A hansenÃase à uma doenÃa infecciosa crÃnica causada pelo Mycobacterium leprae, um bacilo Ãlcool-Ãcido resistente. Tem alta infectividade, porÃm baixa patogenicidade, e quando se manifesta, apresenta-se sob uma grande diversidade de formas clÃnicas. Essa diversidade depende, em grande parte, da resposta imunolÃgica do hospedeiro, sendo os linfÃcitos, em sua plasticidade, componentes essenciais no desenvolvimento da imunidade. Assim, este trabalho teve como objetivo descrever as subpopulaÃÃes linfocitÃrias: linfÃcitos T totais (CD3+), T auxiliares (CD4+), T citotÃxicos (CD8+), T CD4+CD8+, B (CD19+), Natural killers-NK (CD3- CD16+ CD56+) e T Natural killers - NKT (CD3+ CD16+ CD56+) no sangue perifÃrico de pacientes portadores de hansenÃase, antes e apÃs uso da multidrogaterapia. Os pacientes foram selecionados no Centro de Dermatologia D. LibÃnia, Fortaleza-CE, Brasil. A determinaÃÃo de linfÃcitos em cada subpopulaÃÃo foi realizada por citÃmetria de fluxo e anÃlise estatÃstica pelo programa GraphPad Prism 5.0 para Windows. A significÃncia foi estabelecida para valores de p<0,05. Um total de 133 amostras foram utilizadas para as comparaÃÃes, sendo 79 (59,4%) do gÃnero masculino e 54 (40,6%) do gÃnero feminino. A mediana da idade dos pacientes foi de 43 anos no grupo prÃ-tratamento e de 46 anos no pÃs-tratamento. Nove pacientes foram incluÃdos na forma paucibacilar e 124, na multibacilar. As medianas das contagens (cÃlulas/mm3) de linfÃcitos NK (CD3-CD16+ CD56+) nos grupos antes e apÃs tratamento foram 142,0 [15,0â463,0] e 189,5 [18,0 â 1037,0], respectivamente (p=0,0484), enquanto nÃo houve diferenÃas quando foram comparados os grupos pauci e multibacilar. As contagens de linfÃcitos T totais (CD3+), T auxiliares (CD4+), T citotÃxicos (CD8+), T (CD4+CD8+), B (CD19+), e NKT(CD3+CD16+CD56+) mantiveram-se inalteradas nos grupos antes e pÃs-tratamento, assim como nos grupos pauci e multibacilar. Em conclusÃo, os resultados deste estudo apontam para uma reduÃÃo na populaÃÃo de cÃlulas NK (CD3-CD16+CD56+) em indivÃduos com hansenÃase antes de qualquer intervenÃÃo terapÃutica. ApÃs o tratamento, hà uma recuperaÃÃo na contagem desta populaÃÃo celular. / Leprosy is a chronic infectious disease caused by the Mycobacterium leprae, a resistant alcohol-acid bacillus. It has a high infectivity, although the pathogenicity is low. Clinical manifestations present a great diversity. Host immune response is an important determinant of this clinical diversity, whilst lymphocytes collaborate to it. Thus, the present study aimed to describe lymphocyte subpopulations: T lymphocytes (CD3+), T helper lymphocytes (CD4+), T cytotoxic (CD8+), T CD4+CD8+, B (CD19+), Natural killers-NK (CD3- CD16+ CD56+) and T Natural killers - NKT (CD3+CD16+ CD56+) in peripheral blood samples from patients with leprosy, before and after the treatment with multidrugtherapy. Patients were selected at the Dona Libania Dermatology Center, at Fortaleza-CE, Brazil. The determination in each subpopulation of lymphocytes was done by flow-cytometer and statistical analysis by GraphPad Prism 5.0 for Windows. Significance was established at p values of <0.05. A total of 133 samples were studied, while 79 (59,4%) were males and 54 (40,6%)females. Median age of patients was 43 years old for the group before treatment and 46 years old for the group after treatment. Nine patients presented with paucibacillary and 124 with multibacillary form. NK (CD3-CD16+ CD56+) lymphocytes medians cells/mmÂ) were 142.0 [15,0â463,0] and 189,5 [18,0 â 1037,0], respectively for the groups before and after treatment, with a p value of 0.0484. On the other hand, no differences were observed when pauci and multibacillary groups were compared. T lymphocytes (CD3+), T helper lymphocytes (CD4+), T cytotoxic lymphocytes (CD8+), T (CD4+CD8+), B lymphocytes (CD19+) and NKT lymphocytes (CD3+CD16+CD56+)were similar at the groups before and after treatment and also at pauci and multibacillary. In conclusion, data from this study shows a reduction at NK lymphocytes (CD3-CD16+CD56+) populations in leprosy before any therapeutical intervention. After leprosy treatment, a recovery of this cell population occurs.

Embora a obesidade esteja associada à disfunção imune, com incidência aumentada de infecções e alguns tipos de cânceres, há poucos estudos que avaliaram parâmetros imunológicos em pacientes obesos graves. Além disso, há um número limitado de trabalhos analisando o efeito da perda de peso sobre parâmetros imunológicos na obesidade grave. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência da perda de peso de pacientes com obesidade grau III submetidos à cirurgia de derivação gastrojejunal em Y de Roux (DGJYR) em parâmetros imunológicos. A produção de citocinas associadas com a resposta imune adquirida (IL-2, IL-4, IL-10 e IFN-) e inata (TNF- e IL-6) por células mononucleares de sangue periférico (PBMC), o perfil das populações de linfócitos e a atividade citotóxica de células natural killer (NK), além de citocinas associadas a sua função e desenvolvimento (IL-12 e IL-18), foram avaliados em vinte e oito pacientes não diabéticos, sedentários, com obesidade grau III (20 mulheres e 8 homens, com média de idade de 39,9 ± 10,9 anos e IMC de 49,5 ± 7,1kg/m2) no pré-operatório e 6 meses após a cirurgia. As PBMC foram estimuladas com o mitógeno fitohemaglutinina (PHA) e as citocinas produzidas foram quantificadas por ELISA. O perfil das populações de linfócitos foi avaliado por citometria de fluxo. A citotoxicidade mediada por células NK foi determinada pelo ensaio de liberação de LDH por células alvo K562. A perda de peso foi de 35,3 ± 4,5 kg, com uma significativa redução no IMC seis meses após a cirurgia (-12,9 ± 0,9 kg/m2, p< 0,001). Nenhuma das populações de linfócitos analisadas apresentou modificação no 6º mês após a cirurgia. Observou-se aumento significativo da proliferação de linfócitos seis meses após a cirurgia (p= 0,0026). Houve aumento pósoperatório nas concentrações de IFN-, IL-12 e IL-18 produzidas por PBMC após estímulo com PHA, enquanto a IL-2 apresentou uma tendência ao aumento (p= 0,07). As demais citocinas não apresentaram variação significativa. A atividade citotóxica das células NK aumentou seis meses após a cirurgia [17,1 ± 14,7% no pré vs 51,8 ± 11,3% 6 meses pósoperatório, na proporção 40:1 (célula NK:célula alvo); p< 0,001], mostrando recuperação quando se compara aos valores obtidos em indivíduos controle, pareados por idade e sexo, de peso normal [proporção 40:1 (célula NK:célula alvo) de 45,4 ± 7,8%]. Houve aumento de atividade citotóxica em todos os pontos da curva no pós-operatório em cerca de 79% da amostra (22 pacientes). Os resultados obtidos demonstram que a perda de peso induzida por DGJYR aumenta a produção de algumas citocinas relacionadas com a função das células NK e melhora a sua atividade citotóxica. As alterações na função de células NK e do nível de citocinas envolvidas com a atividade destas células podem explicar a propensão ao desenvolvimento de infecções e cânceres associados com a obesidade. Os dados obtidos neste estudo sugerem que a cirurgia bariátrica pode ter impacto positivo sobre estes fatores. / Although obesity is related to immune dysfunction, with a higher incidence of infections and some types of cancer, few studies have evaluated immunological parameters in severely obese patients. Moreover, a limited set of studies have analyzed the effect of weight loss in immunological parameters in severely obese patients. Thus, the objective of this thesis was to evaluate the influence of weight loss induced by Roux en-Y gastric bypass in patients with grade III obesity in immunological parameters. The production of cytokines associated with acquired (IL-2, IL-4, IL-10 and IFN-) and innate (TNF- e IL-6) immune responses from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), the profile of lymphocytes populations and the cytotoxic activity of natural killer cells (NK), besides cytokines related with NK cell cytotoxic function and development (IL-12 e IL-18), were analyzed in 28 non-diabetic and sedentary patients with grade III obesity (20 women and 8 men, 39,9 ± 10,9 years and BMI 49,5 ± 7,1 kg/m2) before and 6 months after RYGB. PBMCs were stimulated with the mitogen phytohemagglutinin (PHA) and cytokines were measure by ELISA. The profile of lymphocytes populations was evaluated by flow cytometry. NK cell cytotoxicity was determined by the lactate dehydrogenase release assay from K562 lysed target cells. The weight loss 6 months after surgery was 35.3±4.5 kg and there was a significant post-surgical decrease in BMI at this point (-12.9±0.9 kg/m2, p<0.001). No significant differences were found in the lymphocytes populations after surgery. It was observed a significant increase in the lymphocytes proliferation six months after surgery (p= 0.0026). There was also a post-surgical increase in the production of IFN-, IL-12 e IL-18 from PBMC stimulated with PHA, while there was a trend towards the increase of the IL-2 production (p=0.07). The other cytokines analyzed were not altered. Cytotoxic activity of NK cells was significantly enhanced 6 months after RYGB [17.1±14.7% before RYGB vs 51.8±11.3% at 6 months after, at effector to target cell (NK cell:K562 cell) ratio 40:1; p<0.001], and it was in the same range when compared to data obtained from controls with normal BMI matched for age and gender (45,4 ± 7,8% at NK cell:K562 cell ratio 40:1). There was a significant post-surgical improvement in all points of the cytotoxic activity curve in almost 79% of the sample (22 patients). In conclusion, the data obtained show that the weight loss induced by RYGB increases the production of cytokines related with NK cell cytotoxic function and improves its activity. The impairment in NK cells cytotoxic activity and cytokines observed in patients with severe obesity may explain their propensity to develop infections and cancer. Our data suggests that the weight loss induced by bariatric surgery can positively impact these factors.

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T17:18:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bianco_JuaresEdnaldoRomero_M.pdf: 23225852 bytes, checksum: 523781fa325c40e61fa0fe33c59406a1 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Durante o período peri-implantacional na gestação de humanos e roedores, ocorre no estroma da mucosa uterina um conjunto de fenômenos que envolvem modificações dos componentes celulares e da matriz extracelular. Este conjunto de modificações é conhecido como decidualização ou reação decidual. Concomitante a este processo ocorre a migração de leucócitos provenientes de órgão hematopoéticos para este estroma. Dentre estes leucócitos predominam as subpopulações de linfócitos denominados de células ¿uterine Natural Killer¿ (uNK), que atuam na gestação reconhecendo o embrião alogeneico, modulando a reação decidual e o crescimento placentário. Porém, a sua participação nos casos de aborto e o possível desencadeamento do potencial lítico e citotóxico relacionado com a resposta imune inata, não foi ainda totalmente elucidado. O presente trabalho buscou desenvolver estratégias para o estudo in situ das células uNK, sem a influência de fatores oriundos do embrião, empregando o modelo da pseudogestação em camundongos. Foram utilizados fêmeas pseudogestantes obtidos através do acasalamento com machos vasectomizados e inoculação intraluminal do óleo vegetal (arachis) ou mineral (nujol) no útero de 4° dia de pseudogestação (dpg). Estes animais pseudogestantes foram subdivididos em grupos submetidos ou não a ovarectomia e com suplementação hormonal de estrógeno e/ou progesterona ou hormônio gonadotrófico coriônico (hCG). Foram coletados o útero e ovário e processados para análise em microscopia de luz e eletrônica de transmissão no 9°, 12° e 14° dpg. Fêmeas em gestação normal foram utilizados como grupo controle. As análises histológicas, citoquímicas e ultra-estruturais efetuadas demonstraram que a indução da pseudogestação com emprego tanto de óleo vegetal (arachis) quanto de óleo mineral resultam na reação decidual e presença de células uNK lectina DBA (Dolichos biflorus) positivas. A reação decidual resultante e mais exuberante com o óleo de arachis, porém, o período de manutenção do deciduoma é menor, mesmo com a suplementação hormonal de progesterona, se comparado ao grupo de animais induzidos com o óleo mineral e suplementada com HCG. As características morfológicas das células uNK foram melhor preservadas nos animais pseudogestantes induzidos com o óleo mineral, não ovarectomizados e suplementados com o HCG.Nestes, as células uNK foram encontradas aém do 12° dpg em meio ao endométrio que mantinha o deciduoma, enquanto nos demais grupos o deciduoma era destituído antes do 12º dpg. Porém, , à semelhança dos demais grupos experimentais, houve predominância de formas menos diferenciadas de células uNK (subtipos I e II), sendo raras as formas plenamente diferenciadas (subtipo III). Em nenhum dos grupos foi encontrado o subtipo IV, correspondentes à forma de degeneração destas células. Estes resultados demonstram que as características do endométrio e o comportamento das células uNK na pseudogestação, apresentam diferenças influenciadas pelos meios de indução utilizados e regimes hormonais adotados.Além disso, a ausência do concepto parece ser o fator limitante na continuidade da manutenção do utero seudogestante. Por conseguinte, a pseudogestação induzida com óleo mineral e mantida sob a regência ovariana supra-controlado pelo HCG poderia ser adotada como modelo experimental para estudo das células uNK sem a interferência do embrião. Este modelo deverá permitir novas estratégias para investigação dos diversos fatores de origem embrionário/fetal que possam afetar as atividades destas e/ou outras células de forma controlada in situ no ambiente uterino que simule a gestação / Abstract: During the period of pre-implantation in humans and rodents gestations, a set of phenomenon, involving, modifications of cellular components and extracellular matrix occur in the stroma of the uterus. These modifications, are known as decidualization or decidual reaction. During this processes a migration of leukocytes that came from the heamatopoetic organs occur into the uterine stroma. Among these leukocytes, there is a predominance of a subpopulation of leukocytes known as uterine Natural Killers (uNK) that play important roles during gestation by recognizing the allogeneic embryos and modulating the decidual reaction and the placental growth. However, the uNK participations in miss carriage and triggering of lytic and citotoxic potential related to innate immune response during pregnancy have not elucidated yet. The present work aimed to develop a strategy for uNK study without the influence of embryonaryfactors by using the pseudopregnancy model in mice. It was used the pseudopregnant females mice obtained by matting with vasectomized males and intra-luminal injection of arachis or mineral oil in the uterus on 4th day of pseudopregnancy (dpp). These animals were grouped according to treatment submitted of ovarectomy or not and with exogenous supplement of progesterone and/or estradiol or chorionic gonadotrophin hormone (HCG). The uteri and ovary were collected and processes for light and electron microscope on the 9th, 12thand 14thdpp. Normal pregnant females were used as controls. Histological analysis, cytochemistry and ultrastructure demonstrated that the induction of pseudopregnancy by using both arachis oil and mineral oil resulted in decidual reaction and presence of the DBA (Dolichos biflorus) lectin positive uNK cells. The decidual reactions induced by arachis oil were more intensive and exuberant, but the deciduomas were not sustained longer even under progesterone treatment, if compared to those, in the uterus induced with mineral oil, and supplemented with HCG. The morphological characteristics of the uNK cells were better preserved in the pseudopregnant animals induced with mineral oils, not ovarectomized and supplement with HCG. In these animals, the uNK cells were found over the 12th dpp in the endometrium preserving the deciduoma while it failed before 12th dpp in the other groups However, similarly to other experimental groups, there was predominance immature forms of uNK cells (subtypes I and II), being rare the fully differentiated forms (subtype III). No groups did not show the uNK sub type IV, corresponding to the degeneration form of this cell / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Aureo Tatsumi Yamada, Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T04:32:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bizinotto-Assuncao_MarciaCristina_D.pdf: 17669234 bytes, checksum: 7623e53be29f1a69dba9c95b19066e0e (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O fenômeno da gestação em mamíferos de placentação hemocorial, onde o feto alogênico, apresentando metade dos genes de origem paterna, desenvolve um íntimo contato com o tecido materno sem desencadear uma resposta de rejeição pelo sistema imune materno, é ainda uma questão da imunologia da reprodução não esclarecida completamente. O diálogo na interface materno-fetal do útero gestante envolve uma gama de citocinas da categoria Th1fTh2, bem como de várias populações celulares, onde se destacam as células Natural KiUer uterinas (uNK). As uNK são populações linfocitárias transitórias que migram a partir de progenitores localizados em órgãos linfóides secundários como linfonodo e baço para o útero gestante e, neste proliferam e diferenciam ao longo da gestação. A presença destas células no útero gestante tem sido relacionada com o reconhecimento dos antígenos HLA-G e HLA-E expressos pelos trofoblastos, resultando na inibição tanto da resposta imune inata quanto da adaptativa. Esta atuação peculiar das uNK sugere que a modulação destas células no útero gestante esteja relacionada com a expressão de receptores específicos não compartilhada com células NK circulantes (eNK). Em uNK de camundongos, a lectina DBA (Doliehos biflorus agglutin) identifica glicoconjugados contendo N-acetil D-galactosamina presentes na superfície destas células e que não são expressos por outros linfócitos, corroborando com a hipótese de que as uNK expressam receptores específicos não comuns às eNK Neste trabalho, nós propusemos avaliar a possível expressão de moléculas específicas na superfície das células uNK de camundongos e identificar as proteínas candidatas através de técnicas proteômicas. Para tanto foram inicialmente utilizadas células uNK isoladas e purificadas de úteros de camundongos prenhes como in6culos antigênicos em machos da mesma espécie, para avaliar a capacidade de indução de uma resposta imune com produção de anticorpos reativos a esses antígenos. Outra estratégia utilizada foi o isolamento de proteínas de homogenados uterinos, de células uNK e da membrana destas células, na tentativa de isolar e identificar aquelas reativas à lectina DBA. Como resultado das inoculaçães de células uNK, os camundongos receptores produziram anticorpos séricos que reconheciam células uNK através de reações imunocitoquímicas. Este resultado confirma a expressão de moléculas específicas em células uNK, que por sua vez as caracteriza como uma subpopulação de NK específica da gestação. Dos dois animais com maior nível de anticorpos séricos foram coletados os baços para o preparo das células empregadas em experimentos de fusão celular para a obtenção de hibridomas secretores de anticorpos monoclonais. Um dos anticorpos monoclonais obtidos reconheceu moléculas presentes na superfície e no citoplasma das células uNK de várias linhagens de camundongos, assim como moléculas em células presentes no endométrio de ratas prenhes e no endométrio gestacional de humanos, sugerindo que moléculas homólogas são expressas em uNK de outras espécies. No entanto, este anticorpo monoclonal anti-uNK de camundongo (mamuNK1) apresentou reação cruzada com componentes citoplasmáticos de outras células, sugerindo não serem específicos para uNK Em relação ao isolamento dos glicoconjugados lectina DBA reativos observouse que através da cromatografia de gel filtração o isolamento mostrou-se pouco eficiente para o "pool" de proteínas contidas no homogenado uterino, ou mesmo de homogenado de células uNK, em decorrência da existência de múltiplas frações de proteínas capazes de ligar à lectina DBA. Restringindo-se o "pool" de proteínas àquelas obtidas apenas da membrana de células uNK e, através da eletroforese de duas dimensões pode-se delimitar as proteínas de interesse, as quais foram submetidas à análise proteomica. A identificação das proteínas isoladas das membranas de células uNK através de técnicas proteomicas sugeriram as proteínas Conserved oligomeric Golgí complex component 4 (COG4) e Heat shock 70-líke proteín 1 (Hsp 70 L1) como potenciais candidatas relacionadas com as atividades das células natural kíller no útero gestante / Abstract: The phenomenon of pregnancy in mammalians with hemochorial type placenta ions where the allogeneic fetus presenting the half of gene from paternal origins growth in tight contact with maternal tissues, without triggering the rejections responses of maternal immune system is still a non-solved question of immunology of reproduction. The cross-talk at maternal-fetal interface in the pregnant uterus involves a range of Th1rrh2 cytokines, as well as, several cell populations with accentuated participation of uterine Natural Killer (uNK) Iymphocytes. The uNK .are transient leukocyte population that migrate from precursor cells localized at secondary Iymphoid organs such as Iymph nodes and spleen into the pregnant uterus and proliferate and differentiate during the gestation. The presence of these cells in the pregnant uterus has been related to recognition of the HLAG and HLA-E antigen present in the trophoblast, which results in inhibition of both innate and adaptive immune response. This peculiar activity of uNK suggests that the modulation of such cells in the pregnant uterus should be related with the expression of specific receptors not shared with peripheral blood circulating NK (cNK) cell. In the mouse uNK, the DBA (Dolichos biflorus agglutin) lectin identify n-acetyl D-galactosamine containing glycoconjugates present on the surface of these cells not expressed by other Iymphocytes, which corroborate the hypothesis of uNK expressing specific receptors not shared by cNK. The present work aimed to evaluate the presumed expression of specific molecules on mouse uNK cell surface and identify the candidate proteins by proteomic methods. Initially were used uNK cells isolated and purified from pregnant mice uteri as antigen to be inoculated in the male mice and evaluate the capacity of induction of immune response with production of antibodies reactive to these antigens. Other strategy was to realize procedures of protein isolation from uterine homogenates, uNK cells and the membrane of these cells, in the attempt to isolate and identify those reactive to DBA lectin. As results of inoculation of uNK cells were verified responses in the inoculated males by presence of serum antibodies that recognized uNK with immunocytochemistry. These results confinn the expression of specific molecules in uNK cells which characterize these cells as specific NK subset of pregnancy. From two animaIs with highest levei of antibodies in 1he serum were collected the spleen to isolate the Iymphocytes clones for monoclonal antibodies obtantion. One of these antibodies recognized antigen molecules found on the surface and cytoplasm of the uNK cells of several mice strains, as well as, molecules in cells present in the pregnant rats and human beings endometrium, which suggests the expression of homologous molecules in uNK of other species. However, this mouse anti-mouse uterine NK (mamuNK1) was reactive with citoplasmatic components the other cells, suggesting not be specific to uNK. About the isolation of DBA lectin reactive glycoconjugates by purification in gel filtration chromatography revealed low efficiency to the pool of proteins contained in the uterine homogenate, or even in the homogenate of isolated uNK cells due to the multiple DBA lectin positive protein fractions. By restriction of protein pool to those obtained from the uNK cells membrane and by two dimension electrophoresis was delimited the target proteins that were submitted to the proteomic analysis. The identification of isolated proteins of the membranes of uNK cells with proteomics methods suggested the Conserved proteins oligomeric Golgi complex Component (4 COG4) and Heat shock 7D-like protein 1 (Hsp 70 L1) as potential candidates related to the activity of the natural to killer cells in the pregnant uterus / Doutorado / Histologia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

As células Natural Killer (NK), quando estimuladas por meio de seus receptores, rapidamente produzem citocinas e quimiocinas, incluindo IFN?, TNF?, TGF?, GMCSF, MIP1?, MIP1?, IL-10 e outras, as quais podem afetar a função de outras células hematopoéticas. Considerando as evidências recentes de que as célulastronco hematopoéticas (CTH) respondem diretamente à sinalização de várias citocinas, acreditamos que a produção de citocinas mediada pelas células NK possa regular a função da CTH e que a sua desregulação possa favorecer a transformação maligna. As neoplasias mieloproliferativas (NMP) negativas para o rearranjo t(9;22)/BCR-ABL1, incluindo as entidades Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MFP), são doenças hematopoéticas originadas de alteração clonal da CTH, e podem servir de modelo para o estudo dessa regulação NK-CTH. Além de mutações que ativam vias de proliferação e sobrevivência celular, como a mutação JAK2V617F, presente em mais da metade das NMP, outros mecanismos contribuem para a patogênese e manutenção da doença, tais como mutações adicionais e regulação da hematopoese neoplásica pelo microambiente da medula óssea. Este último inclui não apenas células do estroma, mas também células do sistema imune. Dessa forma, com objetivo de investigar a potencial contribuição das células NK para a patogênese das NMP, caracterizamos células do sangue periférico de pacientes com NMP do Ambulatório de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, bem como células esplênicas obtidas de animais de um modelo murino condicional knockin de expressão heterozigótica da Jak2V617F (Jak2VF) quanto à frequência, expressão de receptores e função das células NK. Observamos menor porcentagem de células NK e maior expressão do receptor inibitório NKG2A nos animais Jak2 wt/VF. Pacientes portadores de NMP apresentaram número absoluto de células NK-CD16+ reduzido em relação aos controles saudáveis. O número de células NK-CD16+ foi menor na MFP em relação aos controles e à TE, particularmente naqueles portadores da mutação JAK2V617F. Encontramos menor expressão do receptor de ativação NKG2D nos portadores de PV positivos para a mutação JAK2V617F. Houve menor expressão do receptor de ativação NKp46 nos portadores de NMP, particularmente nos portadores da mutação JAK2V617F, e nos pacientes com MFP. Observamos também menor expressão do receptor NKG2A nos portadores de TE negativos para a mutação JAK2V617F. Em concordância com a redução de células NK, a porcentagem de linfócitos totais mostrou-se reduzida nos pacientes com NMP, particularmente nos portadores de MFP, independentemente da mutação JAK2V617F. Encontramos redução percentual e absoluta do subtipo de células NK CD56brightCD16- (cuja principal função é secretória) nos pacientes com NMP, especialmente na presença da mutação JAK2V617F, nos pacientes com PV e MFP, e menor frequência absoluta do subtipo CD56-CD16bright (com função primariamente citotóxica) nos portadores de MFP. Em contraste, não verificamos deficiência citotóxica das células NK dos animais Jak2 wt/VF em relação aos controles Jak2 wt/wt. Adicionalmente, as células NK dos animais Jak2-mutados demonstraram menor capacidade de secreção da citocina MIP-1?, reconhecida por regular a função de CTH, em relação aos animais controle. Finalmente, houve expressão significativamente aumentada do gene MyD88 nos animais mutados em relação aos controles, sugerindo que a via de sinalização dos receptores do tipo Toll (TLR) pode estar envolvida na regulação NKCTH nas NMP. Em resumo, detectamos deficiência numérica e funcional de células NK em células primárias murinas e humanas de NMP. Nossos achados sugerem potencial regulação da hematopoese maligna pelas células NK nestas neoplasias e podem contribuir para a identificação de novas estratégias terapêuticas que possam interferir nesta complexa interação. / Natural Killer (NK) cells, when stimulated by their receptors, rapidly produce cytokines and chemokines, including IFN?, TNF?, TGF?, GM-CSF, MIP1?, MIP1?, IL-10 and others, which may affect the function of other hematopoietic cells. Considering the recent evidence that hematopoietic stem cells (HSC) directly respond to cytokine signaling, we hypothesized that NK cells mediated cytokine production can regulate HSC function and that their dysregulation may favor malignant transformation. BCR-ABL1-negative myeloproliferative neoplasms (MPN), including Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF), are hematopoietic diseases originated from HSC clonal transformation, and thus can serve as a model for studying this NK-HSC regulation. In addition to mutations that activate cell proliferation and survival pathways, such as the JAK2V617F mutation, present in more than half of MPN cases, other mechanisms contribute to the pathogenesis and maintenance of the disease, such as additional mutations and regulation of neoplastic hematopoiesis by the bone marrow microenvironment. This latter includes not only stromal cells but also cells of the immune system. Therefore, in order to investigate the potential contribution of NK cells to the pathogenesis of MPN, we characterized the frequency, receptor expression and function of NK cells from patients with MPN from the Clinical Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo, as well as from splenic cells obtained from animals of a conditional knockin murine model of Jak2V617F heterozigous expression. Lower percentage of NK cells and higher NKG2A inhibitory receptor expression was observed in Jak2 wt/VF animals as compared to Jak2 wt/wt controls. In agreement, patients with MPN presented reduced absolute numbers of NK-CD16+ cells when compared to healthy controls. The number of NKCD16+ cells was lower in the PMF than in controls or ET patients, particularly in those bearing the JAK2V617F mutation. We found lower expression of the NKG2D activatory receptor in PV patients with the JAK2V617F mutation. There was lower expression of the NKp46 activatory receptor in MPN patients, particularly in those with the JAK2V617F mutation, and in PMF patients. We also observed reduced expression of the NKG2A receptor in non-JAK2 mutated ET patients. In agreement with the NK cell reduction, the percentage of total lymphocytes was reduced in patients with MPN, particularly in PMF, regardless of the JAK2V617F mutation. We found an absolute decrease of the CD56brightCD16- NK subtype (whose main function is secretory) in patients with MPN, especially when the JAK2V617F mutation was present, in patients with PV and PMF. Also, lower absolute frequency of CD56-CD16bright NK subtype (primarily cytotoxic) was found in PMF patients. In contrast, we did not find cytotoxic deficiency in the Jak2 wt/VF NK cells as compared to the Jak2 wt/wt controls. In addition, Jak2-mutated NK cells presented reduced ability of secreting the cytokine MIP-1?, known to regulate HSC function. Finally, there was significantly increased expression of the MyD88 gene in the Jak2-mutated animals as compared to controls, suggesting that the Toll-like receptors (TLR) signaling pathway may be involved in NK-HSC regulation in MPN. In summary, we detected numerical and functional deficiency of NK cells in murine and human primary cells of MPN. Our findings suggest a potential regulation of malignant hematopoiesis by NK cells in these neoplasms and may contribute to the identification of new therapeutic strategies that may target this complex interaction.

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T18:21:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Degaki_KarinaYumi_D.pdf: 3236344 bytes, checksum: c9514dcb4b1f172c5ba2ee10da569217 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Células natural killer específicas do útero (uNK) gestante acumulam-se em grande número e desempenham múltiplas funções durante a gestação, As uNK podem atuar tanto como produtoras de fatores angiogênicos que contribuem para a remodelação vascular materna imprescindível para a irrigação placentária ou como células efetoras da resposta imune inata pela produção de citocinas pró-inflamatórias e o acúmulo de proteínas líticas nos grânulos. Contudo, se estas múltiplas funções são desempenhadas cada qual por subtipos funcionais específicos, ou ainda, se é uma única célula multifuncional não está definida. Uma das dificuldades no esclarecimento destas questões está na falta de critérios para a identificação destas células adotados nas diferentes formas de investigação. O presente trabalho propôs no capítulo I, estabelecer uma correlação entre, o fenótipo morfológico das células uNK de camundongos identificadas in situ através de métodos citoquimicos/imunocitoquímicos, com os imunofenótipos das células uNK isoladas do útero que apresentem os perfis de células citotóxico e/ou angiogênico, através da citometria de fluxo. Os métodos citoquímicos de PAS (periodic acid Schiff) e lectina DBA(Dolichos biflorus) e imunocitoquímica para perforina constatou que os três métodos identificam igualmente as células uNK no útero em diferentes dias de gestação (dg) e nas duplas marcações, a maioria das células uNK são DBA+/PAS+/perforina+ e, estas ainda apresentando variações entre grandes e ricas em grânulos e pequenas isentas/pobres em grânulos. Pela citometria de fluxo, as células uNK isoladas do útero no 9ºdg eram predominantemente DBA+/DX5+ (>90%) e negativas para NK1.1. Estas células uNKDBA+/DX5+ eram CD3-, porem surpreendentemente expressavam CD8a (>97%). Este imunofenótipo de célula uNKDBA+/DX5+/CD3-/CD8a+ eram perforina+/TNFa+ (>98%) com expressão do receptor de ativação Ly49H na maioria das células uNK grandes e granulares (64%) e poucas células com receptor de inibição Ly49I+ (~10%), confirmando o perfil citotóxico deste imunofenótipo. Por outro lado, estas células uNKDBA+/DX5+/CD3-/CD8a+ eram também DLL1+/VEGF-A+ e portanto, com perfil de células angiogênicas. Quando confrontado o perfil citotóxico com o angiogênico, as células uNKDBA+ co-expressam o TNFa e o Dll1, confirmando que uma mesma célula compartilha ambos os fenótipos funcionais. O capítulo II avaliou a expressão cronológica e a localização da molécula Dll1, relacionado com a remodelação vascular, nas células uNKDBA+ de camundongos nos períodos de 6,5, 9,5 e 11,5dg. A imunomarcação detectou o fenótipo uNKDBA+/Dll1+ como células pequenas agranulares no 6,5dg que coincidente com o inicio da remodelação vascular do endométrio mesometrial e, atingem o maior numero entre 9,5 e 11,5dg na região central da decídua basal onde ocorre a intensa remodelação das artérias espiraladas. Este conjunto de dados sugerem que as células uNKDBA+ podem apresentar fenótipos funcionais e pode ser adotado como referência para identificação e correlações nas análises in-utero e exo -utero / Abstract: A huge number of pregnancy specific natural killer cell (uNK) accumulates in the uterus and plays multiple functions, such as angiogenic factors, producing cell contributing to the maternal vascular remodeling critical for blood flow to placental and as innate immune responsive cells, producing pro-inflammatory cytokines and storage of lytic protein in the granules. However, it is still unknown if these multiple functions are played each one by specific cell subset, or, by one single multifunctional cell. The difficulty to solve this question is mainly due to the lack of standard criteria for identification of these cells in the different experimental approach. The present study aimed in the chapter I, to establish the relationship between the morphological phenotype of mouse uNK cells identified in situ by cytochemical/immunocytochemical methods and, the immune-phenotype of uNK cells isolated from the uterus showing cytotoxic and angiogenic profile by flow cytometry analysis. All the three, PAS (periodic acid Schiff) and DBA (Dolichos biflorus) lectin cytochemical and anti-perforin immunocytochemical methods equally identified the uNK cells in the uteri of different gestational day (gd) and by using combinations of double staining, the majority of uNK cells showed DBA+/PAS+/perforin+ profile and distinguished the incidence of large granule rich and small granule less uNKDBA+/PAS+/perforin+ cell subsets. By flow cytometry, most of uNK cells isolated from the uterus at gd9 were DBA+/DX5+ (>90%) and NK1.1-. and CD3-. Unexpectedly, this uNKDBA+/DX5+/CD3- was CD8a+ (>97%) and also perforina+/TNFa+ (>98%). The large granule rich uNKDBA+/DX5+/CD3-/CD8a+/ perforina+/TNFa+ cells were mostly Ly49H+ (64%) and poorly Ly49I+ (~10%). This immunophenotype confirms the uNK cell cytotoxic profile. Conversely, these uNKDBA+/DX5+/CD3-/CD8a+ were also DLL1+/VEGF-A+ and therefore, angiogenic cell profile. When crossed the uNKDBA+/TNFa + cytotoxic and uNKDBA+/DLL1+ angiogenic profile, majority were uNKDBA+/TNFa +/DLL1+. This result confirms the uNKDBA+ cell share both cytotoxic and angiogenic functional phenotype. In the chapter II, was evaluated the time dependent expression and localization of Dll1 molecule related to vascular remodeling in the pregnant mice uterus. The immune-stain detected the expression of this angiogenic activator in the uNKDBA+ cell that showed changes in the number and localization at the maternal-fetal interface. Markedly, the uNKDBA+/Dll1+ phenotype appear initially like small granule less cells at gd6.5, coincidental to the beginning of mesometrial endometrium vascular remodeling and reach the peak number around 9.5 to 11,5gd in the central area of decidua basalis. These are the place and time of extensive spiral artery remodeling. Taken all together, there are varieties of uNK cell functional phenotype, but most of them being uNKDBA+, this phenotype could be adopted as reference for uNK cell identification to perform the correlation between in-uterus and exo-uterus analysis / Doutorado / Histologia / Doutora em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Carlos Alberto Petta, Fernando Guimarães / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T13:56:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_RodrigoFernandesda_M.pdf: 2312952 bytes, checksum: 26e5506763c6314d5615c77880da2e51 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: As células NK são linfócitos conhecidos pela capacidade de eliminar uma variedade de células malignas, sem a necessidade de estímulo prévio e por meio de um processo de reconhecimento inato, o qual envolve receptores ativadores e inibidores. Esta capacidade também foi observada nos linfócitos NK-like T, porém a via de reconhecimento imunológico envolvida pode ser tanto a inata quanto a adaptativa. Neste estudo, avaliou-se a atividade funcional e a expressão de receptores ativadores DNAM-1, NKp30 e NKp44 das células NK e NK-like T, do sangue e ascite de pacientes com neoplasia de ovário. Foi colhido sangue de 24 pacientes com neoplasia de ovário (11 benignas, Bng; 6 malignas sem metástases, Mlg e 7 malignas com metástases, MlgMt) e ascite (Asc) de 6 pacientes, mediante consentimento assinado. Células mononucleares foram separadas por gradiente de centrifugação. A ativação das células NK e NK-like T foi determinada pela expressão da molécula CD107a por meio da citometria de fluxo, quando coincubadas com as células K562 (proporção 1:1). Foram comparados os efeitos de dois procedimentos de cultivo celular, um de curta duração (18h) empregando meio RPMI-1640 suplementado com SFB (10%), L-glutamina (2mM) e IL-2 (1000UI/ml) e outro de longa duração (21 dias) empregando meio SCGM CellGro suplementado com anti-CD3 (10ng/ml, nos primeiros 5 dias), IL-2 (1000UI/ml) e SFB (10%) em relação à atividade funcional e a expressão dos receptores ativadores. A atividade funcional das células NK pareceu ser afetada em decorrência da evolução da doença. A estimulação com IL-2 de curta duração aumentou a atividade funcional das células NK, mas não significantemente. A estimulação com IL-2 de longa duração aumentou a atividade funcional das células NK significantemente (p<0.001). A porcentagem de células NK expressando os receptores ativadores DNAM-1, NKp30 e NKp44 aumentou significantemente (p<0.05) depois da estimulação com IL-2 de longa duração. As células NK-like T apresentaram baixa atividade funcional nos períodos de estimulação de pré e curta duração e nenhuma atividade na estimulação de longa duração. Foi observado que a integridade funcional das células NK foi comprometida com o desenvolvimento do câncer de ovário. A estimulação de longa duração resultou em um maior número de células NK funcionais quando comparado à de curta duração, conferindo este método para uso imunoterápico. A estimulação de longa duração também foi eficiente no aumento da expressão do receptor ativador DNAM-1 nas células NK, sugerindo este método para reverter à supressão deste receptor, que frequentemente é observada em pacientes com carcinoma de ovário. A falta de ativação das células NK-like T (pré, curta e longa duração) sugere que, no sistema experimental aplicado, estas células não são ativadas pela via imune inata / Abstract: NK cells are lymphocytes known by their ability to eliminate a variety of malignant cells without previous stimulation, in a process involving innate recognition by an array of stimulatory and inhibitory receptors. Similarly, the variant subset of NK-like T lymphocytes has been reported to eliminate tumor cells, but the targeting process might involve either innate or adaptive immune recognition. This study evaluated the functional activation of NK and NK-like T cells, the expression of activating receptors DNAM-1, NKp30 and NKp44 (pre, short- and long-term IL-2 stimulated), from blood and ascites of ovarian neoplasia patients. Blood was collected from 24 patients with ovarian neoplasias after signed consent: 11 benign (Bng), 6 malignant without metastasis (Mlg) and 7 malignant with metastasis (MlgMt). Ascites (Asc) was collected from 6 patients with ovarian neoplasia. Mononuclear cells were separated by gradient centrifugation. NK and NK-like T cells activation (pre, short- and long-term stimulated) was evaluated against K562 (1:1 ratio) by the expression of CD107a, analyzed by flow cytometry. Short-term stimulation with IL-2 (1000UI/ml) was conducted overnight in RPMI-1640 medium supplemented with FBS (10%) and L-glutamine (2mM). Long-term stimulation was conducted by a 21 day culturing process with SCGM CellGro medium supplemented with anti-CD3 (10ng/ml, first 5 days), IL-2 (1000UI/ml) and FBS (10%). The functional activation of NK cells pre stimulated seemed to be impaired with the progression of the disease. Short-term stimulation increased NK cells activation, but not significantly. Long-term stimulation increased NK cells activation significantly (p<0.001). The percentage of NK cells expressing the activating receptors DNAM-1, NKp30 and NKp44 increased significantly (p<0.05) after long-term stimulation. NK-like T cells showed low activation on pre and short-term and none activation on long-term IL-2 stimulation. Long-term stimulation resulted in a much higher number of functional NK cells compared to short-term, entitling this method for adoptive therapy. Long-term stimulation was particularly efficient to up-regulate DNAM-1 activating receptor on NK cells, representing a way to overcome down-regulation demonstrated on patients with ovarian carcinoma. The lack of activation of NK-like T cells (pre, short- and long-term IL-2 stimulated) suggests that, in the method applied; these cells are not activated through innate pathway / Mestrado / Fisiopatologia Ginecológica / Mestre em Ciências da Saúde

Les cellules NK sont des lymphocytes de l'immunité innée impliqués dans la reconnaissance et l'élimination de cellules tumorales ou infectées par des pathogènes intracellulaires. La biologie des cellules NK est régulée par des facteurs intrinsèques comme les facteurs de transcription ainsi que par des facteurs environnementaux comme les cytokines, produites en condition homéostatique ou inflammatoire. Certaines cytokines, comme l'IL-15, l'IL-12 ou l'IL-18 sont connues pour potentialiser les fonctions effectrices des cellules NK. L'IL-15, en activant la voie STAT5 permet, d'une part, d'assurer la survie des cellules NK et, d'autre part via la kinase mTOR, d'induire leur prolifération, d'augmenter leur métabolisme ainsi que leurs fonctions effectrices. D'autres cytokines comme le TGF-ß sont connues pour inhiber les fonctions des cellules NK. Le TGF-ß1 est une des cytokines les plus immunosuppressives du système immunitaire et, en étant secrété´ par différents types de cancers, il participe a` l'échappement tumoral. Depuis longtemps, les effets du TGF-ß in vitro sont connus pour contrer ceux de l'IL-15. L'objectif de ce travail a été´ d'étudier les effets du TGF-ß sur la biologie des cellules NK. Nous avons observé´ que l'ajout de TGF-ß, in vitro, induit un blocage rapide de l'activation de la voie mTOR par l'IL-15, que le TGF-ß a des effets très proches de ceux de la rapamycine, un inhibiteur spécifique de mTOR et que, in vivo chez la souris, l'activation constitutive des voies de signalisation activées par le TGF-ß induit un phénotype proche de celui de la délétion de mTOR dans les cellules NK / NK cells are innate lymphocytes involved in the recognition and elimination of tumor or infected cells. The biology of NK cells is regulated by intrinsic factors such as transcription factors but also by cytokines produced at steady state or under inflammatory conditions. Some of these cytokines like IL-15, IL-12 or IL-18 are known to increase NK cells functions. IL-15 allows NK cell survival via STAT5 and, via mTOR, increase NK cell proliferation, metabolism and acquisition of functions. In the other hand, cytokines like TGF-ß are known to inhibit NK cell function. TGF-ß1 is a major immunosuppressive cytokine, often secreted by tumor cells and participates to tumor escape. The inhibitory effects of TGF-ß in vitro on IL-2/15 mediated NK cell activation have long been shown, but the mechanism remains unknown. The objective of this work was to characterize the effects of TGF-ß at a molecular level. We have observed that TGF-ß induces a rapid blockade of IL-15 induced mTOR activation, in vitro. TGF-ß and the mTOR inhibitor rapamycin have similar effects. Finally, using genetic mouse models in vivo, constitutive TGF-ß signaling or mTOR deletion results in similar developmental arrests in NK cells

Orientadores: Ronei Luciano Mamoni, Maria Heloisa Souza Lima Blotta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T10:53:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Longhi_LarissaNaraAlegrini_D.pdf: 4091504 bytes, checksum: 149e4a062c177377d07fb66598d14e85 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Pesquisas recentes têm demonstrado a importância da resposta imune inata no controle da resposta adaptativa. Em estudo anterior pudemos demonstrar que as células Natural Killer (NK) participam da resposta imunológica ao Paracoccidioides brasiliensis, agente etiológico da Paracoccidioidomicose (PCM). Atualmente sabe-se que células dendríticas (DCs) são capazes de interagir com células NK, aumentando a sua atividade. O objetivo deste trabalho foi avaliar o mecanismo utilizado pelas células NK no reconhecimento de células leveduriformes de P. brasiliensis e, se DCs estimuladas pelo fungo são capazes de interagir com células NK e por conseguinte influenciar a diferenciação de linfócitos T. Foram utilizadas DCs derivadas de monócitos e células CD56+ (NK) isoladas do sangue periférico de indivíduos saudáveis. A análise do papel dos receptores do tipo toll (TLR-2 e TLR-4) e do receptor de complemento 3 (CR3 - CD11b) no reconhecimento do P. brasiliensis pelas células NK demonstrou que este último receptor é provavelmente mais importante, uma vez que o seu bloqueio diminuiu a ativação e a atividade citotóxica direta das células NK contra o fungo. Enquanto que o TLR2, em conjunto com o CR3 leva à produção de citocinas como IFN-gama e TNF-alfa. Além disso, nossos resultados demonstraram que DCs estimuladas com o fungo são ativadas e produzem citocinas importantes para a ativação de células NK (IL-12, IL-18, IL-23 e IL-15). Células NK estimuladas com essas citocinas ou cocultivadas com DCs (previamente estimuladas com leveduras do fungo) apresentam maior capacidade de proliferação, aumento na expressão de marcadores de ativação (CD25 e CD69), aumento na capacidade fungicida e aumento da produção de citocinas como IFN-gama e TNF-alfa. Esses efeitos foram parcialmente dependentes de contato, provavelmente envolvendo a participação de IL-15 associada à membrana das DCs, e também à produção de citocinas solúveis (IL-12, IL-23 e IL-18) pelas DCs. Por outro lado, a interação entre células NK e DCs leva estas últimas a aumentarem a expressão de moléculas coestimulatórias (CD80 e CD86) e de moléculas de MHC de classe II, importantes para a apresentação de antígenos aos linfócitos T. Também pudemos observar que a interação entre DCs estimuladas com células leveduriformes de P. brasiliensis e células NK levam a diferenciação de linfócitos T CD4+ e T CD8+ produtores de IFN-gama, ao mesmo tempo inibindo a diferenciação de linfócitos T produtores de IL-4. Em conjunto nossos resultados demonstraram que a interação entre DCs e células NK estimuladas com células leveduriformes de P. brasiliensis leva a um aumento tanto da ativação das DCs quanto das células NK, e que essa interação pode ser importante para modular a resposta imunológica adquirida subsequente / Abstract: Several studies have shown that the innate immune response presents a fundamental role in controlling the adaptive immune response. In a previous study we demonstrated that natural killer cells (NK) participate in the immune response to Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM). Currently it is known that dendritic cells (DCs) are able to interact with NK cells, increasing its activity. The objective of this study was to evaluate the mechanism used by NK cells in the recognition of P. brasiliensis yeast cells and, whether DCs stimulated by the fungus are able to interact with NK cells and therefore influence the differentiation of T lymphocytes. We used DCs derived from monocytes and CD56 + (NK) cells isolated from peripheral blood of healthy individuals. We analyzed the role of some toll-like receptors (TLR-2 and TLR-4) and the complement receptor 3 (CR3 - CD11b) in the recognition of P. brasiliensis NK cells. Our results showed that the CR3 is probably more important, since that its blockage decreased the activation and the direct cytotoxic activity of NK cells against the fungus. Furthermore, activation via TLR2, together with CR3, leads to the production of cytokines such as IFN-gamma and TNF-alpha. Moreover, our results demonstrated that DCs stimulated with the fungus are activated and produce cytokines important for the activation of NK cells (IL-12, IL-18, IL-23 and IL-15). NK cells stimulated with these cytokines or co-cultured with DCs (previously stimulated with yeast cells) presented greater capacity for proliferation, increased expression of activation markers (CD25 and CD69), increased fungicide capacity and increased production of cytokines such as IFN-gamma and TNF-alpha. These effects were partially dependent on contact, probably involving the participation of membrane associated IL-15, and also the production of soluble cytokines (IL-12, IL-23 and IL-18) by DCs. In addition, the interaction between NK cells and DCs leads to an increased expression of molecules important for the antigen presentation to T cells, such as costimulatory molecules (CD80 and CD86) and class II MHC on DCs. We also observed that the interaction between DCs (stimulated with the fungus) and NK cells increased the differentiation of T CD4+ and T CD8+ cells into IFN-gamma producing lymphocytes, while inhibited the differentiation of IL-4 producing T lymphocytes. Altogether our results demonstrate that the crosstalk between DCs and NK cells stimulated with P. brasiliensis yeast cells leads to an increased activation of both DCs and NK cells, and that this interaction can be important for modulating the subsequent acquired immune response against the fungus / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutora em Ciências Médicas

As células Natural Killer (NK), quando estimuladas por meio de seus receptores, rapidamente produzem citocinas e quimiocinas, incluindo IFN?, TNF?, TGF?, GMCSF, MIP1?, MIP1?, IL-10 e outras, as quais podem afetar a função de outras células hematopoéticas. Considerando as evidências recentes de que as célulastronco hematopoéticas (CTH) respondem diretamente à sinalização de várias citocinas, acreditamos que a produção de citocinas mediada pelas células NK possa regular a função da CTH e que a sua desregulação possa favorecer a transformação maligna. As neoplasias mieloproliferativas (NMP) negativas para o rearranjo t(9;22)/BCR-ABL1, incluindo as entidades Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MFP), são doenças hematopoéticas originadas de alteração clonal da CTH, e podem servir de modelo para o estudo dessa regulação NK-CTH. Além de mutações que ativam vias de proliferação e sobrevivência celular, como a mutação JAK2V617F, presente em mais da metade das NMP, outros mecanismos contribuem para a patogênese e manutenção da doença, tais como mutações adicionais e regulação da hematopoese neoplásica pelo microambiente da medula óssea. Este último inclui não apenas células do estroma, mas também células do sistema imune. Dessa forma, com objetivo de investigar a potencial contribuição das células NK para a patogênese das NMP, caracterizamos células do sangue periférico de pacientes com NMP do Ambulatório de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, bem como células esplênicas obtidas de animais de um modelo murino condicional knockin de expressão heterozigótica da Jak2V617F (Jak2VF) quanto à frequência, expressão de receptores e função das células NK. Observamos menor porcentagem de células NK e maior expressão do receptor inibitório NKG2A nos animais Jak2 wt/VF. Pacientes portadores de NMP apresentaram número absoluto de células NK-CD16+ reduzido em relação aos controles saudáveis. O número de células NK-CD16+ foi menor na MFP em relação aos controles e à TE, particularmente naqueles portadores da mutação JAK2V617F. Encontramos menor expressão do receptor de ativação NKG2D nos portadores de PV positivos para a mutação JAK2V617F. Houve menor expressão do receptor de ativação NKp46 nos portadores de NMP, particularmente nos portadores da mutação JAK2V617F, e nos pacientes com MFP. Observamos também menor expressão do receptor NKG2A nos portadores de TE negativos para a mutação JAK2V617F. Em concordância com a redução de células NK, a porcentagem de linfócitos totais mostrou-se reduzida nos pacientes com NMP, particularmente nos portadores de MFP, independentemente da mutação JAK2V617F. Encontramos redução percentual e absoluta do subtipo de células NK CD56brightCD16- (cuja principal função é secretória) nos pacientes com NMP, especialmente na presença da mutação JAK2V617F, nos pacientes com PV e MFP, e menor frequência absoluta do subtipo CD56-CD16bright (com função primariamente citotóxica) nos portadores de MFP. Em contraste, não verificamos deficiência citotóxica das células NK dos animais Jak2 wt/VF em relação aos controles Jak2 wt/wt. Adicionalmente, as células NK dos animais Jak2-mutados demonstraram menor capacidade de secreção da citocina MIP-1?, reconhecida por regular a função de CTH, em relação aos animais controle. Finalmente, houve expressão significativamente aumentada do gene MyD88 nos animais mutados em relação aos controles, sugerindo que a via de sinalização dos receptores do tipo Toll (TLR) pode estar envolvida na regulação NKCTH nas NMP. Em resumo, detectamos deficiência numérica e funcional de células NK em células primárias murinas e humanas de NMP. Nossos achados sugerem potencial regulação da hematopoese maligna pelas células NK nestas neoplasias e podem contribuir para a identificação de novas estratégias terapêuticas que possam interferir nesta complexa interação. / Natural Killer (NK) cells, when stimulated by their receptors, rapidly produce cytokines and chemokines, including IFN?, TNF?, TGF?, GM-CSF, MIP1?, MIP1?, IL-10 and others, which may affect the function of other hematopoietic cells. Considering the recent evidence that hematopoietic stem cells (HSC) directly respond to cytokine signaling, we hypothesized that NK cells mediated cytokine production can regulate HSC function and that their dysregulation may favor malignant transformation. BCR-ABL1-negative myeloproliferative neoplasms (MPN), including Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF), are hematopoietic diseases originated from HSC clonal transformation, and thus can serve as a model for studying this NK-HSC regulation. In addition to mutations that activate cell proliferation and survival pathways, such as the JAK2V617F mutation, present in more than half of MPN cases, other mechanisms contribute to the pathogenesis and maintenance of the disease, such as additional mutations and regulation of neoplastic hematopoiesis by the bone marrow microenvironment. This latter includes not only stromal cells but also cells of the immune system. Therefore, in order to investigate the potential contribution of NK cells to the pathogenesis of MPN, we characterized the frequency, receptor expression and function of NK cells from patients with MPN from the Clinical Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo, as well as from splenic cells obtained from animals of a conditional knockin murine model of Jak2V617F heterozigous expression. Lower percentage of NK cells and higher NKG2A inhibitory receptor expression was observed in Jak2 wt/VF animals as compared to Jak2 wt/wt controls. In agreement, patients with MPN presented reduced absolute numbers of NK-CD16+ cells when compared to healthy controls. The number of NKCD16+ cells was lower in the PMF than in controls or ET patients, particularly in those bearing the JAK2V617F mutation. We found lower expression of the NKG2D activatory receptor in PV patients with the JAK2V617F mutation. There was lower expression of the NKp46 activatory receptor in MPN patients, particularly in those with the JAK2V617F mutation, and in PMF patients. We also observed reduced expression of the NKG2A receptor in non-JAK2 mutated ET patients. In agreement with the NK cell reduction, the percentage of total lymphocytes was reduced in patients with MPN, particularly in PMF, regardless of the JAK2V617F mutation. We found an absolute decrease of the CD56brightCD16- NK subtype (whose main function is secretory) in patients with MPN, especially when the JAK2V617F mutation was present, in patients with PV and PMF. Also, lower absolute frequency of CD56-CD16bright NK subtype (primarily cytotoxic) was found in PMF patients. In contrast, we did not find cytotoxic deficiency in the Jak2 wt/VF NK cells as compared to the Jak2 wt/wt controls. In addition, Jak2-mutated NK cells presented reduced ability of secreting the cytokine MIP-1?, known to regulate HSC function. Finally, there was significantly increased expression of the MyD88 gene in the Jak2-mutated animals as compared to controls, suggesting that the Toll-like receptors (TLR) signaling pathway may be involved in NK-HSC regulation in MPN. In summary, we detected numerical and functional deficiency of NK cells in murine and human primary cells of MPN. Our findings suggest a potential regulation of malignant hematopoiesis by NK cells in these neoplasms and may contribute to the identification of new therapeutic strategies that may target this complex interaction.