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Análise proteômica diferencial aplicada para o estudo da morte súbita dos citros / \"Differential proteomic analysis of the citrus sudden death disease\"

Cantú, Marcelo Delmar 20 April 2007 (has links)
Este projeto teve como objetivo principal realizar um estudo proteômico diferencial aplicado às amostras de casca do caule de plantas cítricas sadias e infectadas pela morte súbita dos citros. Subsequentemente, a identificação de proteínas diferentemente expressas será de grande importância, uma vez que estas poderão servir não somente como candidatos a biomarcadores para a doenças, mas também auxiliarão no melhor compreensão da doença. À partir dos géis bidimensionais obtidos para amostras de porta-enxerto (limão cravo e limão volkameriano) e copa (laranja valência) foi possível verificar que existem dois conjuntos de proteínas sensivelmente sub-expressas em plantas doentes. Um desses conjuntos, constituído por 13 spots, apresenta valores de pI entre 4,5 e 5,2 e MM aproximadamente igual a 30 kDa. No outro conjunto, esse composto por 9 spots, valores de pI variando entre 6,1 e 9,6 e MM em torno de 20 kDa são observados. Por meio das técnicas de MALDI-TOF-TOF e LC-ESI-MS/MS, inúmeros spots foram inequivocamente identificados, incluindo os spots correspondentes às regiões diferentemente expressas. Os 13 spots correspondentes a região com valores de pI entre 4,5 e 5,2 e MM ~ 30 kDa foram todos identificados como sendo constituídos por três isoformas de quitinases. Por outro lado, os spots referentes a região com pI entre 6,1 e 9,6 e MM ~ 20 kDa foram identificados como proteína putativa similar a miraculina 2. A justificativa para o fato de diversos spots terem recebido a mesma identificação é atribuída às inúmeras e diferentes modificações pós-traducionais, comumente verificadas em plantas. Entretando, o aspecto mais relevante relacionado a essas identificações é o fato de que ambas as proteínas são conhecidas marcadoras de resistência de defesa em plantas e assim sendo, a priori, espera-se-ia que estivessem sendo super expressas em plantas doentes. Porém, um comportamento inverso foi verificado, o que reforça as evidências de que as quitinases não agem apenas como marcadores de defesa em plantas, possuindo assim outras funções. Além disso, no total, outras 19 proteínas puderam ser identificadas. / The main goal of this project was to perform a differential proteomic analysis of bark tissues of healthy and CSD (citrus sudden death)- affected citrus plants. Subsequently, the identification of differently expressed proteins will be of great importance since they can be used not only as biomarkers for CSD but also as basic information for improving the knowledge about the disease. According to the 2D gels, obtained for bark tissues of both rootstock (rangpur lime and volkamerian lemon) and scion samples, there are two sets of proteins remarkably under expressed in CSD-affected samples. One of these sets is composed by 13 proteins, which presents MW around 30 kDa and pI ranging from 4.5 to 5.2. The other set includes 9 proteins with pI ranging from 6.1 to 9.6 and MW around 20 kDa. By using two mass spectrometry approaches (MALDI-TOF-TOF and LC-ESI-MS/MS), several proteins have been unequivocally identified, including the differentially expressed ones. Thirteen spots have been identified as a mixture of three chitinase isoforms. These spots are relative to the region with pI ranging from 4.5 to 5.2 and MW ~ 30 kDa. On the other hand, the 9 spots referent to the region with MW ~ 20 kDa and pI between 6.1 and 9.6 were identified as putative miraculin-like 2 protein. Several spots have been identified as the same protein most probably due to the occurrence of different post-translational modifications. The most valuable point regarding the identity of these proteins is the fact that they are well-known plant pathogen-related proteins and then they should be over expressed in affected plants. However, the opposite behavior was verified, which may indicate that chitinases and putative miraculin-like 2 protein perform unknown functions, besides the established ones. In addition, other 19 constitutive proteins have been identified.
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Micoflora e ocorrência de micotoxinas em grãos de trigo recém-colhidos e armazenados. / Mycoflora and occurrence of mycotoxins in grains of wheat freshly harvested and stored.

Barbosa, Cynara Baltazar 19 March 2014 (has links)
O presente estudo objetivou avaliar a microbiota fúngica e a ocorrência de micotoxinas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à Espectrometria de Massas em amostras de grãos de trigo recém-colhidas e armazenadas. Os resultados revelaram a predominância do gênero Alternaria nas amostras de todas as coletas, seguido de Epicoccum (12,6%), Fusarium (8,3%) e mais 16 outros gêneros de fungos filamentosos. As espécies de Fusarium e Alternaria foram identificadas utilizando métodos moleculares, sendo F. graminearum e A. alternata as espécies mais frequentes. De 70 amostras, 69 (98,6%) estavam contaminadas com a toxina DON (210-2910 ppb) e 3 (4,3%) amostras contaminadas com a toxina ZEA (20-30,1 ppb). O nível de contaminação por DON é inferior aos limites estabelecidos recentemente pela legislação brasileira (3000 ppb), porém superam os limites da Comunidade Européia (1750 ppb). É prudente que se realize um monitoramento contínuo de grãos de trigo a fim de avaliar a exposição dos consumidores às contaminações e estabelecer diretrizes de segurança alimentar. / The present study aimed to evaluated the mycoflora and occurrence of mycotoxins by high performance liquid chromatography coupled to tandem mass in freshly harvested and stored wheat samples. The results showed the predominance of genus Alternaria in all samples, followed by Epicoccum (12.6%), Fusarium (8.3%) and over 16 other genera of filamentous fungi. The species of Fusarium and Alternaria were identified using molecular methods, and F. graminearum and A. alternata were the most frequent species. Of 70 samples, 69 (98.6%) were contaminated with toxin DON (210-2910 ppb), and 3 (4.3%) samples contaminated with the toxin ZEA (20-30.1 ppb). The level of DON contamination is below of the limits recently established by Brazilian legislation (3000 ppb), but exceed the limits of the European Community (1750 ppb). It is prudent to perform a continuous monitoring of wheat to assess consumer exposure to contaminants and establish guidelines for food safety.
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Influência do EPP-AF® na atividade da glicoproteína P e do citocromo P450 em voluntários sadios usando coquetel de marcadores / Effect of EPP-AF® on cytochrome P450 and P-glycoprotein activity in healthy subjects using the cocktail approach

Cusinato, Diego Alberto Ciscato 24 August 2017 (has links)
O EPP-AF® é um extrato padronizado de própolis quimicamente caracterizado e com eficácia e segurança pré-clínica estabelecidas. O objetivo principal deste trabalho foi realizar um ensaio clínico de segurança para avaliar a influência do EPP-AF® na atividade da P-gp e das principais isoformas CYP, através de um teste in vivo tipo coquetel de fármacos marcadores administrados em doses subterapêuticas. Foram investigados 16 voluntários adultos sadios antes e após a exposição a 375 mg de EPP-AF® por via oral durante 15 dias. As amostras seriadas de sangue foram colhidas até 12 h após a administração do coquetel contendo midazolam (0,2 mg), cafeína (10 mg), omeprazol (2 mg), metoprolol (10 mg), losartana (2 mg) e fexofenadina (10 mg). Foram desenvolvidos e validados três métodos analíticos empregando LC-MS/MS para quantificar as concentrações plasmáticas de fexofenadina, losartana, E-3174 (método 1), omeprazol, 5-OH-omeprazol, midazolam, metoprolol, ?-OHmetoprolol (método 2) e cafeína (método 3). Os métodos não apresentaram efeito matriz ou efeito residual e mostraram-se lineares para os analitos nos intervalos de 0,05-20 ng/mL (fexofenadina); 0,03 - 5 ng/mL (losartana e E31-74); 0,1 - 50 ng/mL (omeprazol), 0,3 - 50 ng/mL (5-OH-omeprazol), 0,01 - 10 ng/mL (midazolam), 0,05 - 50 ng/mL (metoprolol e ?- OH-metoprolol) e 5 - 1000 ng/mL (cafeína). Os parâmetros farmacocinéticos dos compostos foram calculados com base nas curvas de concentração plasmática versus tempo (AUC) empregando o programa Phoenix® WinNonlin®. Os valores das razões das AUC0-t e Cmax após e antes da exposição ao EPP-AF®, apresentados como média geométrica (IC90%) foram de 0,74 (0,62 - 0,89) e 0,90 (0,76 - 1,07) para fexofenadina; 0,88 (0,80 - 0,97) e 0,86 (0,76 - 0,98) para losartana; 0,96 (0,83 - 1,11) e 0,91 (0,79 - 1,04) para E-3174; 1,18 (0,91 - 1,54) e 1,21 (0,87- 1,70) para omeprazol; 1,12 (0,95 - 1,31) e 1,22 (0,95 - 1,67) para 5-OHomeprazol; 1,14 (1,03 - 1,28) e 1,21 (1,00 - 1,46) para o midazolam; 1,04 (0,92 - 1,18) e 0,94 (0,80 - 1,12) para o metoprolol; 1,05 (0,99 - 1,12) e 0,99 (0,88 - 1,12) para ?-OH-metoprolol; 0,97 (0,77 - 1,21) e 0,87 (0,69 - 1,11) para a cafeína. Quando observadas as razões metabólicas das AUC0-t E3174/losartana, 5-OH-omeprazol/omeprazol e ?-OHmetoprolol/ metoprolol encontramos, respectivamente, 1,11 (0,98 - 1,25); 0,94 (0,81 - 1,10) e 1,01 (0,88 - 1,16), indicando que, com exceção do CYP2D6, a administração de EPP-AF® nas condições estudadas apresenta potencial para inibição das isoformas CYP2C19 e CYP3A4 e indução das enzimas CYP1A2, CYP2C9 e do transportador de efluxo P-gp, embora as suas magnitudes encontram-se abaixo dos limites definidos pelos órgãos reguladores e portanto não apresentam relevância clínica / EPP-AF® is a standardized extract of propolis chemically characterized and with established pre-clinical efficacy and safety. The main objective of this work was to perform a clinical trial to evaluate the effect of EPP-AF® on P-gp and the major CYP isoforms activity, through an in vivo assay using the cocktail approach with sub-therapeutic doses. Sixteen healthy adult volunteers were investigated before and after exposure to orally administered 375 mg/day of EPP-AF® for 15 days. Serum blood samples were collected up to 12 h after the administration of midazolam (0.2 mg), caffeine (10 mg), omeprazole (2 mg), metoprolol (10 mg), losartan (2 mg) and fexofenadine (10 mg). Three analytical methods were developed and validated applying LC-MS/MS to quantify plasma concentrations of fexofenadine, losartan, E-3174 (method 1), omeprazole, 5-OH-omeprazole, midazolam, metoprolol, ?-OH-metoprolol (method 2), and caffeine (Method 3). Neither matrix effect nor carryover effect were observed. The methods were linear for the analytes in the ranges of 0.05 - 20 ng/mL (fexofenadine); 0.03 - 5 ng/ml (losartan and E-3174); 0.1 - 50 ng/mL (omeprazole), 0.3 - 50 ng/mL (5-OH-omeprazole), 0.01 - 10 ng/mL (midazolam), 0.05 - 50 ng/mL (metoprolol and ?-OH-metoprolol) and 5 - 1000 ng/mL (caffeine). The pharmacokinetic parameters of the compounds were calculated based on plasma concentration versus time (AUC) curves applying Phoenix® WinNonlin® software. AUC0-t and Cmax ratios after and before the EPPAF ® exposure, presented as geometric mean (CI 90%) were 0.74 (0.62 - 0.89) and 0.90 (0.76 - 1.07) for fexofenadine, 0.88 (0.80 - 0.97) and 0.86 (0.76 - 0.98) for losartan, 0.96 (0.83 - 1.11) and 0.91 (0.79 - 1.04) for E-3174, 1.18 (0.91 - 1.54) and 1.21 (0.87 - 1.70) for omeprazole; 1.12 (0.95 - 1.31) and 1.22 (0.95 - 1.67) for 5-OH-omeprazole, 1.14 (1.03 - 1.28) and 1.21 (1.00 - 1.46) for midazolam, 1.04 (0.92 - 1.18) and 0.94 (0.80 - 1.12) for metoprolol, 1.05 (0.99 - 1.12) and 0.99 (0.88 - 1.12) for ?-OH-metoprolol, 0.97 (0.77 - 1.21) and 0.87 (0.69 - 1.11) for caffeine. AUC0-t metabolic ratios of E3174/losartan, 5-OH-omeprazole/omeprazole and ?-OH-metoprolol/metoprolol we found to be, respectively, 1.11 (0.98 - 1.25), 0.94 (0.81 - 1.10 ) and 1.01 (0.88 - 1.16), indicating that, with the exception of CYP2D6, the administration of EPP-AF® under the conditions studied shows potential for CYP2C19 and CYP3A4 inhibition and CYP1A2, CYP2C9 and P-gp induction, although their magnitudes are below the limits defined by the regulatory agencies and therefore exhibit no clinical relevance
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Avaliação da bioequivalência de formulações contendo lorazepam através de método bioanalítico utilizando a cromatografia líquida acoplada ao sistema de detecção por espectrometria de massa / A bioanalytical method using liquid chromatography coupled to MS/MS detection system for the quantification of Lorazepam in human plasma aiming bioequivalence studies.

Sampaio, Maurício Rocha de Magalhães 17 April 2008 (has links)
Desenvolveu-se método de alta sensibilidade e especificidade por cromatografia liquida de alta eficiência acoplada a detecção por espectrometria de massas (LC-MS/MS) para quantificação do lorazepam em plasma humano visando aplicação em estudo de bioequivalência entre duas formulações de comprimidos contendo esse fármaco. A preparação das amostras de plasma foi feita por extração líquido-líquido usando hexano:diclorometano (60:40 v/v) como solvente de extração. O padrão interno usado foi o bromazepam. A separação cromatográfica ocorreu utilizando-se coluna analítica modelo Gemini® C18 110 A (150 mm x 4,6 mm; partículas de 5µm). Mistura de metanol e tampão acetato de amônio 10 mM (80:20, v/v), acrescida de 0,1% de ácido fórmico ao final da preparação, foi usada como fase móvel. A interface entre HPLC e MS/MS foi a fonte de ionização por eletrospray (ESI) operando em modo positivo (ES+). O analito e o PI foram monitorados e quantificados através de multiple reaction monitoring (MRM). As transições monitoradas foram m/z 320,69 > 274,96 para o lorazepam e m/z 318,00 > 182,20 para o padrão interno. O método foi validado na faixa de concentração de 0,50 a 80,0 ng/ml em plasma humano. A bioequivalência entre as formulações foi determinada através dos intervalos de confiança 90 % obtidos para as razões dos parâmetros farmacocinéticos Cmax (99% - 114%), AUC0-t (93% - 105%) e AUC0-inf (96% - 107%). Concluiu-se que as duas formulações podem ser administradas de maneira intercambiável sem prejuízo da eficácia terapêutica. / A method of liquid chromatography coupled to mass spectrometric detection (LC-MS/MS) with high sensitivity and specificity was developed to quantify Lorazepam in human plasma. This method was applied in a bioequivalence study between two tablet formulations. The preparation of plasma samples were performed by liquid-liquid extraction using hexanedichloromethane (60:40 v/v) as extraction solvent. The internal standard was bromoazepam. The chromatographic separation was achieved using the Gemini® C18 110A (150 mm x 4.6mm; 5µm particles) analytical column. The mobile phase was prepared from a mixture of methanol and 10mM of ammonium acetate (80:20, v/v), and finally adding 0.1% of formic acid. The HPLC and MS/MS interface was the electrospray ionization source (ESI), operating in positive mode (ESI+). The analyte and internal standard were monitored and quantified through multiple reaction monitoring (MRM). The monitored transitions were m/z 320.69 > 274.96 for lorazepam and m/z 318.00 > 182.20 for the internal standard. The method was validated over the range 0.50 to 80.0 ng/mL in human plasma. The bioequivalence between the two formulations was determined inside the 90% confidence interval for the pharmacokinetic parameters, Cmax (99% - 114%), AUC0-t (93% - 105%) and AUC0-inf (96% - 107%). It was concluded that the two formulations can be administered in an interchangeable manner without losing the therapeutic efficiency.
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Estudo de depleção residual de benzoato de emamectina em filés de peixe e estimativa de período de carência / Depletion study of emamectin benzoate in fish fillet and determination of withdrawal period

Fraccarolli Neto, Pedro 11 June 2018 (has links)
O benzoato de emamectina, um antiparasitário da classe das avermectinas, é amplamente utilizado em diversos países para o tratamento de infecções causadas por helmintos intestinais e ectoparasitas, os quais estão relacionados a grandes prejuízos na produção aquícola. Apesar de sua eficácia ser conhecida na aquicultura, seu uso não está regulamentado no Brasil. Diante da demanda nacional por uma maior variedade de medicamentos veterinários regulamentados para uso em espécies aquícolas, o presente projeto visou estimar um período de carência para o antiparasitário benzoato de emamectina, a partir de um estudo experimental de depleção residual desse fármaco em tilápia (filé com pele em proporção natural), a espécie de maior importância comercial para a produção aquícola no Brasil. Para tanto, fez-se necessárias as seguintes etapas: (i) incorporar o benzoato de emamectina na ração através da técnica de revestimento polimérico em equipamento de leito fluidizado; (ii) desenvolver e validar métodos analíticos para a determinação do benzoato de emamectina na ração e em filé de tilápia empregando cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC- MS/MS); e (iii) realizar um ensaio com tilápias para avaliar a depleção residual de emamectina B1a no filé. O revestimento da ração com 1,5% de etilcelulose permitiu incorporar o benzoato de emaectina na ração sem alterar a estrutura física da mesma, o que torna o processo vantajoso, visto que a ração mantém suas características nutricionais e de flutuabilidade. Além disso, o processo foi homogêneo (CV de 2,1%) e não apresentou taxa de lixiviação quantificável do fármaco para a água, contribuindo para uma maior segurança em relação à dose de tratamento a ser administrada e em relação ao risco potencial ao meio ambiente. A emamectina B1a foi extraída da ração por processo sólido-líquido e do filé de tilápia pelo método QuEChERS modificado. Os métodos foram avaliados mediante os seguintes parâmetros: seletividade, curva analítica, linearidade, precisão, exatidão, limite de detecção (LD) e de quantificação (LQ). Todos os parâmetros avaliados se encontraram conformes às recomendações dos guias de validação tomados como referências, qualificando os métodos como adequados para os objetivos propostos no presente trabalho. Para avaliar a depleção de emamectina B1a no filé de tilápia, os peixes receberam o fármaco via ração em dose de 50 ?g/kgPV/dia durante sete dias consecutivos. As curvas de depleção residual de emamectina B1a se ajustaram ao modelo exponencial de primeira ordem. Tomando como referência o limite máximo de resíduo de 100 ?g/kg recomendado pelo Codex Alimentarius, não houve a necessidade de se propor um período de carência mínimo para o abate dos peixes, considerando as condições experimentais empregadas. / Emamectin benzoate, an antiparasitic of the class of avermectins, it is widely used in several countries for the treatment of infections caused by intestinal helminths and ectoparasites, which are related to great losses in aquaculture production. Although its known effectiveness for aquaculture, its use is not regulated in Brazil. The national demand for a greater variety of regulated veterinary drugs for use in aquaculture species,the current project that aimed to evaluate a withdrawal period for the antiparasitic emamectin benzoate, based on an experimental study of residual depletion of this drug in tilapia ( fillet with skin in natural proportion) the species of major commercial importance for aquaculture production in Brazil. To do so, it was necessary to: (i) incorporate emamectin benzoate into the feed through the polymer coating technique in fluidized bed equipment; (ii) to develop and validate the analytical methods for the determination of emamectin benzoate in the feed and in tilapia fillet using high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS / MS) and (iii) perform a tilapia test to evaluate the depletion of emamectin B1a in fillet. The feed coating with 1.5% ethylcellulose allowed to incorporate the emaectin benzoate into the feed without altering the physical structure, which makes the process advantageous, since the feed retains its nutritional and buoyancy characteristics. In addition, the process was homogeneous (CV 2,1%) and did not present quantifiable leaching rate of the drug into the water, contributing to a greater safety in relation to the dose of treatment to be administered and in relation to potential risk to the environment. Emamectin B1a was extracted from the feed by solid-liquid process and from tilapia fillet by the modified QuEChERS method. The methods were evaluated using the following parameters: selectivity, analytical curve, linearity, precision, accuracy, limit of detection (LD) and quantification (LQ). All the evaluated parameters were in accordance with the recommendations of the validation guides taken as references, qualifying the methods as adequate for the objectives proposed in the present work. To evaluate the depletion of emamectin B1a tilapia fillet, the fish received the drug via feed at a dose of 50 ?g / kgPV / day for seven consecutive days. The residual depletion curves of emamectin B1a were fitted to the first order exponential model. Taking into account the maximum residue limit of 100 ?g / kg recommended by the Codex Alimentarius, there was no need to propose a minimum withdrawal period for the slaughtering of fish, considering the experimental conditions used.
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Desenvolvimento de uma metodologia analítica  por LC-MS/MS para determinação de meta-clorofenilpiperazina em plasma de camundongos submetidos à privação de sono paradoxal / Development of an analytical methodology by LC-MS/MS for determination of meta-chlorophenylpiperazine in plasma of mice submitted to paradoxical sleep deprivation

Polesel, Daniel Ninello 13 December 2012 (has links)
O aumento no uso abusivo e nas apreensões de comprimidos contendo 1-(3-clorofenil)piperazina (mCPP) têm sido observado na Europa desde o final do século 20. A mCPP promove efeitos semelhantes a metilenodioximetanfetamina (ecstasy) e surgiu como uma alternativa menos neurotóxica. Os principais efeitos descritos pelos usuários são sensação de bem-estar, euforia e empatia. Os efeitos adversos observados em casos de intoxicação aguda são a ansiedade, confusão, insônia, ataques de pânico, estados convulsivos, taquicardia e até mesmo a morte. A mCPP frequentemente tem seu uso associado com a privação de sono dos usuários em ambientes noturnos (festas e danceterias). Além disso, o fármaco provoca insônia no usuário, agravando ainda mais as consequências ao sono do indivíduo. O sono REM, em humanos, ou chamado de sono paradoxal nos animais, é uma fase importante do sono, por ser ela a fase de retorno da homeostasia comportamental e bioquímica. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos comportamentais dos isômeros da clorofenilpiperazina e desenvolver um método analítico para identificar e quantificar a mCPP em amostras de plasma de camundongos submetidos à privação de sono paradoxal (PSP) por 24 e 48 horas. A ferramenta analítica empregada para identificar e quantificar a mCPP foi a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). As análises comportamentais de ansiedade e atividade locomotora dos camundongos utilizaram os testes do Labirinto em Cruz Elevado e o teste do Campo Aberto, respectivamente. Os resultados mostraram que a associação da PSP com o uso da mCPP acarretou mudanças comportamentais que voltaram ao nível homeostásico somente após 48 horas de rebote de sono. Além disso, observou-se um aumento significativo na concentração circulante de mCPP nos animais PSP por 48 horas em relação ao grupo controle. Por fim, concluiu-se que a privação de sono paradoxal associada com a administração da mCPP produziu graves consequências comportamentais em camundongos e que a concentração do fármaco encontrado no plasma foi maior nos animais submetidos à privação de sono paradoxal. / The increase on abusive use and seizures of tablets containing 1-(3-chlorophenyl)piperazine (mCPP) have been seen in Europe since the late 20th century. The mCPP promotes effects similar to methylenedioxymethamphetamine (ecstasy) and emerged as a less neurotoxic alternative. The main effects described by users are sense of well-being, euphoria and empathy. The adverse events observed in acute poisoning cases are anxiety, confusion, insomnia, panic attacks, convulsive states, tachycardia and even death. mCPP is often associated with sleep deprivation by their users and on night scenery (parties and discos). In addition, the drug causes insomnia on user, further aggravating the consequences to the individual sleep. REM sleep in humans or referred as to paradoxical sleep, in animals, is an important sleep phase, because it was the phase which promote the return of behavioral and biochemical homeostasis. The aim of this study was to evaluate the behavioral effects of the isomers of chlorophenylpiperazine and develop an analytical method to identify and quantify the mCPP in plasma samples from mice subjected to paradoxical sleep deprivation (PSD) for 24 and 48 hours. The analytical tool used to identify and quantify the mCPP was liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS). The behavioral analysis of anxiety and locomotor activity of mice used the Elevated Plus Maze and Open Field tests, respectively. The results showed that association of PSD with the use of mCPP led to behavioral changes that back to the homeostatic level only after 48 hours of rebound sleep. Furthermore, there was a significant increase in circulating concentration of mCPP in animals paradoxical sleep deprived for 48 hours compared to control group. Finally, it is concluded that paradoxical sleep deprivation associated with administration of mCPP produced severe behavioral effects in mice and concentration of drug found in plasma was greater in animals submitted to paradoxical sleep deprivation than control group.
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Albendazol na piscicultura: estudo de incorporação do fármaco na ração e estimativa do período de carência para a espécie de peixe pacu (Piaractus mesopotamicus) / Albendazole in pisciculture: study for drug incorporation in fish feed and estimation of the withdrawal time for the species of pacu fish (Piaractus mesopotamicus)

Busatto, Zenaís 28 November 2016 (has links)
O albendazol (ABZ) é um antiparasitário amplamente utilizado na medicina veterinária para tratar infecções causadas por parasitas helmínticos, devido ao seu baixo custo de aquisição, alta eficácia e facilidade de administração. Apesar, de sua eficácia ser mundialmente conhecida, seu uso não é regulamentado em espécies aquícolas. Diante da demanda nacional por uma maior variedade de medicamentos veterinários regulamentados para uso na aquicultura, o presente projeto visou estimar o período de carência para o ABZ. Para tanto, foi necessário: (i) incorporar o ABZ na ração através da técnica de revestimento polimérico em equipamento de leito fluidizado; (ii) desenvolver e avaliar os métodos analíticos para a determinação do ABZ na ração e do ABZ e seus metabólitos em filé de pacu empregando cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS) e (iii) realizar um ensaio com pacu para avaliar a depleção do ABZ e seus metabólitos no filé desses peixes. O revestimento da ração com 1,5% de etilcelulose permitiu incorporar o ABZ na ração sem alterar a estrutura física da mesma, o que torna o processo vantajoso, visto que, a ração mantém suas características de flutuabilidade. Além disso, o processo foi homogêneo e diminuiu a lixiviação do fármaco para a água, garantindo a segurança da dose administrada e do meio ambiente. O ABZ foi isolado da ração por extração líquido-líquido. O ABZ e seus metabólitos foram extraídos do filé de pacu pelo método de QuEChERS modificado. Para os dois métodos desenvolvidos, a separação cromatográfica foi realizada em coluna de fase reversa octadecil híbrida. Os métodos foram avaliados mediante os seguintes parâmetros: seletividade, curva analítica, linearidade, precisão e exatidão. Para o método do filé de peixe avaliou-se também o CC? e o CC?. Todos os parâmetros avaliados se encontram de acordo com os guias de validação, o que torna os métodos adequados para os objetivos propostos no presente trabalho. Para avaliar a depleção do ABZ e seus metabólitos no filé de pacu, os peixes receberam o fármaco via ração em dose única de 10 mg de ABZ (kg peso vivo)-1. As curvas de depleção residual do ABZ e seus metabólitos se ajustaram ao modelo exponencial de primeira ordem. Tomando como referência as recomendações da EMA, o período de carência foi estimado em sete dias. / Albendazole (ABZ) is an antiparasitic widely used in veterinary medicine to treat infections caused by parasites anthelmintic, due to its low cost, high efficiency and ease of administration. Regardless of its world widely known effectiveness, its use is not regulated in aquaculture species. Faced with national demand for a greater variety of regulated veterinary drugs for use in aquaculture, this project aimed to estimate the withdrawal time for the ABZ. Therefore, it was necessary to (i) incorporate ABZ the feed through the polymeric coating by spouted bed technique; (Ii) develop and evaluate analytical methods for determining the ABZ in feed and ABZ and its metabolites in pacu fillet using high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS / MS) and (iii) conduct a test with pacu to evaluate the depletion of ABZ and its metabolites in the fillet of these fish. The ration with 1.5% coating of ethylcellulose allowed incorporate ABZ the feed without altering the physical structure of the same, which makes the process advantageous, since the feed maintains its buoyancy characteristics. Furthermore, the process was homogeneous and reduced leaching of the drug into the water, ensuring the safety of the administered dose and the environment. The ABZ ration was isolated by liquid-liquid extraction. The ABZ and its metabolites were extracted from pacu fillet the modified QuEChERS method. For both developed methods, chromatographic separation was performed in a hybrid octadecyl reverse phase column. The methods were evaluated by the following parameters: selectivity, analytical curve, linearity, precision and accuracy. For fish fillet method also assessed whether it CC? and CC?. All parameters are according to the validation guides, which makes the appropriate methods for the objectives proposed in this paper. To evaluate the depletion of ABZ and its metabolites in pacu fillet, the fish were dosed via single dose in feed 10 mg ABZ (kg body weight)-1. The curves of residual depletion ABZ and its metabolites adjusted to the exponential model of the first order. With reference to the recommendations of the EMA, the withdrawal time was estimated at seven days
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Quimiometria aplicada à cromatografia líquida multidimensional capilar hifenizada a espectrometria de massas sequencial para proteômica shotgun / Chemometric approach to a capillary multidimensional liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry for shotgun proteomics

Batiston, Weliton Pedro 19 February 2015 (has links)
O sequenciamento genético do DNA humano permitiu maior compreensão da funcionalidade dos seres vivos e principalmente a causa de muitas doenças. Entretanto, os estudos em genética têm se limitado a resolverem os problemas da ciência, e atualmente, a solução para o avanço nessa área tem se atribuído à proteômica. Dessa forma, a pesquisa em química analítica intensificou-se na busca de estratégias melhores para a caracterização de proteomas, em três aspectos principais: preparo de amostra, desenvolvimento da instrumentação analítica e bioinformática. Verifica-se a possibilidade da aplicação de muitas técnicas, atualmente, destaca-se a análise de peptídeos (proteômica shotgun) por cromatografia líquida multidimensional acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC/LC-MS/MS), devido à possibilidade de automatização, minimização dos problemas e resultados satisfatórios na análise de amostras biológicas complexas. Portanto, neste trabalho desenvolveu-se um método LC/LC-MS/MS (modalidade on-line column switching) o qual se constitui de coluna trocadora catiônica (homemade), trap de aprisionamento e limpeza, coluna capilar hidrofóbica e separação e detecção por espectrometria de massas sequencial automatizada. Com a proposta de uma instrumentação analítica aperfeiçoada, realizamos a confecção de um trap com partículas de elevada retenção dos peptídeos, o que permite ótima recuperação de amostra. Por se tratar de uma técnica de elevada complexidade instrumental, devido a difícil compatibilidade entre as dimensões cromatográficas, possíveis perda de analito no processo e elevado tempo de análise, propomos uma nova abordagem de otimização, por meio de estudos quimiométricos. Assim, neste trabalho, foram avaliados doze parâmetros instrumentais e destes houve uma simplificação de apenas dois fatores, responsáveis por 95% da resposta ótima do método. Este fato permitiu valores da cobertura da proteína de BSA (82,54%), número de peptídeos (65) e score (2134,05) superiores aos reportados na literatura, os quais apresentam tempos de análise maiores. Este estudo fornece informações do comportamento químico dos peptídeos em relação ao método proposto, por meio de uma superfície de resposta e equação matemática que pode contribuir para a aplicação em diferentes proteomas. / The genetic sequence of human DNA has helped the comprehension of life and principally the cause of various diseases. However, genetic studies have limited to resolve science problems and currently solutions to advance in this field have been attributed to proteomics. Thus, the analytical chemistry has intensified on the search for a better strategy to proteomic characterization in three principal aspects: sample preparation, development of analytical instrumentation, and bioinformatics. Proteomics involves the application of many techniques, currently; the peptide analyses (shotgun proteomics) by multidimensional liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC/LC-MS/MS) is the state of the art. The main reasons are because it allows full system automation, less problems in repeatability, and adequate results in analysis of highly complex biological samples. Therefore, this dissertation developed the method LC/LC-MS/MS (modality on-line column switching), this has a cation exchange column (homemade), trap column to clean, hydrophobic capillary column and separation and detection by tandem mass spectrometry. We have proposed an improved analytical instrumentation, with a homemade trap that particles have high retention of peptide, which permit great recuperation of samples. Because it is an instrumental technique difficult, such as, obtain compatibility between the chromatography dimensions, can lose samples in the process and long time analysis, we have proposed a new optimization approach with chemometric analysis of data. On that, were evaluated twelve instrumental parameters and there was a simplification only two factors, these were responsible for 95% of greater response of method. As a result, the coverage of BSA protein was 82,54%, number of peptides 65 and score of 2134,05 values of high significance if compare from that there are in literature that presented greater time analysis. This work describes information about chemistry of peptides to method proposed through a surface of response and math equation that can contribute to different proteomes.
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Analyse multi-résidus de sulfonamides et de leurs métabolites dans les tissus d’origine animale / Multiresidue analysis of sulfonamides and their metabolites in animal tissues

Hiba, Abdallah 17 December 2014 (has links)
Les sulfonamides sont parmi les antibiotiques les plus couramment utilisés en élevage. Ils peuvent en effet, si leur utilisation n’est pas conduite de manière raisonnable, être une source de nombreux risques pour la santé publique. Au Liban, il n’existe pas à l’heure actuelle de règlementation fixant les limites de résidus des sulfonamides dans les tissus d'origine animale. En outre, aucune investigation sur la présence des résidus des sulfonamides sous leurs formes actives ou métabolisée dans les denrées animales n’a été menée. L'analyse d'une matrice complexe telle que la viande a nécessité la mise en œuvre d’une préparation d'échantillon rigoureuse afin obtenir une analyse reproductible, et suffisamment sensible pour atteindre les limites de détection requises. Cette thèse décrit le développement de deux méthodes analytiques pour la détermination de sulfonamides et de leurs métabolites à l’état de traces dans les tissus d’origine animale (bœuf, volaille, porc…). Elles sont basées sur une étape d'extraction utilisant la méthode QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) suivie d'une analyse par HPLC couplée à un analyseur triple quadripôle MS/MS ou LTQ-Orbitrap Velos. Les performances analytiques de ces méthodes ont été évaluées et comparées. Les méthodes d’analyse ont été validées suivant les recommandations de la décision de l’UE (2002/657/EC) et lors d’une étude de validation inter-laboratoires organisée par FAPAS (Food Analysis Performance Assessment Scheme). Au vu des performances obtenues, une étude de contrôle a été réalisée sur les résidus des sulfonamides et de leurs métabolites dans plus de 300 échantillons de différents tissus d’origine animale dérivant de poulets de chair, bœufs, brebis et porcs collectés dans différentes régions d’élevage libanaises / Sulfonamides are amongst the most commonly used veterinary antibiotics. The uncontrolled exposure to sulfonamides upon consumption of meat products can be harmful to human health. In Lebanon, there are no current regulations that specify the safe levels of sulfonamides in animal products. In addition, no studies describing the presence of sulfonamides residues in their active or metabolized form in animal tissues exist. The analysis of residues at trace levels in complex matrices such as meat required the implementation of a rigorous sample preparation and analytical protocol that yields reproducible results at very low concentration levels. This thesis describes the development of two analytical methods for the determination of sulfonamides and their metabolites in animal tissues (e.g. poultry, sheep, pork) at trace levels. They are both based on an extraction step using QuEChERS extraction (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) followed by HPLC. In terms of mass analysers the use of LTQ-Orbitrap Velos and triple quadrupole MS/MS was optimized and the figures of merit were compared. The analytical methods were validated according to the EU decision (2002/657 / EC) criteria and by the participation in an inter-laboratory validation study organized by FAPAS (Food Analysis Performance Assessment Scheme). The methods were applied to carry out a monitoring study to detect and quantify residues of sulfonamides and their metabolites in more than 300 different samples of animal tissues derived from poultry, beef, sheep and pork collected from different regions of Lebanon..
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Avaliação da presença de fármacos, por LC-MS/MS, em águas superficiais pré e pós-tratamento convencional por ensaio Jar-test e caracterização do risco humano / Evaluation of the presence of drugs by LC-MS/MS in surface water before and after conventional treatment by jar-test test and the characterization of human risk

Pais, Mariana Castello Novo 03 June 2013 (has links)
O aumento crescente da população brasileira em combinação com o uso abusivo de medicamentos no mercado nacional, aliados à falta de saneamento básico e de políticas públicas para o correto gerenciamento de alguns tipos de resíduos têm resultado na presença de compostos farmacêuticos em ambientes aquáticos. Estudos indicam que várias dessas substâncias parecem ser persistentes no ambiente e algumas vezes, resistem até mesmo às estações de tratamento de água, fazendo-se presentes na água tratada, que chega à população. O presente trabalho visou analisar quantitativamente a presença dos anti-inflamatórios e do analgésico mais comumente consumido no Brasil: diclofenaco, cetoprofeno, naproxeno, indometacina, ibuprofeno e o paracetamol em águas superficiais, por LC-MS/MS com extração em fase sólida, antes e depois do tratamento convencional, em escala laboratorial pelo ensaio de Jar-Test, bem como caracterizar o risco humano pela presença destes compostos na água após o tratamento. Os métodos utilizados na quantificação destes fármacos apresentaram bons resultados: a análise cromatográfica obteve coeficientes de correlação entre 0,9952-0,9991, com limites de quantificação de 0,5ng/mL- 50ng/mL e desvios padrões entre (0,08-2,08); na recuperação do método de extração em fase sólida o diclofenaco, o cetoprofeno, o naproxeno e a indometacina apresentaram cerca de 100% de recuperação, o ibuprofeno apresentou apenas 48%(±9,37) de recuperação e o paracetamol aproximadamente 19,84% (±2,52); no ensaio de jar-test, observou-se que apenas o cetoprofeno e o ibuprofeno não foram removidos completamente no tratamento utilizado (remoção de 0-15% do cetoprofeno e de 0-35% do ibuprofeno). Amostras ambientais foram coletadas e tratadas pelo ensaio de Jar-Test, e os valores obtidos para o cetoprofeno e ibuprofeno após o tratamento foram de 18,67-19,65ng/L e 147ng/L, respectivamente. Através de cálculos, com a dose de referência de cada um dos compostos e considerando as características desta exposição, foi possível concluir que nestas concentrações o cetoprofeno e o ibuprofeno não causam risco à saúde humana. / The increasing population growth in combination with the misuse of drugs in the domestic market, coupled with the lack of sanitation and public policies for proper management of some types of waste have resulted in the presence of pharmaceutical compounds in aquatic environments. Studies indicate that several of these substances appear to be persistent in the environment and sometimes even resistant to water treatment plants, being present in the treated water which reaches the population. This study aimed to analyze quantitatively the presence of anti-inflammatory and analgesic most commonly consumed in Brazil: diclofenac, ketoprofen, naproxen, indomethacin, ibuprofen and paracetamol in surface waters by LC-MS/MS with solid phase extraction prior and after conventional treatment in a laboratory scale by using Jar-test assay, and to determine the human risk posed by the presence of these compounds in the water after treatment. The methods used to quantify these drugs showed good results: a chromatographic analysis obtained correlation coefficients between 0.9952 to 0.9991, with limits of quantification of 0.5 ng/mL- 50ng/mL and standard deviations between (0.08 - 2.08); recovery method of solid phase extraction to diclofenac, ketoprofen, naproxen and indomethacin showed about 100% recovery, ibuprofen showed only 48% (± 9.37) and paracetamol approximately 19 84% (± 2.52) recovery; in the jar-test, it was observed that only ketoprofen and ibuprofen were not completely removed (removal: 0-15% of ketoprofen and 0-35% of ibuprofen). Environmental samples were collected and handled by jar-test test, and the values obtained for ketoprofen and ibuprofen after treatment were 18.67 to 19.65 ng / L and 147ng / L, respectively. By calculation with a reference dose of each compound and considering the characteristics of this display, it was concluded that these concentrations of ketoprofen and ibuprofen do not cause risk to human health.

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