Nous avons étudié la régulation et les fonctions de Cell division cycle 25A (CDC25A), phosphatase impliquée dans l'activation des cyclin-dependent kinases durant le cycle cellulaire, dans les leucémies aiguës myéloïdes portant la mutation de la tyrosine kinase Fms-Like Tyrosine kinase 3 (FLT3) FLT3-ITD, de mauvais pronostic. Nous montrons que CDC25A est une cible précoce en aval de FLT3-ITD, contrairement aux autres protéines du cycle cellulaire, par un mécanisme impliquant STAT5. L'inhibition de CDC25A était à l'origine d'une inhibition de la prolifération et d'une réinduction de la différenciation des cellules primaires ou de lignées FLT3-ITD, in vitro et in vivo, en faisant une cible prometteuse dans les LAM avec la mutation FLT3-ITD. Enfin, nous avons évalué la valeur pronostique de l'expression de CDC25A au niveau ARN messager et protéique sur une série de patients traités au CHU de Toulouse par chimiothérapie intensive. / We studied the regulation and functions of Cell division cycle 25A (CDC25A), a phosphatase involved in the activation of the cyclin-dependent kinases during the cell cycle, in acute myeloid leukemia baring the mutation of the tyrosine kinase Fms-Like Tyrosine kinase 3 (FLT3) FLT3-ITD, which confers adverse prognosis. We show that CDC25A is an early target downstream of FLT3-ITD, contrarily to other cell cycle proteins, by a mechanism involving STAT5. CDC25A inhibition gives rise to inhibition of proliferation and reinduction of differentiation in FLT3-ITD primary cells and FLT3-ITD cell lines, in vitro and in vivo. CDC25A appears as a promising target in FLT3-ITD acute myeloid leukemia. We finally evaluated the prognostic value of CDC25A expression, at the mRNA and proteic level in a series of patients treated by intensive chemotherapy at Toulouse University Hospital.

Chlamydia trachomatis est une bactérie intracellulaire obligatoire. Ce pathogène de l’Homme est la première cause infectieuse de cécité ainsi que de maladies sexuellement transmissible d’origine bacterienne.Utilisant une souche de C. trachomatis L2 exprimant une protéine fluorescente, nous avons développé des méthodes de microscopie et de cytométrie en flux permettant de suivre les différentes étapes du développement de la bactérie. Ces méthodes faciliteront les futures études de l’infection par Chlamydia.Chlamydia interagit avec différents processus cellulaires, et plus particulièrement via la sécrétion d’effecteurs par le système de sécrétion de type 3 (ST3). Nous avons identifié une famille de protéines possédant un signal de ST3 qui partagent un domaine, le DUF582, présent uniquement chez les Chlamydia pathogènes.Nous avons montré que les 5 protéines DUF582 de C. trachomatis sont exprimées à partir du milieu du cycle infectieux. Nous avons démontré que la protéine Hrs interagit avec le DUF582 et que la protéine DUF582 CT619 interagit avec Tsg101. Hrs et Tsg101 sont d’importants composants de la machinerie ESCRT impliquée dans de nombreux processus de fission membranaire.Utilisant l’interférence ARN, nous avons montré que Hrs et Tsg101 ne sont requis ni pour l’entrée, ni pour le développement de la bactérie. Ceci suggère que les protéines DUF582 bloquent des processus dépendant de Hrs/Tsg101. A l’inverse, la bactérie pourrait utiliser la machinerie ESCRT mais l’existence de mécanismes redondants expliquerait l’absence de phénotype dans les expériences d’interférence. Nous discutons trois hypothèses concernant le rôle des protéines DUF582 dans l’infection. / Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular human pathogen. It is the first infectious cause of blindness and the most common cause of sexually transmitted diseases of bacterial origin. Using a strain of C. trachomatis serovar L2 expressing a fluorescent protein we developed microscopy and flow cytometry based methods to quantify several steps of its developmental cycle. These methods will facilitate future studies aimed at testing anti-bacterial compounds or various culture conditions. Chlamydiae interfere with many cellular processes, in particular via the secretion of bacterial proteins through a type 3 secretion (T3S) system. We identified a family of proteins that possess T3S signals. They share a domain designated as DUF582, which is only found in pathogenic chlamydiae. We showed that the five DUF582 proteins of C. trachomatis are expressed from the mid phase of infection. We demonstrated that the protein Hrs is a common interactor for the DUF582. In addition the N-terminal part of the DUF582 protein CT619 interacts with Tsg101. Hrs and Tsg101 are both important components of the ESCRT machinery, which is an ancient machinery required for several processes involving membrane fission.Using RNA interference we showed that Hrs and Tsg101 are dispensable for bacterial entry and growth. This last result suggest that DUF582 proteins actually prevent Hrs and/or Tsg101 driven processes. Alternatively, the bacteria might highjack the ESCRT machinery but redundant mechanisms would explain the absence of phenotype on bacterial development observed in the silencing experiments. We discuss three hypotheses as to the possible role of the DUF582 proteins in infection.

Staphylococcus aureus est capable d’être internalisé par les cellules eucaryotes, notamment au cours des infections osseuses, puis d’induire la mort de la cellule. Deux principaux mécanismes ont été décrits comme associés à la cytotoxicité de S. aureus : l’échappement phagosomal et le détournement de l’autophagie. Nous avons exploré ces deux mécanismes et le rôle de plusieurs toxines staphylococciques majeures (alpha-toxine (Hla), phenol-soluble modulins (PSM), bêta-toxine (Hlb)) dans la mort cellulaire, grâce à un modèle in vitro d’infection intracellulaire et des mutants isogéniques. L’échappement phagosomal nécessitant l’expression d’Hlb, inactivée par l’insertion d’un phage chez la majorité des souches cliniques, nous avons testé l’hypothèse d’une excision de ce phage induite par le stress intracellulaire. Nous avons montré que la restauration de l’expression d’Hlb par excision du phage existe de manière spontanée mais n’est pas induite par le passage intracellulaire et n’est pas associée à une hausse de la cytotoxicité. Dans un second temps, nous avons exploré la cytotoxicité d’une souche de S. aureus hypervirulente et avons montré qu’elle est associée à un détournement de l’autophagie via l’inhibition de la fusion autophagosome-lysosome, ceci étant associé à l’expressions des PSMa. Au contraire, Hla, les PSMß et la d-toxine ne semblent jouer aucun rôle intracellulaire chez les S. aureus hypervirulents. Enfin, nous avons mis en évidence que, dans un autre fond génétique de S. aureus, associé au pied diabétique, la cytotoxicité est principalement liée à la capacité de multiplication intracellulaire de la souche, modulée par la présence d’un phage / Staphylococcus aureus is able to invade eukaryotic cells, in particular during bone infections, and induce cell death. Two mechanisms have been described as associated with S. aureus cytotoxicity: phagosomal escape and autophagy subversion. We investigated these two mechanisms and the respective roles of several staphylococcal toxins, alpha-toxin (Hla), phenol-soluble modulins (PSMs) and beta-toxin (Hlb), in cell death, using an in vitro intracellular infection model and isogenic mutants of S. aureus. Because Hlb is required for phagosomal escape but this toxin is inactivated by a prophage inserted into the hlb gene in most of clinical isolates of S. aureus, we tested the hypothesis of an excision of this phage induced by intracellular stress. We showed that restoration of Hlb expression due to the excision of hlb-converting phage exists spontaneously but is not induced by intracellular environment and does not increase the cytotoxicity of the strain. In a second part, we explored the cytotoxicity of an hypervirulent strain of S. aureus and demonstrated that it is associated with a subversion of host cell autophagy via an inhibition of autophagosome-lysosome fusion, in a PSMa-dependent manner. Conversely, Hla, PSMß and d-toxin appear to have no intracellular role in the cytotoxicity of hypervirulent S. aureus strains. Finally, we showed that, in another genetic background of S. aureus associated with diabetic foot ulcer, cytotoxicity was linked to the ability of intracellular replication of the strain, which was modulated by the presence of a phage

La plupart des processus dans notre vie quotidienne sont des processus hors équilibre. Un exemple de système hors équilibre est la cellule biologique et le transport qui a lieu dedans. Dans cette thèse ce transport intracellulaire est modélisé par des processus stochastiques. Pour cela deux approches différentes ont été utilisées : d’une part une modélisation explicite de particules actives avec des degrés de liberté internes obtenus expérimentalement, d’autre part une description phénoménologique des effets collectifs, qui est réalisée au moyen de processus d’exclusion.Un des résultats principaux pour le modèle explicite est qu’il est crucial de prendre en compte les fluctuations des forces pour reproduire les caractéristiques principales du mou- vement. Un autre élément important est la prise en considération de l’environnement cellu- laire, qui peut produire des effets non-triviaux, comme par exemple une inversion du sens de déplacement moyen. Pour étudier les effets collectifs il est possible de représenter le mou- vement des particules d’une manière simplifiée, en utilisant un processus d’exclusion avec des particules ayant des états internes. Le désordre sur les taux de saut qui en résulte peut provoquer une condensation dépendant de la densité.Un autre modèle étudié est un processus d’exclusion sur un réseau à deux voies. On suppose que deux types de particules se déplacent dans une géométrie tubulaire, inspirée par les champignons filamenteux. Ces hypothèses définissent un modèle minimal qui présente une transition de phase d’une phase de basse densité vers une phase pulsante caractérisée par des oscillations de densité. / Most processes in our daily life are far from equilibrium. The prime example is a cell and the transport occurring within. In this thesis intracellular transport is modeled by means of stochastic processes. For this, two different approaches are applied: the explicit mod- eling of active particles with internal degrees of freedom with characteristics as they were determined experimentally. And secondly, the collective effects occurring in many particle systems are studied in a phenomenological way by means of exclusion processes.In the explicit model one important result is given by the fact that force fluctuations are essential to capture the relevant motion characteristics. Further, the influence of the cellular environment creates counter-intuitive effects, like a possible inversion of the bias. The motion characteristics can be represented in a coarse-grained manner as an exclusion process for particles with internal states. Due to the resulting disorder in the hopping rates a density-dependent condensation occurs.In a second part, a two-lane exclusion model is studied. Two species in a tubular geometry inspired by filamentous fungi are considered.This can be seen as a minimal model exhibiting a phase transition from a low density phase to an intriguing phase with periodically changing particle densities.

La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative progressive et irréversible. Une étape précoce de la MA est la relâche neuronale excessive du peptide amyloïde-[bêta] (A[bêta]), qui s'accumule dans le cerveau, s'assemble et se dépose sous forme de plaques A[bêta] insolubles et neurotoxiques. L'A[bêta] est produit suite au clivage amyloïdogénique de la protéine APP, effectué par les sécrétases [bêta] et [gamma] au niveau des endosomes. Il est bien connu que le trafic intracellulaire de l'APP affecte son clivage. L'étude du trafic intracellulaire de cette protéine est donc cruciale pour comprendre ce qui régit la production d'A[bêta]. Certains membres de la famille des récepteurs de lipoprotéines de faibles densités (LDLR), dont SorLA/LR11, interagissent avec l'APP et modulent son clivage en régulant son trafic et/ou en s'associant avec les sécrétases. LRP10, un nouveau membre peu connu des LDLR, trafique entre le Golgi et les endosomes, tout comme SorLA/LR11. Conséquemment, nous avons émis l'hypothèse selon laquelle LRP10 serait un nouveau récepteur de la protéine APP, impliqué dans la régulation du trafic et du clivage de cette dernière ainsi que dans la relâche d'A[bêta]. Nos résultats démontrent que LRP10 et la protéine APP colocalisent au TGN (trans-Golgi network ) et interagissent de façon directe.La surexpression stable de LRP10 dans les cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y, provoque une accumulation de la forme mature de l'APP, ainsi qu'une diminution de son clivage et de la production d'A[bêta].La déplétion de LRP10, par la technique d'ARN interférant, provoque l'augmentation de la production d'A[bêta]. De plus, l'expression d'un mutant de LRP10, redistribué aux endosomes précoces, induit la redistribution intracellulaire de l'APP au niveau de ces mêmes endosomes dans les cellules HeLa et SH-SY5Y, tel qu'observé en microscopie confocale.La surexpression stable du mutant de LRP10 dans les SH-SY5Y a aussi démontré une augmentation du clivage amyloïdogénique de l'APP normalement effectué aux endosomes et donc une augmentation de la production d'A[bêta]. Enfin, la comparaison des niveaux d'expression protéique de LRP10 retrouvés dans le cortex frontal et l'hippocampe de cerveaux de patients âgés sains ou atteints de la MA, révèle que l'expression de LRP10 est réduit dans le cerveau des patients atteints de la MA. En conclusion, LRP10 est un nouveau récepteur de l'APP participant à son triage entre le TGN et les endosomes, protégeant ainsi l'APP du clivage amyloïdogénique et de l'accumulation d'A[bêta]. Ainsi, la réduction de l'expression de LRP10 dans le cerveau pourrait augmenter la production de l'A[bêta] et représenter un facteur de risque dans la MA.

flasque, est produite par des bactéries anaérobies du genre Clostridium. Les BoNTs, classifiées en 7 types (A à G), forment divers complexes avec des protéines non toxiques, dont le composant non toxique non hémagglutinant (NTNH) et les hémagglutinines (HAs). Les gènes sont organisés, au sein du locus botulique, selon deux opérons divergents, ntnhbont/ A et ha34-ha17-ha70 pour le type A, dont l'expression est positivement régulée par le facteur sigma alternatif BotR. Un pic d'expression synchrone de tous les gènes du locus de type A est mesuré par RT-PCR en temps réel lors de la transition entre les phases exponentielle et stationnaire de croissance, en parallèle avec l'augmentation du titre en toxine du surnageant de culture. Dans un modèle d'épithélium intestinal, BoNT/A purifiée est transcytosée après liaison via le domaine Hc/A à des récepteurs apicaux comprenant des gangliosides et des protéines potentiellement apparentées à SV2. L'intensité de liaison et l'efficacité de transport de la toxine sont supérieures dans les cellules intestinales de type crypte plutôt qu'entérocyte. Injectés dans la lumière d'une anse iléale ligaturée, BoNT/A inhibe les contractions des muscles lisses et le domaine Hc/A fluorescent progresse de la muqueuse, via certaines cellules des cryptes, vers la sous-muqueuse et la musculeuse où il cible certaines terminaisons nerveuses, majoritairement cholinergiques. Hc/A entre par des voies distinctes dans les cellules neuronales (voie clathrine dépendante de la dynamine) et les cellules intestinales (voie non-clathrine, dépendante de Cdc42 et de la dynamine).

Les cellules sont organisées en tissus dont les propriétés physiques comme la rigidité et l'élasticité sont variables. La matrice extracellulaire (MEC) est produite et remodelée par les cellules qui s'adaptent en retour aux conditions physico-chimiques de cet environnement extracellulaire. Cela nécessite une communication bidirectionnelle entre la cellule et la matrice. Les intégrines sont des protéines transmembranaires impliquées dans l'adhérence, liant la MEC au cytosquelette d'actine via une plateforme protéique appelée adhérence focale, lieu d'une double signalisation (inside-out et outside-in). Des variations de tension intracellulaire imposées par l'environnement modifient la distribution et la taille de ces adhérences. Leur dynamique est aussi contrôlée par certaines protéines cytoplasmiques comme la protéine ICAP-1, partenaire de l'intégrine b1. En cherchant à comprendre le lien entre la tension interne et l'activation des intégrines, j'ai montré qu'ICAP-1 contrôle l'étalement, la contractilité interne et la migration cellulaire en présence comme en absence de l'intégrine b1, révélant un rôle ICAP-1 indépendant de son interaction avec l'intégrine b1. Ce contrôle semble passer par l'interaction ICAP-1/ROCK et a révélé un contrôle de l'intégrine b3 par l'intégrine b1.

L'endothélium constitue un véritable organe qui sécrète de nombreuses substances vasoactives régissant des fonctions cardiovasculaires vitales telles que le tonus et la croissance vasculaires. Ce tissu requiert la polyvalence de la signalisation calcique puisque plusieurs de ses fonctions dépendent de la modulation de la concentration intracellulaire de Ca[indice supérieur 2+].L'un des moyens utilisés par les cellules endothéliales pour assurer une réponse calcique efficace et spécifique est la propagation des signaux sous forme de vagues. Dans ce travail, nous avons décortiqué les mécanismes de mobilisation du Ca[indice supérieur 2+] intracellulaire menant à la propagation de vagues de Ca[indice supérieur 2+]. Nous avons recueilli des données qui aideront à mieux comprendre à la fois l'organisation et la propagation de vagues de Ca[indice supérieur 2+] dans les cellules endothéliales d'aorte de boeuf (BAEC). Nous montrons par vidéomicroscopie, que la stimulation des BAEC avec l'ATP ou avec la bradykinine (BIC) induit une réponse calcique oscillatoire finement régulée dans le temps et dans l'espace. En fait, le Ca[indice supérieur 2+] se propage d'une extrémité à l'autre de la cellule sous la forme d'une vague qui se produit en présence ou en absence de Ca[indice supérieur 2+] extracellulaire. Bien que les vagues de Ca[indice supérieur 2+] soient initiées à un endroit très précis près de la membrane plasmique, les cavéoles ne sont pas essentielles à leur propagation dans les BAEC, contrairement à ce qui a été observé dans certains autres types cellulaires. Toutefois, la dépolymérisation des microfilaments avec la latrunculine B et des microtubules avec la colchicine empêche la propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+]. Dans ces conditions, les BAEC présentent plutôt une augmentation calcique uniforme dans toute la cellule. Ces résultats suggèrent que, dans les BAEC, les cavéoles ne sont pas impliquées dans l'organisation de la réponse calcique sous forme de vague, mais que l'organisation du cytosquelette est essentielle. Nous montrons aussi que la vitesse de propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+] est constante d'un bout à l'autre d'une BAEC, ce qui est incompatible avec un mécanisme impliquant uniquement la diffusion de l'IP[indice inférieur 3] ou du Ca[indice supérieur 2+]. Nous montrons également que la vitesse de propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+] dépend de l'intensité de la stimulation et aussi de l'état fonctionnel de l'IP[indice inférieur 3]R qui peut être modulé par des kinases endogènes comme la PKA, la PKC et mTOR. Enfin, nous montrons que la vitesse de propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+] n'est pas directement reliée à l'amplitude de la relâche de Ca[indice supérieur 2+]. La vitesse de propagation des vagues de Ca[indice supérieur 2+] est un paramètre relativement nouveau dans le domaine de la signalisation calcique intracellulaire. Il reste à définir jusqu'à quel point ce paramètre peut être utile dans l'interprétation des différentes activités cellulaires.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

A travers l'évolution, les agents pathogènes ont développé des stratégies leur permettant de survivre au sein de leur hôte en interférant avec la biogénèse des phagolysosomes. Comme C. burnetii vit dans un phagosome acide incapable de fusionner avec les lysosomes et que sa virulence est associée à l'expression de son LPS, nous avons étudié le rôle du LPS de C. burnetii dans le détournement de la conversion phagosomale. En effet, nous avons montré que C. burnetii virulent ainsi que son LPS se localisent dans des compartiments Lamp-1+ qui n'acquièrent pas la CathepsineD et Rab7 n'est pas recruté à leur surface. Contrairement au LPS du variant avirulent de C. burnetii, qui est localisé dans les lysosomes, le LPS de C. burnetii virulent (vLPS) n'induit pas l'activation de la MAPKinase p38, empêche le recrutement de Rab7 à la surface des compartiments en déstabilisant le complexe HOPS. Finalement, nous avons démontré que la bactérie virulente exprimant le vLPS détourne la conversion phagosomale pour survivre et pour se multiplier dans les macrophages en évitant l'activation de l'axe MAPK-p38/Vps41-HOPS. Nous avons également étudié les mécanismes permettant à Tropheryma whipplei, l'agent de la maladie de Whipple, de se répliquer dans les macrophages puisque les macrophages sont la cible in vivo de cette bactérie. Nous avons montré que T. whipplei bloque la conversion de son phagosome. / Through evolution, pathogens have developed strategies to survive within their host by interfering with the biogenesis of phagolysosomes. As it is known that C. burnetii lives in acidic phagosome which is unable to fuse with the lysosomes and that its virulence is associated with the expression of LPS, we studied the role of C. burnetii LPS in hijacking of phagosomal conversion. Indeed, we showed that the virulent C. burnetii and its LPS are located in Lamp-1+ compartments which do not acquire CathepsineD and Rab7 is not recruited to their surface. Contrary to LPS of avirulent C. burnetii, which is located in the lysosomes, the LPS of virulent C. burnetii (vLPS) does not induce activation of the p38 MAPKinase and it prevents the recruitment of Rab7 to the surface of compartments by destabilizing the HOPS complex. Finally, we demonstrated that virulent bacteria expressing virulent LPS hijack phagosomal conversion to survive and multiply in macrophages by preventing activation of p38-MAPK/Vps41HOPS axis. We also studied the mechanisms by which Tropheryma whipplei, the agent of Whipple's disease, replicates in macrophages, which are its target in vivo. We have shown that T. whipplei blocks the conversion of its phagosome. Indeed, after purification of phagosomes containing-T. whipplei, we observed by Western blot and confocal microscopy that T. whipplei survives in an immature phagosome with characteristics of both early and late phagosomes (presence of Rab5 and Rab7) making it unable to fuse with lysosomes. As the IL-16 is known to induce replication of T. whipplei, we studied the effect of this cytokine on the phagosome biogenesis of T. whipplei.