Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-26. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:28Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00291a.pdf: 2012251 bytes, checksum: 21e4927ff9907a0e614761f475e1bc26 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:28Z : No. of bitstreams: 2 Publico-00291a.pdf: 2012251 bytes, checksum: 21e4927ff9907a0e614761f475e1bc26 (MD5) Publico-00291b.pdf: 1285004 bytes, checksum: b092509fe084d14584b2356d3e9d3722 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: Endometriose é uma afecção ginecológica benigna e, em sua fisiopatologia, encontramos os distúrbios do ciclo celular e apoptose. Os genes TP53, P27 e FAS, que participam da regulação do ciclo celular e apoptose, apresentam polimorfismos que podem ter influência funcional. Objetivo: Avaliar se há associação entre a presença dos polimorfismos nos genes TP53 (códons 11, 72, 248), P27 (V109G) e FAS (A670G) com a endometriose. Método: Estudo transversal, casocontrole onde foram pesquisados polimorfismos nos genes TP53 (códons 11, 72 e 248), P27 e FAS por PCR-RFLP em DNA extraídos de swab bucal de mulheres com e sem endometriose. Resultados: Os códons 11 e 248 do gene TP53 apresentaram raros alelos mutados, levando-se a crer que os polimorfismos destes códons não apresentam relevância clínica para a endometriose. O polimorfismo do gene FAS não apresentou diferença estatisticamente significativa entre os grupos endometriose e controle. Já no estudo do polimorfismo do gene TP53 (códon 72) e do gene P27, houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos endometriose e controle (p= 0,01; OR= 2,19; IC de 95%= 1,196-4,039 e p= 0,017; OR= 1,93; IC de 95%= 1,12-3,34; respectivamente). Conclusões: Os polimorfismos dos genes TP53*72 e P27 parecem estar associados à endometriose. Os polimorfismos dos genes TP53*11, TP53*248 e FAS não parecem estar associados à endometriose. / Introduction: Endometriosis is a benign gynaecologycal disease, defined as the presence of functional endometrial implants out of uterus, mainly in pelvis. Cell cycle and apoptosis disturbs could be associated with this disease as well as alterations in the genes that control. Aim: To investigate the possible association between the presence of the polymorphisms in the genes TP53: codons 11; 72; 248, P27 (V109G) and FAS –A670G with endometriosis. Methods: Cross sectional case–control study was performed. Genomic DNA was extracted from cells collected from buccal swabs. The TP53: codons 11; 72; 248, P27 (V109G) and FAS –A670G polymorphisms were investigated using the polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method in a hospital-based Brazilian population. Results: The P53 gene, codon 11 (P53*11) polymorphism study showed that mostly of women did not present the allelic variance (p=0,255). The P53 gene, codon 72 (P53*72) polymorphism study presented significant differences between endometriosis and control groups (P=0,01; OR=2,19; 95% IC=1,196-4,039). The P53 gene, codon 248 polymorphism study showed that only one woman from endometriosis group presented heterozygosis to variate allele. The distribution of genotype and allele frequencies of p27 V109G polymorphism was significantly different between the endometriosis cases and healthy women (p = 0.016 and 0.002). Finally, FAS gene polymorphism study showed any significant difference between groups (p=0,97). Conclusions: P53*72 and P27 polymorphisms studies could be associated with endometriosis. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

ANDRÉ, Angela Rosa. Associação da presença de Helicobacter pylori e dos genótipos caga e vaca com as alterações moleculares dos supressores tumorais P53 e P27 nos adenocarcinomas gástricos. 2008. 146 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2008. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2011-12-20T13:56:04Z No. of bitstreams: 1 2008_dis_arandré.pdf: 5783302 bytes, checksum: 36586c0859cef2aa2be2b5835b3602c4 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-02-01T16:04:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_dis_arandré.pdf: 5783302 bytes, checksum: 36586c0859cef2aa2be2b5835b3602c4 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-02-01T16:04:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_dis_arandré.pdf: 5783302 bytes, checksum: 36586c0859cef2aa2be2b5835b3602c4 (MD5) Previous issue date: 2008 / Gastric carcinoma is the second cause of death by cancer in the world. On State of Ceara-Brazil is the second most frequent type of cancer in men and third in women. Adenocarcinomas account for approximately 95% of all malignant gastric neoplasms. It has been associated to genetic and environmental factors and a intimate relationship between the infection by the bacteria Helicobacter pylori and the gastric carcinoma have been related. The presence of the cagA gene and specific genotypes (s1m1) of the gene vacA have been detected in more pathogenic strains. Although the precise molecular mechanisms by which H. pylori could promote the process of gastric carcinogenesis are under investigation, one hypothesized mechanism involves the tumor supressor genes inactivation. The aim of the present study was to verify if the presence of Helicobacter pylori, cagA and vacA genes is related to mutations in the tumor supressor gene p53 and altered expression of p53 and p27 proteins in gastric adenocarcinomas. Seventy-four (74) samples were analyzed to detect the presence of H. pylori, cagA and genotypes of vacA by Polymerization Chain Reaction (PCR). The mutational analysis of p53 gene was performed by PCR-SSCP (Polymerization Chain Reaction for analysis of the Single-strand Conformation Polymorphism). Analysis of mutation or overexpression of p53 protein and p27 expression was detected by the immunohistochemical method. The bacteria was detected in 95% of the samples, 63% was cagA(+). Among the vacA allele it was observed prevalence of s1 (74%) and m1 (82%), associated in 69% of the cases. Mutation analysis of p53 demonstrated 72% of the cases with altered electrophoretic mobility; The alterations were significatively more frequent in the presence of the cagA gene. Immunohistochemical analysis detected only 29% of cases with the expression of p53 protein. The protein p27 showed accentuated reduction in its expression (detected in only 19% of the cases), it has not demonstrated compensatory activity in relation to the p53 altered protein, neither association to H. pylori presence. Finally, these data suggest that simultaneous inactivation of these tumor suppressors genes may be the key point of deregulation of the cellular cycle that, associated to the other factors, favor the development and progression of the gastric cancer. There is some evidence that the bacterial presence, cagA and vacA/s1m1 genes, may influence, in a not understood way, the alterations observed in the tumor suppressors p53 and p27. / O carcinoma gástrico é a segunda causa de morte por câncer no mundo. No Ceará é o segundo mais freqüente entre os homens e o terceiro entre as mulheres. Dos cânceres gástricos os adenocarcinomas representam em torno de 95%. A doença tem sido associada a fatores genéticos e ambientais sendo demonstrada íntima relação com a infecção por Helicobacter pylori, principalmente associada à presença do gene cagA e genótipos vacAs1m1. Entretanto, apesar dos mecanismos pelos quais a bactéria promove a carcinogênese gástrica ainda não estarem esclarecidos, uma das hipóteses seria através da inativação de supressores tumorais. O objetivo do presente trabalho foi verificar, em adenocarcinomas gástricos, se a presença de H. pylori, e de seus genes cagA e vacA, está relacionada com a mutação e/ou alteração na expressão protéica dos supressores tumorais p53 e p27. Neste estudo, 74 amostras de pacientes foram analisadas quanto à presença de H. pylori, cagA+ e os genótipos de vacA, pela reação em cadeia da polimerase (PCR). A análise mutacional do gene p53 foi realizada por PCR-SSCP e a detecção da mutação/superexpressão do p53 e expressão da proteína p27 pelo método imunohistoquímico. A bactéria foi detectada em 95% das amostras, das quais 63% eram cagA(+). Dentre os alelos de vacA, observou-se predomínio de s1 (74%) e m1 (82%), associados em 69% dos casos. Na análise mutacional do p53 verificou-se que 72% dos casos exibiram alteração no padrão de mobilidade eletroforética, sendo esta associada significativamente à presença do gene cagA. Por outro lado, apenas 29% dos casos apresentaram detecção pelo método imunohistoquímico, não sendo encontrada associação com a H. pylori. A proteína p27 demonstrou acentuada redução em sua expressão (detectada em apenas 19% dos casos), não demonstrando atividade compensatória em relação à proteína p53 mutada e sem associação estatística dos casos negativos com a presença da H. pylori. Finalmente, os resultados sugerem que estes supressores simultaneamente inativados podem ser o ponto chave da desregulação do ciclo celular que, associados a outros fatores, favoreçam o desenvolvimento e progressão dos adenocarcinomas gástricos. Há indícios de que a presença bacteriana, e dos seus genes cagA(+) e vacA/s1m1, possam influenciar, de forma não esclarecida, as alterações moleculares ocorridas nos supressores tumorais p53 e p27.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-04-19T13:14:58Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2407879 bytes, checksum: 24a29868ff91347f5c8b65b662cb7870 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-19T13:14:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2407879 bytes, checksum: 24a29868ff91347f5c8b65b662cb7870 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Serine/Arginine protein kinases (SRPKs) são componentes chave da maquinaria de splicing através da regulação por fosforilação das proteínas SR, as quais são cruciais para a seleção dos sítios de splicing alternativo. Entretanto, as SRPKs são frequentemente encontradas superexpressas ou com atividade alterada em diversos tipos de cânceres, inclusive em leucemias. Dessa forma, a busca por pequenas moléculas inibidores destas quinases são de potencial interesse para o delineamento de novas estratégias terapêuticas. Nesta tese, descreve­se a avaliação da inibição farmacológica de SRPKs pelo inibidor seletivo N­(2­ (piperidin­1­il)­5­(trifluorometil)fenil)isonicotinamida (SRPIN340) sobre a viabilidade de linhagens leucêmicas linfoides e mieloides. Além de mostrar atividade citotóxica significativa, o efeito dos tratamentos na regulação da fosforilação das proteínas SR e na alteração da expressão dos genes MAP2K1, MAP2K2, VEGF e FAS foram também identificados. Além disso, a inibição farmacológica de SRPKs foi capaz de desencadear eventos precoces e tardios de apoptose. Por último, estudos de fluorescência intrínseca de triptofano, docking molecular e dinâmica molecular foram analisados a fim de se obter informações estruturais acerca do complexo SRPK/SRPIN340. No segundo estudo, é descrita a síntese de uma série de vinte e duas trifluorometil arilamidas baseadas na estrutura molecular do SRPIN340, além da avaliação dos seus efeitos antileucêmicos. Alguns dos derivados apresentaram efeitos citotóxicos superiores contra linhagens de leucemia mieloide e linfoide em comparação com o SRPIN340. Em particular, os compostos N­(2­(4­bromofenilamino)­5­(trifluorometil)fenil)­2­cloronicotinamida (24), N­(2­(4­bromofenilamino)­5­(trifluorometil)fenil)nicotinamida (30), e N­(2­(4­ bromofenilamino)­5­(trifluorometil)fenil)benzamida (36) apresentaram valores de IC 50 na faixa de 6,0 – 35,7 μM (μmol L ­1 ). Estes três compostos também foram capazes de desencadear eventos de apoptose e autofagia, além de exibir efeito sinergístico em combinação com o agente quimioterápico vincristina. Além disso, o composto 30 se mostrou mais eficiente que o SRPIN340 na diminuição da fosforilação das proteínas SR bem como na diminuição da expressão de isoformas oncogênicas dos genes MAP2K1, MAP2K2, VEGF, e RON. Tomados conjuntamente, estes resultados sugerem que inibidores de SRPKs são capazes de suprimir o crescimento celular através da regulação dos eventos de splicing e podem ser considerados como ponto de partida importante para desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas contra leucemias e outros tipos de cânceres. / Serine/Arginine protein kinase (SRPK) are key components of the splicing machinery trough the phospho­regulation of SR Proteins, which are crucial for exon selection in the alternative splicing. However, SRPK have frequently been found overexpressed or/and with altered activity in a number of cancers, including leukemias. Thus, the discovery of small molecule inhibitors against these kinases is of potential interest to identify novel therapeutic opportunities. Here, it is described the pharmacological inhibition of SRPK by N­(2­(piperidin­1­yl)­5­ (trifluoromethyl)phenyl)isonicotinamide (SRPIN340) on the viability of lymphoid and myeloid leukemia cell lines. Along with significant cytotoxic activity, the effect of treatments in regulating the phosphorylation of the SR protein family and in altering the expression of MAP2K1, MAP2K2, VEGF and FAS genes were also assessed. Furthermore, it was found that pharmacological inhibition of SRPKs can trigger early and late events of apoptosis. Finally, intrinsic tryptophan fluorescence emission, molecular docking and molecular dynamics were analyzed to gain structural information on the SRPK/SRPIN340 complex. In a second study, it is described the synthesis of a series of twenty­two trifluoromethyl arylamides based on the SRPIN340 scaffold and the evaluation of their antileukemia effects. Some derivatives presented superior cytotoxic effects against myeloid and lymphoid leukemia cell lines compared to SRPIN340. In particular, compounds N­(2­(4­bromophenylamino)­5­(trifluoromethyl)phenyl)­2­chloronicotinamide (24), N­(2­(4­bromophenylamino)­5­(trifluoromethyl)phenyl)nicotinamide (30), and N­(2­(4­ bromophenylamino)­5­(trifluoromethyl)phenyl)benzamide (36) presented IC 50 values within the 6.0 – 35.7 μM (μmol L ­1 ) range. In addition, these three compounds were able to trigger apoptosis and autophagy, and they exhibited synergistic effects in combination with the chemotherapeutic agent vincristine. Moreover, compound 30 was more efficient than SRPIN340 in impairing the intracellular phosphorylation status of SR proteins as well as the expression of MAP2K1, MAP2K2, VEGF, and RON oncogenic isoforms in leukemia cells. Taken together, these results suggest that SRPK pharmacological inhibitors may be considered for the development of novel therapeutic strategies against leukemias and other types of cancers.

O melanoma é uma forma de câncer com alto índice de morte devido, em parte, à sua tendência de formar metástases. Esse tipo tumoral apresenta deleção de CDKN2A e amplificação de HDM2 em aproximadamente 50 % dos casos, mas apenas 10 % apresentam mutação em p53. Aproveitando-se do fato de a maioria dos casos de melanoma retêm p53 selvagem, uma proteína supressora tumoral e fator de transcrição, utilizamos vetores adenovirais nos quais a expressão dos transgenes é controlada pelo p53 endógeno. Estes vetores foram aperfeiçoados com a inclusão de uma modificação na proteína fibra que permite a eficiente transdução de um amplo espectro de células. Utilizando estes vetores, nosso laboratório mostrou que o tratamento combinado, mas não individual, de vetores virais codificando p19Arf e IFNbeta (interferon-beta) induziu elevados níveis de morte em células de melanoma de camundongo, B16F10. Assim, iniciamos novos estudos que têm como alvo explorar os mecanismos de morte celular e identificar genes críticos cuja expressão é alterada frente o tratamento combinado e que agem como mediadores da resposta celular para a estratégia de transferência gênica. Com este projeto, transferimos a combinação gênica (p19Arf + IFNbeta) para células B16F10 e analisamos o tipo de morte celular induzido. Assim, detectamos o aumento da presença de marcadores de morte celular conhecidos, tais como de apoptose (atividade de caspases e exposição de fosfatidilserina) e de necroptose (expressão de RIPK3 e TNFR1), e a diminuição de um marcador de autofagia (expressão de LC3-II). Além disso, mostramos que a detecção dos três marcadores clássicos de morte imunogênica (ATP, calreticulina e HMGB1) foi possível somente quando as células B16F10 foram tratadas com a combinacao de p19Arf + IFNbeta. Por fim, a avaliação do perfil de expressão gênica através de microarray de cDNA das células B16F10 tratadas com p19Arf + IFNbeta revelou expressão diferenciada de 1054 genes em comparação com células que receberam apenas somente um ou outro transgene. Em seguida, a expressão dos genes Nr3c1, RanBP9, Sin3A, Wdr46, FoxO1, Phlda3 e tp73 foi validada por qPCR e estudos funcionais foram iniciados para revelar a participação destes na resposta celular. Dessa forma, desvendamos importantes aspectos da resposta de células B16F10 frente ao tratamento com p19Arf e IFNbeta / Melanoma is a form of cancer with a high death rate due, in part, to its tendency to generate metastasis. These tumors carry deletion of CDKN2A and amplification of HDM2 in nearly 50 % of cases, but only 10 % have mutations in p53. Taking advantage of the fact that most melanoma cases retain wild type p53, a transcription factor and tumor suppressor protein, we used adenoviral vectors in which transgene expression is controlled by endogenous p53. These vectors were improved with a modification of the fiber protein that allows efficient transduction of a broad spectrum of cells. Using these vectors, our laboratory showed that the combined treatment with viral vectors encoding p19Arf and IFNbeta (interferon-beta) induced high levels of B16F10 (mouse melanoma) cell death, but not when treated with these vectors individually. Thus, we initiated studies to explore the mechanisms of cell death and to identify critical genes involved in the response of B16F10 cells to treatment with p19Arf + IFNbeta. Here, we transferred p19Arf + IFNbeta genes to B16F10 cells and analyzed the type of cell death induced. In this regard, we detected an increase of cell death markers, such as apoptosis (caspase activity and exposure of phosphatidylserine) and necroptosis (RIPK3 and TNFR1 expression) and a decrease of an autophagy marker (LC3-II expression). Furthermore, we showed that the detection of three classic immunogenic cell death markers (ATP, calreticulin and HMGB1) was possible only when B16F10 cells were treated with p19Arf + IFNbeta combination. Lastly, assessment of gene expression profile using cDNA microarray analysis of B16F10 cells treated with p19Arf + IFNbeta revealed differential expression of 1054 genes compared to cells that received only one of the transgenes. Expression of Nr3c1, RanBP9, Sin3a, Wdr46, FoxO1, Phlda3 and TP73 genes was validated by qPCR and functional studies were started to reveal participation of these genes in the cellular response. Thus, we exposed important aspects of the B16F10 cellular response to treatment with p19Arf and IFNbeta

O melanoma é uma forma de câncer com alto índice de morte devido, em parte, à sua tendência de formar metástases. Esse tipo tumoral apresenta deleção de CDKN2A e amplificação de HDM2 em aproximadamente 50 % dos casos, mas apenas 10 % apresentam mutação em p53. Aproveitando-se do fato de a maioria dos casos de melanoma retêm p53 selvagem, uma proteína supressora tumoral e fator de transcrição, utilizamos vetores adenovirais nos quais a expressão dos transgenes é controlada pelo p53 endógeno. Estes vetores foram aperfeiçoados com a inclusão de uma modificação na proteína fibra que permite a eficiente transdução de um amplo espectro de células. Utilizando estes vetores, nosso laboratório mostrou que o tratamento combinado, mas não individual, de vetores virais codificando p19Arf e IFNbeta (interferon-beta) induziu elevados níveis de morte em células de melanoma de camundongo, B16F10. Assim, iniciamos novos estudos que têm como alvo explorar os mecanismos de morte celular e identificar genes críticos cuja expressão é alterada frente o tratamento combinado e que agem como mediadores da resposta celular para a estratégia de transferência gênica. Com este projeto, transferimos a combinação gênica (p19Arf + IFNbeta) para células B16F10 e analisamos o tipo de morte celular induzido. Assim, detectamos o aumento da presença de marcadores de morte celular conhecidos, tais como de apoptose (atividade de caspases e exposição de fosfatidilserina) e de necroptose (expressão de RIPK3 e TNFR1), e a diminuição de um marcador de autofagia (expressão de LC3-II). Além disso, mostramos que a detecção dos três marcadores clássicos de morte imunogênica (ATP, calreticulina e HMGB1) foi possível somente quando as células B16F10 foram tratadas com a combinacao de p19Arf + IFNbeta. Por fim, a avaliação do perfil de expressão gênica através de microarray de cDNA das células B16F10 tratadas com p19Arf + IFNbeta revelou expressão diferenciada de 1054 genes em comparação com células que receberam apenas somente um ou outro transgene. Em seguida, a expressão dos genes Nr3c1, RanBP9, Sin3A, Wdr46, FoxO1, Phlda3 e tp73 foi validada por qPCR e estudos funcionais foram iniciados para revelar a participação destes na resposta celular. Dessa forma, desvendamos importantes aspectos da resposta de células B16F10 frente ao tratamento com p19Arf e IFNbeta / Melanoma is a form of cancer with a high death rate due, in part, to its tendency to generate metastasis. These tumors carry deletion of CDKN2A and amplification of HDM2 in nearly 50 % of cases, but only 10 % have mutations in p53. Taking advantage of the fact that most melanoma cases retain wild type p53, a transcription factor and tumor suppressor protein, we used adenoviral vectors in which transgene expression is controlled by endogenous p53. These vectors were improved with a modification of the fiber protein that allows efficient transduction of a broad spectrum of cells. Using these vectors, our laboratory showed that the combined treatment with viral vectors encoding p19Arf and IFNbeta (interferon-beta) induced high levels of B16F10 (mouse melanoma) cell death, but not when treated with these vectors individually. Thus, we initiated studies to explore the mechanisms of cell death and to identify critical genes involved in the response of B16F10 cells to treatment with p19Arf + IFNbeta. Here, we transferred p19Arf + IFNbeta genes to B16F10 cells and analyzed the type of cell death induced. In this regard, we detected an increase of cell death markers, such as apoptosis (caspase activity and exposure of phosphatidylserine) and necroptosis (RIPK3 and TNFR1 expression) and a decrease of an autophagy marker (LC3-II expression). Furthermore, we showed that the detection of three classic immunogenic cell death markers (ATP, calreticulin and HMGB1) was possible only when B16F10 cells were treated with p19Arf + IFNbeta combination. Lastly, assessment of gene expression profile using cDNA microarray analysis of B16F10 cells treated with p19Arf + IFNbeta revealed differential expression of 1054 genes compared to cells that received only one of the transgenes. Expression of Nr3c1, RanBP9, Sin3a, Wdr46, FoxO1, Phlda3 and TP73 genes was validated by qPCR and functional studies were started to reveal participation of these genes in the cellular response. Thus, we exposed important aspects of the B16F10 cellular response to treatment with p19Arf and IFNbeta

Os avanços científicos das últimas décadas permitiram que a compreensão do câncer evoluísse de uma visão simplista, na qual o principal motor seria uma atividade celular hiperploriferativa, para uma visão mais complexa onde o estado fisiológico geral permite a gênese e progressão tumoral. Essa evolução permite o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas e traz novas esperanças para o tratamento de muitos tipos de cânceres ainda extremamente deletérios. Dentro desse novo panorama, terapias que estimulem a imunidade antitumoral têm se mostrado extremamente promissoras. Nesse trabalho, procuramos investigar os efeitos antitumorais desencadeados pela combinação da indução de morte celular e imunoestimulação. Para tanto, visamos à recuperação da via de p53 (pela transferência gênica do próprio p53 ou p19) associada à transferência gênica de IFNbeta. A transferência gênica foi mediada por vetores adenovirais do sorotipo 5. Nossas observações, em um modelo murino de carcinoma pulmonar, permitem concluir que esta linhagem é sensível a morte induzida pela transferência gênica de p19 e não p53. Porém, a transferência gênica intratumoral de IFNbeta se mostrou chave no controle do crescimento do tumor primário. Destacamos, entretanto, que a associação de IFNbeta com p19 produziu efeitos imunoprotetores superiores à transferência de IFNbeta ou p19 sozinhos. Tal efeito parece ser dependente da indução de fatores quimiotáxicos e conseqüente recrutamento de neutrófilos para o sítio tumoral. O efeito da transferência gênica combinada de ambos os genes IFNbeta e p19 se mostrou ainda mais promissor quando associado à cisplatina, induzindo uma notável redução no crescimento tumoral / Scientific advances from the last decades enabled the evolution of our knowledge of cancer from a simplistic vision, in which the main motor was an excessive cell proliferation, to a more complex one, where the general physiologic state enables tumorigenesis and tumor progression. This evolution enabled the development of new therapies and brings new hopes for the treatment of several types of cancers. In this context, therapies that induce an antitumor immunity are very promising. In this work, we are investigating the antitumor effects triggered by the combination of cell death induction and immunostimulation. To this end, we aimed to restore p53 pathway (by p53 or p19 gene transfer) associated with immunostimulation by IFNbeta gene transfer. The gene transfer was mediated by Adenovectors Serotype 5. Our observations in a murine model of lung cancer showed that this cell line is sensitive to cell death induced by p19 gene transfer, but not p53. Nevertheless, intratumoral gene transfer of IFNbeta, was crucial in controlling tumor growth. Moreover, p19 and IFNbeta association induced higher immunoprotecting effects than p19 or IFNbeta alone. This effect seems to be depending on the induction of chemotactic factors, and the recruitment of neutrophils to the tumor site. The effect of combined gene transfer of p19 and IFNbeta was even more promising when associated with Cisplatine, inducing a remarkable reduction in tumor growth

A maior parte dos casos de doença renal policística autossômica dominante (DRPAD) é causada por mutações no gene PKD1 (Polycystic Kidney Disease 1). O insulto por isquemia/reperfusão (IR) constitui-se em uma causa freqüente de lesão renal aguda, incluindo a população de pacientes com DRPAD, mas a relação entre policistina-1 e IR é essencialmente desconhecida. Uma vez que a policistina-1 modula proliferação, diferenciação celular e apoptose em sistemas de cultura de células, sua menor atividade biológica na DRPAD poderia favorecer um maior grau de lesão renal. Utilizamos uma linhagem endogâmica de camundongos 129Sv com uma mutação nula em Pkd1 para testar esta hipótese. Camundongos Pkd1+/- não apresentam cistos renais até 12 semanas de vida, constituindo-se em um modelo puro de haploinsuficiência para este gene. Um insulto IR bilateral de 32 min foi induzido em camundongos machos de 10-12 semanas de idade, heterozigotos e selvagens, por meio do clampeamento reversível de ambos os pedículos renais. Os animais foram analisados 48 h, 7 dias (d) e 14 d após o insulto. Camundongos Pkd1+/- apresentaram FENa, FEK e SCr mais elevadas que animais Pkd1+/+ 48 h após IR. O dano cortical residual foi mais severo em heterozigotos que em selvagens em todos os tempos avaliados. A marcação para PCNA também foi mais alta em camundongos Pkd1+/- que Pkd1+/+ 48 h e 7 d pós-IR, enquanto a taxa de apoptose e a infiltração inflamatória intersticial foram maiores em heterozigotos que em selvagens nos seguimentos de 48 h, 7 d e 14 d pós-IR. A expressão renal de p21 foi menor nos camundongos Pkd1+/- que Pkd1+/+ no tempo de 48 h pós-insulto, tanto no nível transcricional como traducional. Análises adicionais realizadas 6 semanas após o insulto IR revelaram dilatação tubular e formação de microcistos nos camundongos haploinsuficientes para Pkd1, assim como fibrose renal aumentada nesses animais, comparados aos camundongos selvagens. Por fim, um insulto de 35 min de isquemia/reperfusão acompanhou-se de uma mortalidade precoce substancialmente maior nos animais Pkd1+/-. Esses achados sugerem que isquemia/reperfusão induza uma lesão mais severa em rins de camundongos haploinsuficientes para Pkd1, um processo aparentemente dependente de uma deficiência relativa da atividade de p21, assim como dilatação tubular e formação de microcistos. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a heterozigose para mutação nula em Pkd1 em camundongo (e talvez em humanos) esteja associada a um risco aumentado para lesão renal por isquemia/reperfusão e a um pior impacto desse insulto sobre a progressão da doença renal. / The majority of autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) cases are caused by mutations in the PKD1 gene. Ischemia/reperfusion is a frequent cause of acute kidney injury, including the ADPKD patient population, but the relationship between polycystin-1 and ischemia/reperfusion is essentially unknown. Since polycystin-1 modulates cell proliferation, cell differentiation and apoptosis in cell culture systems, its lower biological activity in ADPKD might amplify the degree of renal injury. Using an inbred 129Sv mouse line with a Pkd1-null mutation, 32-min renal ischemia/reperfusion was induced in 10-12 week-old male non-cystic mice, heterozygotes and wild types. The animals were analyzed at 48h, 7 days (d) and 14d after the insult. Pkd1+/- mice showed higher FENa, FEK and SCr than Pkd1+/+ animals at 48h of follow-up. The residual cortical damage was more severe in heterozygotes than wild types at all evaluated time points. The PCNA staining was also higher in Pkd1+/- than Pkd1+/+ mice at 48h and 7d, while cell apoptotic rates and the interstitial inflammatory infiltration were higher in heterozygotes than wild types at 48h, 7d and 14d postischemia/ reperfusion. The expression of p21 was lower in Pkd1+/- than Pkd1+/+ kidneys at 48h, both at the transcriptional and translational levels. Additional analyses performed 6 weeks after the insult showed tubular dilatation and microcyst formation in the haploinsufficient mice, and increased renal fibrosis in these animals compared to wild types. Thirty-fivemin ischemia/reperfusion, at last, was accompanied by a substantially higher early mortality of Pkd1+/- animals. These findings suggest that ischemia/reperfusion induces a more severe injury in kidneys of Pkd1- haploinsufficient mice, a process that is apparently dependent on a relative deficiency of p21 activity, as well as tubular dilatation and microcyst formation. Altogether, our results suggest that mouse Pkd1-null heterozygosity (and maybe human) is associated with a higher risk for renal ischemia/reperfusion injury and with a worse impact of this insult upon renal disease progression.

Objetivos: Verificar a frequência de Chlamydia trachomatis e a sua associação com a expressão de p16/Ki-67 em mulheres com lesões intraepiteliais cervicais. Analisar a associação entre a positividade para Chlamydia trachomatis e variáveis demográficas selecionadas, antecedentes sexuais e obstétricos, resultados anormais citológicos e anatomopatológicos. Também verificar a associação entre a expressão da dupla coloração para p16/Ki-67 com os resultados citológicos e anatomopatológicos. Métodos: Estudo de corte transversal em 1481 mulheres de 18 a 64 anos, participantes de projeto de rastreamento para câncer cervical realizado em São Paulo. As citologias foram coletadas em meio líquido e no líquido residual foi pesquisada a presença do DNA da Chlamydia trachomatis. Nos resultados de citologia anormal foi feita a pesquisa da expressão das proteínas p16/Ki-67. A análise estatística foi realizada usando-se os testes qui-quadrado e da razão de verossimilhanças. Foram estimados os valores de odds ratios (OR) com os respectivos intervalos com 95% de confiança. Resultados: A frequência de detecção da Chlamydia trachomatis foi 15,6%. Não houve associação estatisticamente significativa entre a presença de Chlamydia trachomatis e a expressão de p16/Ki-67 [OR=1,35 (0,5-3,4)]. A idade e o número de parceiros sexuais apresentou associação significativa com a presença de Chlamydia trachomatis [OR= 2,01 (1,1-3,6) e 4,14 (1,7-10,3)]. Não foi encontrada associação significativa entre citologia alterada e a positividade para Chlamydia trachomatis [1,21 (0,46-3,2)]. Não foi observada associação significativa entre os resultados anatomopatológicos e a presença de Chlamydia trachomatis (p = 0,112). A expressão do p16/Ki-67 mostrou associação estatisticamente significativa com lesões intraepiteliais cervicais de alto grau tanto nos resultados citológicos quanto anatomopatológicos. Conclusões: A frequência de infecção por Chlamydia trachomatis na amostra estudada foi de 15,6%. A associação da Chlamydia trachomatis com a dupla coloração para p16/Ki-67 nas citologias anormais não foi significativa, não sendo possível estabelecer uma associação clara entre a presença de Chlamydia trachomatis e a persistência da infecção por HPV oncogênico detectada por este marcador. Dentre as variáveis demográficas pesquisadas, a faixa etária apresentou associação estatisticamente significativa com a presença do DNA da Chlamydia trachomatis; mulheres com idade entre 35 e 45 apresentaram a maior frequência da infecção; entretanto, mesmo as outras faixas etárias mostraram uma alta frequência da presença desse patógeno; foi observada maior frequência da infecção entre as mulheres com mais de 10 parceiros sexuais, quando comparadas com as com menor número de parceiros durante a vida e essa associação foi estatisticamente significativa; não foi demonstrada associação significativa entre os resultados anormais da citologia com a positividade para a presença do DNA da Chlamydia trachomatis. Não foi encontrada associação significativa entre os resultados anatomopatológicos dirigidas pela colposcopia com a positividade da infecção pela bactéria. A positividade da dupla coloração para p16/Ki-67 foi significativamente maior nas lesões intraepiteliais cervicais de alto grau. Foi demonstrada associação estatisticamente significativa entre a expressão do p16/Ki-67 com os resultados anatomopatológicos das biopsias dirigidas pela colposcopia / Objective: To verify the frequency of Chlamydia trachomatis and its association with the expression of p16/Ki-67 on women with cervical intraepithelial lesions. To analyze the association between Chlamydia trachomatis presence and the selected demographic variables such as sexual and obstetric history, abnormal cytology and histopathology, as well as analyzing any association between the expression of dual staining for p16/Ki-67 with cytological and histopathological results. Methods: Cross-sectional study on 1481 women with ages between 18 and 64 years, who were enrolled in a screening project for cervical cancer held in São Paulo. The cytology was collected in liquid based medium and the residual liquid was submitted for examination to find the presence of Chlamydia trachomatis DNA. The expression of protein p16/Ki-67 was performed in the abnormal cytology results. Statistical analysis was performed using chi-square tests and likelihood ratio. The values of the odds ratios (OR) with respective intervals of 95% confidence were estimated. Results: The frequency of detection of Chlamydia trachomatis was 15.6%. There was no statistical significant association between the presence of Chlamydia trachomatis and the expression of p16/Ki-67 [OR = 1.35 (0.5 to 3.4)]. Both the age and number of sexual partners presented a significant association in presence of Chlamydia trachomatis [OR = 2.01 (1.1 to 3.6) and 4.14 (1.7 to 10.3)]. There was no significant association between abnormal cytology and positivity for Chlamydia trachomatis [1.21 (0.46 to 3.2)]. No significant association was found between histopathological results and presence of Chlamydia trachomatis (p= 0.112). The expression of p16/Ki-67 showed a significant statistical association with high grade intraepithelial lesions in both cytological and histopathological results. Conclusions: The prevalence of Chlamydia trachomatis infection on the sample studied was 15.6%. The association of Chlamydia trachomatis with dual staining for p16/Ki-67 in abnormal cytology was not significant, therefore, it is not possible to establish a clear association between the presence of Chlamydia trachomatis and the persistence of oncogenic HPV infection detected by this marker. Among the demographic variables, the age range showed statistically significant association with the presence of Chlamydia trachomatis; women aged between 35 - 45 years showed the highest rate of infection, nevertheless the other age ranges showed a high frequency of the presence of this pathogen; It has been observed a higher number of infected women who had more than 10 sexual partners compared to woman who had less partners throughout life and this association was statistically significant; No significant association was found between abnormal cytology with positivity for the presence of Chlamydia trachomatis DNA; There was no significant association between pathological results directed by colposcopy with the positivity of Chlamydia trachomatis; The positivity of the double staining for p16/Ki-67 was significantly higher in the cervical high-grade intraepithelial lesions; Statistical significant association was demonstrated between the expression of p16/Ki-67 with histopathological results of biopsy directed by colposcopy

A deficiência de vitamina D (dVD) aumenta o risco de morte em pacientes hospitalizados. A injúria de isquemia/reperfusão renal (Isq) ativa vias de necrose e/ou apoptose e proliferação celular. A injúria renal aguda (IRA) induz a ativação de inibidores do ciclo celular, incluindo a p21, uma inibidora de kinase dependente de ciclina, a qual possui efeito protetor na IRA. A p21 é um alvo genômico da 25-hidroxivitamina D [25 (OH) D], a qual, atuando através de receptores de vitamina D (VDRs), possui efeitos imunomoduladores potentes e antiproliferativos, sugerindo a participação deste hormônio na fisiopatologia da doença renal. Desta forma, o objetivo deste estudo foi verificar a participação da deficiência de vitamina D no modelo de isquemia/reperfusão renal em ratos. Foram utilizados ratos Wistar que foram divididos em quatro grupos: controle (C), animais que receberam dieta padrão por 30 dias; dVD, animais que receberam dieta livre de vitamina D por 30 dias; Isq, animais que receberam dieta padrão por 30 dias e no 28º dia foram submetidos ao insulto de isquemia/reperfusão em ambos os rins por 45 minutos; e dVD+Isq, animais que receberam dieta livre de vitamina D por 30 dias e no 28º dia foram submetidos ao insulto de isquemia/reperfusão em ambos os rins por 45 minutos. Ao final dos 30 dias e após 48 horas da realização da isquemia/reperfusão, os animais foram submetidos à eutanásia e amostras de sangue, urina e tecido renal foram coletados para o estudo dos mecanismos de lesão renal. A injúria renal aguda associada à deficiência de vitamina D levou a uma queda da filtração glomerular e aumento da proteinúria; aumento da relação peso renal/peso corporal, sugerindo maior proliferação e hipertrofia; induziu uma diminuição na ativação dos receptores de vitamina D e da expressão da proteína p21 e aumento da expressão de caspase-3; observou-se déficit de concentração urinária com diminuição da expressão da AQP2; e um maior dano morfológico caracterizado pela análise da área intersticial e presença de necrose tubular. Nossos dados mostraram que alterando os níveis da p21 na IRA isquêmica, a vitamina D, via VDRs, controla a inflamação renal, a proliferação e a lesão celular / Vitamin D deficiency (VDD) increases the risk of death in hospitalized patients. Ischemia/reperfusion injury activates pathways of necrosis and/or apoptosis and cell proliferation. Acute kidney injury (AKI) induces the activation of cell cycle inhibitors, including p21, an inhibitor of cyclin-dependent kinase, which has a protective effect on the IRA. The p21 is a genomic target of 25-hydroxyvitamin D [ 25 (OH) D], which, acting through vitamin D receptors (VDRs), has potent antiproliferative and immunomodulatory effects, suggesting the involvement of this hormone in the pathophysiology of renal disease. Thus, the aim of this study was to assess the role of vitamin D deficiency in rats submitted to renal ischemia/reperfusion. Wistar rats were divided into four groups: control (C), animals that received a standard diet for 30 days; VDD, animals that received vitamin D-free diet for 30 days; IRI, animals that received standard diet for 30 days and on day 28 were subjected to the ischemia/reperfusion insult (IRI) in both kidneys for 45 minutes; and VDD+IRI, animals that received vitamin D-free diet for 30 days and on day 28 were subjected to the IRI in both kidneys for 45 minutes. At the end of 30 days and 48 hours after the IRI insult, the animals were euthanized and samples of blood, urine and kidney tissue were collected to study the mechanisms of renal injury. Acute kidney injury associated with vitamin D deficiency led to a decrease in glomerular filtration rate and increased proteinuria; increased relative kidney weight/body weight, suggesting greater proliferation and hypertrophy; induced a decrease in the activation of vitamin D receptors and the p21 protein expression and, increased caspase-3 expression; renal concentration impairment with decreased AQP2 expression, as well as greater morphological damage characterized by interstitial area analysis and presence of tubular necrosis. Our data showed that altering the levels of p21 in ischemic-AKI, vitamin D via VDRs, controls kidney inflammation, proliferation and cell injury

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O carcinoma gÃstrico à a segunda causa de morte por cÃncer no mundo. No Cearà à o segundo mais freqÃente entre os homens e o terceiro entre as mulheres. Dos cÃnceres gÃstricos os adenocarcinomas representam em torno de 95%. A doenÃa tem sido associada a fatores genÃticos e ambientais sendo demonstrada Ãntima relaÃÃo com a infecÃÃo por Helicobacter pylori, principalmente associada à presenÃa do gene cagA e genÃtipos vacAs1m1. Entretanto, apesar dos mecanismos pelos quais a bactÃria promove a carcinogÃnese gÃstrica ainda nÃo estarem esclarecidos, uma das hipÃteses seria atravÃs da inativaÃÃo de supressores tumorais. O objetivo do presente trabalho foi verificar, em adenocarcinomas gÃstricos, se a presenÃa de H. pylori, e de seus genes cagA e vacA, està relacionada com a mutaÃÃo e/ou alteraÃÃo na expressÃo protÃica dos supressores tumorais p53 e p27. Neste estudo, 74 amostras de pacientes foram analisadas quanto à presenÃa de H. pylori, cagA+ e os genÃtipos de vacA, pela reaÃÃo em cadeia da polimerase (PCR). A anÃlise mutacional do gene p53 foi realizada por PCR-SSCP e a detecÃÃo da mutaÃÃo/superexpressÃo do p53 e expressÃo da proteÃna p27 pelo mÃtodo imunohistoquÃmico. A bactÃria foi detectada em 95% das amostras, das quais 63% eram cagA(+). Dentre os alelos de vacA, observou-se predomÃnio de s1 (74%) e m1 (82%), associados em 69% dos casos. Na anÃlise mutacional do p53 verificou-se que 72% dos casos exibiram alteraÃÃo no padrÃo de mobilidade eletroforÃtica, sendo esta associada significativamente à presenÃa do gene cagA. Por outro lado, apenas 29% dos casos apresentaram detecÃÃo pelo mÃtodo imunohistoquÃmico, nÃo sendo encontrada associaÃÃo com a H. pylori. A proteÃna p27 demonstrou acentuada reduÃÃo em sua expressÃo (detectada em apenas 19% dos casos), nÃo demonstrando atividade compensatÃria em relaÃÃo à proteÃna p53 mutada e sem associaÃÃo estatÃstica dos casos negativos com a presenÃa da H. pylori. Finalmente, os resultados sugerem que estes supressores simultaneamente inativados podem ser o ponto chave da desregulaÃÃo do ciclo celular que, associados a outros fatores, favoreÃam o desenvolvimento e progressÃo dos adenocarcinomas gÃstricos. Hà indÃcios de que a presenÃa bacteriana, e dos seus genes cagA(+) e vacA/s1m1, possam influenciar, de forma nÃo esclarecida, as alteraÃÃes moleculares ocorridas nos supressores tumorais p53 e p27. / Gastric carcinoma is the second cause of death by cancer in the world. On State of Ceara-Brazil is the second most frequent type of cancer in men and third in women. Adenocarcinomas account for approximately 95% of all malignant gastric neoplasms. It has been associated to genetic and environmental factors and a intimate relationship between the infection by the bacteria Helicobacter pylori and the gastric carcinoma have been related. The presence of the cagA gene and specific genotypes (s1m1) of the gene vacA have been detected in more pathogenic strains. Although the precise molecular mechanisms by which H. pylori could promote the process of gastric carcinogenesis are under investigation, one hypothesized mechanism involves the tumor supressor genes inactivation. The aim of the present study was to verify if the presence of Helicobacter pylori, cagA and vacA genes is related to mutations in the tumor supressor gene p53 and altered expression of p53 and p27 proteins in gastric adenocarcinomas. Seventy-four (74) samples were analyzed to detect the presence of H. pylori, cagA and genotypes of vacA by Polymerization Chain Reaction (PCR). The mutational analysis of p53 gene was performed by PCR-SSCP (Polymerization Chain Reaction for analysis of the Single-strand Conformation Polymorphism). Analysis of mutation or overexpression of p53 protein and p27 expression was detected by the immunohistochemical method. The bacteria was detected in 95% of the samples, 63% was cagA(+). Among the vacA allele it was observed prevalence of s1 (74%) and m1 (82%), associated in 69% of the cases. Mutation analysis of p53 demonstrated 72% of the cases with altered electrophoretic mobility; The alterations were significatively more frequent in the presence of the cagA gene. Immunohistochemical analysis detected only 29% of cases with the expression of p53 protein. The protein p27 showed accentuated reduction in its expression (detected in only 19% of the cases), it has not demonstrated compensatory activity in relation to the p53 altered protein, neither association to H. pylori presence. Finally, these data suggest that simultaneous inactivation of these tumor suppressors genes may be the key point of deregulation of the cellular cycle that, associated to the other factors, favor the development and progression of the gastric cancer. There is some evidence that the bacterial presence, cagA and vacA/s1m1 genes, may influence, in a not understood way, the alterations observed in the tumor suppressors p53 and p27.