ANDRADE NETO, João Batista de. Atividade antimicrobiana de metabólitos secundários obtidos de leveduras ambientais do bioma cearense frente a cepas de bactérias patogênicas, incluindo Staphylococcus aureus resistentes à meticilina: atividade antibacteriana e investigação do mecanismo de ação. 2015. 79 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-10-26T13:52:40Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_jbandradeneto.pdf: 1779572 bytes, checksum: 7b7551fddf440a7b2eaf793a8f5dbdda (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2015-10-26T13:54:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_jbandradeneto.pdf: 1779572 bytes, checksum: 7b7551fddf440a7b2eaf793a8f5dbdda (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-26T13:54:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_jbandradeneto.pdf: 1779572 bytes, checksum: 7b7551fddf440a7b2eaf793a8f5dbdda (MD5) Previous issue date: 2015 / The consequent and continuous use of antimicrobials led to the emergence of potentially lethal pathogens. ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter sp.) microorganisms group stands towards others, in which Staphylococcus aureus infections stand out as the leading cause of systemic infections, with SARM being a major responsible for these infections in Brazil. Thus, the emergence of strains with reduced sensitivity accompanied by a limited antimicrobial therapy makes the search for new therapeutic options necessary. In this study, isolate yeasts from the northeaster region of Brazil, more specifically in Ceará state, were analysed in order to find antimicrobial metabolites with anti-SARM activity, as well as to find a description of a possible mechanism of action. In this paper, 13 yeasts were isolated and conditioned in different growing conditions, in order to optimize the growth of the isolates. In addition, it was explored whether extracts from yeast produced new secondary metabolites with antimicrobial properties. 59% (11) of the obtained extracts were active against Gram positive bacteria and 32% (7) were active against Gram positive and Gram negative bacteria. These more active extracts showed activity against SARM and had MIC ranging between 34-192 µg/mL. Analysis by flow cytometer showed that these extracts were capable of causing damage to the plasma membrane and of promoting bacterial DNA fragmentation, leading the cell to cell death by apoptosis. In cytotoxic tests using the MTT test with human leukocyte cells, the secondary metabolites showed low cytotoxicity. Chemical analysis revealed structurally different secondary metabolites, including the compounds pyrrolo [1,2-a] pyrazine-1,4-dione, Hexahydro-3- (phenyl methyl) Laurie acid and, as described in the literature for their properties against MSSA and SARM as well as other known metabolites were identified in the remaining extracts, suggesting that these strains can produce new molecules. Within this context, the antimicrobial activity and the low cytotoxic potential demonstrated by these extracts reveal a class of promising chemical compounds to the development of new antibiotics. However, more pharmacological studies will be done to confirm these data. / O uso consequente e contínuo dos antimicrobianos levaram ao surgimento de patógenos potencialmente letais. O grupo de micro-organismos ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter sp.) se destaca perante os demais, onde as infecções por Staphylococcus aureus se sobressaem como a principal causa de infecções sistêmicas, sendo o Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (SARM) um dos principais responsáveis por estas infecções no Brasil. Dessa forma, a emergência de cepas com sensibilidade reduzida acompanhada de uma terapia antimicrobiana limitada faz com que seja necessária uma busca por novas opções terapêuticas. No presente trabalho, foram analisadas leveduras isoladas da região nordeste do Brasil, mais especificamente no estado do Ceará, com o objetivo de buscar metabólitos antimicrobianos com atividade anti-SARM, bem como a descrição de um eventual mecanismo de ação. Foram isoladas 13 leveduras as quais foram acondicionadas em condições de cultivo distintas, a fim de otimizar o crescimento dos isolados de leveduras. Em seguida os extratos acetoetílicos obtidos a partir das leveduras, foram exploradas afim de verificar se produziam metabólitos secundários com propriedades antimicrobianas. 59% (11) dos extratos obtidos foram ativos contra bactérias Gram positivas e 32% (7) contra bactérias Gram positivas e Gram negativas. Os extratos mais ativos apresentaram atividade contra SARM e tiveram CIM que variaram de 34-192 µg/mL. A análise por citometria de fluxo revelou que esses extratos foram capazes de causar danos a membrana plasmática e promover fragmentação do DNA bacteriano, levando a célula à morte celular por apoptose. Nos ensaios citotóxicos, utilizando o teste do MTT com células de leucócitos humanos, os extratos mostraram baixa citotoxicidade. As análises químicas revelaram estruturalmente diversos metabólitos secundários, incluindo os compostos hexahidro-3-(fenilmetil)-pirrolo[1,2-a] pirazina-1,4-dione e o ácido láurico, já descritos na literatura por suas propriedades contra Staphylococcus aureus sensíveis à meticilina (MSSA) e SARM, bem como outros metabólitos conhecidos foram identificados nos extratos restantes, sugerindo que estas leveduras podem produzir moléculas promissoras. Dentro deste contexto, a atividade antimicrobiana e o baixo potencial citotóxico demonstrado por esses extratos revelaram uma classe de compostos químicos promissores para desenvolvimento de novos antibioticos. No entanto, mais estudos farmacológicos serão feitos para confirmar estes dados.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-07-16T21:09:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 316872.pdf: 4951520 bytes, checksum: 4c7e50e4c336bd2f3960e08cce62f0e9 (MD5) / As olefinas eletronicamente ativadas com grupos retiradores de elétrons, (4R)-carvona (7), (4S)-carvona (8), (6E)-2-metil-6-[(4-nitrofenil)metileno]-ciclo-hexanona (22), (3E)-3-metil-4-fenil-3-buten-2-ona (23), (2E)-1,3-difenil-2-propen-1-ona (24) e 3-metil-ciclo-hexen-2-ona (25), foram utilizadas como substratos nas reações de biorredução mediada por leveduras e fungos em meio aquoso. Realizou-se a otimização das condições reacionais para a biorredução dos substratos 7, 8 e 22 com Fermento de pão comercial (FP, Saccharomyces cerevisiae), onde avaliou-se o efeito da concentração de levedura e substrato, temperatura, pH e adição de aditivos. A biotransformação de 7, 22, 23, 24, 25 e 8 formou as cetonas saturadas (1R,4R)-dihidrocarvona (10), 2-metil-6-(4-nitrofenilmetil)-ciclo-hexanona (33), (3S)-3-metil-4-fenil-2-butanona (34), 3-difenil-2-propen-1-ona (35) e 3-metil-ciclo-hexanona (36) pela redução da ligação dupla C-C e do álcool saturado (1R,2R,4S)-dihidrocarveol (12) pela redução das ligações dupla C-C e C-O, respectivamente. Na biotransformação de 8, utilizou-se também os fungos isolados da Carapanaúba e as leveduras Cryptococcus flavescens e Spathaspora xylofermentans. Um novo método de extração dos reagentes e produtos do meio aquoso e/ou sistema bifásico foi desenvolvido, baseado em micro extração em fase líquida com fibras ocas de polipropileno (HF-LLLME).<br> / Abstract : In this study, the electronically activated alkenes with electron-withdrawing groups, such as (4R)-carvone (7), (4S)-carvone (8), (6E)-2-methyl-6-[(4-nitrophenyl)metylene]-cyclohexanone (22), (3E)-3-methyl-4-phenyl-3-buten-2-one (23), (2E)-1,3-diphenyl-2-propen-1-one (24) and 3-methyl-cyclohexen-2-one (25) were used as substrates in the bioreduction reaction mediated by yeasts and fungi in aqueous media or in biphasic systems. Firstly, the optimization of experimental condition on the bioreduction of 7 catalyzed by commercial baker#s yeast (BY, Saccharomyces cerevisiae) was carried out, where the effect of biocatalyst system, yeast and substrate concentration, temperature, pH, addition of additives and volumetric percentage of additives were evaluated. The optimum conditions obtained in the reduction of (4R)-carvone mediated FP were when the reaction was carried out in aqueous medium, substrate concentration and yeast of 16.6 mmol L-1 and 100.0 g L-1, temperature 25 °C, pH 7.5, and with the additives DMSO, trehalose and sucrose. Then, and using the best reaction conditions obtained on the biotransformation of 7, the bioreduction of the other electronically activated alkenes was performed. The biotransformation of 7, 23, 24, 25 e 8 formed the corresponding saturated ketones (1R,4R)-dihydrocarvone (10) (conv. 70% and d.e. of 97%), 2-methyl-6-(4-nitrophenylmethyl)-cyclohexanone (33) (conv. 59% and d.e. of 38%), (3S)-3-methyl-4-phenyl-2-butanone (34) (conv. 33% and e.e. of 64%), 3-diphenyl-2-propen-1-one (35) (conv. >99%) by the reduction of C#C double bond, and the saturated alcohol (1R,2R,4S)-dihydrocarveol (12) (conv. 4% and of >99%) by the reduction of C#C and C#O double bond, respectively. As low conversions into 12 and 34 were obtained, the optimization of experimental conditions on the bioreduction of 8 and 23, also was carried out to obtain the product in higher conversions and d.e. or e.e.. The reaction parameters influenced the formation of 10, 12 and 34, however temperature and substrate concentrations were the most outstanding. In the biotransformation of 8, besides using the yeast S. cerevisiae as biocatalyst, the isolated fungis from Aspidosperma excelsum Benth (carapanaúba) (CG 0504 e CF 0305) and the yeast C. flavescens e S. xylofermentan were used. From the obtained results, these fungi and yeasts showed a great potential to be used as biocatalysts. In this study, a new and green methodology for the extraction of reagents and products from the aqueous media or biphasic system based on a liquid-liquid-liquid micro extraction with porous hollow fiber polypropylene membranes (HF-LLLME) is also reported. The main advantages of this methodology in relation to conventional liquid-liquid extraction are the smallest waste generation (organic solvent) and the time required for extraction. In conclusion, the use of microorganisms as biocatalysts in the biotransformation of electronically activated alkenes compounds in aqueous media is a viable alternative to obtain compounds with high optical purity, under mild reaction conditions, low cost reagents and environmental pollution.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Tecnologias Química e Biológica, 2018. / Submitted by Robson Amaral (robsonamaral@bce.unb.br) on 2018-05-11T15:04:54Z No. of bitstreams: 1 2018_AnaLauraAlfonsoPérez.pdf: 2516747 bytes, checksum: b579caf86dfe900c3615afb57174b809 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-06-07T13:22:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_AnaLauraAlfonsoPérez.pdf: 2516747 bytes, checksum: b579caf86dfe900c3615afb57174b809 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-07T13:22:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_AnaLauraAlfonsoPérez.pdf: 2516747 bytes, checksum: b579caf86dfe900c3615afb57174b809 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / O sistema de expressão baseado na utilização da levedura Komagataella phaffii tem sido utilizado com sucesso na produção de uma grande variedade de proteínas heterólogas. Esta levedura reúne características como fácil manipulação molecular, crescimento celular rápido, capacidade de realizar modificações pós-traducionais e secreção eficiente de proteínas, além de atingir altas densidades celulares com grande produção da proteína heteróloga. Uma das proteínas de grande interesse na indústria biofarmacêutica e cosmética é o fator de crescimento epidermal humano (hEGF). O objetivo desse estudo foi desenvolver um sistema para a produção de hEGF na levedura K. phaffii. Para isso foram utilizados os peptídeos sinais dos genes αF, SUC2 e PHO1. Três vetores foram construídos, cada um deles contendo um dos peptídeos sinal. Foram construídos os vetores de expressão sob o controle do promotor do PGK1 e utilizados para transformação de K. phaffii M12-K, uma linhagem mutante para o gene KEX1. Os clones recombinantes foram confirmados por PCR de colônia e foram crescidos em meio mínimo para avaliar a cinética de crescimento. Os clones positivos foram selecionados e utilizados na expressão em frasco empregando meio complexo. A presença do hEGF foi avaliada por SDS-PAGE e confirmada por Western blot na presença de um anticorpo específico. Com isso, um clone de cada sistema foi escolhido para a purificação do hEGF por cromatografia de exclusão molecular e RP-HPLC. A partir desses experimentos foi confirmada a presença do hEGF e o polipeptídeo foi parcialmente purificado. Finalmente, foi escolhido o clone 1αF para otimizar o processo de purificação, adicionando uma etapa em HILIC. O hEGF foi satisfatoriamente purificado. O tamanho correto e a sequência do N-terminal igual ao EGF presente em humanos foram confirmados por espectrometria de massas e sequenciamento automático. Os resultados obtidos mostram que o hEGF foi produzido com sucesso em K. phaffii com a sequência primária correta. / The expression system based on the utilization of the yeast Komagataella phaffii has been used successfully used in the production of a large variety of heterologous proteins. This yeast combines several important features such as easy molecular manipulation, rapid cell growth, ability to perform post-translational modifications and efficient secretion of proteins, in addition to large heterologous protein production at high cell densities. One of the proteins of great interest in the biopharmaceutical and cosmetic industry is the human epidermal growth factor (hEGF). The aim of this study was to develop a system for hEGF production in K. phaffii. For this, the 3 different signal peptides sequences from genes αF, SUC2 and PHO1 were tested. Three vectors were constructed, each containing one of the signal peptides. Expression vectors were constructed under the control of the PGK1 promoter and used for transformation of K. phaffii M12-K, a strain mutant for the KEX1 gene. Recombinant clones were confirmed by colony PCR and grown in minimal medium to evaluate growth kinetics. Positive clones were selected and used in flask expression using complex media. The presence of hEGF was assessed by SDS-PAGE and confirmed by western blot with a specific antibody. One clone from each system was chosen for the production and purification of hEGF by molecular-exchange chromatography and RP-HPLC. From these experiments the presence of hEGF was confirmed and the polypeptide was partially purified. Finally, clone 1αF was chosen to optimize the purification process by adding one step in HILIC. The hEGF was successfully purified. Correct size and N-terminal sequence equal to EGF present in humans were confirmed by mass spectrometry and Edman sequencing. Together, our results show that hEGF was successfully produced in K. phaffii with the proper primary structure. / El sistema de expresión basado en la utilización de la levadura Komagataella phaffii ha sido utilizado con éxito en la producción de una gran variedad de proteínas heterólogas. Esta levadura reúne características como fácil manipulación molecular, rápido crecimiento celular, capacidad de realizar modificaciones pos-traduccionales y eficiente secreción de proteínas, además de llegar hasta altas densidades celulares con elevada producción heteróloga. Una de las proteínas de gran interés en la industria biofarmacéutica y cosmétic es el factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF). El objetivo de este estudio foi desarrollar un sistema para la producción de hEGF en la levadura K. phaffii. Para eso fueron utilizadas los péptidos señales de los genes αF, SUC2 e PHO1. Fueron construidos tres vectores, cada uno de ellos conteniendo una de las sequencias señales. Los vectores fueron construidos sobre el control del promotor del gen PGK1 y fueron utilizados para la transformación de la cepa M12-K de K. phaffii, que es mutante para el gen KEX1. Los clones recombinantes fueron confirmados mediante PCR de colonias y fueron crecidos en medio mínimo para analizar la cinética de crecimiento. Los clones positivos fueron seleccionados y utilizados para expresión en frasco utilizando medio complejo. La presencia de hEGF fue analizada por SDS-PAGE e confirmada por western blot en presencia de un anticuerpo específico. A partir de ahí, una muestra de cada sistema fue escogida para la purificación de hEGF utilizando cromatografía de exclusión molecular y RP-HPLC. A partir de esos experimentos fue confirmada la presencia de hEGF y el polipeptídeo fue parcialmente purificado. Finalmente, fue escogido el clon 1αF para optimizar el proceso de purificación, adicionando una cromatografía en HILIC. El hEGF fue satisfactoriamente purificado. El tamaño correcto y la secuencia del N-terminal igual al EGF presente en humanos fueron confirmados por espectrometría de masas y sequenciamiento automático. Los resultados obtenidos muestran que fue producido hEGF en K. phaffii, con la sequencia primária correcta.

As figueiras são encontradas em abundância no Parque de Itapuã, onde interagem com diversos organismos superiores e, potencialmente, com microrganismos. Os objetivos do presente trabalho foram isolar, identificar e avaliar o potencial biotecnológico de leveduras e fungos semelhantes a leveduras associados ao filoplano de figueiras no Parque de Itapuã, Viamão, RS. Foram realizadas 6 coletas em diferentes pontos do Parque de Itapuã durante o ano de 2005 e 2006. Fragmentos das folhas foram submetidos a lavagens sucessivas com 0,5% Tween 20. Diluições decimais seriadas da última lavagem foram inoculadas em meio YM modificado e incubadas a 25°C por 5-7 dias. Representantes dos diferentes morfotipos foram purificados e identificados de acordo com características morfológicas e testes bioquímicos - fisiológicos. Foi testada a produção de enzimas de interesse industrial (amilase, celobiase, caseinase, gelatinase e esterase), além de toxinas “killer” pelos isolados. Dos 175 isolados obtidos, 125 são leveduras verdadeiras e 50 fungos semelhantes a leveduras. As 125 leveduras isoladas pertencem a 45 espécies, sendo oito de afinidade ascomicética e 37 de afinidade basidiomicética. Sete isolados tiveram as regiões D1/D2 do 26S rDNA seqüenciadas, sendo que quatro pertencem a duas espécies ainda não descritas do gênero Bullera. Dos 175 isolados 29,1% produziram amilase, 46,3% caseinase e 9,7% gelatinase. Foram testados 138 isolados para verificar a atividade de esterase, sendo 81,5% produtores da enzima. Das 126 cepas testadas para produção de celobiase, 74,8% produziram a enzima. Aproximadamente 4,5% dos isolados de leveduras e fungos semelhantes a leveduras apresentaram atividade “killer”. Assim sendo, o filoplano de figueiras demonstra ser um bom substrato para o isolamento de leveduras, inclusive de novas espécies. Estas leveduras demonstram ter potencial para contribuir efetivamente para a inovação biotecnológica. / The fig trees are found in abundance in the Itapuã Park, where they interact with various higher organisms and, potentially, with microrganisms. The objectives of this study were to isolate, identify and evaluate the biotechnological potential of yeasts and yeast-like fungi associated with phylloplane of fig trees in the Itapuã Park, Viamão, RS. Six samples were performed at different points in the Itapuã Park during 2005 and 2006. Leaf pieces were submitted to successive washings with 0.5% Tween 20. Decimal serial dilutions from the last washing were inoculated in modified YM medium and incubated at 25° C for 5-7 days. Representatives of the different morphotypes were purified and identified according to morphological characteristics, physiological and biochemical tests. We tested the production of industrially interesting enzymes (amylase, cellobiase, caseinase, gelatinase and esterase), besides the production of killer toxins. Of the 175 isolates obtained, 125 are yeasts and 50 yeast-like fungi. The 125 yeasts isolated belong to 45 species, eight with ascomycetic affinity and 37 with basidiomycetic affinity. Seven isolates had their 26S rDNA D1/D2 regions sequenced and four belong to two yet undescribed species of the genus Bullera. Of the 175 isolates, 29.1% were positive for amylase, 46.3% for caseinase and 9.7% for gelatinase. One hundred and thirty-eight isolates were tested for esterase activity, and 81.5% were producers of the enzyme. Of the 126 strains tested for the production of celobiase, 74.8% produced the enzyme. Approximately 4.5% of the isolates of yeasts and yeast-like fungi had "killer" activity. Therefore, the phylloplane of fig trees demonstrates to be a good substrate for the isolation of yeasts, including new species. These yeasts have the potential to contribute effectively to the biotechnological innovation.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-05-11T17:59:48Z No. of bitstreams: 1 2017_SamyraMaraCoelhoCaxito.pdf: 1139297 bytes, checksum: 24f3a0eef6fd020d0c115c27afb54541 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2017-05-16T16:04:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_SamyraMaraCoelhoCaxito.pdf: 1139297 bytes, checksum: 24f3a0eef6fd020d0c115c27afb54541 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-16T16:04:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_SamyraMaraCoelhoCaxito.pdf: 1139297 bytes, checksum: 24f3a0eef6fd020d0c115c27afb54541 (MD5) / A incidência de infecções fúngicas sistêmicas vem se elevando com o aumento de situações em que se observa supressão do sistema imune do paciente, tornando-se este, um problema de saúde mundial. Cryptococcus neoformans é um fungo cosmopolita e mundialmente distribuído, que se apresenta como uma levedura encapsulada, presente no ambiente, acometendo, especialmente, pacientes imunodeprimidos e apresentando índice de mortalidade acima de 60%. Embora existam extensivos estudos sobre a estrutura capsular das leveduras do fungo C. neoformans, pouco se sabe sobre a interação deste patógeno com o hospedeiro, particularmente no que diz respeito aos componentes de sua parede celular. Estudos em algumas espécies de fungos vem apontando os componentes presentes na parede destes micro-organismos, como forte imunomodulador durante a interação patógeno-hospedeiro, podendo estes componentes serem empregados em estudos na elaboração de vacinas. Nesse trabalho, foi avaliada a capacidade da fração 1 (F1) extraída da parede celular de diferentes linhagens de C. neoformans em modular a resposta imune do hospedeiro. Inicialmente, foram realizados ensaios in vitro, para avaliar a viabilidade celular de macrófagos de camundongo, empregando diferentes concentrações das frações, extraídas a partir das linhagens de C. neoformans H99, B3501 e da linhagem mutante cap67Δ. Em seguida, foi avaliada a capacidade das fracões em induzir a produção de citocinas nas células do hospedeiro. Os dados mostram que, após 18 horas de interação, as frações das linhagens B3501 e cap67Δ induziram elevados níveis de TNF-α, demonstrando que há uma prévia ativação desses fagócitos sem alterar a viabilidade celular. Além disso, foi avaliado a atividade microbicida e de fagocitose de macrófagos previamente estimulados com essas frações, seguindo com interação com leveduras de C. neoformans. Os dados demonstram que, no intervalo de 24 horas após interação, houve uma diminuição significativa no número de leveduras recuperadas a partir dos macrófagos. Além disso, houve também um aumento significativo no número de leveduras fagocitadas. Nos testes in vivo, usando camundongos fêmeas da linhagem C57Bl/6, as frações foram previamente aplicadas nos animais, e em seguida os animais foram infectados com leveduras de C. neoformans H99. Os resultados mostram um aumento significativo na sobrevida dos animais que receberam o tratamento com as frações 14 em relação aos não tratados. Em conjunto, esses resultados claramente sugerem que os estímulos realizados com a fração F1 da parede de C. neoformans, são capazes de imunomodulador a resposta do hospedeiro, resultando em uma ação protetora contra a infecção a fúngica. Esses resultados abrem margem para possíveis alvos terapêuticos, além de contribuir com os estudos na elaboração de vacinas contra a infecção causada por C. neoformans. / The incidence of systemic fungal infections has been aggravated by the increase in diseases that induce a suppression of the immune system, making it a global health problem. Cryptococcus neoformans is a globally distributed, cosmopolitan fungus that presents as an encapsulated yeast present in the environment, especially affecting immunosuppressed patients and showed a mortality rate above 60%. Although there are extensive studies on the capsular structure, composed especially of polysaccharides involving the yeasts of C. neformans, little is known about the interaction of this pathogen with the host, particularly with respect to the components of its cell wall. Studies in some species of fungi have pointed out the components present in the wall of these microorganisms, as a strong immunomodulator during pathogen-host interaction, and these components can be used in studies in the elaboration of vaccines. In this study the captivity of the different fractions extracted from the cell wall of C. neoformans was evaluated in modulating the immune response of the host. Initially, in vitro assays were performed to assess the cell viability of mouse macrophages cultured with different concentrations of b-glucan fraction from H99, B3501 and a mutant strain cap67Δ strains of C. neoformans. Following, it was investigated the ability of these fractions to induce cytokine production in host cells. The data show that after 18 hours interaction, the fractions of strains B3501 and cap67Δ increased the TNF-α levels, showing that these fractions are able to activate the macrophage response without affecting the cell viability. Moreover, we evaluate the microbicidal and phagocytosis capacity of macrophages, previously stimulated with these fractions, during interaction with C.neoformans yeast. The data showed that after 24 hour of interaction, the number of yeasts recovered from macrophages was significantly decreased. Furthermore, there was a significant increase in the number of yeast phagocytosed. Mice treated with b-glucan fraction previously of C. neoformans infection showed a increased survival compared to the mouse not treatment. Taken together, these results clearly suggest that cell wall components is able to stimulate host immune response, resulting in an increased host immunity. These results open to the new therapeutic possibilities, beyond gives support on adjuvant therapeutic research during C. neoformans infections.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Nutrição Humana, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-09-26T15:49:57Z No. of bitstreams: 1 2016_MarcelaBerckmansViegasCostaDantas.pdf: 1767043 bytes, checksum: b16e159621d41adcdd9ca75c276e7f18 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-11T19:30:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_MarcelaBerckmansViegasCostaDantas.pdf: 1767043 bytes, checksum: b16e159621d41adcdd9ca75c276e7f18 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-11T19:30:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_MarcelaBerckmansViegasCostaDantas.pdf: 1767043 bytes, checksum: b16e159621d41adcdd9ca75c276e7f18 (MD5) / Entre os frutos comestíveis do cerrado brasileiro, o tucum-do-cerrado (Bactris setosa Mart) se destaca devido ao seu alto potencial antioxidante e conteúdo de polifenóis. Nós investigamos o extrato aquoso de tucum-do-cerrado quanto ao seu mecanismo de ação e o potencial antioxidante de suas frações. O extrato aquoso foi fracionado por HPLC e as frações analisadas em termos da sua atividade antioxidante por meio da degradação oxidativa de 2-desoxirribose. Cinco frações foram selecionadas com base na atividade antioxidante observada in vitro e os componentes de três delas foram identificados como cianidina, peonidina e quercetina. No entanto, as amostras de HPLC selecionadas apresentaram um efeito prejudicial sobre o crescimento de células de levedura na presença de H2O2. Assim, nossos resultados avançam na identificação de compostos tucum-do-cerrado com atividade antioxidante. Os resultados mostram ações dicotômicas dos compostos tucum-do-cerrado que devem ser investigadas cuidadosamente para descobrir as reais possibilidades de tucum-do-cerrado em contribuir para a boa saúde humana. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Among the edible fruits of the Brazilian savanna, tucum-do-cerrado (Bactris setosa Mart) stands out due to its high antioxidant potential and polyphenol content. We investigated the aqueous extract of tucum-do-cerrado regarding its mechanism of action and the antioxidant potential of its fractions. The aqueous extract was fractionated by HPLC and the fractions analyzed in terms of their antioxidant activity by means of the oxidative degradation of 2-deoxyribose. Five fractions were selected based on the antioxidant activity observed in vitro and components of three of them were identified as cyanidin, peonidin and quercetin. The selected HPLC samples, on the other hand, showed a detrimental effect on yeast cell growth in the presence of H2O2. Thus our results advance in identifying tucum-do-cerrado compounds with antioxidant activity. The results show dichotomous actions of the tucum-do-cerrado compounds that should be investigated thoroughly to uncover the real possibilities of tucum-do-cerrado in contributing to good human health.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-29Bitstream added on 2014-06-13T19:28:58Z : No. of bitstreams: 1 thomaz_d_me_araiq.pdf: 857603 bytes, checksum: b018c2e63051b94c8ef590d12caf9e91 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A hidratação é uma fase crítica no uso da levedura seca instantânea por depender do meio líquido usado, da temperatura e do tempo de hidratação. A levedura seca apresenta-se como um material biológico de grande heterogeneidade celular. Hidratação direta do fermento seco com soluções de aditivos, bem como, o tratamento do fermento seco, mas previamente hidratado com água foram acompanhados por medidas de viabilidade e atividade de fermentação (variações em volume de massa e evolução de CO2). O efeito do tempo de abertura da embalagem do fermento seco sobre as variações em viabilidade celular teores de glicerol interno e atividade de fermentação também foram determinados. Os seguintes tratamentos foram aplicados a levedura, previamente hidratada em água: (a) incubação em solução de citrato; (b) aplicação de choque térmico as células suspensas em solução de citrato. A levedura seca foi hidratada diretamente em água a temperatura ambiente e em solução de lisina a 37oC. As hidratações diretas do fermento seco com soluções de citrato 0,15 mol.L-1 a pH 6,9 e 7,5 por 40 min a temperatura ambiente proporcionaram aumentos em volume de massa da ordem de 25-29% (35,4-36,6 mL/180 min de fermentação) em relação ao controle (28,3 mL/180 min de fermentação). No entanto, a hidratação direta do fermento seco com água por 10 min a temperatura ambiente proporcionou um volume de massa (36,0 mL/150 min de fermentação) tão bom quanto aos obtidos com solução de citrato, mas com tempos de hidratação e fermentação menores. As hidratações diretas, do fermento seco, com soluções de glicose 2,0% e 0,5% por 40 min a temperatura ambiente proporcionaram aumentos em volume de CO2 da ordem de 33-38% (53,7-56,0 mL/180 min de fermentação) em relação ao controle (40,5 mL/180 min de fermentação). / Hydration is a critical phase in the use of instant dry yeast because it depends on the liquid media used, temperature and hydration time. Instant dry yeast is showed as biological material of great cellular heterogeneity. Direct hydration of instant dry yeast in additive solutions as well as the treatment of the instant dry yeast, but previously hydrated in water, were followed by viability measures and activity of fermentation (variations in dough volume and CO2 evolution). The time effect of the opened packing of the instant dry yeast on the fermentation activity, the internal glycerol and the cellular viability variations were also determined. The following treatments were applied to yeast, previously hydrated in water: a) incubation in citrate solution; b) application of heat shock to suspension cells in citrate solution. Instant dry yeast was directly hydrated in water at room temperature and in lysine solution at 37oC. Direct hydrations of instant dry yeast in 0,15 mol.L-1 citrate solutions at pH 6.9 and 7.5 for 40 min at room temperature provided increases in dough volume around 25- 29% (35.4-36.6 mL/180 min of fermentation) in relation to the control (28.3 mL/180 min of fermentation). However, direct hydration of instant dry yeast in water for 10 min at room temperature provided a dough volume (36.0 mL/150 min fermentation) as good as the ones obtained after citrate hydration, but with shorter hydration and fermentation time. Direct hydration of instant dry yeast in 2.0% e 0.5% glucose solutions for 40 min at room temperature provided increases in CO2 evolution around 33-38% (53.7-56,0 mL/180 min of fermentation) in relation to the control (40.5 mL/180 min of fermentation). However, direct hydration of instant dry yeast in water for 10 min at room temperature provided a CO2 evolution (79.0 mL/180 min of fermentation) bigger than the CO2 evolution previously obtained with glucose hydration.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Doutorado em Nutrição Humana, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-01-27T18:05:17Z No. of bitstreams: 1 2014_LuanaTaquetteDalvi_Parcial.pdf: 576296 bytes, checksum: 077c7602441bff2e15ecf9b69e65f019 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2015-01-30T15:52:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_LuanaTaquetteDalvi_Parcial.pdf: 576296 bytes, checksum: 077c7602441bff2e15ecf9b69e65f019 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-30T15:52:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_LuanaTaquetteDalvi_Parcial.pdf: 576296 bytes, checksum: 077c7602441bff2e15ecf9b69e65f019 (MD5) / O ácido elágico (AE) é um polifenol presente em frutas vermelhas e castanhas que tem sido estudado nas últimas duas décadas devido suas propriedades antioxidante, antimutagênica e anticarcinogênica. Apesar disso, ainda não se sabe ao certo como seria o mecanismo antioxidante do AE in vitro ou in vivo. Portanto, nós primeiramente investigamos a capacidade do AE de quelar íons Fe3+ na presença de diferentes ligantes de ferro (EDTA, citrato e NTA). O mecanismo quelante do AE foi correlacionado com sua atividade antioxidante. O AE apresenta uma pequena proteção contra a degradação da 2-desoxiribose induzida por Fe3+-EDTA e ascorbato, alcançando apenas 12% de proteção com 50 μM de AE. Entretanto, ao utilizar citrato ou NTA, ligante que formam complexos mais fracos com o Fe3+, a proteção aumenta para 80% e 45%, respectivamente. Além disso, o efeito antioxidante do AE é depende do tempo de pré-incubação na presença de uma razão 1:1 de Fe3+-EDTA, o que sugere novamente mecanismo quelante. AE apresenta uma maior inibição da taxa de consumo de oxigênio na presença de Fe3+-citrato do que na presença de Fe3+-EDTA. Nossos resultados estão de acordo com os espectros de formação do complexo ferro-AE, os quais demonstram que o AE remove Fe3+ do EDTA de forma mais lenta do que na presença de citrato (1h x 1 min, respectivamente). Essa diferença na taxa de complexação pode explicar o efeitoantioxidante encontrado nesses sistemas. Em seguida, nós analizamos o efeito do AE contra o estresse induzido por menadiona em linhagens de levedura selvagem (WT) e deficiente em SOD1 (Δsod1). Em condição controle, sem a adição de menadiona, AE melhora a viabilidade da linhagem Δsod1 de forma dose dependente. Além disso, o tratamento com 50 μM de AE em ambas as linhagens WT e Δsod1 aumenta a viabilidade da célula incubada com menadiona. O estresse induzido pela menadiona aumenta, em 10 vezes, os níveis de GSSG da linhagem Δsod1 (devido a oxidação de GSH) enquanto que nenhum efeito é observado na linhagem selvagem. A administração de AE aumenta os níveis de glutationa total nas duas linhagens (60-90% de aumento), assim como promove diminuição na formação de GSSG na levedura Δsod1 tratada com menadiona. A atividade de enzimas antioxidantes como GPx e GR são afetadas pelo tratamento com menadiona e pela suplementação com AE. Como já era de se esperar, a atividade GPx está aumentada na linhagem Δsod1 quando comparado com a WT. Atividade GR, por outro lado, está significativamente aumentada na presença de menadiona e AE. Atividade aconitase é conhecida como sensor da presença de radical superóxido na célula, uma vez que esse radical remove o íons de ferro do seu sítio ativo, inativando a enzima. Tratamento com menadiona diminui a atividade aconitase da linhagem Δsod1, que não é previnida pela suplementação com AE. Aparentemente, essas linhagens de levedura apresentam um controle rigoroso da integridade de membrana, uma vez que análises em FACS mostraram que não há alterações relevantes na permeabilidade de membrana após tratamento com menadiona em ambas as linhagens. Mais ainda, análises por HPLC não detectaram mudanças nos níveis de peroxidação lipídica ou mesmo na concentração de ergosterol. Ao todo, os resultados sugerem que que o AE apresenta efeito protetor contra o estresse induzido por menadiona evidenciado pela melhora da viabilidade celular e pela prevenção da oxidação de GSH. Nossos resultados também demonstram que o AE é capaz de modular a atividade de enzimas antioxidantes induzindo o sistema antioxidante endógeno da levedura. / Ellagic acid (EA) is a polyphenol present in berries and nuts that has been subject of research over the past two decades due to its antioxidant, antimutagenic and anticarcinogenic properties. Despite that, it is still unclear its antioxidant mechanism in vitro and in vivo. With this in mind, we first investigated the capacity of EA to chelate Fe3+ ions in the presence of different iron ligands (EDTA, citrate and NTA). The chelating mechanism of EA was then correlated to its antioxidant activity. EA has a small protection against 2-deoxyribose degradation induced by Fe3+-EDTA and ascorbate, reaching only 12% of protection with 50 μM EA. However, using citrate or NTA, ligands that are known to form weaker complexes with Fe3+, the protection increases to 80% and 45%, respectively. In addition, the antioxidant effect of EA is dependent on the pre-incubation period only when employing a 1:1 Fe3+-EDTA, suggesting again a chelating mechanis. EA presents a better inhibitory effect on the oxygen consumption rate in the presence of Fe3+-citrate when compared to Fe3+-EDTA. Our results are in agreement with spectroscopic analyses of iron-EA complexes, which demonstrate that EA removes Fe3+ from EDTA slower that from citrate (1 h and 1 min, respectively). The difference in the complexation rate could help explaining the antioxidant effects of EA in these systems. We then analyzed the effects of EA against a menadione-induced oxidative stress using both wild-type (WT) and SOD1 deficient (Δsod1) yeast strains. Under control conditions, in the absence of menadione, EA already improves Δsod1 viability in a dose-dependent manner. Moreover, the treatment with 50 μM EA in both WT and Δsod1 strains increases their viability when incubated with menadione. The stress caused by menadione increases, by 10 fold, the GSSG levels in Δsod1 strain (due to GSH oxidation), while no effect is observed in the WT strain. Supplementation with EA, on the other hand, induces an increase in the levels of total-GSH in both strains (by about 60%-90%) as well as it induces a decrease in GSSG formation in the Δsod1 strain stressed with menadione. The activity of antioxidant enzymes such as GPx and GR are affected by menadiona treatment and by supplementation with EA. Not surprisingly, GPx activity is increased in the Δsod1 strain when compared to the WT. GR activity, on the other hand, is significantly increased in the presence of both menadione and EA. Aconitase activity is a known sensor of the presence of superoxide radicals in the cell, since it removes iron ions from the active site, inactivating the enzyme. Treatment with menadione led to a decrease in the aconitase activity in the Δsod1 strain, which is not prevented by the supplementation with EA. Apparently, these yeast strains have a strict control of the membrane integrity, since FACS analyses showed no relevant alterations after menadione treatment in both strains. Moreover, HPLC experiments did not detect major changes in lipid peroxidation levels or ergosterol concentration in both strains Altogether, these results suggest that EA presents protective effects against menadione-induced oxidative stress, which were demonstrated by the improvement of cell viability and the prevention of GSH oxidation. Our results also demonstrate that EA can modulate the activity of antioxidant enzymes, improving the endogenous antioxidant system.

As figueiras são encontradas em abundância no Parque de Itapuã, onde interagem com diversos organismos superiores e, potencialmente, com microrganismos. Os objetivos do presente trabalho foram isolar, identificar e avaliar o potencial biotecnológico de leveduras e fungos semelhantes a leveduras associados ao filoplano de figueiras no Parque de Itapuã, Viamão, RS. Foram realizadas 6 coletas em diferentes pontos do Parque de Itapuã durante o ano de 2005 e 2006. Fragmentos das folhas foram submetidos a lavagens sucessivas com 0,5% Tween 20. Diluições decimais seriadas da última lavagem foram inoculadas em meio YM modificado e incubadas a 25°C por 5-7 dias. Representantes dos diferentes morfotipos foram purificados e identificados de acordo com características morfológicas e testes bioquímicos - fisiológicos. Foi testada a produção de enzimas de interesse industrial (amilase, celobiase, caseinase, gelatinase e esterase), além de toxinas “killer” pelos isolados. Dos 175 isolados obtidos, 125 são leveduras verdadeiras e 50 fungos semelhantes a leveduras. As 125 leveduras isoladas pertencem a 45 espécies, sendo oito de afinidade ascomicética e 37 de afinidade basidiomicética. Sete isolados tiveram as regiões D1/D2 do 26S rDNA seqüenciadas, sendo que quatro pertencem a duas espécies ainda não descritas do gênero Bullera. Dos 175 isolados 29,1% produziram amilase, 46,3% caseinase e 9,7% gelatinase. Foram testados 138 isolados para verificar a atividade de esterase, sendo 81,5% produtores da enzima. Das 126 cepas testadas para produção de celobiase, 74,8% produziram a enzima. Aproximadamente 4,5% dos isolados de leveduras e fungos semelhantes a leveduras apresentaram atividade “killer”. Assim sendo, o filoplano de figueiras demonstra ser um bom substrato para o isolamento de leveduras, inclusive de novas espécies. Estas leveduras demonstram ter potencial para contribuir efetivamente para a inovação biotecnológica. / The fig trees are found in abundance in the Itapuã Park, where they interact with various higher organisms and, potentially, with microrganisms. The objectives of this study were to isolate, identify and evaluate the biotechnological potential of yeasts and yeast-like fungi associated with phylloplane of fig trees in the Itapuã Park, Viamão, RS. Six samples were performed at different points in the Itapuã Park during 2005 and 2006. Leaf pieces were submitted to successive washings with 0.5% Tween 20. Decimal serial dilutions from the last washing were inoculated in modified YM medium and incubated at 25° C for 5-7 days. Representatives of the different morphotypes were purified and identified according to morphological characteristics, physiological and biochemical tests. We tested the production of industrially interesting enzymes (amylase, cellobiase, caseinase, gelatinase and esterase), besides the production of killer toxins. Of the 175 isolates obtained, 125 are yeasts and 50 yeast-like fungi. The 125 yeasts isolated belong to 45 species, eight with ascomycetic affinity and 37 with basidiomycetic affinity. Seven isolates had their 26S rDNA D1/D2 regions sequenced and four belong to two yet undescribed species of the genus Bullera. Of the 175 isolates, 29.1% were positive for amylase, 46.3% for caseinase and 9.7% for gelatinase. One hundred and thirty-eight isolates were tested for esterase activity, and 81.5% were producers of the enzyme. Of the 126 strains tested for the production of celobiase, 74.8% produced the enzyme. Approximately 4.5% of the isolates of yeasts and yeast-like fungi had "killer" activity. Therefore, the phylloplane of fig trees demonstrates to be a good substrate for the isolation of yeasts, including new species. These yeasts have the potential to contribute effectively to the biotechnological innovation.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:06:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo542_1.pdf: 1336116 bytes, checksum: 90846b467049eef0b8bb15d968404b65 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Leveduras estão distribuídas na cavidade bucal e têm sido isoladas de diferentes nichos, dentre estes, cáries dentárias, que podem se constituir em reservatórios de microrganismos potencialmente invasivos aos tecidos do hospedeiro, podendo provocar infecções superficiais ou sistêmicas. No Ambulatório de Odontologia do Hospital Universitário Oswaldo Cruz - UPE - Recife, foram atendidos 100 pacientes, de ambos os sexos, numa faixa etária de três a 80 anos e distribuídos em quatro grupos: Pacientes com cardiopatia, com neoplasia, com transplante hepático e clinicamente sãos. Desses pacientes foi coletado material de cárie dentária para detectar leveduras. Com cureta periodontal, odontólogos coletaram as amostras de material de cárie dentária, as quais foram armazenadas em baterias térmicas e transportadas para os laboratórios da pós-graduação em Biologia de fungos (UFPE), onde foram realizadas as técnicas para exame direto, cultura e identificação. Leveduras foram isoladas de cárie dentária de todos os pacientes. Das amostras de material de cárie dentária de pacientes com cardiopatia foram isoladas Candida albicans 51(79%), C.guilliermondii 7(11%), C. dubliniensis 3(5%), C. parapsilosis 2(3%) e Trichosporon pullulans 1(2%); De pacientes com neoplasia, apenas C.albicans 11 (100%); De pacientes com transplante hepático, C. albicans 6(50%) e C. guilliermondii 6(50%) e de pacientes clinicamente sãos, C. albicans 6 (43%),C. guilliermondii 6(43%),C. magnoleae 1(7%) e C. tropicalis 1 (7%). Maior número e diversidade de leveduras ocorreram em amostras de pacientes com cardiopatia. Maior número de leveduras foi obtido de amostras de pacientes da faixa etária entre 45 a 54 anos e maior diversidade entre 55 a 80 anos. Segundo o teste do Qui-quadrado, não houve diferença significativa entre as espécies de leveduras com relação aos grupos de pacientes e faixa etária