The secreted acid phosphatase (SAcP) of Leishmania donovani is a secreted glycoprotein modified with unique glycoforms which share a structural heterogeneity and immunological similarity with the dominant, cell surface phosphoglycolipid produced by all species of leishmania parasites. The post-translational modifications of this enzyme are structurally diverse and include standard high-mannose type N-linked glycosylations as well as a novel O-linked phosphoglycan. This dissertation encompasses the analysis of these structures including assessment of their size, hexose composition and sites of attachment to the protein. These analyses have employed both carbohydrate and protein chemistry techniques, as well as physical methods such as mass spectrometry. The N-linked glycosylations have been compared with those previously characterized on other Leishmania proteins and show substantial structural similarity. The O-linked phosphoglycans are unique to L. donovani, and are composed of phosphodisaccharides with the structure 4-O-(beta-D-galactopyranosyl)-alpha-D-mannopyranosyl-1-phosphate. These phosphodisaccharides are arranged in linear polymers by way of a phosphodiester linkage between the C1 hydroxyl of mannose and the C6 hydroxyl of galactose. Linkage of this structure to the protein is novel and proceeds via a phosphodiester to selected serine residues that are contained within a consensus protein sequence. This sequence occurs in excess of 20 times within the SAcP, which results in abundant glycan modification and contributes to the heterogeneity displayed by this enzyme. The biosynthetic machinery used to produce these structures was also investigated. The addition of phosphoglycan to the SAcP is initiated by the transfer of alpha-D-mannopyranosyl-1-phosphate from GDP-Man to the protein catalysed by a mannosyl phosphate transferase (MPT). An assay for this enzyme is described using a synthetic peptide substrate to which radiolabeled mannose can be transferred from GDP-[14C] Man. This assay has been used to partially characteriz the MPT and has assisted in the isolation of the enzyme using an affinity chromatography approach. Sequence analysis and amino acid analysis of the enzyme isolated in this way has shown that the MPT is a novel molecule that does not presently exist in the public database. / Graduate

Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2016. / Submitted by Marise Leite (marise_mg@yahoo.com.br) on 2016-04-15T14:05:13Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) TESE_RecrutamentoReceptorAdenosina.pdf: 10895173 bytes, checksum: 063aa6f41640dc7c0ad7cf1bfd62b643 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2016-04-25T14:32:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) TESE_RecrutamentoReceptorAdenosina.pdf: 10895173 bytes, checksum: 063aa6f41640dc7c0ad7cf1bfd62b643 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-25T14:38:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) TESE_RecrutamentoReceptorAdenosina.pdf: 10895173 bytes, checksum: 063aa6f41640dc7c0ad7cf1bfd62b643 (MD5) Previous issue date: 2016 / A infecção por Leishmania pode resultar num amplo espectro de manifestações clínicas e a infecção por Leishmania amazonensis é associada a uma deficiência na resposta de linfócitos T específicos para o parasito. Células dendríticas direcionam a diferenciação de linfócitos Th1 que contribuem para o controle da infecção por Leishmania. Em um trabalho anterior, nós mostramos que a infecção por L. amazonensis, mas não por L. braziliensis ou L. major, prejudica a resposta de células dendríticas por um mecanismo dependente do receptor de adenosina A2B. Neste trabalho, nós avaliamos a expressão de receptores de adenosina e os eventos intracelulares ativados a partir do receptor A2B em células dendríticas infectadas, bem como o papel desses eventos na infecção de camundongos por L. amazonensis. Inicialmente, células dendríticas derivadas de células de medula óssea de camundongos C57BL/6J foram infectadas por promastigotas metacíclicas de L. amazonensis, L. braziliensis ou L. major. Imagens obtidas por microscopia de fluorescência mostraram que a infecção por promastigotas metacíclicas de L. amazonensis estimula a redistribuição do receptor A2B para a superfície de células dendríticas infectadas, sem alterar a quantidade total do receptor, avaliada por western blotting, nem a expressão dos receptores de adenosina A1, A2A e A3. A infecção por L. braziliensis, L. major ou promastigotas procíclicas de L. amazonensis não alteram a expressão do receptor A2B em células infectadas. Nossos resultados mostraram, ainda, que a infecção por L. amazonensis estimula a produção de AMPc e a fosforilação de ERK1/2 por mecanismos dependentes do receptor A2B. Além disso, L. amazonensis prejudica a expressão de CD40 e a produção de IL-12p70 por células dendríticas, efeitos independentes de IL-10 e revertidos pela inibição de adenilato ciclase, de PI3K e da fosforilação de ERK1/2. Por fim, camundongos infectados na orelha por L. amazonensis na presença de inibidores do receptor A2B ou das proteínas PI3K ou ERK1/2 desenvolvem lesões menores se comparados a animais controles, mas apenas o bloqueio do receptor A2B é capaz de diminuir o parasitismo tecidual. Concluindo, nós propomos um novo mecanismo utilizado por L. amazonensis (redistribuição do receptor A2B AMPc PI3K ERK1/2) para inibir a ativação de células dendríticas, que parece ser importante para a deficiência na resposta imune observada na infecção por essa espécie de parasito. ______________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Leishmania infection can result in a wide spectrum of clinical manifestations and L. amazonensis is associated with a lack of antigen-specific T-cell responses. Dendritic cells direct the differentiation of T-helper 1 lymphocytes that contribute to the control of Leishmania infection. In a previous work, we showed that infection by L. amazonensis, but not by L. braziliensis or L. major, impairs dendritic cells responses by activating adenosine A2B receptors. Here, we evaluated the expression of adenosine receptors and the intracellular events triggered by A2B receptor in infected cells. Furthermore, we evaluated the role of these intracellular events in L. amazonensis-infected mice. With this aim, bone marrow-derived dendritic cells from C57BL/6J mice were infected with metacyclic promastigotes of either L. amazonensis, L. braziliensis or L. major. Fluorescence microscopy revealed that L. amazonensis infection stimulates the redistribution of A2B receptor to the surface of infected dendritic cells, without altering total A2B receptor protein density, as gauged by Western blotting, nor the expression of A1, A2A or A3 adenosine receptors. We also report that L. amazonensis increases cAMP production and ERK1/2 phosphorylation in infected dendritic cells by a mechanism dependent on A2B receptor. Furthermore, L. amazonensis infection impairs CD40 expression and IL-12 production by dendritic cells, an IL-10-independent effect prevented by the inhibition of adenylate cyclase, PI3K or ERK1/2 phosphorylation. Finally, mice infected in ear with L. amazonensis in the presence of inhibitors of A2B receptor, PI3K or ERK1/2 develop smaller lesions if compared with control animals, but only A2B receptor blockade decreases tissue parasitism. In conclusion, we propose a new pathway used by L. amazonensis (A2BR redistribution cAMP PI3K ERK1/2) to suppress dendritic cells activation, which may contribute to the pronounced deficiency of immune response elicited against this parasite infection.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-05-21Bitstream added on 2014-06-13T19:54:00Z : No. of bitstreams: 1 moraes_ce_me_botib_parcial.pdf: 160847 bytes, checksum: e1fbd72efec3c35b64a2af0a0589e554 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-05-28T14:25:06Z: moraes_ce_me_botib_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-05-28T14:26:11Z : No. of bitstreams: 1 000695380.pdf: 531611 bytes, checksum: 33724e2ee839154fda10d1a7a97cea49 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Na maioria dos eucariotos, proteínas que ligam aos telomeros, tais como POT1 e TRF2 apresentam papéis cruciais na biologia dos telômeros, interagindo com vários outros reguladores dos telômeros para garantir a manutenção adequada dos mesmos e ainda formam complexos de ordem maior, conhecido como telosome ou shelterin. Os telômeros de Leishmania spp. são compostos por repetições conservadas TTAGGG e são mantidos pela telomerase. A base do complexo de proteínas teloméricas de Leishmania é formado pelas proteínas LaRPA-1 e LaRbp38, que ligam vitro e in vivo, com alta afinidade a DNA telomérico simples fita rico em G, e por proteínas que interagem com a região de DNA telemérico dupla fita, como a proteína recentemente descrita, homólogo de TRF. O genoma de Leishmania spp., como outros tripanossomatídeos, não tem muitas das proteínas conservadas que ligam a simplesfita teloméricos encontrada em eucariontes, tais como os homólogos da proteína CDC13 e POT1. Portanto, nós especulamos que o homólogo de RPA-1 de Leishmania pode desempenhar as mesmas funções como POT1/CDC13 nos telômeros do parasita, embora possa se ligar ao DNA telomérico simples fita com alta afinidade e de forma independente de seqüência. LaRPA-1, juntamente com a proteína multifuncional LaRbp38, que também interage com uma ampla gama de seqüências rico em GT, incluindo os telômeros, parece fazer parte de um complexo telomérico parasita que se assemelha ao complexo CST recentemente descrito. O complexo CST está sendo considerado um segundo modo de proteger os telômeros presentes em umavariedade de espécies, com exceção de leveduras de brotamento, e é constituído principalmente por proteínas RPA-like. Neste estudo, nós usamos diferentes abordagens para demonstrar que LaRPA-1 interage com o LaRbp38 e com a... / In most eukaryotes, telomere binding proteins such as POT1 and TRF2 play crucial roles in telomere biology by interacting with several other telomere regulators to ensure proper telomere maintenance and to form high order complexes known as telosome or shelterin. Leishmania spp. telomeres are composed by the conserved TTAGGG repeats which are maintained by telomerase. The basic Leishmania telomeric protein complex is formed by the proteins LaRPA-1 and LaRbp38, which bind in vitro and in vivo, with high affinity, to the G-rich single-stranded DNA, and by proteins that interact with the double-stranded region of telomeres such as the recently described TRF homologue. The Leishmania spp. genome, like other trypanosomatid, lacks many of the conserved single-stranded telomeric proteins found in other eukaryotes, such as the CDC13 and POT1 protein homologues. Thus, we speculate that the Leishmania RPA-1 homologue may play the same roles as POT1/CDC13 at parasite telomeres, although it can also bind to other single-stranded DNA with high affinity and in a sequence-independent manner. LaRPA-1 together with the multifunctional LaRbp38 protein, which also interacts with a wide range of GT-rich sequences, including telomeres, seems to form part of a parasite telomeric complex that resembles the recently described CST complex. The CST complex is being considered a second telomere capping mode occurring in a broad variety of species, except budding yeast, and is mainly formed by RPA-like proteins. In this report we used different approaches to show that LaRPA-1 interacts with both LaRbp38 and with telomerase, and that these protein:protein interactions seem to occur in a cell-cycle independent manner. In addition, LaRPA-1 partially co-localizes with both proteins, probably... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-09-14Bitstream added on 2014-06-13T20:56:02Z : No. of bitstreams: 1 penha_ta_me_jabo.pdf: 999907 bytes, checksum: 65a051d69be1b9f6360131e9bb8dadf6 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A Leishmaniose Visceral (LV) é uma zoonose de distribuição mundial. No Brasil foi descrita em várias regiões, mas na região sudeste vem ocorrendo de forma significativa desde 1998, na região de Araçatuba, SP. O cão é o principal reservatório doméstico do protozoário Leishmania chagasi e a principal fonte de contaminação para o homem. A resposta imune do hospedeiro canino frente ao parasito é variável e por este fato, os cães apresentam sinais clínicos acentuados ou ausência destes. Os animais que apresentam maior carga parasitária e sinais clínicos mais severos são considerados susceptíveis à infecção pelo parasito. Este padrão está associado ao perfil de citocinas produzidas, ou seja, na predominância de citocinas Th1 são resistentes ou Th2 susceptíveis. No entanto existem muitas variações neste padrão de resposta, ou seja, muitos animais apresentam a produção de citocinas Th1 e Th2, sugerindo um desequilíbrio na proporção de citocinas pró e antiinflamatórias, que favorecem a multiplicação e sobrevivência dos parasitos. Este desequilíbrio tem influência direta sobre a ativação de macrófagos e sobre sua capacidade microbicida e de apresentação antigênica, levando a uma anergia de linfócitos T e a manutenção e cronicidade da infecção. As quimiocinas são citocinas com potente atividade quimiotática sobre leucócitos. Na LV existem estudos no homem e em modelos experimentais, mas no cão apenas um estudo avalia o seu papel no baço. Existe muita controvérsia sobre o seu verdadeiro papel na LV, pois descreve-se tanto a sua ação próinflamatória quanto a sua ação deletéria, que favorece o parasito. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar o papel das quimiocinas MIP-1a e MCP-1 no baço e fígado de 30 cães... / Visceral Leishmaniasis (VL) is a zoonosis of worldwide distribution. In Brazil has been described in several regions, but has been occurring in the Southeast significantly since 1998 in Araçatuba, SP. The dog is the main domestic reservoir of Leishmania chagasi and the main source of contamination for humans. The canine host immune response against the parasite is variable. Dogs have severe intensity or absence of clinical symptoms. Animals that have a higher parasite load and clinical signs are considered more susceptible to infection by the parasite. This pattern is associated with the profile of cytokines produced, in the predominance of Th1 they are resistant or in the predominance of Th2 they are susceptible. However there are many variations on this response pattern, many animals have the production of Th1 and Th2 cytokines, suggesting an imbalance in the proportion of pro and anti-inflammatory cytokines, which favor the multiplication and survival of parasites. This imbalance has a direct influence on the activation of macrophages and their microbicidal activity and antigen presentation, leading to anergy of T lymphocytes and the maintenance and chronicity of infection. Chemokines are cytokines with potent chemotactic activity on leukocytes. In the VL are studies in humans and experimental models, but the dog only one study assessing its role in the spleen. There is much controversy over its true role in VL, because it describes both its pro-inflammatory action and its deleterious effects, which favors the parasite. Therefore, the aim of this study was to evaluate the role of chemokines MIP-1α and MCP-1 in the spleen and liver of 30 dogs naturally infected with Leishmania spp. and compare the findings with the parasite load of each organ. For this purpose, samples of liver and spleen were analyzed... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Valéria Marçal Felix de Lima / Banca: Hélio José Montassier / Banca: Mirela Tinucci Costa / Banca: Cáris Maronis Nunes / Banca: Vânia Luiza Deperon Bonato Martins / Resumo: O presente estudo investiga in vitro a ação leishmanicida do imunomodulador fosfolinoleato-palmitoleato de magnésio e amônio proteico (PMAPA) e sua ação citotóxica em células mononucleares, e in vivo seu efeito imunomodulador em cães naturalmente infectados por Leishmania spp. Para avaliar a viabilidade celular após a ação do P-MAPA utilizou-se o ensaio colorimétrico com (3 - (4,5-dimetil-2-il) -2,5-difenil tetrazolium brometo (MTT), onde células mononucleares derivadas de sangue periférico foram cultivadas com diferentes concentrações de P- MAPA; 0, 50, 100 e 200 μg/mL em ambiente úmido a 37°C, com 5% de CO2 por 72 horas. A ação leishmanicida do imunomodulador foi avaliada pelo mesmo método utilizando-se a forma promastigosta de Leishmania (L.) chagasi. Para avaliar a ação terapêutica do PMAPA, vinte cães sem raça definida, com sintomas clínicos compatíveis com leishmaniose e positivos na detecção de anticorpos anti-leishmania pelo método ELISA, foram tratados. Dez cães receberam 15 doses do imunomodulador (2,0 mg/kg), por via intramuscular, e dez receberam solução fisiológica como placebo. Os grupos foram acompanhados para observação da remissão de sinais clínicos, no grupo tratado e controle foram colhidas amostras de pele antes e após a administração do imunomodulador para quantificação da carga parasitária, ao final do tratamento amostras de sangue periférico foram utilizadas para o isolamento de mononucleares e investigação do perfil linfocitário do tipo T e produção das citocinas IL-10, IFN-gama e IL-2 em sobrenadante de cultura celular. A quantificação da carga parasitária nas amostras de pele foi realizada pelo método da PCR em tempo real. O perfil linfocitário do tipo T foi realizado por citometria de fluxo, e a quantificação das citocinas em sobrenadante de cultura... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This study investigates the in vitro leishmanicidal action of the immunomodulator-phospholinoleate palmitoleato magnesium and ammonium protein (P-MAPA) together with its cytotoxic action in mononuclear cells. It also investigates, in vivo, its immunomodulatory effect in dogs naturally infected by Leishmania spp. To assess cell viability after the action of P-MAPA, the colorimetric assay with (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) was used. There mononuclear cells derived from peripheral blood and were cultured with different concentrations of P-MAPA, 0, 50, 100 and 200 μg/mL in a humid environment at 37 ° C with 5% CO2 for 72 hours. The leishmanicidal action of immunomodulators was evaluated using the same method to form promastigosta of Leishmania (L.) chagasi. To assess the therapeutic action of P-MAPA, twenty mongrel dogs, with clinical symptoms compatible with leishmaniasis and positive detection of anti-leishmania antibodies by ELISA assay were treated. Ten dogs received 15 doses of the immunomodulator (2.0 mg / kg) intramuscularly, and ten received saline solution as placebo. The groups were followed for observation of clinical signs of remission; in the both groups, skin samples were collected before and after administration of the immunomodulator to quantify the parasite load. At the end of treatment, peripheral blood samples were used for the isolation of mononuclears, the profile investigation of type T lymphocytes, together with the production of IL-10, IFN-gamma and IL-2 cytokines in cell culture supernatant. The quantification of parasite load in the samples was performed by PCR in real time. The profile of type T lymphocytes was performed by flow cytometry, and quantification of cytokines in culture supernatants by ELISA capture... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Diego Araújo Campos (diegoa@bce.unb.br) on 2014-05-29T16:09:51Z No. of bitstreams: 1 2013_ÉricaAlessandraRochaAlves.pdf: 2385299 bytes, checksum: 03bdd9a5cec34798dfe49b99c553f60e (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-05-29T16:19:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_ÉricaAlessandraRochaAlves.pdf: 2385299 bytes, checksum: 03bdd9a5cec34798dfe49b99c553f60e (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-29T16:19:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_ÉricaAlessandraRochaAlves.pdf: 2385299 bytes, checksum: 03bdd9a5cec34798dfe49b99c553f60e (MD5) / Alguns estudos têm demonstrado que os inibidores da protease do VIH modulam várias funções do sistema imunitário, porém não se sabe ainda se estes medicamentos podem modificar a resposta de defesa contra as leishmânias. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do tratamento com os inibidores da protease do VIH lopinavir/ritonavir e atazanavir sobre funções dos macrófagos durante as primeiras horas de interação com as leishmânias. Utilizamos macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, tratados por 10 dias, por via oral, com lopinavir/ritonavir (200/50 mg/Kg) e atazanavir (90 mg/Kg), que foram infectados ou não in vitro com um menor (proporção 2:1) e um maior número (proporção 10:1) de promastigotas de L. (L.) amazonensis e que denominamos condições subótimas e ótimas, respectivamente. Analisamos o efeito desses medicamentos sobre o índice de infecção, a capacidade de aderência, a viabilidade dos macrófagos, a viabilidade das leishmânias, a produção de moléculas microbicidas, a produção de citocinas, a expressão de corpúsculos lipídicos, e parte das vias de sinalização intracelular do NF-B e PPAR-. O índice de infecção e o número de macrófagos aderentes foram avaliados por microscopia ótica, após coloração com Giemsa 10%. O percentual de macrófagos viáveis foi analisado por microscopia de fluorescência, após coloração com laranja de acridina (5 mg/mL). A viabilidade dos parasitos foi estimada contando-se, em câmara de Neubauer, o número de parasitos que proliferaram a partir das amastigotas recuperadas dos macrófagos infectados. A produção de óxido nítrico (NO) e peróxido de hidrogênio (H2O2) foi determinada pelos métodos de Griess e Pick, respectivamente. A produção das citocinas IL-1, IL-6, IL-12p70, TNF-α e IL-10 foi analisada pela técnica de ELISA. A influência dos medicamentos sobre a expressão dos corpúsculos lipídicos foi analisada tanto por microscopia ótica, após coloração com Oil Red O, quanto por microscopia confocal, após coloração com Bodipy e as vias do NF-B e PPAR- foram investigadas por microscopia confocal e quantificadas utilizando o software ImageJ. O número de células recuperadas da cavidade peritoneal dos camundongos BALB/c tratados com LPV/RTV (p=0,003) e ATV (p=0,003) foi menor do que o número recuperado dos animais que foram tratados com salina. O índice de infecção dos macrófagos dos camundongos tratados com LPV/RTV foi maior do que o dos macrófagos dos animais tratados com salina, tanto quando as células foram incubadas com um menor número de parasitos (p=0,0005) como quando foram incubadas com um maior número de leishmânias (p=0,004). Em ambos os casos, esse aumento foi ocasionado por uma elevação do percentual de macrófagos infectados por L. (L.) amazonensis (p<0,05), porém quando a infecção foi feita com um menor número de parasitos, também deveu-se a uma elevação do número médio de L.(L.) amazonensis interiorizada por macrófago (p=0,004). Diferentemente, o índice de infecção dos macrófagos dos camundongos tratados com ATV somente foi maior do que o dos macrófagos dos animais tratados com salina quando as células foram incubadas com um menor número de leishmânias (p=0,04) e esse aumento foi ocasionado por uma elevação do percentual de células infectadas por L. (L.) amazonensis (p=0,02). Quando as células foram incubadas com um maior número de parasitos, ambos os medicamentos não influenciaram a viabilidade dos macrófagos, bem como sua capacidade de aderência ao vidro, entretanto tanto o LPV/RTV quanto o ATV aumentaram a capacidade de aderência dos macrófagos que foram incubados com um menor número de leishmânias (p=0,02). Um maior número de parasitos proliferaram a partir dos macrófagos dos animais tratados com LPV/RTV e ATV em todos os dias analisados, sendo que no terceiro dia de cultivo, foram recuperadas 45,1% (p=0,001) e 56,4% (p=0,001) mais promastigotas/mL a partir dos macrófagos dos animais tratados com antiretrovirais do que daqueles provenientes dos animais tratados com salina. Os antiretrovirais não influenciaram a produção de H2O2 pelos macrófagos. Quando os macrófagos foram incubados com um menor número de parasitos, a infecção com pelas leishmânias deprimiu a produção do NO (p=0,054), entretanto o tratamento com LPV/RTV (p=0,03) aumentou a produção desse reativo de nitrogênio pelos macrófagos incubados com leishmânias em relação aos macrófagos dos animais que foram tratados com salina. Ambos os medicamentos não interferiram na produção de IL-23, IL-6 e na expressão dos corpúsculos lipídicos pelos macrófagos incubados ou não com as leishmânias. A infecção dos macrófagos pela incubação com um maior número de parasitos deprimiu a produção de IL-12p70 pelos macrófagos dos camundongos tratados com ATV (p=0,058). A incubação dos macrófagos com um maior número de parasitos acarretou uma diminuição da produção do TNF-α pelos macrófagos dos camundongos tratados com salina (p=0,047). O tratamento com ATV deprimiu a produção de TNF-α pelos macrófagos (p<0,0001), entretanto houve um aumento da produção do TNF-α após incubação in vitro com as leishmânias (p=0,025), porém, sem ultrapassar os níveis máximos observados nos animais não tratados. Ambos os tratamentos reduziram a produção de IL-10 pelas células que foram incubadas apenas com o meio de cultura (p=0,01), e essa produção se manteve baixa mesmo quando os macrófagos foram incubados com um maior número de leishmânias. O tratamento com o ATV estimulou a translocação do NF-B p65 do citoplasma para os núcleos dos macrófagos incubados apenas com o meio de cultura e favoreceu a translocação mais precoce desse fator de transcrição para os núcleos dos macrófagos incubados com um menor número de parasitos. A infecção com um maior número de leishmânias diminuiu a translocação do NF-B RelB do citoplasma para os núcleos dos macrófagos nos animais tratados com o LPV/RTV (p=0,0001) e ainda a expressão citoplasmática do NF-B RelB nos animais tratados com o atazanavir (p=0,0003). A infecção dos macrófagos com uma maior número de leishmânias aumentou a expressão citoplasmática do PPAR- nos animais tratados com ATV (p=0,02), sem modificar a translocação do PPAR- do citoplasma para os núcleos dos macrófagos. Os nossos resultados mostraram que os inibidores da protease do VIH influenciaram diversos mecanismos de defesa inato que são importantes para a imunidade e imunopatogenia das leishmanioses. Embora esses medicamentos sejam altamente efetivos para controlar a replicação do Vírus da Imunodeficiência Humana, é possível que essas drogas possam influenciar o curso clínico das leishmanioses nos indivíduos coinfectados pelo VIH e Leishmania. ___________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Some studies have shown that HIV protease inhibitors modulate many functions of the immune system, but it is unknown whether these drugs may influence the defense response against Leishmania. Therefore, the aim of this research was to evaluate the influence of the treatment with the HIV protease inhibitors lopinavir/ritonavir and atazanavir on macrophage functions during its first interaction with Leishmania. We used peritoneal macrophages from BALB/c mice treated orally, for 10 days, with lopinavir/ritonavir (200/50 mg / kg) and atazanavir (90 mg/kg ), which were infected or not in vitro with a low (2:1) or high (10:1) amount of promastigotes of L. ( L. ) amazonensis. We analyzed the effect of these drugs on infection index, viability of macrophages, adhesion capacity, viability of Leishmania, production of microbicidal molecules and cytokines production, expression of lipid bodies and NFB and PPAR- intracellular signaling pathways. The infection index and the number of adherent macrophages were evaluated by light microscopy after staining with 10% Giemsa solution. The percentage of viable macrophages were assessed by fluorescence microscopy after staining with acridine orange (5 mg/mL). The viability of the parasites was determined by counting the number of parasites that proliferated in culture after recovered from infected macrophages using a Neubauer chamber. The production of nitric oxide (NO) and hydrogen peroxide (H2O2) was determined by Griess and Pick methods, respectively. The production of IL-1 , IL-6 , IL-12p70, TNF-α and IL-10 was assessed by ELISA. The influence of the drugs on the NF-B and PPAR- signaling pathways was investigated by confocal microscopy, whereas the expression of lipid bodies was studied by optical microscopy, after staining with Oil Red, and by confocal microscopy, after staining with Bodipy. The number of cells recovered from peritoneal cavity of LPV/RTV treated-BALB/c mice (p=0.003) and ATV-treated-BALB/c mice (p=0.003) was lower than the number recovered from animals treated with saline. The infection index of macrophages from LPV/RTV-treated animals was higher than that of macrophages from saline-treated animals, both when cells were incubated with a low amount of parasites (p=0.0005) as when they were incubated with a high amount of Leishmania (p=0.004). In both cases, this elevation was due to an increase in the percentage of macrophages infected by L. (L.) amazonensis (p<0.05), but when infection was performed with a low amount of parasites, was also due to the increase in the average number of L. (L.) amazonensis by macrophage (p=0.004). Differently, the infection index of macrophages from ATV-treated mice was only higher than that of macrophages from animals treated with saline when cells were incubated with a high amount of Leishmania (p=0.04), and this elevation was due to the increase of the percentage of macrophages infected by L. (L.) amazonensis (p=0.02). When cells were incubated with a high amount of parasites, no treatment influenced the viability of macrophages as well as their abilities to adhere to glass slides, however LPV/RTV and ATV increased adhesion capacity of macrophages when they were incubated with a low amount of parasites (p=0.02). An increased number of Leishmania proliferated after recovered from macrophages of mice treated with antiretrovirals, and on third day in culture, 45.1% (p=0.001) and 56.4% (p=0.001) more promastigotes/mL were recovered from macrophages of LPV/RTV- and ATV- treated mice than from saline-treated mice. Both drugs did not influence H2O2 production by macrophages. Leishmania infection decreased NO production by macrophages treated with saline (p=0.054), however, when macrophages were incubated with a low amount of parasites, the NO production by macrophages from LPV/RTV-treated mice (p=0.03) was higher than the NO production by macrophages from saline-treated mice. Both drugs did not influence the production of IL-23, IL-6 and the expression of lipid bodies by macrophages incubated with or without Leishmania. The infection of macrophages with a high amount of parasites decreased the IL- 12p70 production by macrophages from ATV-treated mice (P=0.058). The infection of macrophages with a high amount of parasites decreased TNF-α production by macrophages from saline-treated mice (P=0.047). The ATV treatment decreased the production of TNF-α by macrophages (p<0.0001), however, there was an increased production of TNF-α after incubation in vitro with a high amount of Leishmania (p=0.025), however, without exceeding the TNF-α levels observed in macrophages from untreated animals. Both treatments reduced the production of IL-10 when cells were incubated only with culture medium (p=0.01) that remained low even when macrophages were incubated with a high amount of Leishmania. The treatment with ATV stimulated NF-B p65 nuclear translocation when macrophages were incubated in medium and favored an earlier nuclear translocation of this transcription factor when macrophages were incubated with a low amount of parasites. Infection with a high amount of parasites decreased the nuclear translocation of NF- RelB B in macrophages recovered from LPV/RTV-treated animals (p=0.0001) and also the cytoplasmic expression of NF-B RelB when macrophages were recovered from atazanavir-treated animals (p=0.0003). Infection of macrophages with a high amount of Leishmania increased cytoplasmic expression of PPAR- when macrophages were derived from ATV treated-mice (p=0.02), without changing the cytoplasm-to-nucleus PPAR- translocation in macrophages. Our results showed that HIV protease inhibitors were able to influence the innate defense mechanisms, which are important for immunity and immunopathogenesis of leishmaniasis. Although these drugs are highly effective in controlling the HIV replication, it is possible that they may influence the clinical course of leishmaniasis in individuals HIV and Leishmania coinfected.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2011. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-17T14:52:27Z No. of bitstreams: 1 2012_AdaAmaliaAyalaUrdapilleta_Parcial.pdf: 577695 bytes, checksum: da6d65d141a3fe1334cdfd1c715bf6ab (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-17T14:53:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_AdaAmaliaAyalaUrdapilleta_Parcial.pdf: 577695 bytes, checksum: da6d65d141a3fe1334cdfd1c715bf6ab (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-17T14:53:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_AdaAmaliaAyalaUrdapilleta_Parcial.pdf: 577695 bytes, checksum: da6d65d141a3fe1334cdfd1c715bf6ab (MD5) / No Brasil, a Leishmaniose Tegumentar Americana constitui um importante problema de saúde pública. É uma doença de difícil controle com aumento de casos que não respondem ao tratamento. Até o momento, não existe terapêutica ideal para as leishmanioses, contudo os antimoniais pentavalentes têm representado a droga de escolha com cura de 60 a 90%, nos últimos anos. A não resposta ao tratamento é complexa com vários fatores envolvidos tais como, a falha terapêutica vinculada à resposta do hospedeiro e a resistência do parasito as drogas. O objetivo deste estudo foi analisar isolados de L.(L.) amazonensis e L.(V.) braziliensis obtidos de lesão cutânea de portador de Leishmaniose Cutânea Difusa e Leishmaniose Cutânea Mucosa respectivamente com sucessivas falhas terapêuticas, comparados com Leishmanias controles. Os isolados dos pacientes foram estudados em relação a manifestação clínica, a ação de drogas in vitro e a identificação de proteínas. Os testes in vitro foram realizados com formas promastigotas e amatigotas axênicas testadas com antimônio pentavalente, miltefosina, anfotericina B lipossomal, pentoxifilina, itraconazol e alopurinol. As drogas foram distribuídas em placas Elisa de 96 poços em concentrações de 0 até 3000 μg/mL para formas promastigotas e de 0 a 50 μg/mL para formas amastigotas axênicas. A suspensão utilizada foi de 106 para formas promastigotas incubadas por 48 h e de 107 amastigotas/mL incubadas por 24 horas a 37ºC e 5% de CO2 para as formas amastigotas axênicas. Em ambas as formas foi empregado o método colorimétrico, com o Methyl Thiazolyl Blue e a leitura dos testes foi realizada em leitor de placas Elisa (Molecular Devices-Spectra Max, 385 plus - USA) no comprimento de onda de 570nm. As drogas alopurinol e miltefosina apresentaram maior eficácia (p<0,05) frente às formas promastigotas de L.(L.) amazonensis comparadas com o controle. E para as formas amastigotas axênicas da mesma espécie, as drogas anfotericina B lipossomal e miltefosina mostraram redução significativa (p<0,05) do número de parasitos em relação ao controle. Na identificação de proteínas pela técnica de cromatografia líquida de alta eficiência associada a espectrometria de massa, foram identificadas em maior quantidade as proteínas malate dehydrogenase no isolado de L.(L.) amazonensis e as proteínas XIX ATPase alpha subunit Leishmania braziliensis e putative heat shock protein hsp70 Leishmania braziliensis no isolado de L.(V.) braziliensis, indicando possível relação destas proteínas no comportamento da doença. Acredita-se que seja necessária, além da identificação e elevação dos níveis das proteínas, a constatação da super-expressão das mesmas nas populações sensíveis e resistentes das espécies de L.(L.) amazonensis e L.(V.) braziliensis estudadas para explicar melhor a falha terapêutica dos isolados dos pacientes. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In Brazil, American cutaneous leishmaniasis is an important public health problem. It is a difficult disease to control with an increase in cases no-response to treatment. At the moment, no exist ideal therapy for leishmaniasis, but the pentavalent antimonials have represented the drug of choice to cure 60-90% in recent years. The non-responsiveness to treatment is complex with many factors involved such as therapeutic failure linked to the host response and parasite resistance to drugs. The objective of this study was analyze isolated from L.(L.) amazonensis and L.(V.) braziliensis obtained from patients with diffuse cutaneous leishmaniasis and cutaneous mucosa leishmaniasis respectively with successive therapeutic failures, compared with controls Leishmanias. The isolates of patients were studied in relation to clinical manifestation, the action of drugs in vitro and identification of proteins. The in vitro tests were performed with promastigotes and axenic amatigotas with pentavalent antimony, miltefosine, liposomal amphotericin B, pentoxifylline, itraconazole and allopurinol. The drugs were distributed in 96-well ELISA plates in concentrations ranging from 0 to 3000 mg/mL for promastigotes and 0-50 mg/mL for axenic amastigotes. The suspension used was 106 to forms promastigotes/mL incubated for 48 h and 107 forms amastigotes/mL incubated for 24 hours at 37°C and 5% CO2. In both forms was used the colorimetric method, with Methyl Thiazolyl Blue and reading test was performed in Elisa plate reader (Molecular Devices, Spectra Max 385 plus - USA) at a wavelength of 570nm. The drug allopurinol and miltefosine showed greater efficacy (p <0.05) compared to the promastigotes of L.(L.) amazonensis compared with control. And for the axenic amastigotes of the same species, the drug miltefosine and liposomal amphotericin B showed a significant reduction (p <0.05) of the parasites number when compared to the control. The identification of proteins by the technique of high performance liquid chromatography combined with mass spectrometry identified in higher quantities the proteins malate dehydrogenase isolated from L.(L.) amazonensis and ATPase alpha subunit Leishmania braziliensis and putative heat shock protein hsp70 in Leishmania braziliensis isolated from L.(V.) braziliensis, indicating a possible relationship of these proteins in disease behavior. It is XXI believed that besides the identification and increased levels of proteins, it is necessary the realization of over-expression of the same in sensitive and resistant populations of the species of L.(L.) amazonensis and L.(V.) braziliensis studied to explain better the treatment failure from patients isolates.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-09-25T15:49:45Z No. of bitstreams: 1 2012_MarthinaGomesMiranda.pdf: 2033955 bytes, checksum: efb3978c46cb7852b5438193e339efaf (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-10-02T11:12:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_MarthinaGomesMiranda.pdf: 2033955 bytes, checksum: efb3978c46cb7852b5438193e339efaf (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-02T11:12:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_MarthinaGomesMiranda.pdf: 2033955 bytes, checksum: efb3978c46cb7852b5438193e339efaf (MD5) / A leishmaniose é endêmica em várias partes do mundo, e ainda nos dias atuais a doença permanece um sério problema de saúde pública. A doença tem diferentes formas clínicas, afeta cerca de 12 milhões de pessoas no mundo com um aumento de 1,5 a 2 milhões de novos casos ao ano. A Leishmania amazonensis é uma das espécies causadora da leishmaniose tegumentar americana que pode manifestar a forma cutânea ou difusa dependendo do estado imunológico do indivíduo. A imunidade inata participa da defesa inicial contra o parasita e pode determinar a evolução da doença. Camundongos da linhagem BALB/c são suscetíveis à infecção pela leishmânia desenvolvendo uma forma disseminada que evolui para morte, enquanto que camundongos C57BL/6 possuem características de resistência parcial, desenvolvem lesão, porém exercem controle sobre o crescimento do parasito, evoluindo para a cura. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta imune inata dos macrófagos de camundongos suscetíveis e resistentes nas primeiras 24 h de contato do parasita com o fagócito. De 14 camundongos BALB/c e C57BL/6 foram obtidos macrófagos peritoneias para análise do índice de infecção, da capacidade microbicida dos macrófagos dos dois modelos e capacidade de produção de óxido nítrico e peróxido de hidrogênio na presença ou ausência da Leishmania amazonensis. Não houve diferença no índice de infecção dos macrófagos dos camundongos dos dois modelos estudados. A capacidade microbicida dos macrófagos obtidos dos camundongos resistentes foi mais efetiva do que a dos macrófagos dos camundongos suscetíveis, sendo que observamos um retardo e um menor crescimento em cultura dos parasitos recuperados dos macrófagos dos animais resistentes, que foram estatisticamente significantes a partir do quarto dia de acompanhamento. Ocorreu produção inicial de óxido nítrico pelos macrófagos peritoneais dos camundongos suscetíveis à infecção na presença de L. amazonensis, entretanto, estes animais não conseguiram manter a produção deste radical após 24 h em cultura, ocorrendo uma modulação negativa da produção deste radical na presença da leishmânia. Enquanto a produção do NO pelos macrófagos dos animais resistentes aumentou progressivamente e manteve-se 24 horas após. A produção do peróxido de hidrogênio pelos macrófagos peritoneais dos camundongos C57BL/6 foi maior do que o dos camundongos BALB/c mesmo quando infectados com L. amazonensis. Concluímos que a interação da Leishmania amazonensis com os macrófagos modulou negativamente a produção de óxido nítrico em camundongos suscetíveis, mas não nos camundongos resistentes. Os macrófagos dos camundongos C57BL/6, resistentes à leishmânia, foram capazes de eliminar o parasito mais eficientemente do que os macrófagos da linhagem suscetível BALB/c. A produção precoce mais elevada de H2O2 e a capacidade de manter a resposta de NO por tempo mais prolongado parecem ter sido fatores importantes para a resposta de suscetibilidade ou resistência a Leishmania amazonensis. Nossos dados, portanto, contribuíram para esclarecer alguns mecanismos iniciais envolvidos nas respostas de suscetibilidade ou resistência à infecção pela Leishmania amazonensis. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmaniasis is endemic in several parts of the world and still remains an important healthy problem. The disease affects about 12 million people worldwide, with an increase of 1.5 to 2 million new cases by year. There are different clinical forms of the disease depending on the host, parasite species, and immunological response to infection. The innate immunity response is responsible by the initial defense against the parasite and may determine the evolution of the disease. BALB/c mice are susceptible to Leishmania infection and show disseminated disease that progress to death, whereas C57BL/6 mice show partial resistance to the disease, develop lesions, but control the growth of the parasite evolving to healing. This work aimed to evaluate the innate immune response of macrophages from susceptible or resistant mice during the first 24h in culture. The macrophage infection rate, the microbicidal activity of macrophages, and the nitric oxide and hydrogen peroxide production by macrophages of 14 BALB/c and 14 C57BL/6 mice were in vitro assessed in presence or absence of Leishmania amazonensis. There was no difference in macrophage infection rate by Leishmania between both models evaluated. The microbicidal capacity of macrophages from resistant mice was more effective than that of macrophages from susceptible animals, which showed statistical difference in the fourth day. Enhanced nitric oxide production by peritoneal macrophages from BALB/c susceptible mice stimulated with L. amazonensis occurred at the beginning of the incubation, but there was a decrease in production after that, showing a downmodulation of nitric oxide production by Leishmania in this mouse model. However, differently, the nitric oxide production by C57BL/6 resistant mice gradually increased until 24 h. The hydrogen peroxide production by peritoneal macrophages from C57BL/6 mice was higher than that of BALB/c mice when infected with L. amazonensis. We conclude that the interaction of macrophages with Leishmania amazonensis dowmodulates nitric oxide production in susceptible but not in resistant mice. Furthermore, macrophages from C57BL6 mice resistant to Leishmania were able to eliminate the parasite more efficiently than macrophages from the susceptible strain BALB/c. The higher early production of H2O2 and the capacity to maintain NO production for a longer period appear to be important factors in the response of susceptibility or resistance to Leishmania amazonensis. Our data therefore may clarify some mechanisms involved in the initial responses of susceptibility or resistance to Leishmania amazonensis infection.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-04-09T12:43:24Z No. of bitstreams: 1 2009_RenataMachadoMarchese.pdf: 3642300 bytes, checksum: 50da4ef3e8efe641805cb1f1d68df8df (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-06-23T21:27:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_RenataMachadoMarchese.pdf: 3642300 bytes, checksum: 50da4ef3e8efe641805cb1f1d68df8df (MD5) / Made available in DSpace on 2010-06-23T21:27:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_RenataMachadoMarchese.pdf: 3642300 bytes, checksum: 50da4ef3e8efe641805cb1f1d68df8df (MD5) Previous issue date: 2009 / As leishmanioses correspondem a um complexo de doenças tropicais causadas por protozoários pertencentes ao gênero Leishmania e encontram-se entre as seis endemias consideradas prioritárias no mundo. Suas manifestações clínicas podem variar de lesões cutâneas benignas a lesões mucocutâneas desfigurantes e destrutivas ou à forma visceral, fatal se não tratada. Sua incidência tem aumentado por diversos fatores, dentre eles a co-infecção com o HIV, que dificulta o êxito da farmacoterapia. O tratamento atualmente disponível inclui os antimoniais pentavalentes como medicamentos de primeira escolha e a pentamidina e a anfotericina B, como segunda escolha, além da miltefosina, já registrada em alguns países. Entretanto, problemas de toxicidade e alto custo associados ao uso destes medicamentos, além de casos de resistência, limitam sua utilização. Existe, portanto, uma necessidade urgente de se buscar novos compostos que possibilitem opções terapêuticas para o tratamento das leishmanioses. Extratos ou compostos de origem vegetal podem constituir-se em um valioso início pela busca de novos agentes terapêuticos. Uma triagem in vitro previamente realizada em nosso laboratório sobre formas promastigotas de Leishmania amazonensis, identificou a atividade do extrato hexânico das folhas de Renealmia alpinia, com IC50 de 40,58 μg/mL. O extrato hexânico de folhas e pseudocaules de Renealmia alpinia (Rottb.) Maas (Zingiberaceae) foi então testado e apresentou atividade sobre formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) chagasi, com IC50 de 22,81 μg/mL. O fracionamento químico biomonitorado do extrato ativo sobre Leishmania (Leishmania) chagasi em coluna cromatográfica resultou na obtenção de 24 grupos, reunidos segundo atividade anti- Leishmania e perfil cromatográfico em CCD. O grupo D3, com um IC50 de 19,41 μg/mL, foi obtido em maior quantidade a partir de nova coluna e então fracionado. Seu fracionamento resultou na obtenção de 26 sub-grupos, reunidos segundo perfil cromatográfico. Destes, o sub-grupo D3-9 permitiu o isolamento do 2,4-di-hidroxi-6-(fenileteno)-benzoato de metila e do 2,4-di-hidroxi-6-(feniletano)-benzoato de metila, elucidados por meio de técnicas espectrométricas de ressonância magnética nuclear (RMN) de uma dimensão (1D) (1H e 13C) e bidimensional (2D) (COSY, HSQC e HMBC) e de infra-vermelho (IV). Até onde conhecemos, o 2,4-di-hidroxi-6-(fenileteno)-benzoato de metila é inédito na espécie Renealmia alpinia, na família Zingiberaceae e como composto natural tendo sido obtido previamente apenas por síntese. Seus dados de RMN de 13C, COSY, HSQC e HMBC são inéditos. Já o composto 2,4-di-hidroxi-6-(feniletano)-benzoato de metila é inédito na espécie Renealmia alpinia, entretanto, foi previamente isolado dos rizomas de Boesenbergia rotunda (Zingiberaceae) e também obtido por síntese. Seus dados de RMN de 13C, COSY, HSQC e HMBC são inéditos. Quanto à atividade anti-Leishmania, estes dois compostos apresentaram IC50 >100 μg/mL não sendo, portanto, os compostos responsáveis pelo potencial anti- Leishmania observado para o sub-grupo D3-9 e para a espécie. Entretanto, são substâncias inéditas na espécie Renealmia alpinia, cuja composição química é pouco conhecida. Quanto à atividade anti-Leishmania da planta, esta apresenta, em sua composição, outros grupos e subgrupos provenientes do fracionamento cromatográfico do extrato que, em triagem, apresentaram-se ativos sobre Leishmania (Leishmania) chagasi, como AcOEt2, com IC50 de 7,12 μg/mL, D4, com IC50 de 3,08 μg/mL e D3-11 e D3-16, com IC50 de 12,23 e 15,25 μg/mL, respectivamente. Tais grupos e/ou sub-grupos permanecem como promissores para novos estudos na busca de opções terapêuticas para o controle das leishmanioses. Estão sendo obtidos em maiores quantidades para prosseguimento dos estudos. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmaniasis is a complex of tropical disease caused by protozoa belonging to the genus Leishmania and it is among the six most important endemic diseases in the world. Its clinical manifestations can vary from benign cutaneous injuries to the disfiguring and destructive mucosal lesions or to the visceral form, fatal if not treated. Its incidence has increased for several factors, including co-infection with the HIV which hampers the success of the pharmacotherapy. The currently available treatment includes pentavalent antimony as first choice and the pentamidine and the amphotericin B, as second-line drugs, in addition to the miltefosine, already registered in some countries. However, problems of toxicities and high cost associated to the use of these medicines, beyond resistance cases, limit their use. So,there is an urgent need to find new compounds that provide therapeutics options for the treatment of leishmaniasis. Extracts or compounds from plants can consist in a valuable beginning on search for new therapeutics agents. An in vitro screening previously carried out in our laboratory against promastigotes forms of Leishmania amazonensis identified activity for the hexane extract of Renealmia alpinia leaves, with an IC50 of 40,58 μg/mL. The hexane crude extract of Renealmia alpinia (Rottb.) Maas (Zingiberaceae) leaves and pseudostems was then tested and showed activity against promastigotes forms of Leishmania (Leishmania) chagasi, with IC50 of 22,81 μg/mL. The chemical bioguided fractionation of the crude extract active against Leishmania (Leishmania) chagasi in chromatographic column produced 24 groups, congregated according to anti-Leishmania activity and chromatographic profile in TLC. The D3 group, with IC50 of 19,41 μg/mL, was gotten in greater quantify from a new column and then fractionated. Its fractionation resulted in 26 sub-groups, congregated according to chromatographic profile. Of these, the D3-9 sub-group allowed the isolation of 2,4-dihydroxy- 6-(phenylethene)-methyl benzoate and of 2,4-dihydroxy-6-(phenylethane)-methyl benzoate, elucidated by spectrometric techniques of nuclear magnetic resonance (NMR) (1D) (1H, 13C) e (2D) (COSY, HSQC, HMBC) and infra-red spectroscopy (IR). To the best of our knowledge, 2,4-dihydroxy-6- (phenylethene)-methyl benzoate is unpublished in Renealmia alpinia, in Zingiberaceae family and as natural compound and it was previously gotten by synthesis. Your NMR 13C, COSY, HSQC e HMBC data are unpublished. The compound 2,4- dihydroxy-6-(phenylethane)-methyl benzoate is unpublished in Renealmia alpinia specie, however, it was previously isolated from Boesenbergia rotunda rhizomes (Zingiberaceae) and it was also obtained by synthesis. Your NMR 13C, COSY, HSQC e HMBC data are unpublished. Against Leishmania (Leishmania) chagasi, both compounds showed IC50 > 100 μg/mL and, therefore, are not the antileishmanial compounds from the D3-9 subgroup and Renealmia alpinia specie. However, are unpublished in Renealmia alpinia specie, which chemical composition is almost unknown. Other groups and sub-groups proceeding from the crude extract and that had showed activity against Leishmania (Leishmania) chagasi during the study, as AcOEt2, with IC50 of 7,12 μg/mL, D4, with IC50 of 3,08 μg/mL and D3- 11 and D3-16, with IC50 of 12,23 and 15,25 μg/mL remain as promising for new studies in the search for therapeutics options for leishmaniasis control. They are being obtained in larger quantities for further studies.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Núcleo de Medicina Tropical, 2010. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2011-01-17T18:25:28Z No. of bitstreams: 1 2010_CesarOmarCarranzaTamayo.pdf: 2331387 bytes, checksum: a74afd3014bb08366f7a5e52e402ad70 (MD5) / Rejected by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br), reason: on 2011-01-17T18:31:34Z (GMT) / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2011-01-17T19:10:59Z No. of bitstreams: 1 2010_CesarOmarCarranzaTamayo.pdf: 2331387 bytes, checksum: a74afd3014bb08366f7a5e52e402ad70 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2011-01-30T16:49:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_CesarOmarCarranzaTamayo.pdf: 2331387 bytes, checksum: a74afd3014bb08366f7a5e52e402ad70 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-01-30T16:49:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_CesarOmarCarranzaTamayo.pdf: 2331387 bytes, checksum: a74afd3014bb08366f7a5e52e402ad70 (MD5) / Foi desenvolvido um estudo transversal baseado na prova de intradermorreação de Montenegro (IDRM) para avaliar a infecção por Leishmania nas comunidades da Fercal, área rural da região de Sobradinho, Brasília - Distrito Federal entre 2007 e 2009. A pesquisa envolveu duas avaliações com intervalo de um ano entre uma e outra. Os indivíduos foram selecionados de forma aleatória, avaliando-se uma criança ou adolescente entre 2 e 14 anos em cada casa selecionada. No período inicial foram incluídas 700 pessoas, divididos de forma estratificada segundo o número de residências em cada comunidade. Além da IDRM foram realizados testes moleculares (PCR) e um teste imunocromatográfico (Kalazar detect™) para avaliar o estado de infecção por Leishmania. Foram colhidos dados pessoais e domiciliares visando a avaliação de fatores associados com a infecção por Leishmania. Na primeira avaliação obtivemos prevalência de 33,28% (IC95% 29,87 – 36,84) segundo a IDRM. A PCR foi positiva em quatro indivíduos nesta avaliação. A positividade da prova imunocromatográfica foi de zero em ambas as avaliações. A segunda avaliação - realizada na coorte de 396 suscetíveis segundo o primeiro inquérito - mostrou incidência da infecção de 23,2% (IC95% 19,27 – 27,58) segundo a IDRM, enquanto a PCR foi positiva em nove casos. A regressão logística multivariada tipo one step mostrou que as características associadas com a positividade à IDRM foram ter mais de sete anos de idade (OR=3,04; IC95% 1,86 - 4,99; p<0,01) e a presença de gambás no peridomicílio (OR=1,46; IC95% 1,02 - 2,10; p=0,04). Esta última característica mostrou-se também associada com a incidência de infecção por Leishmania (OR=3,22; IC95% 1,35 - 7,68; p=0,01). Uma abordagem diferente dos testes de regressão logística (stepwise forward) mostrou que além das características encontradas previamente, na primeira avaliação houve associações adicionais, como gênero masculino (OR=1,95; IC95% 1,19 - 3,17; p=0,01) e criação de aves domésticas diferentes de galinhas (OR=2,23; IC95% 1,19 - 4,18; p=0,01). Na segunda avaliação observaram-se associação da positividade à IDRM com convivência com cães suspeitos de leishmaniose visceral canina (OR=2,28; IC95% 1,02 - 5,10; p=0,04) e criação de aves domésticas (OR=2,94; IC95% 1,08 - 8,02; p=0,04). A análise espacial mostrou que a medida que as comunidades se afastam da área urbana de Sobradinho a intensidade de infecção aumenta. Concluiu-se que em áreas periurbanas de introdução recente de espécies viscerotrópicas de Leishmania existem algumas características associadas ao estado de infecção diferentes às descritas em áreas de colonização antiga por este parasito. / A survey was developed based on the leishmanin test (IDRM) to evaluate the infection for Leishmania in the communities of Fercal, rural area of Sobradinho, Brasília - Federal District between 2007 and 2009. The research involved two evaluations with interval of one year between each one. The individuals were selected in a random way, being evaluated a child or adolescent between 2 and 14 years in each selected house. In the initial period 700 people were included, stratified according to the number of houses in each community. Besides leishmanin tests they were accomplished a immunocromatographic test (Kalazar detect™) and a molecular test (PCR) to evaluate the infection state for Leishmania. There were registered personal and home data seeking the evaluation of factors associated with the infection for Leishmania. In the first evaluation we obtained prevalence of 33,28% (95%CI 29,87 - 36,84) according to IDRM. PCR was positive in four individuals in this evaluation. The positivity of the immunocromatographic test was zero in both evaluations. The second evaluation - just accomplished with the 396 susceptible people according to the first survey - showed incidence of 23,2% (95%CI 19,27 - 27,58) according to IDRM, while PCR was positive in nine cases. The multivariate logistic regression type one step showed that characteristics associated with the positivity to IDRM were to be more than seven years old (OR=3,04; 95%CI 1,86 - 4,99; p < 0,01) and the presence of skunks in the neighborhood (OR=1,46; 95%CI 1,02 - 2,10; p=0,04). This last characteristic was also associated with the incidence of infection by Leishmania (OR=3,22; 95%CI 1,35 - 7,68; p=0,01). A different approach of the multivariate logistic regression tests (stepwise forward) showed that besides the characteristics previously cited, in the first evaluation there were additional associations, as masculine gender (OR=1,95; 95%CI 1,19 - 3,17; p=0,01) and creation of domestic birds different to chickens (OR=2,23; 95%CI 1,19 - 4,18; p=0,01). In the second evaluation they were observed association of the positivity to IDRM with presence of dogs suspicious of visceral canine leishmaniasis (OR=2,28; 95%CI 1,02 - 5,10; p=0,04) and creation of domestic birds (OR=2,94; 95%CI 1,08 - 8,02; p=0,04). The spatial analysis showed that in the measure that the communities stand back of the urban area of Sobradinho the infection intensity increases. It is concluded that in periurban areas of recent introduction of viscerotropic species of Leishmania there are some different characteristics associated to the infection state to described in areas of old colonization for this parasite.