Made available in DSpace on 2014-05-29T12:32:35Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 69316.pdf: 16389099 bytes, checksum: 74eb72078f131d9d9be7efc37391f1e6 (MD5) 69316.pdf.txt: 484412 bytes, checksum: 46c33af71747059817ce7b4a20b609af (MD5) 69316.pdf.jpg: 1433 bytes, checksum: 084dde94865696f7af0cab1566875cf5 (MD5) Previous issue date: 2014-05-06 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é uma doença tropical negligenciada que representa um grave problema de saúde pública. Assim, compreender a biologia da interação T. cruzi-hospedeiros constitui um grande desafio, uma vez que o ciclo de vida deste parasito exige um repertório de adaptações para garantir sua dispersão em hospedeiros vertebrados e invertebrados. O presente estudo demonstra o potencial das proteínas com propriedade de ligação à heparina (PLHs) em atuar no ciclo biológico do T. cruzi. Durante este trabalho foi oportuno isolar uma fração de proteínas hidrofóbicas com propriedade de ligação à heparina, com massas moleculares entre 70 kDa e 59 kDa em formas epimastigotas e tripomastigotas de T. cruzi por cromatografia de afinidade à heparina. A presença destas proteínas na superfície celular destes parasitos foi confirmada por ressonância plasmônica de superfície. Tais ensaios também foram decisivos na determinação da especificidade e estabilidade da ligação das PLHs a heparina, heparam sulfato (HS) e condroitim sulfato (CS). Os ensaios de competição realizados indicaram que a interação entre PLHs e GAGs pode influenciar a adesão dos epimastigotas à superfície de células epiteliais do trato intestinal de Rhodnius prolixus O envolvimento de GAGs na invasão de amastigotas em cardiomiócitos, célula alvo da infecção pelo T. cruzi, também foi demonstrado através de ensaios de competição com 20 \03BCg/ml de GAGs solúveis, incluindo heparina, HS, CS, dermatam sulfato (DS) e queratam sulfato (KS). Uma drástica redução no nível de infecção foi evidenciada apenas com heparina e HS, atingindo 82% e 65% de redução da invasão, respectivamente. Ensaios com células deficientes em GAGs (CHO-745) corroboraram o importante papel destes componentes de matriz extracelular no processo de reconhecimento e invasão de amastigotas. Na continuidade deste estudo, avançamos na caracterização bioquímica de PLHs, na determinação da expressão e distribuição espacial destas proteínas em tripomastigotas. As análises por citometria de fluxo revelaram que PLHs são abundantes na superfície de tripomastigotas, clone Dm28c, e a detecção destas proteínas por imunofluorescência indireta revelou uma localização predominante na membrana flagelar do parasito. Com os ensaios de zimografia realizados neste trabalho, revelamos que as PLHs de tripomastigotas tem atividade de protease sobre gelatina em uma ampla faixa de pH (5,5 - 8,0). A sensibilidade destas enzimas a presença de inibidores de serino protease indicam que as PLHs de tripomastigotas têm propriedades similares à tripsina. O conjunto de resultados deste trabalho aponta para o importante papel das PLHs em todas as etapas do ciclo biológico do T. cruzi a partir de eventos de adesão e invasão celular, através do reconhecimento de glicosaminoglicanos sulfatados / Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is a neglected tropical disease that causes a serious public health problem. Thus, understanding the biology of the T. cruzi-hosts interaction is a major challenge, since the life cycle of this parasite requires a repertoire of adaptations to ensure their dispersion in vertebrate and invertebrate hosts. The present study demonstrates the potential of proteins with heparin-binding property (HBPs) to act in the biological cycle of T. cruzi. During this study, it was opportune to isolate a hydrophobic protein fraction with property to bind to heparin, with molecular weights ranging from 70 kDa to 59 kDa, in epimastigotes and trypomastigotes of T. cruzi by heparin affinity chromatography. The presence of these proteins on the cell surface of these parasites was confirmed by surface plasmon resonance. These assays were also decisive in determining the specificity and stability of the binding of HBPs to heparin, heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS). The competition assays indicated that the interaction between HBPs and GAGs can influence the adhesion of the epimastigote to the surface of epithelial cells of the intestinal tract of Rhodnius prolixus. The involvement of GAGs in the invasion of amastigotes in cardiomyocytes, target cell of T. cruzi infection, was also demonstrated by competition assays with 20 μg/ml of soluble GAGs, including heparin, HS, CS, dermatan sulfate (DS) and keratan sulfate (KS). A drastic reduction in the level of infection was observed only with heparin and HS, reaching 82% and 65% reduction of the invasion, respectively. Experimental assays using cells deficient in GAGs (CHO-745) corroborated the important role of extracellular matrix components in the recognition and invasion of amastigotes. In continuation of this study, we advanced in the biochemical characterization of HBPs and also determined the expression and spatial distribution of these proteins in trypomastigotes. The flow cytometric analysis revealed that HBPs are abundant at the surface of trypomastigotes, Dm28c clone, and the detection of these proteins by indirect immunofluorescence revealed a predominant location in the flagellar membrane of the parasite. With the zymography assays conducted in this work, we revealed that HBPs of trypomastigotes have proteinase activity on gelatin in a wide pH range (5.5 - 8.0). The sensitivity of these enzymes in the presence of serine proteinase inhibitors indicates that HBPs of trypomastigotes have properties similar to trypsin. All together, the results of this study points out to the important role of HBPs at all stages of the life cycle of T. cruzi from events of adhesion and cell invasion, through the recognition of sulfated glycosaminoglycans

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-07T19:18:29Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_SC_MarianaMichelBarbosa.pdf: 233577 bytes, checksum: d4f23c8b78a1d9d6a2432053a7c7e47d (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-07T19:18:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_SC_MarianaMichelBarbosa.pdf: 233577 bytes, checksum: d4f23c8b78a1d9d6a2432053a7c7e47d (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-07T19:19:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_SC_MarianaMichelBarbosa.pdf: 233577 bytes, checksum: d4f23c8b78a1d9d6a2432053a7c7e47d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-07T19:19:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_SC_MarianaMichelBarbosa.pdf: 233577 bytes, checksum: d4f23c8b78a1d9d6a2432053a7c7e47d (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / O presente trabalho teve como objetivo determinar a prevalência e os fatores associados a interações medicamentosas potencialmente prejudiciais (IMPPs) entre idosos (60 + anos de idade) residentes na cidade de Bambuí, bem como identificar os princípios ativos mais frequentemente envolvidos nesses eventos e caracterizar essas interações quanto à gravidade. Participaram do estudo 1.132 idosos que utilizaram dois ou mais medicamentos simultaneamente. Esses participantes eram predominantemente do sexo feminino (68,6%), com idade entre 60-69 anos (54,8%), e 84,2% apresentavam pelo menos uma das doenças crônicas pesquisadas. Foram consumidos em média 4,2 medicamentos por participantes, e a prevalência do uso de cinco ou mais fármacos foi de 36,1%. A prevalência de IMPPs foi de 11,9%, das quais 13,2% foram classificadas como maiores e 66,5% moderadas. Os medicamentos mais frequentemente envolvidos em IMPPs foram diclofenaco (10,2%) e efedrina (9,8%) e a associação mais comum foi a de teofilina + efedrina (18,2%). As classes terapêuticas com atuação sobre o aparelho cardiovascular (36,8%) e sistema músculo esquelético (27,8%) foram as mais frequentes. A ocorrência de IMPPs foi mais frequente entre os usuários de polifarmácia, entre aqueles submetidos à hospitalização e a um maior número de consultas médicas, mas somente a polifarmácia permaneceu independentemente associada ao evento (OR= 4,49; IC 95% 2,93- 6,87). Na análise multivariada, as chances de exposição ao risco de IMPPs foram menores entre aqueles que apresentavam uma ou duas das condições crônicas investigadas, em comparação àqueles livres delas. O estudo constitui uma importante contribuição para a melhoria da qualidade de prescrição, integrando os esforços despendidos para reforçar as ações de farmacovigilância, especialmente na população idosa, em que os riscos no uso de medicamentos são agravados pela própria fisiologia do envelhecimento. Além disso, vem ajudar a preencher a carência de produção científica sobre o tema em populações idosas residentes em comunidade, em um cenário distinto do serviço de saúde, especialmente o hospitalar. / This study aimed to determine the prevalence and factors associated with Potentially Harmful Drug-drug interactions (PHDDIs) in community-dwelling elderly people (60 + years) in Bambuí and identify the drugs most frequently involved in these events and characterize these interactions regard to severity. The study included 1,132 elderly people who used two or more drugs simultaneously. These participants were predominantly female (68.6%), aged between60-69 years (54.8%), and 84.2 % had at least one of the studied chronic diseases. Were consumed on average 4.2 drugs per participant, and the median prevalence of consumed the five or more drugs was 36.1%. The prevalence of PHDDIs was 11.9%, of which 13.2% were classified as severe and 66.5% moderate. The drugs most frequently involved in PHDDIs were diclofenac (10.2%) and ephedrine (9.8%) and the most common combination was theophylline + ephedrine (18.2%). The therapeutic classes acting on cardiovascular system (36.8%) and musculoskeletal system (27.8%) were the most frequent in all PHDDIs. The occurrence of IMPPs was more frequent among users of polypharmacy among those undergoing hospitalization and with a greater number of medical visits, but only polypharmacy remained independently associated with the event (OR = 4.49, 95% CI 2.93 to 6.87). In multivariate analysis, the chance of exposure to PHDDIs were lower among those with one or two chronic conditions investigated, compared to those without these conditions. The study have a contribution relevant to improving quality of prescribing, integrating the efforts to strengthen pharmacovigilance actions, especially in the elderly population, where the risk the use of medicines are exacerbated by physiological problems own aging. Also, come help fill the lack of scientific literature on the topic in elderly populations residing in the community, in a distinctive setting of the health service, especially the hospital.

Made available in DSpace on 2015-10-23T12:45:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 thiago_pinto_ioc_mest_2013.pdf: 2486105 bytes, checksum: 868a236b9a638adc77cfb2312e1f391d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A indução da via de interferon (IFN) do tipo I (IFN-\03B1 e -\03B2) é crucial para uma resposta protetora contra infecções virais. Entretanto, estudos recentes demonstraram que esta classe de IFNs tem a ativação mediada por receptores citoplasmáticos de DNA e regula negativamente a resposta protetora contra a infecção por bactérias intracelulares, com destaque para o Mycobacterium tuberculosis, criando um nicho favorável para a replicação micobacteriana. Um estudo anterior do nosso grupo, utilizando uma abordagem de expressão gênica global por microarranjos, demonstrou que a infecção de células de Schwann com Mycobacterium leprae induz genes ativados por IFN do tipo I, com destaque para o gene OASL, o qual codifica a proteína 2\2019 5\2019 oligoadenilato sintetase like. No presente estudo, esses resultados foram estendidos e validados utilizando o modelo de macrófagos derivados de célulasTHP-1. Nossos dados demonstram que a OASL foi induzida por M. leprae vivo, mas não M. bovis BCG ou M. leprae morto. Adicionalmente, a transfecção de DNA de M. leprae, mas não de RNA, induziu a produção de OASL. Em nosso modelo, a infecção por M. leprae não foi capaz de induzir a produção de IFN-\03B1, assim como o tratamento CpG não induziu OASL, excluindo assim a sinalização de DNA mediada por TLR9 Além disso, mostramos evidências da permeabilização fagossomal mediada pelo fator de virulência micobacteriano ESAT-6, a qual permite acesso do conteúdo do fagossomo ao citoplasma e, consequente, produção de IFN-\03B2. O bloqueio farmacológico de TBK1 foi capaz de inibir a produção de OASL mediada pela infecção com M. leprae, indicando, dessa forma, que a indução de IFN-\03B2 e seus genes a jusante, como o OASL, ocorre através do eixo de sinalização STING/TBK1/IRF3. Interessantemente, o silenciamento gênico de OASL resultou na redução da viabilidade intracelular do M. leprae juntamente com redução da liberação da quimiocina CCL2/MCP-1 induzida por M. leprae. Entretanto, a transfecção de DNA seguida por infecção com M. bovis BCG foi capaz de reverter o fenótipo avirulento dessa bactéria, aumentado sua viabilidade intracelular e induzindo altos níveis de CCL2/MCP-1. Dessa maneira, nossos dados sugerem que a ativação da via de IFN tipo I é, de fato, capaz de inibir a reposta protetora do hospedeiro contra micobactérias, criando um ambiente favorável para a sobrevivência da micobactéria no ambiente intracelular, representando assim um potencial alvo para intervenções farmacológicas e/ou prevenção / The induction of interferon pathway (IFN) type I (IFN - α and - β ) is crucial for a protective response against viral infections. However, emergent research has shown that type I IFNs and cytoplasmic DNA signaling ar e negative regulators of the protective response against infection by in tracellular bacteria, such as Mycobacterium tuberculosis , and provide a favorable niche for mycobacterial replication. Recently, using an approach of global gene expression by microar r ay, our group showed that Schwann cells infection with Mycobacterium leprae induced genes activated by IFN type I, highlighting the OASL gene, which encodes the 2 '5' oligoadenylate synthetase like protein. In the present work , these results were extended and validated using the THP - 1 - derived macrophages m odel . Our data demonstrate that OASL and type I IFN pathway was upregulated by M. leprae , but not M. bovis BCG or dead M. leprae , in macrophage - like THP - 1 infected cells. In addition, M. leprae DNA transfection but not RNA, was able to induce OASL production . In our model, M. leprae infection was not able to induce IFN - α and OASL was not induced by CpG, therefore excluding a TLR9 dependent pathway. Furthermore, we show evid ence of fagossomal permeabilization mediated by mycobacterial virulence factor ESAT - 6, which enables access of contents of the phagosome to host cytoplasm and subsequent induction of IFN - β. Pharmacological blockag e of TBK1 was able to inhibit M. leprae - ind uced OASL mRNA expression, indicating thereby that the IFN - β induction and its downstream genes, such as OASL occur through the STING/TBK1/IRF3 pathway . Interestingly, OASL targeted silencing directly decreased intracellular M. leprae survival and impaired the CCL2/MCP - 1 secretion. Furthermore, M. leprae DNA transfection followed by infection with M. bovis BCG has reverted the avirulent infection phenotype of this mycobacteria, increasing its intracellular viability and inducing high levels of CCL2/ MCP - 1. Together , these results suggest that OASL plays an important role in the response to mycobacteria and provide a potential pharmacological target for prevention or intervention

Made available in DSpace on 2015-11-18T13:18:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 andres_quesne_ioc_mest_2014.pdf: 2284982 bytes, checksum: 60f23c8536661b9357f727cee49ed7ee (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Giardia intestinalis (G. intestinalis) é o parasita gastrointestinal mais comum que coloniza o trato intestinal humano onde permanece extracelular e aderido às células intestinais. O parasita tem uma distribuição mundial, causando um número estimado de 2.8x108 casos por ano e recentemente a doença foi incluída como parte da Iniciativa das Doenças Negligenciadas da Organização Mundial de Saúde. As manifestações clínicas da giardíase são variáveis, e vão desde a ausência de sintomas até diarreias agudas ou crônicas. Adicionalmente, estudos recentes indicam que distúrbios gastrintestinais funcionais, tais como a síndrome do intestino irritável, e o déficit de crescimento em crianças podem ser associados com a infecção por G. intestinalis. Apesar da alta prevalência e das consequências desta doença, os mecanismos fisiopatológicos subjacentes na giardíase ainda permanecem incompreendidos. Os trofozoítos causam a doença sem penetrar no epitélio intestinal, nem entrar na corrente sanguínea e sem secretar nenhuma toxina conhecida. Nos últimos anos, tem sido descrito que as vesículas extracelulares podem participar na interação parasita-célula hospedeira. As vesículas extracelulares podem ser: microvesículas (MVs) e derivadas da membrana plasmática; exosomos, pequenas vesículas originadas a partir de membranas de endossomos; e corpos apoptóticos contendo material do núcleo celular. As MVs têm sido mostradas como importantes fatores na interação parasita-célula hospedeira No presente trabalho, foi utilizada uma combinação de metodologias, incluindo citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, proliferação celular, análises de proteoma e ensaios de aderência celular para investigar o papel das microvesículas liberadas por trofozoítos de G. intestinalis nas propriedades patogênicas deste parasita. Demonstramos que G. intestinalis produz e secreta microvesículas com exposição superficial de fosfatidilserina. Além disso, o processo de liberação de MVs é dependente do tempo e da concentração de cálcio, envolve microdomínios de membrana e as microvesículas contêm RNA de baixo peso molecular. Observamos também que os microdomínios de membrana estão envolvidos na adesão do parasita à células Caco-2. Nossa análise proteômica preliminar sugere presença de componentes do citoesqueleto, alfa giardinas, enzimas metabólicas e proteínas variáveis de xi superfície (VSP) nas MVs isoladas de G. intestinalis. Foi demonstrado também que as MVs de G. intestinalis interagem com as células do hospedeiro aumentando a proliferação destas e incrementado também o número de trofozóitos aderidas à estas células. O presente estudo é o primeiro a sugerir um papel potencial para as microvesículas de G. intestinalis na colonização do hospedeiro. Uma melhor compreensão do papel das MVs liberadas pelo parasita na interação com a célula hospedeira poderá fornecer novas perspectivas sobre patogênese e possivelmente novas ferramentas para o diagnóstico e a terapia da doença / Giardia intestinalis ( G. intestinalis ) is the most common gastrointestinal parasite that colonizes the human intestinal tract where it remains extracellular and adheres to intestinal cells . The parasite has a global distribution causing an estimated 2.8x10 8 cases per year and the illness was recently included in the World Health Organization Neglected Disease Initiative . Clinical manifestations of giardiasis are quite variable, and range from the absence of symptoms to acute or chronic diarrhea. Aditionally, r ecent studies indicate that functional gastrointestinal disorders , such as irritable bowel syndrome , and failure of children to thrive can be associated with G. intestinalis infection . Even though the high prevalence and consequences of this disease , pathophysiological mechanisms underlying symptomatic giardiasis remain incompletely understood . Trophozoites cause disease without penetrating the intestinal epithelium , entering the bloodstream or secreting toxin s . In recent years it has been described that extracellular ves icles could participate in parasite - host cell interaction. The extracellular vesicles ma y be: microvesicles (MVs) and derived f rom the plasma membrane; exosome s, small vesicles originated from endosomal limiting membrane ; and apoptotic bodies containing nuclear material. MVs have been shown to be important factors in the parasite - host cell in teraction. Here, we used a combination of methodologies including flow cytometry, fl u orescence microscopy, cell proliferation, proteomics analysis and cell adherence assays to investigate the role of released microvesicles from G. intestinalis trophozoites on the pathogenic properties of this parasite . We have found that G. intestinalis produces and secretes microvesicles with superficial exposition of phosphatidilserine. Additionally , the shedding process was calcium and time - dependent , involve s membrane microdomains and the microvesicles contain low - molecular weight RNA . We also observed that membrane microdomains are involved in parasite attachment to Caco - 2 cells. Our preliminary proteomic analysi s suggested the presence of cytoskeleton components, alpha giardins, metabolic enzymes and variant - specific surface protein ( VSP ) in the isolated MVs from G. intestinalis. We demonstrate that G. intestinalis microvesicles interact with host cells xiii increasing their prolifer ation and augment ing the number of trophozoites adhered t o these cells . The present study is the first to suggest a potential role for G. intestinalis microvesicles in host cell colonization. A better understanding of the role of the released microvesicles by the parasite on the host - cell interaction will provide insights into pathogenesis and possibly new tools for diagnosis and therapy

Made available in DSpace on 2016-02-26T13:34:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 francisco_junior_ioc_mest_2007.pdf: 5291215 bytes, checksum: 88ec236330fd3ac74ad110315d9ceb1b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A capacidade do Trypanosoma cruzi de reconhecer moléculas na superfície de células fagociticas e não-fagociticas profissionais é essencial para sua sobrevivência no hospedeiro vertebrado. O papel de proteoglicanos sulfatados no processo de reconhecimento celular tem sido relatado em muitos patógenos humanos, incluindo o T. cruzi. Dados do nosso grupo demonstraram a participação de proteoglicanos de heparam sulfato (PGHS) de cardiomiócitos na invasão por formas tripomastigotas. Entretanto, a estrutura da molécula de PGHS envolvida na interação receptor-ligante e o papel de outros glicosaminoglicanos (GAGs) sulfatados no processo de invasão ainda não foram elucidados. Para avaliar a participação dos GAGs na invasão do T. cruzi, tripomastigotas, clone Dm28c, foram pré-tratados com 20µg/ml de heparina, queratam sulfato (KS) ou três fragmentos distintos de heparam sulfato (HS), os quais foram obtidos por tratamento enzimático (heparitinase I e II) e ácido nitroso. Nos ensaios de competição, os parasitas controles ou pré-tratados com GAGs solúveis foram incubados por 2hs a 37°C com culturas de cardiomiócitos e o percentual de infecção foi determinado após coloração pelo Giemsa. Nossos resultados revelaram uma inibição significante no índice de infecção de 84,8% e 45% após tratamento dos parasitas com heparina e com o fragmento N-acetilado/N-sulfatado (NA/NS), respectivamente, sugerindo o importante papel do domínio ([IdoUA-GlcNAc]-[GlcUA-GlcNS]3-[GlcUA-GlcNAc]4[GlcNAc]), da cadeia de HS no reconhecimento T. cruzi-cardiomiócito. Em contraste, o tratamento dos parasitas com KS, fragmento N-acetilado ou N-sulfatado não apresentou efeito no processo de invasão. O papel da sulfatação no processo de reconhecimento e invasão foi avaliado pelo tratamento de culturas de cardiomiócitos por 16hs a 37°C com diferentes concentrações de clorato de sódio e posteriormente, infectados com tripomastigotas (2hs)... (...) O declínio da sulfatação resultou na redução (dose dependente) do índice de infecção, alcançando níveis de inibição de 26%, 48,5% e 73,6% após o tratamento de cardiomiócitos com 25 mM, 50 mM e 75 mM de clorato de sódio, respectivamente, sugerindo a participação da carga negativa como moduladora do reconhecimento específico com o domínio NA/NS da cadeia de HS. Adicionalmente, ensaios bioquímicos foram realizados para caracterizar a proteína de ligação a heparina presente na superfície do T. cruzi. Duas bandas majoritárias de 65,8 kDa e 59 kDa foram identificadas no extrato protéico total das 3 formas evolutivas do T. cruzi por Western blotting, utilizando heparina, condroitim sulfato (CS) e HS conjugados a biotina. O ligante de heparina de T. cruzi foi isolado pela associação do método do Triton X-114 e cromatografia de afinidade a heparina-Sepharose. Após marcação metabólica (35S-Metionina), as proteínas hidrofóbicas foram isoladas em coluna de afinidade e separadas por SDS-PAGE, revelando um perfil protéico, similar ao extrato total, com duas bandas majoritárias (65,8 kDa e 59 kDa) eluídas com 0,5 M e 1,0 M de NaCl em tripomastigotas e epimastigotas, respectivamente. A análise isotópica também revelou uma expressão superior deste ligante (1,3-2 vezes) em tripomastigotas quando comparado com epimastigotas. As proteínas de ligação a heparina (65,8 kDa e 59 kDa) foram detectadas na fração de membrana de epimastigotas obtida pelo método de fracionamento subcelular associado a purificação em coluna de afinidade. A detecção das proteínas eluídas da coluna de afinidade a heparina por Western blotting com heparina-, HS- e CS-biotinilados revelou intensa marcação principalmente na proteína de 59 kDa. Além disso, a análise das proteínas por eletroforese não desnaturante revelou a presença de duas bandas nas formas tripomastigotas e epimastigotas de T. cruzi... (...) Ensaios bioquímicos complementares serão realizados a fim de obter informações detalhadas sobre a proteína de ligação a heparina de T. cruzi. / The ability of Trypanosoma cruzi to recognize molecules at the surface of both the phagocytic and non-phagocytic cells is essential to its survival in the vertebrate host. The role of the sulfated proteoglycans in the cell reco gnition process has been reported in several human pathogens, including T. cruzi . Data from our group have demonstrated the participation of heparan sulfated proteoglycan (HSP G) of cardiomyocytes in the invasion for forms trypomastigotes. However, the structure of th e HSPG molecule involved in the receptor-ligand interaction and the role of other s ulfated glycosaminoglycans (GAGs) in the invasion process have not been elucidated yet. To evaluate the participation of GAGs in T. cruzi invasion, trypomastigotes, clone Dm28c, were pre-treated with 20μg/ml of heparin, ke ratan sulfate (KS) or three distinct fragments of heparan sulfate (HS) obtained by enzym atic (heparitinase I and II) and nitrous acid treatments. For competition assays, the untrea ted or soluble GAGs pre-treated parasites were incubated for 2h at 37°C with the ca rdiomyocyte cultures and the percentage of infection was determined after Giemsa staining. Our results revealed a significant inhibition of the infection index of 84.8% and 45% after treatment of the parasites with heparin and the N-acetylated/ N-sulfated fragment, respectively, suggesting the important role of the ([IdoUA-GlcNAc]-[GlcUA-GlcNS] 3 -[GlcUA-GlcNAc] 4 [GlcNAc]) domain of the HS chain in the T. cruzi -cardiomyocyte recognition. In contrast, the treatm ent of the parasites with KS, N- acetylated or N-sulfated fragments did not display any effect in the invasion process. The role of sulfation in the recognition and invasion p rocess was evaluated by treating the cardiomyocytes cultures for 16h at 37°C with differ ent concentrations of sodium chlorate, followed by trypomastigotes infection (2h). The dec line of sulfation resulted in the reduction (dose dependent) of the infection index, achieving inhibition levels of 26%, 48.5% and 73.6% after treatment of cardiomyocyte cultures with 25mM , 50mM and 75mM of sodium chlorate, respectively, suggesting the participation of negat ive charge as modulator of the specific recognition with the NA/NS domain of HS chain. Additionately, biochemical assays were performed to characterize the heparin binding protein present at the surface of T. cruzi . Two major protein bands of 65.8 kDa and 59 kDa were identified in the total protein extract of all evolutive forms of T. cruzi by Western blotting , using biotin conjugated-heparin, -chondroitin sulfa te (CS) and -HS. The T. cruzi heparin ligand was isolated by association of Triton X-114 extraction method and heparin-Sepharose affinity chromatography. After metabolic labeling ( 35 S-Methionine), the hydrophobic proteins were isolated by affinity column and separated by S DS-PAGE, revealing a protein profile, similar to total protein extract, with two major ba nds (65.8 kDa and 59 kDa) eluted with 0.5M and 1M NaCl in trypomastigotes and epimastigotes, r espectively. The isotopic analysis also revealed a higher expression of heparin ligand (1.3 -2X) in trypomastigotes when compared to epimastigotes. The heparin binding proteins were detected at membrane fraction of epimastigotes obtained by cell fractionation method ology associated to the affinity column purification. The detection of proteins eluted from heparin affinity column with biotinilated heparin, CS and HS by Western blotting revealed intense labeling mainly at the 59 kDa protein. In addition, the analysis of the proteins by denaturant electrophoresis revealed the presence of two protein band in both trypomastigote s and epimastigotes forms of T. cruzi . Complementary biochemical assays will be carried ou t to get more detailed information about the T. cruzi heparin binding protein.

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:16:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 ellen_altoe_ioc_mest_2013.pdf: 1397353 bytes, checksum: 107b103e24982f28206bdb6e9749cd60 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A gp63, metalopeptidase altamente abundante na superfície de Leishmania, contribui para uma infinidade de funções bem estabelecidas na interação deste parasito com o hospedeiro mamífero. No entanto, apesar desta molécula ser abundantemente expressa na superfície das formas promastigotas, encontradas no inseto vetor, pouco é conhecido sobre as funções desempenhadas por essa metalopeptidase no flebotomíneo. Nosso grupo de pesquisa, utilizando abordagens bioquímicas, tem demonstrado que moléculas de gp63 de vários tripanosomatídeos não patogênicos ao homem estão implicadas na adesão ao intestino de insetos hospedeiros. Aqui, nós analisamos o papel da gp63 na interação de Leishmania braziliensis e Leishmania infantum, com os seus respectivos insetos hospedeiros, Lutzomyia intermedia e Lu. longipalpis e com a linhagem celular derivada de Lu. longipalpis (LL5). Os intestinos dissecados de insetos foram prétratados ou não com o fosfoglicano (PG) puro derivado do lipofosfoglicano e colocados para interagir com os parasitos. Em paralelo, promastigotas de L. braziliensis e L. infantum foram pré-tratados com anticorpo anti-gp63 ou com inibidores da metalopeptidase. Depois disso, os parasitos foram colocados para interagir com os intestinos dissecados de insetos ou com as células LL5 Como esperado, o PG praticamente elimina a capacidade dos parasitos de se ligarem ao intestino dos insetos. Todos os tratamentos relacionados com a gp63 também provocaram uma diminuição acentuada nestes ensaios de ligação. Além disso, o sobrenadante de cultura de L. braziliensis foi concentrado por precipitação com sulfato de amônio e analisado por SDS-PAGE e SDS-PAGE-gelatina. Observamos uma degradação proteolítica, por volta de 63 kDa, que corresponde à enzima gp63 já identificada e caracterizada em várias espécies de Leishmania. Esses resultados em conjunto demonstram uma possível participação da gp63 na interação com o inseto vetor e nos estimulam a continuar estudando o papel dessa metalopeptidase no ciclo de vida de Leishmania / The highly abundant surface metallopeptidase of Leishmania, gp63, contributes to a myriad of well-established functions in the interaction of this parasite with the mammalian host. However, despite this molecule being abundantly expressed on the surface of promastigote forms, found in the insect vector, little is known about the functions performed by this metallopeptidase in the phlebotomine. Our research group, using biochemical approaches, has demonstrated that gp63 molecules from several not pathogenic trypanosomatids to man are implicated in the adhesion to guts of insect hosts. Here, we analyzed the role of gp63 in the interaction of Leishmania braziliensis and Leishmania infantum with their respective insect hosts, Lutzomyia intermedia and Lu. longipalpis and with the cell line derived from Lu. longipalpis (LL5). The dissected insect guts were pretreated or not with purified phosphoglycan (PG) derived from the lipophosphoglycan and placed to bind with the parasites. In parallel, promastigotes of L. braziliensis and L. infantum were pretreated with anti-gp63 antibodies or with metallopeptidase inhibitors. Thereafter, the parasites were placed to interact with dissected insect guts or with the LL5 cells. As expected, PG virtually eliminates parasites ability of bind to the insect guts. All treatments related to gp63 also provoked a pronounced decrease in these binding assays. Moreover, the culture supernatant of L. braziliensis was concentrated by precipitation with ammonium sulfate and analyzed by SDS-PAGE and SDS-PAGE-gelatin. We observed a proteolytic degradation around 63 kDa, which corresponds to the gp63 enzyme already identified and characterized in several Leishmania species. These results together demonstrate a possible role of gp63 in the interaction with the insect vector and stimulate us to continue studying the role of this metallopeptidase in the life cycle of Leishmania.

Submitted by Gilvan Almeida (gilvan.almeida@icict.fiocruz.br) on 2016-10-11T17:37:06Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 72047.pdf: 2371893 bytes, checksum: 77f3735b9ff714c38d542ea95b2fc9b8 (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-10-17T13:57:42Z (GMT) No. of bitstreams: 2 72047.pdf: 2371893 bytes, checksum: 77f3735b9ff714c38d542ea95b2fc9b8 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-17T13:57:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 72047.pdf: 2371893 bytes, checksum: 77f3735b9ff714c38d542ea95b2fc9b8 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A esquistossomose mansônica ainda constitui um grave problema de saúde pública no Brasil e, portanto, o conhecimento dos diversos aspectos da interação Schistosoma mansoni-Biomphalaria, são pertinentes e relevantes como subsídios à medidas de controle e prevenção desta parasitose. Estudos in vitro têm mostrado que a suscetibilidade dos hospedeiros intermediários de S. mansoni, Biomphalaria straminea e Biomphalaria glabrata está relacionado à presença de lectinas. Importante transmissor da Esquistossomose no Brasil, B. straminea apresenta baixos índices de infecção em condições experimentais. Apesar disto, existem poucos estudos a respeito das características morfológicas e do comportamento in vitro dos hemócitos deste molusco frente à infecção por S. mansoni. Com o objetivo de caracterizar a resposta hemocitária de B. straminea (cepa Souza-PB) expostas a miracídios de S. mansoni, os moluscos foram expostos em massa e expostos individualmente a cinco miracídios. Exemplares de B. glabrata foram utilizadas como controle positivo. A hemolinfa foi coletada, corada em Azul de Tripan e os hemócitos foram contados em câmara de Neubauer. Alguns hemócitos foram colocados em placa de cultura para observação da interação das células com os parasitos e outros foram submetidos à marcação por lectinas fluoresceinadas de Griffonia simplicifolia e Lens culinaris conjugadas a FITC. As imagens foram obtidas e gravadas através de microscópio AxioObserver e câmera McR5 Zeiss. Os moluscos expostos em massa foram sacrificados logo após a penetração inicial do parasito (0 minuto), 24, 48, 72 horas e 30 dias após exposição (dpe) Moluscos expostos a cinco miracídios foram mortos após 0, 15, 30 e 45 minutos de exposição. Os órgãos foram fixados em formalina Millonig de Carson, incluídos em parafina e corados em HE. Após a exposição em massa verificou-se um aumento de 496,37% de células na hemolinfa de B. straminea e de 230,29% na hemolinfa de B. glabrata logo após a penetração dos miracídios. Na exposição por cinco miracídios houve um aumento de 78,14% de células na hemolinfa de B. straminea e de 36,36% na hemolinfa de B. glabrata logo após a penetração dos miracídios. A maioria das células encontradas na hemolinfa eram células blásticas e seu diâmetro foi em torno de 6\03BCm para B. straminea e 7\03BCm para B. glabrata. Hemócitos de B. straminea exibiram marcação mais intensa para lectina de G. simplicifolia nos tempos iniciais após a exposição, enquanto que aos 30 dias dpe as células estavam mais positivas para L. culinaris. Na análise histológica dos tempos iniciais, não foram observadas reações celulares nem parasitos mortos nos tecidos de ambos os hospedeiros. Entretanto, B. glabrata apresentou esporocistos secundários na região da massa cefalopediosa aos 30 dias após a infecção. Concluímos que a resistência de B. straminea está associada a modulação de lectinas expressas nos hemócitos. Além do mais, verificamos que as células blásticas, as células precursoras de outros hemócitos, são as mais abundantes nos dois hospedeiros estudados / Schistosomiasis still remain as an important parasitic disease under the public health point of view. Thus, studies that involve the interaction between Schistosoma mansoni-Biomphalaria are pertinent and useful to the disease prevention and control. In vitro studies have shown that the susceptibility of Biomphalaria straminea and Biomphalaria glabrata, intermediate hosts of Schistosoma mansoni, is related to the presence of lectins. As an important carrier of schistosomiasis in Brazil, B. straminea presents low infection rates under laboratory conditions. Despite of that, there are few studies regarding the morphological features and in vitro behavior of this mollusc's haemocytes challenged by S. mansoni miracidia. For this purpose, we analyzed the haemocyte response of B. straminea (Sousa \2013 PB strain) challenged by the parasite, so the molluscs were put under mass exposure and individual exposure to five miracidia. B. glabrata molluscs were used as positive controls. The molluscs had their haemolymph drawn, the haemocytes were stained in Trypan Blue and counted in Neubauer chamber. Some haemocytes were put into cell culture plates in order to observe the interaction between the cells and the parasites and other cells were stained by FITC conjugated lectins from Griffonia simplicifolia and Lens culinaris. The images and films were made at the microscope AxioObserver with McR5 camera from Zeiss. The mass exposed molluscs were killed at 0 minutes (first penetration of the miracidia), 24, 48, 72 hours and 30 days after exposure (dae) and the five miracidia exposed molluscs were killed after 0, 15, 30 and 45 minutes The organs were fixed in Carsons's Millonig Formalin, embedded in paraffin and stained with Hematoxylin and Eosin. After mass exposure, an increase of 496,37% in the haemolymph cells from B. straminea and an increase of 230,29% in the haemolymph cells from B. glabrata right after the miracidia penetration was observed. Most cells observed were blast cells and their diameter was 6\03BCm for B. straminea and 7\03BCm for B. glabrata. In the histological analysis of the earlier times, there were no cell reactions nor dead parasites found as the result of the exposure in both hosts tissues. Whereas at 30 dae B. glabrata shown parasites in its cephalopedal region. B. straminea haemocytes showed an intense staining for G. simplicifolia at the initial times of the exposure whereas 30 dae the cells were positive for L. culinaris lectin. Our conclusion is that B. straminea resistance to S. mansoni is associated with lectin modulation expressed by haemocytes and the fast response to miracidial penetration. Furthermore, we have seen that blast cells, precursor cells that origin other types of haemocytes, are more plentiful among both hosts studied

GOUVEIA, Daniel Xavier. Estudo de compostos lamelares contendo Fe usando Espectroscopia Mössbauer de 57Fe e técnicas complementares. 2006. 119 f. Tese (Doutorado em Física) - Programa de Pós-Graduação em Física, Departamento de Física, Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2006. / Submitted by Edvander Pires (edvanderpires@gmail.com) on 2015-05-05T20:52:57Z No. of bitstreams: 1 2006_tese_dxgouveia.pdf: 8355694 bytes, checksum: 26ff8e3ed6ee26b0d1972a7024528620 (MD5) / Approved for entry into archive by Edvander Pires(edvanderpires@gmail.com) on 2015-05-07T14:58:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_tese_dxgouveia.pdf: 8355694 bytes, checksum: 26ff8e3ed6ee26b0d1972a7024528620 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-07T14:58:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_tese_dxgouveia.pdf: 8355694 bytes, checksum: 26ff8e3ed6ee26b0d1972a7024528620 (MD5) Previous issue date: 2006 / The structural and thermal decomposition properties of Mg-Fe and Co-Cu-Fe hy- drotalcites (HT) have been studied through thermogravimetric analysis, X ray powder difraction (XRD), Fourier transform infrared spectroscopy and 57Fe Mössbauer spec- troscopy. In the Mg-Fe system, the destruction of the layered structure took place at about 300 oC. The broad peaks observed in the X ray difractograms suggests that the resultant oxides constitute a solid solution. For samples treated at temperatures higher than 500 oC the formation of the MgO and MgFe2O4 formation of the MgO and MgFe2O4 spinel phases is observed. 57Fe Mössbauer spectroscopy was employed to monitor the Fe chemical environment for the samples annealed at diferent temperatures (100-900 oC). In situ XRD experiments revealed that the HTs start an interlayer contraction at about 180 oC. This phenomenon is identified as being due to a grafting process for which the interlamellar anions attach to the layers through a covalent bond. The reconstruction of the Mg-Fe HTs was also investigated and its eficiency depends on the thermal anneal- ing temperature and on the Mg/Fe ratio. The structure of the reconstructed samples was found to be exactly the same as the parent structure. The in situ 57Fe Mössbauer experiments were performed in the 100-500 oC temperature range confirm an increasing structural disorder in this temperature range. The quadrupolar splitting indicates that the maximum disorder occurs at 300 oC. Regarding the Co-Cu-Fe ternary system we have observed that due to the strong Jahn-Teller effect the Cu-Fe layered system is stabilized only in the presence of Co2+. At low Co2+ contents, additional phases are segregated in the solids. X ray patterns diffraction show the presence of Cu(OH)2 and CuO. The decomposition process was investigated by in situ X ray, in situ Mössbauer and FTIR experiments. By increasing the temperature from 25 oC up to 180 oC we observed that the structural disorder increases. This effect has been likely attributed to the Co2+ to Co3+ oxidation since thermal decomposition was carried out under static air atmosphere. Part of the Co3+ cations could migrate to the interlayer region, thus forming a metastable compound that still has a layered structure. Collapse of the layered structure was ob- served at about 200 oC. By further increasing the temperature the system becomes more crystalline and the formation of Co3O4 is observed in the X ray patterns. In Cu-rich HT, some of the carbonate anions are released at temperatures higher than 550 oC and this phenomenon is attributed to the formation of a carbonate-rich phase. The specific surface area data present its highest values in the temperature range where the collapse of the layered structure takes place. / As propriedades estruturais e de decomposição térmica das hidrotalcitas Mg-Fe e Co-Cu-Fe foram estudadas através de espectroscopia Mössbauer de 57Fe, análise termo- gravimétrica, difração de raios X, e espectroscopia de absorção no infravermelho (FTIR). No sistema Mg-Fe a destruição da estrutura lamelar ocorre em torno de 300 oC. O alargamento dos picos de difração de raios X observados nos difratogramas sugerem que os óxidos resultantes constituem uma solução sólida. Para as amostras tratadas em temperaturas maiores do que 500 oC a formação de fases do tipo MgO e MgFe2O4 é observada. A espectroscopia Mössbauer de 57Fe foi empregada para monitorar o ambiente químico do Fe na faixa 100-900 oC de temperatura. As medidas in situ de difração de raios X revelam que em 180 oC inicia-se uma contração interlamelar. Este fenômeno é atribuído ao processo de “grafting" no qual os ânions interlamelares ligam-se nas camadas através de uma ligação covalente. A reconstrução estrutural da hidrotalcita Mg-Fe também foi investigada. A eficiência da reconstrução estrutural depende da temperatura de tratamento e da razão molar Mg/Fe. A estrutura das amostras reconstruídas são as mesmas da amostra inicial. As medidas in situ de espectroscopia Mössbauer de 57Fe foram realizadas na faixa 100-500 oC confirmaram uma desordem estrutural crescente nesta região de temperaturas. Os valores do desdobramento quadrupolar indicam que o máximo de desordem ocorre em 300 oC. Com relação ao sistema ternário Co-Cu-Fe observamos que devido ao efeito Jahn-Teller o sistema Cu-Fe somente é estabilizado na presença de Co2+. Para baixas concentrações Co2+ fases adicionais segregadas são observadas nos sólidos. Os padrões de difração de raios X indicam a presença de Cu(OH)2 e CuO. O processo de decomposição térmica foi investigado através de difração de raios X, espectroscopia Mössbauer de 57Fe in situ e de espectroscopia de absorção no infravermelho (FTIR). Aumentando a temperatura de tratamento térmico das amostras de 25 oC a 180 oC observamos um aumento da desordem estrutural. Este efeito tem sido atribuído a oxidação Co2+ para Co3+ uma vez que a decomposição foi realizada ao ar. Parte dos cátions Co3+ migram para a região interlamelar formando um composto metastável que ainda possui uma estrutura lamelar. O colapso da estrutura lamelar é observado a 300 oC. Com o aumento posterior da temperatura o sistema torna-se mais cristalino e a formação de Co3O4 é observada através do ensaio de raios X. Nas hidrotalcitas com maior teor de Cu, alguns dos ânions carbonato são liberados somente acima de 550 oC sendo este fenômeno atribuído a formação de uma fase rica em carbonato. Os valores de área superficial específica apresentam um máximo na faixa de temperatura onde ocorre o colapso da estrutura lamelar.

MARTINS, Suzana Cláudia Silveira. Facilitação como atenuante do estresse ambiental entre populações microbianas imobilizadas. 2012. 189 f. Tese (Doutorado em ecologia e recursos naturais)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-05-31T17:27:06Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_scsmartins.pdf: 5457872 bytes, checksum: 8169a45e08494d7c4b0b2803f726ecf2 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-05-31T22:33:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_scsmartins.pdf: 5457872 bytes, checksum: 8169a45e08494d7c4b0b2803f726ecf2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-31T22:33:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_scsmartins.pdf: 5457872 bytes, checksum: 8169a45e08494d7c4b0b2803f726ecf2 (MD5) Previous issue date: 2012 / The attenuating influence of facilitate or positive interactions between immobilized and associated microbial populations under environmental stresse conditions is the main objective of this study. In this perspective, five chapters were developed. The first shows the state of the art of microbial immobilization, importance of facilitating interactions between species under environmental stress and cell immobilization as a tool to increase the efficiency of treatment of toxic pollutants in industrial wastewaters. In the second chapter was defined the type of polyurethane foam and the culture medium to be used for natural immobilization. In the third, qualitative and quantitative tests were conducted for selection of environmental microbial strains with potential for cell adhesion. The fourth chapter consisted of the evaluation of the effect of environmental stress on microbial populations immobilized in monoculture. In the fifth and last chapter, the selected microbial strains were immobilized in consortium and tested the effect of a physiological stress on the adaptive value of microbial populations, indicative of the predominant type of interaction between the species. The potential of strains for biotransformation processes of toxic chemical pollutants was also investigated. The results showed polyurethane foam of 23 kg/m3 immersed in Luria-Bertani broth diluted ten fold, as appropriate for cell retention of about 107 cells of Pseudomonas aeruginosa ATCC 25619. Among environmental microbial strains the Serratia marcescens bacterium and the yeast C. rugosa showed better adhesion potential. Individual microbial cells immobilized on polyurethane foam were more resistant to phenol than the respective cell suspensions. When associated, the two strains showed better adaptive value in the presence of phenol, compared to the same cells immobilized in individual cultivation, proving the prevalence of facilitative interactions between microbial populations. / A facilitação como atenuante do estresse ambiental, resultante de atividades antrópicas, entre populações microbianas imobilizadas, é o principal objetivo do presente estudo, que foi dividido em cinco capítulos. O primeiro consta do estado da arte sobre imobilização microbiana, importância das interações facilitadoras entre espécies sob estresse ambiental e a imobilização celular como ferramenta para aumentar a eficiência de tratamento de poluentes tóxicos em águas residuárias de origem industrial. No segundo capítulo, foi definido o tipo de espuma de poliuretano e meio de cultura a ser usado para imobilização natural. No terceiro, testes qualitativos e quantitativos foram realizados para seleção de linhagens microbianas ambientais com potencial para adesão celular. O quarto capítulo constou da avaliação do efeito de estresse ambiental sobre populações microbianas imobilizadas em monocultivo. No quinto e último capítulo, as linhagens microbianas selecionadas foram imobilizadas consorciadas e foi testado o efeito de estresse fisiológico, sobre o valor adaptativo de populações microbianas, indicativo do tipo de interação predominante entre espécies. O potencial das linhagens para processos de biotransformação de poluentes químicos tóxicos também foi investigado. Os resultados mostraram a espuma de poliuretano de 23 kg/m3 e caldo Luria-Bertani 1/10 como adequados para retenção de aproximadamente 107 UFC/cm2 células da bactéria Pseudomonas aeruginosa ATCC 25619. Entre as linhagens microbianas de origem ambiental a bactéria Serratia marcescens e a levedura C. rugosa mostraram melhor potencial de adesão. As células dessas culturas, imobilizadas sobre espuma de poliuretano, foram mais resistentes ao fenol que as respectivas células em suspensão. Quando consorciadas, as duas linhagens apresentaram melhor valor adaptativo na presença do fenol, em relação ás mesmas células imobilizadas em cultivo individual, comprovando a prevalência das interaçãoes facilitadoras entre as populações avaliadas.

Acanthamoeba spp. são patógenos protistas de vida livre, capazes de causar ceratite grave e encefalite granulomatosa fatal. Trofozoíto é a forma infectiva de Acanthamoeba spp. e pode provocar infecções em uma variedade de hospedeiros mamíferos e seres humanos, como resultado da complexa interação patógeno-hospedeiro. O dano causado por trofozoítos em infecções da córnea ou do cérebro é o resultado de vários mecanismos patogênicos diferentes não elucidados a nível molecular até agora. Neste trabalho, descrevemos os resultados da caracterização genotípica de isolados ambientais de Acanthamoeba spp. e a identificão por análises proteômicas do repertório de proteínas expressas por trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga. Nossos resultados permitiram a caracterização de 13 isolados ambientais de Acanthamoeba spp. obtidos da água de piscinas, que foram classificados em nível de genótipo com base na análise da sequência do gene da subunidade menor do rDNA. Nove dos 13 isolados foram identificados como pertencentes ao genótipo T5, três ao genótipo T4 e um ao genótipo T3. Vários genótipos têm sido relatados em todo o mundo como agentes causadores de ceratite amebiana, incluindo os genótipos T3, T4 e T5. O presente estudo indica que o genótipo T5 é um contaminante comum na água de piscinas. Este trabalho também estabeleceu uma ampla análise do repertório de proteínas expressas por trofozoítos de A. polyphaga, baseado no conjunto de estratégias por 2-DE MS/MS e LC-MS/MS. Foram identificadas 192 proteínas não redundantes. Um mapa proteômico de referência de A. polyphaga na faixa de pH 3-10 foi produzido e de 370 spots resolvidos, 136 proteínas foram identificadas. A classificação funcional das proteínas revelou diversas proteínas com relevância potencial para a sobrevivência do parasita e infecção de hospedeiros mamíferos, incluindo proteínas de superfície e proteínas relacionadas aos mecanismos de defesa. Este estudo descreveu a primeira análise proteômica abrangente do estágio de trofozoíto de Acanthamoeba spp. e fornece bases para estudos prospectivos, comparativos e funcionais de proteínas envolvidas nos mecanismos moleculares de sobrevivência, desenvolvimento e patogenicidade de Acanthamoeba spp. / Acanthamoeba spp. are free-living protist pathogen, capable of causing a blinding keratitis and fatal granulomatous encephalitis. Trophozoite is the form infective of Acanthamoeba spp. and can provoke infections in a variety of mammalian hosts and humans, as result of complex interaction host-pathogen. The damage caused by trophozoites in human corneal or brain infections is the result of several different pathogenic mechanisms not elucidated at the molecular level so far. Here, we describe the results of the characterization genotypic of environment isolates of Acanthamoeba spp. and we performed proteomic analysis to identify the repertoire of proteins expressed by trophozoites of an environmental strain of Acanthamoeba polyphaga. Our results allowed the characterization of 13 Acanthamoeba isolates from swimming pools water that were classified at the genotype level based on the sequence analysis of the small-subunit rDNA gene. Nine of the 13 isolates were genotype T5, three were genotype T4, and one was T3. Several genotypes have been reported worldwide as causative agents of keratitis, including genotypes T3, T4, and T5. The present study indicates that genotype T5 is a common contaminant in swimming-pool water. This work also established a comprehensive analysis of the proteins expressed by A. polyphaga trophozoites based on complementary 2-DE MS/MS and gel-free LC-MS/MS approaches. Overall, 192 nonredundant proteins were identified. An A. polyphaga proteomic map in pH range 3-10 was produced, with protein identification for 136 out of 370 resolved spots. Functional classification of identified proteins revealed several proteins with potential relevance for parasite survival and infection of mammal hosts, including surface proteins and proteins related to defense mechanisms. This study describes the first comprehensive proteomic survey of the trophozoite infective stage of an Acanthamoeba species, and provides foundations to prospective, comparative and functional studies of Acanthamoeba proteins involved in molecular mechanisms of survival, development, and pathogenicity.