Orientador: Vera Lucia Gil da Silva Lopes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T04:54:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vieira_TarsisAntonioPaiva_D.pdf: 3309313 bytes, checksum: 6d4805118bd5c929446b40064e1263b2 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A aplicação de modernos conhecimentos sobre causa, efeito e métodos diagnósticos de doenças genéticas para cuidados de saúde é bastante complexa, especialmente no Brasil onde o sistema de saúde é predominantemente público. A síndrome de deleção 22q11.2 (S. Del 22q11.2) é a condição geneticamente determinada mais comum em indivíduos com anomalias palatais, com prevalência de 1/4.000 nascimentos. Considerando esta prevalência, as características do sistema de saúde e da atenção em genética no Brasil, o principal objetivo deste estudo foi realizar estudo multicêntrico para diagnóstico da S. Del 22q11.2 como modelo para otimização de estratégias diagnósticas em genética médica. Para isso, verificou-se a disponibilidade do diagnóstico laboratorial da S. Del 22q11.2 em 11 serviços de genética de diferentes regiões do país, e este foi centralizado nos Laboratórios de Citogenética Humana e Genética Molecular da FCM/UNICAMP por 30 meses. Foram estudados 100 pacientes (48M:52F) e as técnicas utilizadas foram FISH (Fluorescence in situ Hibridization) e MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Disponibilidade anterior e temporária do diagnóstico laboratorial de deleção em 22q11, vinculada a projetos de pesquisa, foi informada por sete instituições, sendo detectada desigualdade regional. Microdeleção em 22q11 foi identificada em 35% dos pacientes e aberrações cromossômicas não envolvendo a região 22q11 foram detectadas em três casos, obtendo-se conclusão diagnóstica em 38% dos casos. Encontrou-se diferença estatisticamente significativa para alguns sinais clínicos apresentados entre os pacientes com e sem deleção. As técnicas de FISH e MLPA mostraram 100% de sensibilidade e especificidade. Considerando a infraestrutura necessária e a adaptação da técnica de FISH, que permitiu reduzir a quantidade de sonda utilizada, esta foi eficaz, mais econômica e mais rápida em comparação a MLPA. A investigação centralizada mostrou-se vantajosa. Aponta-se o modelo estabelecido como uma estratégia importante e factível para o Brasil. Os resultados deste estudo propiciaram reflexões que culminaram em sugestões para o incremento desta abordagem para esta e outras condições geneticamente determinadas em nosso país / Abstract: The introduction of new technologies of molecular diagnosis for health care has been a challenge in the last years, especially in Brazil, where the majority of the population is served by the public health system. The 22q11.1 deletion syndrome is the most common syndrome that has palatal anomalies as a major feature, with a prevalence of 1/4000 births. Considering this prevalence, the Brazilian health system characteristics and the current situation of medical and clinical genetic services in the country, the main aim of this study was to conduct a multicenter study for 22q11.2 deletion diagnosis as a model for the optimization of diagnostic strategies in medical genetics. We investigated the access to laboratorial diagnosis of 22q11.2 deletion at 11 genetic services and centralized this diagnosis for 100 patients with palatal abnormalities and suspicion of 22q11.2 deletion syndrome, referred from these centers during 30 months, at the Cytogenetics and Molecular biology laboratories of the FCM/UNICAMP. To detect 22q11 deletions FISH (Fluorescence in situ Hibridization) and MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) techniques were used. Previous and temporary availability for the diagnosis of 22q11 deletion, associated with research projects, was informed by seven centers, with remarkable geographic disparities. We detected 22q11 deletion in 35% of the patients, and chromosome abnormalities not related to 22q11 region in three patients; thus we reached diagnostic conclusion in 38% of the cases. There was significant difference between some clinical signs found in patients with or without 22q11 deletion. There was 100% of sensibility and specificity for both MLPA and FISH techniques. Considering the required infrastructure and the modifications in the FISH (allowing to reduce probe quantity), this technique was efficient, more economical and faster than MLPA. Centralizing the laboratorial diagnosis was considered advantageous, pointing to this model as an important and feasible strategy for genetic diagnosis in Brazil. These results allowed to suggestions for the improvement of laboratorial diagnosis of this and other genetic conditions in our country / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-03-26T12:09:17Z No. of bitstreams: 2 Tese - Saura Nayane de Souza - 2017.pdf: 4815483 bytes, checksum: a9d3c576d6699488befc8fdde284c795 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-03-26T12:11:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Saura Nayane de Souza - 2017.pdf: 4815483 bytes, checksum: a9d3c576d6699488befc8fdde284c795 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-26T12:11:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Saura Nayane de Souza - 2017.pdf: 4815483 bytes, checksum: a9d3c576d6699488befc8fdde284c795 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-03-06 / The goal of the study was to evaluate cystatin C and other biomarkers as diagnostic tools in canine renal disease. The project was divided in two studies. In the first study renal injury was induced in 6 animals by subcutaneous administration of gentamicin (30mg/kg) for 10 days, and 6 animals were kept as controls. Animals were evaluated for 45 days by the following clinical and laboratorial parameters: physical examination; hemogram and fibrinogen levels; measurement of creatinine, urea, total proteins, albumin, phosphorus, calcium, sodium, potassium, cholesterol levels (biochemical analysis); serum protein electrophoresis; urine sodium, potassium, gamma glutamyl transferase and alkaline phosphatase levels; urinalysis; urine protein / creatinine ratio; hemogasometry and non-invasive systemic arterial pressure. The second study evaluated the level of cystatin C in 58 dogs suffering from different stages (2-4) of chronical renal disease, as defined by International Renal Interest Society (IRIS) guidelines. Six animals presenting acute renal injury induced bygentamicin treatment were also evaluated (for 20 time points upon injury). The results indicated that changes in urine gamma glutamyl transferase and fractional excretion of sodium and potassium were the earliest parameters indicating acute renal injury, even when compared to most common renal disease biomarkers: urea and creatinine. Cystatin C measurement, on the other hand, showed little value for early detection of chronic kidney disease and acute kidney injury in dogs. / O objetivo deste estudo foi avaliar a aplicação dos biomarcadores, em especial da cistatina C, no diagnóstico da doença renal em cães e compreendeu duas etapas. Uma fase constou da avaliação de 12 cães, sendo seis pertencentes ao grupo controle e seis cães pertencentes ao grupo experimental que foram submetidos a um protocolo de indução de injúria renal com 30 mg/kg ao dia de gentamicina, via subcutânea, durante 10 dias. Os cães foram avaliados durante 45 dias por meio de: exame clínico; hemograma e fibrinogênio; bioquímica sérica (ureia, creatinina, proteínas totais, albumina, fósforo, cálcio, sódio, potássio, colesterol e eletroforese das proteínas séricas); bioquímica urinária (sódio, potássio, gama glutamil transferase e fosfatase alcalina); urinálise; determinação da razão proteína/creatinina urinária; hemogasometria e pressão arterial sistólica não- invasiva. A outra fase constou da mensuração da cistatina C sérica em 58 cães com doença renal crônica divididos nos estádios 2, 3 e 4 da IRIS (International Renal Interest Society) e em seis cães com injúria renal aguda induzida por gentamicina, avaliados durante 20 momentos após o início da injúria. Os resultados demonstraram que a enzima gama glutamil transferase urinária e a excreção fracionada de sódio e potássio foram mais precoces em detectar a injúria renal aguda em cães do que outros marcadores mais utilizados na rotina clínica como a creatinina e a ureia. A cistatina C sérica não foi eficiente em detectar de forma precoce a doença renal crônica em cães nos estádios iniciais e a injúria renal aguda, possuindo uma baixa aplicabilidade neste estudo.

In regions where endemic measles virus circulation has been interrupted, laboratory confirmation of measles is like puzzle solving. The complexity of these puzzles depends on the available pieces of clinical, epidemiological and laboratory information. The main goal of this dissertation is to evaluate diagnostic laboratory tools to aid in suspected case confirmation in these settings. First, protocols to elute measles IgM and IgG antibodies from blood spots dried onto filter paper were compared to propose one that will permit the recovery of the maximum volume of eluted sample in the minimum time, effort and cost. An easy-to-implement protocol is proposed for the rapid extraction of serum for measles/rubella serology in outbreak situations for use in the World Health Organization Global Measles and Rubella Laboratory Network. Second, due to inherent limitations of measles specific IgM enzyme immunoassays and molecular methods used for measles confirmation, not all suspected cases can be resolved. For example, IgM and RNA may not be detected in vaccinated cases with waning immunity (secondary vaccine failures) and presenting with modified measles. The observation is made that serological parameters of elevated titers of high avidity neutralizing antibodies correlate with measles secondary vaccines failures and may be useful biomarkers for confirming secondary vaccine failures that cannot be confirmed otherwise. Third, a highly accurate measles IgG avidity enzyme immunoassay for vaccine failure classification is described. Detection of low avidity antibodies using this highly sensitive and specific avidity assay can complement existing measles diagnostic tools in confirming suspected cases when routine IgM testing may be inconclusive. Therefore, these diagnostic approaches can provide additional laboratory information to resolve suspected cases irrespective of vaccination status. Together, data presented in this dissertation may assist in enhancing measles control and surveillance in elimination settings. / En les regions on s'ha interromput la circulació del virus del xarampió endèmic, la confirmació del xarampió a nivell de laboratori és com resoldre trencaclosques. La complexitat d'aquests trencaclosques depèn de les peces disponibles d'informació clínica, epidemiològica i de laboratori. L'objectiu principal d'aquesta tesi doctoral és avaluar eines de diagnòstic de laboratori per a ajudar en la confirmació de casos sospitosos en regions on el xarampió està eliminat. En primer lloc, es van comparar protocols per a eluir les IgM i IgG anti-xarampionoses de mostres de taques de sang seca sobre paper de filtre i proposar un protocol que permetés la recuperació del volum màxim de mostra eluïda en el mínim temps, esforç i cost. Es proposa un protocol de fàcil implementació dins de la xarxa de laboratoris de rubèola i xarampió de l'Organització Mundial de la Salut per a ser usat en situacions de brot. En segon lloc, les IgM anti-xarampionoses i l’ARN del virus del xarampió poden no ser detectats en casos vacunats amb disminució de la immunitat (fallada vacunal secundària) i amb simptomatologia de xarampió modificada. L'observació de que paràmetres serològics de títols elevats d'anticossos anti-xarampionosos neutralizants i d'alta avidesa correlacionen amb fallades vacunals secundàries permet proposar aquests paràmetres com a biomarcadors útils per a confirmar aquestes fallades vacunals quan d'altra manera no podrien confirmar-se. En tercer lloc, es descriu un assaig immumoenzimàtic per a determinar l'avidesa de les IgG contra el virus del xarampió per a la classificació de fallades vacunals. Aquest assaig és altament sensible, específic i precís. La detecció d'anticossos de baixa avidesa mitjançant aquest assaig pot a més complementar les eines actuals de diagnòstic de xarampió en la confirmació de casos sospitosos quan les proves rutinàries de IgM no són concloents. Per tant, aquestes estratègies diagnòstiques poden proporcionar informació de laboratori addicionals per a resoldre casos sospitosos de xarampió independentment del seu estat de vacunació. Les dades presentades en aquesta tesi doctoral poden ajudar a millorar el control del xarampió i vigilància epidemiològica allà on el xarampió ja està eliminat.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniversitet, 2008. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniv., 2007. / Härtill 6 uppsatser.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-05-23T11:18:56Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Pedro Henrique Dias Botelho - 2017.pdf: 2156209 bytes, checksum: 7548059cd0e4b1077f097a09aa4fd4eb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-05-23T11:19:34Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Pedro Henrique Dias Botelho - 2017.pdf: 2156209 bytes, checksum: 7548059cd0e4b1077f097a09aa4fd4eb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-23T11:19:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Pedro Henrique Dias Botelho - 2017.pdf: 2156209 bytes, checksum: 7548059cd0e4b1077f097a09aa4fd4eb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-04-20 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Introduction. Laboratory tests are essential for dengue diagnosis, in that sense algorithms are proposed, which proposes instructions for a more effective laboratory dengue diagnosis. Aim. To evaluate the performance of laboratory tests in the confirmation of suspected dengue cases, appling an algorithm, during a dengue epidemic in Goiânia, Central West Brazil 2012-2013. Methodology. This is a retrospective analytical observational study in a database of a prospective cohort with suspected dengue cases. The algorithm applied was based on three periods in the acute phase of disease, 0-3, 4-7 and >7 days after onset of symptoms (DOS) and in detection of immunoglobulins M and G (IgM and IgG), non-structural 1 protein antigen (NS1Ag) and viral RNA by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Positivity was seen individually and in association of tests in the algorithm and per day of infection, and used to confirm cases. The tests performance was evaluated by the sensitivity, specificity and accuracy of each test when compared to the others association, also in the algorithm. The results were statistically analyzed using SPSS Statistics 17.0, R software and OPENEPI. Results. 592 patients with suspected dengue were included, 415 (70.1%) were laboratory confirmed. In the 0-3 DOS period, the best positivities were by RT-PCR (81.6%) and NS1Ag (63.3%). While, IgM obtained the best positivities in 4-7 and >7 DOS periods (85.5% and 93.3%, respectively). Individually, RT-PCR and IgM tests were the most efficient to add positivity to diagnosis at the beginning and at the end of the acute phase of infection, respectively. Sensitivity results were similar to those of positivity, whereas NS1Ag specificities were greater than 90% at all periods. Conclusion. The algorithm sowed which laboratorial test was the best for the course of disease. Until 3 DOS, molecular is most sensitive test; between 4-7 DOS, two techniques may be required to obtain an accurate diagnostic. NS1Ag test, presented less detection in secondary infection cases, however, they was more specific test and can be used in differential diagnosis of dengue. These results contributed to diagnostic decision in the epidemiological context with concomitant arbovirus circulation. / Introdução. Testes laboratoriais são fundamentais para o diagnóstico da dengue, nesse sentido são propostos algoritmos, que propõe instruções para um diagnóstico laboratorial de dengue mais eficaz. Objetivo. Avaliar o desempenho de testes laboratoriais na confirmação de casos suspeitos de dengue, no curso de duas epidemias (2012 e 2013) em Goiânia, Goiás, Centro-Oeste do Brasil. Metodologia. Trata-se de um estudo observacional analítico que analisou uma base de dados clínicos e laboratoriais de uma coorte prospectiva de pacientes com suspeita clínica de dengue. O algoritmo aplicado baseou-se em três períodos da doença, 0-3, 4-7 e >7 dias após o início dos sintomas (DOS) e no uso de testes de detecção das imunoglobulinas M e G (IgM e IgG), do antígeno da proteína não-estrutural 1 (NS1Ag) e do RNA viral por reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR). Foram avaliadas a positividade dos testes individualmente e em associação de testes por dia de infecção; e a sensibilidade, especificidade e acurácia dos testes. A análise estatistica usou os programas SPSS Statistics 17.0, R software e OPENEPI. Resultados. Dos 592 pacientes selecionados, 415 (70,1%) foram confirmados laboratorialmente. No período de 0-3 DOS, a RT-PCR e NS1Ag obtiveram 81,6% e 63,3% de positividade respectivamente. IgM obteve as positividade nos períodos de 4-7 e >7 DOS (85,5% e 93,3%, respectivamente). Individualmente, os testes de RT-PCR e IgM positividade ao diagnóstico no início e no final da fase aguda da infecção, respectivamente. Os resultados de sensibilidade foram semelhantes aos de positividade, enquanto os de especificidade de NS1Ag foram superiores à 90% em todos os períodos. Conclusão. O algoritmo apontou qual teste laboratorial foi o melhor para o curso da doença. Até 3 DOS, o teste molecular é o mais sensível; Entre 4-7 DOS, duas técnicas podem ser necessárias para obter um diagnóstico preciso. O teste de NS1Ag apresenta menor detecção em casos de infecção secundária, no entanto, foi o teste mais específico, podendo ser utilizado no diagnóstico diferencial de dengue. Estes resultados contribuíram para a decisão diagnóstica no contexto epidemiológico com a circulação concomitante de arbovírus.

Orientadores: Jancarlo Ferreira Gomes, Alexandre Xavier Falcão / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:19:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_JulianaBarboza_M.pdf: 1818938 bytes, checksum: d44ab358d0482575e52d1f77a3f4c07b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: As parasitoses intestinais são altamente prevalentes no mundo, estando entre as maiores causadoras de doenças e óbitos em seres humanos. Atualmente, o diagnóstico laboratorial destas parasitoses é realizado por meio de procedimentos técnicos manuais, desenvolvidos na sua grande maioria há décadas, o que justifica a aplicabilidade de técnicas mais sensíveis e práticas para esta finalidade, visando obter resultados eficientes, especialmente em programas governamentais direcionados à Saúde Pública. Sendo assim, o objetivo do projeto foi de avaliar e validar uma nova técnica parasitológica, denominada TF-Test Modified, em comparação com três técnicas parasitológicas convencionais consagradas pela literatura: TF-Test Conventional; Rugai, Mattos e Brisola; e Kato-Katz/Helm-Test. As etapas do trabalho consistiram em realizar coleta de material fecal de 457 indivíduos localizados em regiões endêmicas para parasitoses no município de Campinas, SP; no processamento laboratorial de 1.828 exames; no diagnóstico de 14 espécies parasitárias; e na análise estatística qualitativa de resultados de maneira abrangente. Dentre as espécies parasitárias encontradas, helmintos e protozoários intestinais foram detectados em 42,23% de indivíduos pela técnica de TF-Test Modified, ante 36,76% por TF-Test Conventional, 5,03% por Kato-Katz/Helm-Test, e 4,16% por Rugai, Mattos e Brisola. Destes casos, 54,40% de infecção simples dos indivíduos demonstrou serem portadores de monoparasitismo. A nova técnica parasitológica de TF-Test Modified, quando comparada com as demais técnicas, apresentou alto valor de infecção, como exemplo para dupla, tripla e múltipla, de maneira a perfazer um total de 98,37% de infecções. Ademais, a nova técnica apresentou índice Kappa com grau de concordância Quase Perfeito em todos os parâmetros avaliados com estimativa de 95% (P<0,05), permitiu encontrar com alta eficiência diagnóstica todas as espécies parasitárias estudadas, mostrou um notável diagnóstico verdadeiro, especialmente quando analisada comparativamente com as outras três técnicas convencionais. O atual estudo permitiu concluir que a técnica de TF-Test Modified pode ser utilizada de forma abrangente no diagnóstico qualitativo de protozoários e helmintos intestinais de humanos. O ganho de sensibilidade diagnóstica proporcionada por esta nova técnica deverá ser de estimável contribuição para o diagnóstico individual laboratorial, inquéritos populacionais e controle das parasitoses intestinais, de modo a repercutir em contribuição social / Abstract: Intestinal parasites are highly prevalent worldwide and is among the largest cause of illness and death in humans. Currently, the laboratory diagnosis of these parasites is accomplished through technical procedures manuals, developed mostly for decades, justifying the applicability of more sensitive techniques and practices for this purpose, to obtain effective results, especially in government programs aimed at Public Health. Thus, the objective of the project was to evaluate and validate a new technique parasite, called TF-Test Modified, compared with three conventional parasitological techniques enshrined in literature: TF-Test Conventional; Rugai, Mattos and Brisola, and Kato-Katz / Helm-Test. The steps of the work consisted of conducting a collection of fecal samples from 457 individuals located in regions endemic for parasitic infections in Campinas, SP, in laboratory processing of 1,828 examinations, the diagnosis of 14 parasitic species, and the qualitative statistical analysis of results so comprehensive. Among the species found parasitic, helminths and intestinal protozoa were detected in 42,23% of subjects using the technique of TF-Test Modified, against 36,76% by TF-Test Conventional, 5,03% by Kato-Katz/Helm-Test, and 4,16% Rugai, Mattos and Brisola. Of these cases, 54,40% of single infections of individuals were shown to be carriers of monoparasitism. The new technique parasitological TF-Test Modified compared to other techniques of infection showed a high value, for example double, triple and multiple so as to make a total of 98,37% infections . Moreover, the new technique presented Kappa index level of agreement with Almost Perfect in all parameters with estimated 95% (P <0.05), allowed to meet with high diagnostic efficiency all parasitic species studied showed remarkable true diagnosis, especially when viewed in comparison with other three conventional techniques. The current study showed that the technique TF-Test Modified can be used comprehensively in qualitative diagnosis of intestinal protozoa and helminths of humans. The gain in diagnostic sensitivity afforded by this new technique should be estimable contribution to the individual diagnostic laboratory, population surveys and control of intestinal parasites, in order to reflect on social contribution / Mestrado / Parasitologia / Mestra em Parasitologia

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_claudia_fernandes.pdf: 1692742 bytes, checksum: 5395743de930fc1ac7ec3c75eaab4e86 (MD5) Previous issue date: 2008-02-15 / Leptospirosis is a zoonotic disease that occurs all over the world and is caused by pathogenic bacteria of the genus Leptospira. Clinical manifestations of leptospirosis are similar to other febrile illnesses and this fact frequently retards beginning of antibiotic therapy. Thus, early and accurate diagnosis is a prerequisite for proper treatment of leptospirosis. Pathogenic serovars of Leptospira have a wide antigenic diversity attributed mainly to the lipopolysacharide present in the outer membrane. In contrast, antigens conserved among pathogenic serovars are mainly represented by outer membrane proteins. Surface exposure of a major and highly conserved outer membrane lipoprotein (LipL32) was recently demonstrated on pathogenic Leptospira. LipL32 on its recombinant form (rLipL32) was used to immunize BALB/c mice to develop murine monoclonal antibodies (mAbs). Three mAbs against rLipL32 were produced, isotyped and evaluated for further use in diagnostic tests of leptospirosis using different approaches. The mAbs were conjugated to peroxidase and evaluated in a native protein ELISA with intact and heat-treated leptospiral cells, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) for direct immunofluorescence with intact and methanol fixed cells and were used for LipL32 immunoprecipitation from leptospiral cells. rLipL32 mAbs conjugated to peroxidase or used as primary antibody bounded to intact and heat-treated cells in ELISA, proving that they could be used in enzyme immunoassays for detection of the native protein. On immunofluorescence assay, mAbs labeled bacterial cells either intact or methanol fixed. Two mAbs were able to immunoprecipitate the native protein from live and motile leptospiral cells and, adsorbed onto magnetic beads, captured intact bacteria from artificially contaminated human sera for detection by PCR amplification. One mAb was utilized for the development of an immunoseparation assay coupled to PCR test (IMS/PCR) for diagnosis of leptospirosis. The antibody adsorved onto magnetic beads captured leptospires from urine and human sera artificially contaminated for further amplification of the lipL32 gene by PCR. To ensure PCR accuracy, an internal amplification control (IAC) was constructed using as amplification targets sequences of standardized primers specific for pathogenic Leptospira and for a not-related DNA sequence. The IMS/PCR IAC method developed was able to detect 102 cells per mL of sera or urine, corresponding to approximately 25 genomic copies per reaction. These results suggest that the association of LipL32-based immunochemical and molecular techniques could yield a novel method for the diagnosis of leptospirosis. Moreover, immunomagnetic separation with mAbs against LipL32 can be used previous to amplification of other targets in the Leptospira genome by PCR. / A Leptospirose é uma zoonose de ocorrência mundial causada por bactérias do gênero Leptospira. As manifestações clínicas da leptospirose são similares a outras doenças febris e este fato frequentemente atrasa o diagnóstico e o início do tratamento. Portanto, o diagnóstico precoce e acurado da doença é um prerequisito para o tratamento adequado. Sorovares patogêncios de Leptospira possuem uma grande variação antigência e esta diversidade é atribuída principalmente ao lipopolissacarídeo presente na membrana externa. Contrastando com esta característica, antígenos conservados de sorovares patogênicos são principalmente representados por proteínas de membrana externa. Recentemente foi comprovada a exposição da proteína LipL32 na superfície da membrana externa de leptospiras patogênicas. Neste estudo, LipL32 em sua forma recombinante (rLipL32) foi utilizada para imunizar camundongos BALB/c e produzir anticorpos monoclonais (mAbs). Três mAbs contra rLipL32 foram produzidos e caracterizados quanto ao seu potencial para uso em testes diagnósticos usando diferentes metodologias. Os mAbs foram conjugados à peroxidase e avaliados quanto a reação com proteina nativa em células de leptospiras íntegras e rompidas, conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) para uso em imunofluorescência para marcar células de leptospira intactas e tratadas com metanol, e usados para imunoprecipitar células de leptospira. Os anticorpos monoclonais anti-LipL32, utilizados em ELISA tanto conjugados com peroxidase ou como anticorpo primário, ligaram-se às células de leptospiras intactas ou rompidas pelo calor, provando que podem ser usados em testes imunoenzimáticos para detecção da proteína nativa. Na imunofluorescência, os mAbs foram capazes de marcar células da bactéria tanto intactas como fixadas com metanol. Dois mAbs foram capazes de imunoprecipitar proteina nativa de leptospiras vivas e móveis, e quando adsorvidos em partículas magnéticas foram capazes de capturar bactérias para amplificação por PCR. Na seqüência deste estudo, o mAb 1D9 foi utilizado em estudos de padronização da metodologia de imunoseparação magnética associada a PCR (IMS/PCR) para diagnóstico de leptospirose. O anticorpo 1D9 foi adsorvido em partículas magnéticas e utilizado para capturar leptospiras em soro e urina humanas artificialmente contaminadas com leptospiras para posterior amplificação. Para assegurar a acurácia da PCR foi construído um controle interno de amplificação (IAC) específico para a metodologia desenvolvida utilizando como alvo sequências de primers já padronizados para exclusiva amplificação de leptospiras patogências e uma sequencia de DNA não relacionada. A metodologia de IMS/PCR IAC permitiu usar somente um par de primers na reação de PCR e mostrou ser promissora para diagnóstico de leptospirose, pois foi capaz de detectar 102 células por mL em amostras de soro e urina artificialmente contaminadas, correspondendo a amplificação a partir de aproximadamente 25 cópias do genoma. Os resultados obtidos evidenciam uma nova perspectiva no diagnóstico da leptospirose através da utilização da proteína LipL32 em métodos imunoquímicos e moleculares ou pela associação destas metodologias. A metodologia de imunoseparação com o mAb anti-LipL32 pode ser utilizada previamente a amplificação de outros alvos do genoma bacteriano por PCR, já que ela possibilita a separação e concentração exclusiva de Leptospira patogênica.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2015-07-20T17:18:11Z No. of bitstreams: 1 Camille de la Cruz Lui.pdf: 2086241 bytes, checksum: 75ab05b8f15dc9046a3907a69abcc137 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-20T17:18:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camille de la Cruz Lui.pdf: 2086241 bytes, checksum: 75ab05b8f15dc9046a3907a69abcc137 (MD5) Previous issue date: 2014-11-14 / The supply chain in the public or private educational institutions, focused on laboratory diagnosis in the health area should be managed according to standards of quality and relevant to biosafety laws. The cost and the optimization of the use of these materials is an important factor in health centers or diagnostic organizations, taking into account the reverse logistics leftover of packages of sterile supplies for improvement in sustainability. A health organization integrates as subsystem to serve the needs of inputs (consumption materials) and equipment (permanent material). These activities are complex and demand a specific mix of inputs, layered on a supply chain that incorporates sequences of actions defined for the generation of their products or procedures. The Supply Chain encompasses all activities related to the flux and transformation through which the product passes, since the raw materials to the final consumer. With the growing concern about the environment and the competitive nature of the market, the importance of the reverse flow of materials and products, has been taking larger proportions. The management of this reverse path of these materials, when compared to the direct flow of the supply chain, is called reverse logistics. The nosocomial infection affects around the world and is one of the causes of death in hospitalized patients, the sensitivity tests are shown to any microorganism that causes an infectious process requiring antimicrobial therapy. The preparation of the Petri dishes for antibiogram tests involves the use of sterile materials, which are often not fully utilized in a laboratory. This loss of leftover material is a break in the supply of an educational institution or diagnostic laboratory chain. The overall goal of this work is to identify how reverse logistics practices can influence the cost savings of a laboratory of an Institution of Higher Education (IHE), with the use of ionizing radiation treatment on plastic materials for sterile use, since after the package is opened and the no use of all the units of their content, makes it impossible to application of these materials in good condition, as the Petri dishes in microbiological testing in laboratories. / A cadeia de suprimentos nas instituições de ensino públicas ou privadas, voltadas para o diagnóstico laboratorial na área de saúde, deve ser gerenciada seguindo normas de qualidade e legislações pertinentes à biossegurança. O custo e a otimização do uso desses materiais é um fator importante nas organizações de saúde ou centros de diagnóstico, levando-se em consideração a logística reversa de sobras das embalagens de materiais estéreis para melhoria na sustentabilidade. Uma organização de saúde integra-se como subsistema para atender as necessidades de insumos (materiais de consumo) e de equipamentos (materiais permanentes). Essas atividades são complexas, e demanda um mix específico de insumos, assentadas sobre uma cadeia produtiva que incorpora sequências de ações definidas para a geração de seus produtos ou procedimentos. A Cadeia de Suprimentos ou Supply Chain compreende todas as atividades ligadas ao fluxo e à transformação pela qual um produto passa, desde a matéria-prima até o consumidor final. Com a crescente preocupação com o meio ambiente e a natureza competitiva do mercado, a importância do fluxo inverso de materiais e produtos, vem tomando maiores proporções. O gerenciamento desse caminho inverso dos materiais, quando comparado ao fluxo direto da cadeia de suprimentos, é chamado de logística reversa. A infecção hospitalar atinge o mundo todo e representa uma das causas de morte em pacientes hospitalizados, os testes de sensibilidade são indicados para qualquer microrganismo que cause um processo infeccioso que requeira terapia antimicrobiana. O preparo de placas de Petri para testes de antibiograma envolve a utilização de materiais estéreis, que muitas vezes não são utilizados na sua totalidade em um laboratório. Essa perda do material de sobra é uma quebra na cadeia de suprimentos de uma instituição de ensino ou laboratório de diagnóstico. O objetivo geral deste trabalho é identificar como práticas de logística reversa podem influenciar na redução de custos de um laboratório de uma Instituição de Ensino Superior (IES), com o emprego do tratamento por radiação ionizante em materiais plásticos para uso estéril, uma vez que após a abertura da embalagem e o não uso da totalidade das unidades de seu conteúdo, inviabiliza a aplicação destes materiais em bom estado, como as placas de Petri, em testes microbiológicos nos laboratórios.