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Despite recent advances in antiretroviral therapy, nearly 37 million people continue to live with human immunodeficiency virus (HIV). Basic and applied research on the assembly of HIV could be enhanced by using a genetically tractable organism, such as yeast, rather than mammalian cells. While previous studies showed that expression of the HIV Gag polyprotein in Saccharomyces cerevisiae spheroplasts resulted in the production of virus-like particles (VLPs), many questions regarding the utility of yeast in HIV assembly remain uninvestigated. Here, we report use of S. cerevisiae for both the production of VLPs with selectively packaged RNA and to evaluate the human Y-box-binding protein 1 (YB-1) in selective RNA packaging into VLPs. Our data reveal: (1) When co-expressed alongside HIV-1 Gag, an RNA mammalian expression cassette is selectively encapsidated and released in VLPs produced from spheroplasts; (2) Inclusion of the 5’UTR-5’Gag RNA upstream of the mammalian expression cassette greatly increased the selectivity to which non-viral RNA was packaged into VLPs; and (3) heterologous expression of the human YB-1 protein in S. cerevisiae did not facilitate the selective packaging of viral RNA into VLPs, likely due to inability to bind upstream elements in the HIV-1 viral RNA. Overall, this research provides a key first step in the use of yeast for the production of viral vectors used in gene therapy, and lays a foundation for further experiments investigating the role of YB-1 and other host proteins in selective RNA packaging.

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G-CSF besitzt direkte Effekte auf die Aktivierung bakterizider Eigenschaften neutrophiler Granulozyten und verbessert das Überleben bakteriell infizierter Tiere. Daher wurde in der hier vorliegenden Arbeit der Effekt einer prophylaktischen oder therapeutischen Gabe von G-CSF bei experimenteller Pneumonie durch Klebsiella pneumoniae in Mäusen untersucht. Unerwarteterweise verschlechterte aber eine prophylaktische G-CSF-Gabe das Überleben und führte dosisabhängig zu einer Steigerung der bakteriellen Dissemination von der Lunge in Leber und Milz. Im Gegensatz dazu konnte ein spezifisch gegen K2-Kapselpolysaccharid (K2-KPS) von K. pneumoniae gerichteter monoklonaler Antikörper signifikant die Vermehrung der Bakterien in Lunge, Leber und Milz reduzieren. Die Blockierung von TNF?? durch Pentoxifyllin hingegen verzögerte die Letalität nach Induktion der Pneumonie, verhinderte sie jedoch nicht. In vitro konnte hier nachgewiesen werden, daß G-CSF spezifisch an K. pneumoniae bindet und daß diese Bindung an mehrere Proteine mit einem Molekulargewicht von 41, 25 und 21 kDa erfolgt. Die Bindung von G-CSF an K. pneumoniae führte zu einer signifikant erhöhten Produktion des wichtigsten Virulenzfaktors, K2-KPS. Dies verminderte in vitro signifikant eine Phagozytose der Bakterien durch neutrophile Granulozyten. Damit gelang es zum ersten Mal, die Bindung von G-CSF an ein gram-negatives Bakterium, K. pneumoniae, nachzuweisen und zu zeigen, daß diese Bindung in vitro zu einer erhöhten Produktion des wichtigsten Virulenzfaktors und in vivo zur Verschlechterung einer experimentellen Pneumonie durch erhöhte bakterielle Disseminierung bei prophylaktischer Gabe von G-CSF vor Infektion führt. Die weitere Untersuchung dieser Phänomene hinsichtlich einer möglichen Bindung von G-CSF auch an andere Bakterien könnte zu einer differenzierten supportiven Therapie bakterieller Infektionen mit G-CSF in nicht neutropenischen Patienten führen. / Besides its well-established effects on granulocytopoiesis, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) has been shown to have direct effects on the recruitment and bactericidal ability of neutrophils, resulting in improved survival of experimentally infected animals. The effect of G-CSF on the course of experimental pneumonia induced by Klebsiella pneumoniae was studied. Using a highly reproducible murine model, the paradoxical finding that mortality from infection was significantly increased when animals received G-CSF before induction of pneumonia could be demonstrated. Administration of G-CSF promoted replication of bacteria in the liver and spleen, thus indicating an impairment rather than an enhancement of antibacterial mechanisms. By contrast, a monoclonal antibody against Klebsiella K2 capsule significantly reduced bacterial multiplication in the lung, liver, and spleen, and abrogated the increased mortality caused by G-CSF. Blocking of TNF-? with pentoxifylline, however, could not prevent increased mortality caused by G-CSF. In vitro studies showed a direct effect of G-CSF on K pneumoniae resulting in inreased capsular polysaccharide (CPS) production. When bacteria were coincubated with therapeutically achievable concentrations of G-CSF, phagocytic uptake and killing by neutrophils was impaired. Western blot analysis showed three binding sites of G-CSF to K pneumoniae. Thus, in this model, the direct effect of G-CSF on a bacterial virulence factor, CPS production, outweighed any beneficial effect of G-CSF on recruitment and stimulation of leukocytes. Further investigations of possible binding of G-CSF to other bacteria might influence a differentiated supportive therapy of bacterial infections in non-neutropenic patients with this growth factor.

Der Plötzliche Herztod ist eine der häufigsten Todesursachen in Europa, in den USA sogar die häufigste Ursache aller natürlichen Todesfälle. Ziel der experimentellen und klinischen Forschung ist das Erkennen und Verhindern ("Prediction and Prevention") der malignen Herzrhythmusstörungen. Schwerpunkt der wissenschaftlichen Arbeit bilden die experimentellen Untersuchungen hinsichtlich der Mechanismen von Herzrhythmusstörungen. Durch die Entwicklung neuartiger Mappingsysteme konnte erstmalig gezeigt werden, dass im Tiermodell Kammerflimmern initial fokal und geordnet entsteht. Die bisherigen Untersuchungen und Daten erweitern unser Wissen zur kardialen Defibrillation und zum Entstehen von malignen Herzrhythmusstörungen, stellen aber nur einen Baustein im Gesamtverständnis des Plötzlichen Herztodes dar. Weitere begonnene oder geplante Projekte beschäftigen sich mit Herzrhythmusstörungen bei Vorliegen einer Kardiomyopathie und akuter Ischämie, sowohl im Tiermodell als auch beim Patienten. Neuartige Mappingtechnologien und Tiermodelle können helfen, die Mechanismen zu verstehen, die Therapie von Herzrhythmusstörungen zu verbessern und Therapieverfahren weiterzuentwickeln. / Sudden cardiac death is one of the leading causes of death in Europe, and the leading cause of all natural deaths in the USA. The primary aim of experimental and clinical research is the "prediction and prevention" of lethal ventricular arrhythmias. The focus of this thesis is on animal studies investigating the mechanisms of arrhythmias. Using a novel multichannel electrical cardiac mapping technique we were able to demonstrate that whatever generates fibrillation activations it locates at a small region in the LV apex. This research will widen our understanding of defibrillation and causes of lethal ventricular arrhythmias, but is still only a piece of the puzzle called sudden cardiac death. New initiated or planed project are focusing on arrhythmias in patients and animals with heart failure or acute ischemia. Novel mapping techniques and animal models might further widen our understanding of the mechanisms and might help to develop and improve therapeutic options.

Die postoperative pulmonale Hypertension (PHT) bei Kindern nach chirurgischer Korrektur eines angeborenen Herzfehlers ist mit einer erhöhten postoperativen Morbidität und Mortalität assoziiert. Sie kann in lebensbedrohliche pulmonalhypertensive Krisen exazerbieren. Eine systematische Untersuchung der zugrundeliegenden Pathophysiologie sowie mögliche Behandlungsformen der postoperativen PHT ist Gegenstand dieser Arbeiten. Alle Untersuchungen wurden im Rahmen der klinischen Routine an sedierten und zumeist intubierten und mechanisch beatmeten Kindern mit angeborenen Herzfehlern durchgeführt, sowohl präoperativ im Herzkatheterlabor, als auch postoperativ auf der Intensivstation. Es wird die Anwendung von inhalatorischem NO und aerosolisiertem PGI2 zur Diagnostik und Therapie der prä- und postoperativen PHT bei Patienten mit angeborenen Herzfehlern konkret entwickelt und dargestellt. Die Bedeutung von pulmonalem endothelialen Versagen, zirkulierenden plasmatischen Endothelinen und vaskulo-bronchialen Interaktionen für Ausprägung der postoperativen PHT und den klinischen Verlauf des Patienten werden hier erstmals dargestellt. Insgesamt werden hierdurch neue Therapieansätze aufgezeigt, welche bereits im Einsatz sind oder in naher Zukunft umgesetzt werden. / Postoperative pulmonary hypertension in children after congenital heart surgery is associated with increased postoperative morbidity and mortality. This state may exacerbate in livethreatening pulmonary hypertensive crises. A systematic assessment of the underlying pathophysiology and possible treatment options was the object of this work. All studies were done within the clinical routine in sedated and mostly intubated and mechanically ventilated children with congenital heart disease, during preoperative evaluation in the cardiac catheter laboratory, and during their postoperative recovery on the intensive care unit. The application of inhaled nitric oxide and aerosolised prostacyclin for the preoperative evaluation and postoperative treatment of pulmonary hypertension is described. The impact of pulmonary endothelial dysfunction, circulating endothelins, and vasculo-bronchial interactions for the development and perpetuation of postoperative pulmonary hypertension and the clinical course of the patient is delineated for the first time. Thus, novel therapeutic options are demonstrated which may be already in use or will be applied in the near future.

Die Quantifizierung koronararterieller Verkalkungen mit der Elektronenstrahltomographie hat sich als ein genaues nichtinvasives Instrument der Risikostratefizierung bei koronarer Herzerkrankung erwiesen. Obwohl die Herztransplantation heute als etablierte Therapie der fortgeschrittenen Herzinsuffizienz akzeptiert ist, wird der langfristige Behandlungserfolg durch das Auftreten einer koronararteriellen Intimaproliferation, der sog. Graftsklerose, limitiert. Um die Eignung der Elektronenstrahltomographie für die Diagnostik der Graftsklerose zu prüfen, wurden 112 Patienten zwischen einem und 153 (Median: 46) Monate nach Herztransplantation untersucht. Die koronararterielle Kalklast wurde mit der Agatston-Methode quantifiziert und mit den Ergebnissen der Koronarangiographie und der intrakoronaren Ultraschalluntersuchung verglichen. Koronararterielle Verkalkungen fanden sich bei 84 Patienten (75%). In der Koronarangiographie wiesen 16 Patienten eine >50% Stenose auf, deren Agatston-Score nur in einem Fall unter 55 lag (p9 das Vorliegen verkalkter Plaques. Die Elektronenstrahltomographie hat sich damit als ein vielversprechendes Verfahren zur nichtinvasiven Diagnose einer koronaren Herzerkrankung nach Herztransplantation erwiesen. / Electron beam computed tomography (EBCT) is a non-invasive imaging method that allows for the accurate estimation of coronary risk. Although cardiac transplantation represents the ultimate treatment of end stage congestive heart failure, ist success is limited by intimal proliferation, also known as transplant vasculopathy. To validate the use of EBCT in the detection of cardiac transplant coronary disease, 112 patients were examined between one and 153 months after cardiac transplantation (median: 46 months). Coronary artery calcium load was determined by the Agatston-method and compared with the results of conventional coronary angiography and intracoronary ultrasound. Coronary artery calcifications were found in 84 patients (75%). Upon coronary angiography, 16 patients displayed stenotic lesions of more than 50% of the luminal diameter, and only one of these patients had an Agaston score of less than 55 (p

Das Herzzeitvolumen ist ein wichtiger Parameter zur Beurteilung der Hämodynamik. Trotz des Bedarfs umfangreichen Monitorings in der heutigen Hochleistungsmedizin hat sich bisher keine Methode etablieren können, die diese Größe zuverlässig auf kontinuierlicher Basis bestimmt. Die vorliegende Arbeit untersucht in einem Großtierhämodynamikmodell am Schwein die Möglichkeit, durch Verrechnungen des rechtsventrikulären Druckes (RVP) das korrespondierende Schlagvolumen (SV) zu bestimmen und dadurch eine neue Methode zur kontinuierlichen Schlagvolumen- respektive Herzzeitvolumenbestimmung zu entwickeln. Dazu wurden bei insgesamt 16 Tieren in einem computergestützten Meßsystem kontinuierlich neben anderen wesentlichen Fluß- und Druckparametern der RVP mittels piezoresistiver Druckmessung und das SV mittel Ultraschall-Transit-Time bestimmt. Schlagvolumenvariationen wurden durch akute Änderungen der kardialen Vor- und Nachlast sowie unter Bedingungen der Koronarischämie erreicht. So wurden die Atmungsparameter variiert, die Tiere atrial und ventrikulär frequenzmoduliert, sowie unter Applikation von Dobutamin untersucht. In einer Modifikation der Pulskonturmethode wurde die Fläche unter der RVP-Kurve während der Austreibungsphase als Schlagvolumen bestimmt (SVRVP). Diese Fläche wird von der Geraden mit den Schnittpunkten des RVP zu den Zeitpunkten des Maximums und des Minimums seiner ersten Ableitung (dP/dt) begrenzt. Die errechneten Werte für SVRVP wurden zu den per Ultraschall bestimmten SV-Werten in Korrelation gesetzt. Die Regressionsanalysen zwischen SVRVP und SV zeigten einen engen linearen Zusammenhang zwischen beiden Größen bei geringen Standardfehlern. Dies traf für alle Interventionen - jeweils für sich und im Zusammenhang - gleichermaßen zu. Somit erscheint durch die aufgezeigte Verrechnung des RVP eine kontinuierliche Herzzeitvolumenmessung möglich. Anwendungsmöglichkeiten dieses einfach anzuwendenden Verfahrens ergeben sich im Monitoring auf Intensivstationen sowie im perioperativen Bereich. In erster Linie aber eröffnen sich neue Wege in der ambulanten Diagnostik und Therapieüberwachung von Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz. / Cardiac output is an important parameter of haemodynamics. Despite the need for extensive monitoring in todays hightech medicine a method that can detect this parameter reliably on a continous basis has not yet emerged. We tried to develop a new method on a haemodynamic pig model, to continously calculate the corresponding stroke volume (SV) from the right ventricular pressure curve (RVP) on the basis of the pulse contour method. Sixteen pigs were examined. RVP and SV, among other flow and pressure parameters, were continously monitored on a computer-based-system. RVP was measured by piezo-resistive pressure monitoring, SV was determined by the ultrasound-transit-time method. Variations of stroke volume were achieved by altering pre- and afterload and by inducing myocardial ischemia. The pigs were examined under varying parameters of respiration, atrial and ventricular stimulation, and application of dobutamine. In a modification of the pulse contour method the area under the RVP-curve during the ejection period was determined as stroke volume (SV_RVP). This area is limited by the straight line intersecting the RVP at the time of the maximum and minimum of its first derivative (dP/dt). The calculated data for SVRVP was correlated to the SV determined via the ultrasound-transit-time-method. The regression analysis of SV and SVRVP showed a close and linear relationship between the two parameters with a small standard error. This was true for all interventions. It is therefore possible to monitor cardiac output continously with the variation of the pulse contour method used here. This technique with little invasion may be used for monitoring on intensive care units and for the perioperative care. First of all it opens new ways in ambulatory diagnosis and optimizing medical therapy of patients with congestive heart failure.

Sekundäre bakterielle Infektionen im Verlauf oder in Folge einer Infektion mit Influenza A Viren (IAV) steigern oftmals die Schwere des Krankheitsverlaufes, was besonders während der IAV Pandemien von 1918, 1968 und 2009 deutlich wurde. Genaue mechanistische Ursachen, welche dieser gesteigerten Kopathogenität zugrunde liegen wurden überwiegend in Tierversuchsmodellen adressiert und sind immunologisch unvollständig. Aufgrund organstruktureller und immunfunktioneller Speziesunterschiede ist ungewiss, inwieweit eine Übertragbarkeit der Daten zwischen Mensch und Maus besteht. Fokus der Arbeit bildete die Analyse potentieller IAV assoziierter Änderungen der angeborenen Immunität, welche sekundäre Pneumokokkeninfektionen in humanem ex vivo Lungengewebe begünstigen. Dafür wurden zentrale Zyto - bzw. Chemokine als Reaktion auf Einzelinfektionen mit dem saisonalen IAV Pan/99(H3N2) sowie Streptococcus pneumoniae D39 mit denen subsequenter viral-bakteriellen Koinfektion verglichen. Ausgelöst durch die antivirale Interferonantwort erfolgte die Reduktion der pneumokokkeninduzierten Bildung von IL-1β und GM-CSF auf translationaler und transkriptioneller Ebene. Vermutlich beeinflussen Typ I und II Interferone die IL-1β Bildung, welches über parakrine Wechselwirkungen an der GM-CSF Regulation beteiligt ist. Auf zellulärer Ebene verursachte IAV die Freisetzung von Typ I, II und III Interferonen aus primären humanen Alveolarepithelzellen vom Typ II. In humanen Alveolarmakrophagen unterdrückten Typ I und II Interferone die pneumokokkeninduzierte IL-1β Freisetzung. Folglich unterblieb die IL-1β-regulierte GM-CSF Sekretion aus Alveolarepithelzellen vom Typ II. Die Ergebnisse zeigen, dass influenzainduzierte Interferone durch die Unterdrückung der IL-1β regulierten Bildung von GM-CSF in humanem Lungengewebe beitragen. Damit unterstützt sie das Verständnis immunologischer Faktoren, welche diesem Krankheitsbild im Menschen pathophysiologisch zugrunde liegen können. / Secondary bacterial infections, which occur during or following an IAV infection, exaggerate the severity of the course of disease up to a lethal outcome, clearly recognizable during the fatal IAV pandemics from 1918, 1968 or 2009. Particular mechanisms underlying this exaggerated viral-bacterial copathogenity were almost solely addressed using animal models and are immunologically incomplete. Due to structural and immunofunctional interspecies differences the transferability of data between human and mice remains indeterminate. The study mainly purposed to investigate IAV associated modulations of innate immunity, which potentially facilitates secondary pneumococcal pneumonia in primary human ex vivo lung tissue. Hence secretion of central cyto- and chemokines initiated by single infection with the seasonal IAV Pan/99(H3N2) or the bacterium Streptococcus pneumoniae D39 were compared to subsequent viral-bacterial coinfection. In context of an antiviral interferon response the pneumococcal induced translation and transcription of IL-1β and GM-CSF were reduced. Probably type I and type II interferons affect generation of IL-1β, which participates in the regulation of GM-CSF by paracrine interactions. On a cellular basis the infection of primary human alveolar epithelial cells type II (AECII) with IAV triggered the release of interferon type I, II and III. In human alveolar macrophages type I and II interferons suppressed the pneumococcal induced release of IL-1β. Consequently, the IL-1β regulated generation of GM-CSF in AECII was impeded. The present study indicates, that influenza related induction of interferons suppresses the IL-1β related release of GM-CSF in human lung tissue. Thereby it takes part in contributing to pathophysiological comprehension of immunological factors underlying this copathogenity.

Für die dilatative Kardiomyopathie gibt es bisher keine kausalen Therapiemöglichkeiten. Verschiedene kardiale Autoantikörper sind an der Pathogenese der Erkrankung beteiligt. Diese können durch eine Immunadsorptionsbehandlung entfernt werden. Das Ziel dieser Studie war es, die hämodynamischen Effekte einer Immunadsorption mit nachfolgender Immunglobulin-G-Substitution zu untersuchen. Dazu wurden 18 Patienten (NYHA III-IV, linksventrikuläre Ejektionsfraktion < 30 %) eingeschlossen und zufällig der Behandlungs- oder Kontrollgruppe zugeteilt. An drei aufeinanderfolgenden Tagen erfolgte eine Immunadsorptionsbehandlung. Abschließend wurde polyklonales Immunglobulin-G substituiert. Die Behandlung wurde insgesamt viermal in monatlichen Abständen durchgeführt. Die hämodynamischen Messungen erfolgten mit Hilfe eines Swan-Ganz Thermodilutionskatheters. Nach drei Monaten waren der Herzindex und der Schlagvolumenindex in der Behandlungsgruppe signifikant angestiegen. Der systemvaskuläre Widerstand wurde signifikant gesenkt. Außerdem wurde ein Anstieg der echokardiographischen linksventrikulären Ejektionsfraktion sowie eine Reduktion des linksventrikulären endsystolischen und enddiastolischen Durchmesser Index beobachtet. Die echokardiographischen Veränderungen waren auch im Verlauf nach einem halben Jahr stabil nachweisbar. Die günstige Beeinflussung der hämodynamischen Parameter wurde zudem von einer Verbesserung der klinischen Beschwerdesymptomatik - repräsentiert durch die Einteilung nach der NYHA-Klassifikation - begleitet. Hingegen wurden in der Kontrollgruppe für alle genannten Parameter keine signifikanten Veränderungen beobachtet. Die Effekte der Immunadsorption werden hauptsächlich auf die Elimination der Autoantikörpern zurückgeführt, wenngleich andere Einflüsse - wie ein Einfluss der Immunglobulinsubstitution oder anderer immunmodulatorischer Komponenten - nicht ganz ausgeschlossen werden können. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass Immunadsorptionsbehandlungen bei dilatativer Kardiomyopathie als Ergänzung zur medikamentösen Basistherapie zur Verbesserung der Herzfunktion und zur Linderung der Beschwerdesymptomatik beitragen. / There is no causal therapy for the treatment of dilated cardiomyopathy. Various cardiac antibodies have been detected. These antibodies are extractable by immunoadsorption. The aim of the study was to assess the hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin G substitution. 18 patients with dilated cardiomyopathy (New York Heart Association III-IV, left ventricular ejection fraction < 30%) were randomly assigned either to the treatment group or to the control group. The patients were treated by immunoadsorption on three consecutive days. After the final session polyclonal immunoglobulin G was substituted. The procedure was repeated four times at one-month intervals. Hemodynamic mesurements were made by Swan-Ganz-catheterization. After three months cardiac index and stroke volume index increased significantly. Systemic vascular resistence decreased. Although, the echocardiographic ejection fraction increased, while there was a reduction of the left ventricular endsystolic and enddiastolic diameter index. The echocardiographic changes persisted after six months. The hemodynamic changes were accompanied by an improvement regarding the New York Heart Association classes in the treatment group. In contrast, all parameters did not change throughout the six months in the control group. Presumably the hemodynamic effects result from elimimation of cardiac antibodies. Although there may be an influence of different immunmodulatory components or of the immunoglobulin G substitution, too. In conclusion, Immunoadsorption and subsequent immunoglobulin G substitution improves cardiovascular function in addition to conventional drug therapy.