Hsp65 micobacteriana (LLHsp65), apresentaria vantagens significativas no desenvolvimento de pesquisas translacionais. Diante disso, este estudo teve como objetivo avaliar se o probiótico LLHsp65 apresenta atividades imunoterapêuticas no modelo de asma experimental induzida por ovalbumina (OVA). Em diferentes grupos experimentais, 5x109 CFU de LLHsp65 ou de L. lactis selvagem (LLSELV), foram administrados por via oral durante 10 dias consecutivos aos camundongos BALB/c previamente sensibilizados e desafiados com OVA. Em seguida, investigamos os efeitos do tratamento na inflamação alérgica, modulação do padrão de citocinas, produção de anticorpos específicos, hiper-responsividade das vias aéreas e inflamação pulmonar. Nossos resultados demonstraram que o tratamento oral com LLhsp65 modula a resposta imune alérgica de padrão Th2 para o perfil Th1 com aumento dos níveis de IFN-?, IL-12, TNF-?, IL-10, IL-6 e IL- 17, e com a redução das citocinas IL-4, IL-5 e IL-13. Os níveis de IgE e IgG1 anti-OVA no soro também foram significativamente diminuídos. Como consequência desses resultados, também observamos diminuição significativa do infiltrado de eosinófilos no lavado broncoalveolar, na hiper-responsividade nas vias aéreas e a atenuação da inflamação e produção de muco no tecido pulmonar, quando comparados com o grupo controle (OVA/SAL). Por conseguinte, nossos resultados demonstraram que a administração oral de LLHsp65 proporciona uma melhora significativa do processo inflamatório alérgico induzido por OVA, sendo portanto, uma estratégia terapêutica promissora para o desenvolvimento de pesquisa translacional no tratamento de asma alérgica. / Allergic asthma is a chronic inflammatory lung disease characterized by a Th2-type immune response and one of the main therapeutic approaches to its treatment in the future could be immunotherapy based on the modulation of the Th2 immune response to a Th1 and anti-inflammatory profile. Our group has already demonstrated the efficacy of an immunotherapy based on a DNA plasmid carrying the mycobacterial hsp65 gene (DNAHsp65) in murine model of allergic asthma. However, despite the excellent results, our group is looking for other immunotherapeutic alternatives, using mycobacterial Hsp65, for future clinical use in the area of human and veterinary health. Beneficial effects in the prevention and treatment of allergic diseases have been obtained with the use of probiotics. Our hypothesis is that a new therapeutic formulation, such as the probiotic Lactococcus lactis expressing mycobacterial Hsp65 (LLHsp65), would present significant advantages in the development of translational research. The objective of this study was to evaluate whether the probiotic LLHsp65 has immunotherapeutic activities in the ovalbumin-induced asthma model. In different experimental groups, 5x109 CFU of LLHsp65 or control L. lactis (ctLL) were administered orally for 10 consecutive days to BALB/c mice previously sensitized and challenged with OVA. We then investigated the effects of treatment on allergic inflammation, modulation of the cytokine pattern, production allergen-specific antibodies, airway hyperresponsiveness and pulmonary inflammation. Our results demonstrated that oral treatment with LLhsp65 modulates the allergic Th2 immune response to Th1 profile with increased levels of IFN-?, IL-12, TNF-?, IL-10, IL-6 and IL-17 and with the reduction of IL-4, IL-5 and IL-13 cytokines. Serum anti-OVA IgE and IgG1 levels were also significantly decreased. Correspondingly with these results, we also observed a significant decrease in eosinophil infiltrate in bronchoalveolar lavage, airway hyper responsiveness and attenuation of inflammation and mucus production in lung tissue when compared to the control group (OVA/SAL). Therefore, our results demonstrated that oral administration of LLHsp65 provides a significant improvement of the OVA-induced allergic inflammatory process and is therefore a promising therapeutic strategy for the development of translational research in the treatment of allergic asthma.