Les syndromes lipodystrophiques sont des maladies rares caractérisées par une perte sélective et en quantité variable de tissu adipeux (TA). Ils constituent un groupe hétérogène de pathologies du TA, de par des étiologies multiples, la quantité de perte du tissu adipeux (généralisée ou partielle), le caractère congénital ou acquis, l'intégration dans des pathologies systémiques complexes ou non. Sur le plan physiopathologique, la limitation des capacités d'expansion du TA dans ces syndromes conduit aux troubles métaboliques dominés par l'insulinorésistance majeure avec notamment diabète et hypertriglycéridémie. La leptine, hormone aux effets pléiotropes sécrétée par le tissu adipeux, est déficiente dans ces syndromes. Son utilisation thérapeutique dans les syndromes lipodystrophiques permet une amélioration de l'insulinorésistance et des paramètres glucido-lipidiques. Afin de mieux caractériser les mécanismes d'amélioration de ces paramètres, nous avons traité la première cohorte française de patients diabétiques atteints de lipodystrophies génétique par leptine recombinante. Nous avons montré une amélioration de l'insulinosécrétion par des mesures de référence ainsi qu'une diminution des concentrations sériques de l'enzyme PSCK9 sous traitement, qui pourraient contribuer à l'amélioration des paramètres lipidiques. Nous avons également étudié des patients traités par glucocorticoïdes et développant une lipodystrophie glucocorticoinduite et nous avons montré que la concentration de leptine avant traitement est prédictive du risque de survenue de ces lipodystrophies. Ainsi la leptine semble jouer un rôle clé dans la physiopathologie de différents syndromes lipodystrophique. / Lipodystrophic syndromes are very rare diseases characterized by selective loss of varying amounts of adipose tissue. They constitute a heterogeneous group of adipose tissue diseases, by multiple etiologies, the amount of loss of adipose tissue (generalized or partial), congenital or acquired character, integration in complex or non-complex systemic pathologies. On the physiopathological level, the limitation of the capacities of expansion of adipose tissue in these syndromes leads to metabolic disorders dominated by major insulin resistance with especially diabetes and severe hypertriglyceridemia.Leptin, a hormone secreted by adipose tissue, is deficient in these syndromes. It has pleiotropic effects and its therapeutic use in these syndromes allows an improvement of insulin resistance and of glucose and lipid parameters. In order to better characterize the metabolic improvement mechanisms, we treated the first French cohort of diabetic lipodystrophic patients with recombinant leptin and we were able to demonstrate an improvement of insulin secretion by the reference measures calculated during hyperinsulinemic euglycemic clamps and hyperglycaemic clamps. We also showed a decrease in the serum concentration of PSCK9 under treatment, which could contribute to the improvement of lipid parameters. We also studied patients treated with glucocorticoids and with glucocorticoinduced lipodystrophy and we were able to show that the concentration of leptin prior to treatment is predictive of the occurrence of lipodystrophies. Thus leptin appears to play a key role in the pathophysiology of different types of lipodystrophies.

Il est désormais clairement établi que la vélocité de croissance dans les premiers mois de la vie influence le risque d’apparition de maladies métaboliques, telles que l’obésité à l’âge adulte. L’un des mécanismes sous-jacents à cette programmation néonatale pourrait mettre en jeu des perturbations de l’environnement hormonal périnatal pendant des périodes critiques du développement. Cette hypothèse repose sur des travaux réalisés au laboratoire montrant que pendant le développement postnatal, des hormones telles que la ghréline et la leptine peuvent influencer le développement des circuits neuronaux impliqués dans la régulation de la prise alimentaire à l’âge adulte. Dans ce contexte, l’objectif général de ce travail de thèse a été de définir les médiateurs hormonaux par lesquels l’environnement nutritionnel périnatal peut influencer le développement de maladies métaboliques à l’âge adulte. Une attention particulière a été portée à la contribution de la ghréline et de la leptine.Pour induire une surnutrition postnatale, nous avons utilisé un modèle murin de surnutrition postnatale induit par la réduction de la taille de portées. Au troisième jour de vie post-natale, les portées ont été réduites à 3 petits (SL) pour induire une suralimentation et les portées contrôles ont conservé 7 petits. Comparées aux souris NL, les souris SL présentent un gain de poids rapide pendant la lactation, et présentent un surpoids à l'âge adulte même sous régime de nourriture standard. A l’âge adulte, les souris SL ont une adiposité et une glycémie à jeun plus élevée. Sous régime « obésogène » les souris SL présentent également une prise de poids et de graisse plus importante que les souris NL. La première partie de ces travaux a été dédiée à l’étude de la nutrition périnatale sur le développement du système ghrélinergique. Les souris SL présentent des taux réduits de ghréline total et active pedant la troisième semaine de vie post-natale. Ces diminutions des taux de ghréline sont associées à une diminution de l’expression de ghreline dans l'estomac. La normalisation de la ghrélinémie ne parvient pas à restaurer un phénotype métabolique normale chez les souris SL ce qui suggère que les souriceaux SL présenteraient une résistance a la ghréline. En accord avec cette hypothèse, les souriceaux SL présente une atténuation de la réponse centrale suite à l’injection périphérique de ghréline. Les mécanismes sous-jacents à cette résistance à la ghréline semblent mettre en jeu un défaut de transport de l’hormone via les tanycytes de l’éminence médiane. La seconde partie de mon travail de thèse a consisté à étudier l’importance de la leptine dans la programmation nutritionnelle. Etant connu que les souris SL présent des taux anormalement élevés de leptine pendant la deuxième semaine de vie postnatale, nous avons émis l’hypothèse que le blocage partiel de la leptine chez les souris SL pourrait avoir des effets bénéfiques sur le métabolisme de ces souris. Les animaux injectés néonatalement avec l’antagoniste de la leptine ne présentent pas de différences de poids par rapport aux animaux contrôles. En revanche, l’injection de l’antagoniste de la leptine chez les souriceaux SL induit une amélioration de leur masse grasse et une normalisation de leur glycémie. Cette amélioration du phénotype métabolique des souris SL est associée à un rétablissement de la sensibilité centrale à l’hormone leptine.Ainsi, les travaux réalisés au cours de ce doctorat confortent l’importance de l’environnement hormonal périnatal, en particulier de la ghéline et de la leptine, dans la programmation nutritionnelle. / Rapid weight gain after birth is associated with increased risk of metabolic disease in adulthood. This metabolic malprogramming may be mediated by endocrine disturbances during critical periods of development. Several hormones that act on hypothalamic feeding circuits in adulthood to regulate energy homeostasis, such as leptin and ghrelin, are also involved in the postnatal development of these circuits. Previous studies have shown that leptin promotes the growth of axons from the arcuate nucleus of the hypothalamus(ARH), whereas ghrelin inhibits arcuate axon growth. The aim of this thesis was to study whether accelerated growth during early postnatal life is associated with alterations in the ghrelin and leptin systems during postnatal development. Our general objective was also to examine the relative contribution of ghrelin and leptin in the metabolic malprogramming associated with neonatal overnutrition. To manipulate nutrient intake specifically during postnatal (pre-weaning) life, we manipulated litter size on postnatal day 3 by randomly distributing pups among mothers such that small litters (overfed) had 3 pups and normal litters (normal fed) had 7 pups. SL pups gained substantially more weight than NL pups during lactation, and remained overweight throughout adulthood on a standard chow diet. Adult SL mice displayed increased adiposity and and elevated fasting glucose levels. Adult SL mice also gained more weight and fat when exposed to an obesogenic diet. During postnatal development, SL pups displayed reduced total and active circulating ghrelin levels compared to NL pups, particularly during the third week postnatal week. This was associated with decreased stomach expression of ghrelin in the third postnatal week. Normalization of hypoghrelinemia in overnourished pups is relatively ineffective in ameliorating metabolic outcomes, suggesting that SL pups may present ghrelin resistance. Consistent with this idea, pups raised in small litters displayed an impaired central response to peripheral ghrelin. The mechanisms underlying this ghrelin resistance include diminished ghrelin transport into the brain.In addition to marked changes in ghrelin levels, neonatally overnourished pups also display a marked increase in circulating leptin levels during early postnatal life. To investigate whether these abnormally high levels in circulating leptin levels might be causally involved in the central leptin resistance and metabolic programming, we used a competitive leptin antagonist to partially block leptin action in SL and NL mice between P6 and 16, i.e. when when endogenous leptin levels are high in SL mice. Neonatal injection of the leptin antagonist had no effect on postnatal growth or adult body weight. However, SL pups treated with the leptin antagonist displayed a marked reduction in adult fat mass and normalized glucose tolerance and insulin sensitivity. Previous studies reported that SL exhibit early central leptin resistance. Remarkably, pretreatment with leptin antagonist significantly increased leptin-induced pSTAT3 levels in the ARH of SL pups, suggesting that neonatal leptin antagonism may normalize metabolic programming in neonatally overnourished mice by enhancing central leptin sensitivity. Together our data show that early postnatal nutrition influence the pattern of secretion of metabolic hormones and their ability to act on hypothalamic regions involved in appetite regulation. These hormonal alterations may contribute to the metabolic defects observed in subject exposed to overnutrition during early life.

Le développement de nouvelles stratégies de prise en charge de la MAP constitue un enjeu important de Santé Publique, la seule stratégie disponible reposant sur l’inhibition des contractions utérines par les tocolytiques. Bien que les mécanismes physiopathologiques de la MAP restent mal élucidés, il a été établi que l’induction du travail s’accompagne d’une transition des cellules myométriales d’une phase proliférative vers une phase contractile. Dans nos travaux, nous nous sommes intéressés aux effets de la leptine sur la prolifération et la différenciation des cellules myométriales. Nous avons mis en évidence que la leptine est capable d’induire une prolifération cellulaire, associée ou non à l’induction d’une signalisation pro-inflammatoire. En effet, nous avons démontré que la leptine à 50 ng/ml est capable d’activer la voie pro-inflammatoire IL-6R/NFkB, jouant un rôle dans la mise en route du travail alors que la leptine à 6.25 ng/ml stimule la voie OB-R/ERK1/2, en faveur de la prolifération. De plus, des résultats préliminaires ont suggéré que la leptine à 6.25 ng/ml est capable de s’opposer à la différenciation des cellules myométriales alors que la leptine à 50 ng/ml induit une réorganisation du cytosquelette, une synthèse des protéines COX2 et Cx43, ainsi qu’une augmentation de l’influx calcique, étapes indispensables à la genèse de contractions. Ce travail apporte un argument supplémentaire en faveur d’un potentiel rôle de la leptine dans la prévention de la MAP, en maintenant les cellules dans un état prolifératif et en s’opposant à leur différenciation. De plus, ce travail fournit de nouvelles informations quant à la compréhension des différents troubles de l’accouchement observés chez les femmes obèses – dépassements de terme ou accouchements prématurés - ayant été mise en évidence. / Maternal obesity is associated with a wide spectrum of adverse pregnancy outcomes leading to higher rates of postdate pregnancies or preterm deliveries. Finding new strategies for the management of the Threat of Preterm Labor (TPL) is an important Public Health issue. Indeed, the only available strategy (tocolytic drugs) inhibiting uterine contractions, does not allow delaying parturition for more than 48 hours. The physio-pathological mechanisms leading to TPL remain poorly understood, but it has been shown that labor onset is associated with a phenotypic switch of myometrial smooth muscle cell from a proliferative to a contractile phenotype. In this work, we investigated the effect of leptin, an adipokine synthesized by the placenta during pregnancy and that has been proposed for the management of preterm labor, as it is able to prevent in vitro uterine contractility, on human myometrial cell proliferation and differentiation. In this work, we demonstrated that leptin induces myometrial proliferation, with or without the induction of pro-inflammatory signaling. Indeed, we highlight that leptin at 50ng/ml is able to activate IL-6R/NFkB pro-inflammatory pathway described to play a role in the onset of labor while leptin at 6.25 ng/ml stimulates OB-R/ERK1/2 signaling pathway, leading to proliferation. In addition, preliminary results on cell differentiation have suggested that leptin at 6.25ng/ml is able to oppose this transition, whereas leptin at 50ng/ml induces cytoskeletal reorganization, COX2 and Cx43 protein expression and increased calcium influx, leading to effective myometrial contractions. Finally, this work emphasizes the potential value of leptin in the pharmacological management of TPL and it also strengthens the hypothesis that leptin might be a contributory factor in the delivery disorders observed in obese women.

La leptine est une hormone peptidique ayant une action sur de nombreux tissus. Une dérégulation de la sécrétion de cette hormone est observée au cours de l’obésité. L’obésité est fréquemment associée à des troubles de santé dont les principaux sont le diabète de type II, l’hypertension artérielle et les maladies cardiovasculaires. Elle est également un facteur de risque du cancer du sein, particulièrement en post-ménopause favorisant la récidive et augmentant la mortalité. Ces perturbations, associées à un état de stress oxydant défini par un excès de production des espèces réactives de l’oxygène (ERO) par rapport aux systèmes de défense antioxydants, pourraient avoir un impact majeur dans le risque de carcinogenèse chez le sujet obèse. Il est clairement établi aujourd’hui que le statut oxydatif des cellules est directement corrélé aux capacités de prolifération mais aussi de survie des cellules dans leur environnement. A ce jour, très peu de données existent concernant le rôle de la leptine dans la modulation du statut oxydatif des cellules épithéliales mammaires saines et tumorales. L’objectif de cette thèse était d’étudier d'abord les mécanismes d’action et les effets de la leptine sur le statut oxydatif et inflammatoire des cellules épithéliales mammaires saines et néoplasiques ; puis dans un deuxième temps, une étude expérimentale a été conduite pour caractériser in vivo l’impact de l’obésité associée ou non à l’activité physique sur la croissance tumorale et le statut oxydatif et inflammatoire des tumeurs. Le projet avait également pour but de mettre en œuvre une nouvelle technique d’analyse basée sur la détection de fluorescence native induite par excitation laser à 224 nm afin d’évaluer la production de composés bio-actifs de la famille des éicosanoïdes, dont les isoprostanes, impliqués dans le processus inflammatoire. Nous avons exploré in vitro l’impact de la leptine sur le statut oxydatif des cellules épithéliales mammaires. Cette étude nous a permis d’établir que la réponse au signal leptinique varie en fonction du statut néoplasique de la lignée considérée, en fonction du temps de contact et non de la dose testée. Ensuite, nous avons étudié l’impact de l’obésité associée ou non à l’activité physique sur la croissance tumorale et sur le statut oxydatif et inflammatoire des tumeurs à l’aide d’un modèle de souris âgées C57BL/6 nourries avec un régime hyper-lipidique (HL) pendant 14 semaines, et hébergées soit dans un environnement enrichi (EE) pour favoriser l’activité physique et les interactions sociales, soit dans un environnement standard pendant 8 semaines, après quoi des cellules syngéniques de tumeur mammaire EO771 ont été implantées dans les quatrièmes coussinets adipeux mammaires. In vitro, la leptine a stimulé la production de ROS de façon indépendante de la dose et cette augmentation était dépendante de la production d'O2 cytosolique. Les résultats montrent une augmentation significative du poids dans les groupes recevant le régime HL à prise alimentaire journalière identique. La composition corporelle à 8 semaines montre une prise de masse grasse significative sous régime HL, majorée par l’ovariectomie et partiellement limitée par l’activité physique. Après implantation des tumeurs, le régime HL favorise la croissance tumorale et la perte de l’activité locomotrice. Par contre, l’EE prévient la perte d’activité physique des animaux. L’ensemble de ces travaux montre que la leptine contribue à l’apparition d’un stress oxydant en lien avec le statut tumoral des cellules épithéliales mammaires. Ceci peut expliquer en partie l’augmentation du risque de cancer mammaire associée à l’obésité en post-ménopause. Ces résultats permettront d'objectiver le bénéfice d'une intervention nutritionnelle ciblée afin de moduler la réponse des cellules aux stimulations des adipokines. A terme, cette étude doit contribuer à mieux comprendre l’intégration des signaux issus de l’environnement cellulaire. / Obesity is now considered, as a risk factor for developing breast cancer in postmenopausal women and for mortality in response to this pathology. Obesity, which is frequently associated with hyperleptinemia, induces cellular signalling pathways, some of which involving reactive oxygen species (ROS) as intracellular messengers. High levels of ROS contribute to oxidative stress, cellular damages and pathogenesis. Therefore, ROS production associated to obesity could be a major risk factor for mammary carcinogenesis. Furthermore, increased oxidative stress and inflammation characterised by infiltration of immune cells into adipocytes are described. This is associated with a lipid peroxidation and the production of bio-active compounds including isoprostanes.The aim of this study was to determine the impact of leptin in modulating the oxidative and inflammatory status of epithelial mammary cells and in tumor mammary tissue. Moreover, the purpose of this work was to develop a new analysis technique based on native fluorescence detection induced by laser excitation at 224 nm to evaluate the production of bio-active compounds from the family of eicosanoids, involved in the inflammatory process, including isoprostanes.Initially we identified in vitro the leptin effects on ROS production in 3 human epithelial mammary cell models which present different neoplastic status (healthy primary (HMEC) cells, MCF-7 and MDA-MB-231) in presence of two leptin concentrations (10 ng/ml close to physiological values, 100 ng/ml as obesity level). To better understand the potential involvement of adipocyte tumor microenvironment in mammary carcinogenesis, we secondly explored in vivo the impact of high fat diet (HFD) and of enriched environment (EE) on mammary tumor development. Female C57BL/6 mice were fed with a HFD versus a normo-caloric diet (NC) for 14 weeks. After 8 weeks mammary tumor syngeneic cells EO771 were implanted into the fourth mammary fat pads. Before injection, mice were housed in EE or in standard environment (ES) for 8 weeks. In vitro, leptin stimulated ROS production in dose-independent manner and this increase was dependent of cytosolic O2•- production. This ROS production contributed to a different antioxidative response depending of the neoplastic cell status. Leptin induced the antioxidative enzymes expression and activities such as heme-oxygenase or glutathione peroxidase only in HMEC cells. In neoplastic cells, these enzyme activities did not change whatever the leptin concentration used.Thus, high fat diet promoted mammary tumor development associated with a decrease in body fat and an increase in volume and weight of tumors that was not limited by physical activity. This diet induced a decrease of adiponectin and an increase of leptin plasma level compared to NC diet however, leptinemia was not influenced by EE.The native fluorescence isoprostanes determination method, turned out not to be quite sensitive. Therefore, the native fluorescence of these compounds is too low to allow their detection in biological media used. In contrast, the native fluorescence appears to be a potential cellular exploration tool.Through this work, we have shown that leptin contributes to the onset of oxidative stress linked to the status of mammary epithelial tumor cells. This may partly explained the increase of risk of breast cancer recurrence observed in situations of obesity. The results obtained in vivo eventually will support the benefit of a nutrition intervention to modulate cell response to adipokines stimulation. Ultimately, this study contributes to better understand the integration of signals from the cell environment.

L’obésité est responsable de diverses complications médicales, notamment respiratoires. Elle favorise l’apparition de maladies bronchiques chroniques (asthme, BPCO) et complique leur prise en charge. Elle s’accompagne de troubles respiratoires du sommeil et augmente la susceptibilité aux infections respiratoires.Le tissu adipocytaire est désormais reconnu comme un tissu hormonal, source de nombreux médiateurs dont font partie les adipokines, cytokines produites principalement par les adipocytes. Parmi celles-ci, l’adiponectine (APN) est une protéine de 30kDa qui peut s’associer en multimères de plus ou moins haut poids moléculaire. Ses taux circulants sont élevés mais sa concentration sérique diminue avec le gain de poids.L’adiponectine est impliquée dans les phénomènes d’immunorégulation associés aux modifications nutritionnelles et également dans le développement pulmonaire. Mais le rôle pro ou anti-inflammatoire de l’APN est toujours un sujet à débat. L’association entre les taux sériques d’APN et la survenue de maladies bronchiques n’est pas clairement démontrée chez l’homme.Nous nous sommes intéressés au rôle que joue l’APN au sein du système respiratoire, dans la régulation du fonctionnement des macrophages et cellules épithéliales bronchiques. Nous avons plus particulièrement étudié l’effet de l’APN sur la sécrétion de cytokines par ces deux types cellulaires.Nous disposons de pièces opératoires pulmonaires de patients opérés pour un cancer bronchique, à partir desquelles nous réalisons des cultures primaires d’explants de parenchyme, de macrophages pulmonaires ou de cellules épithéliales bronchiques et nous disséquons des anneaux bronchiques.Nous avons montré qu’il existait une production d’APN in situ par du tissu pulmonaire humain et que cette production était corrélée, à l’instar de la forme circulante, au poids du patient. Nous avons vérifié que les récepteurs à l’APN (AdipoR1 et AdipR2) étaient tous les deux exprimés par des macrophages pulmonaires, des explants de bronches et des cellules épithéliales bronchiques.Nous avons soumis les macrophages pulmonaires humains à un traitement par de l’APN à différentes concentrations (3-10-30 microg/ml) avant de les stimuler par du LPS (10 ng/ml ou Poly I:C 10 ng/ml) ou d’IL-4 (10 ng/ml). Nous avons montré que l’adiponectine diminuait la sécrétion des cytokines M1 induites par le LPS et le Poly I:C (IL6, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL8, TNF). tout comme celles des cytokines M2 induites par l’IL-4 (CCL13, CCL18, CCL22). L'adipoRon, agoniste synthétique des récepteurs de l'adiponectine, a montré les mêmes effets que la protéine recombinante.Nous avons comparé avec l’effet d’autres adipokines : la leptine à sa plus grande concentration (1000 ng/ml) induisait la production de cytokines de type M1 (IL6, CCL3, CCL4, CCL5, TNFa) par des macrophages non stimulés alors que la visfatine et la chémérine n’avaient aucun effet sur la production de cytokines par les macrophages.Seule l’adiponectine a démontré un effet sur les cellules épithéliales bronchiques, en modulant de façon opposée la production de certaines cytokines : diminution de la sécrétion de CXCL1 et CCL2 en situation basale et après traitement par TNF (50 ng/ml) mais augmentation de celle d’IL6 et CXCL8 en situation basale.Nous avons complété ce travail par des expériences sur la régulation du tonus bronchique par les adipokines, en utilisant des anneaux bronchiques dans des cuves à organes isolées. Ces résultats ont fait l'objet d’un dépôt de brevet européen.Ces travaux sont les premiers à s’intéresser à l’effet de l’APN et de l’AdipoRon sur un modèle de culture primaire de macrophages et cellules épithéliales bronchiques humains. L’APN est capable de moduler la polarisation de ces cellules. Les adipokines régulent aussile tonus bronchique. Les adipokines sont essentielles à la compréhension du retentissement pulmonaire de l’obésité. / Obesity promotes the development of chronic bronchial diseases (asthma, COPD) and complicates their management, induces sleep breathing disorders and increases susceptibility to respiratory infections. Adipocytea are a source of mediator production including adipokines. Among these, adiponectin (APN) is a 30kDa protein that can associate in multimers of variable molecular weight. It circulates at high level but its serum concentration decreases with weight gain. APN is involved in immunoregulation and pulmonary development. But the pro or anti-inflammatory role of the APN is still a matter for debate. The association between serum levels of APN and the occurrence of bronchial diseases is not clearly demonstrated in humans. We explored the role of adipokines within the respiratory system. In particular, we studied the effect of the APN on the production of cytokines by pulmonary macrophages and bronchial epithelial cells. We obtained lung specimens from patients operated for carcinoma, from which we carried out primary cultures of parenchymal explants, pulmonary macrophages or bronchial epithelial cells and we also prepared bronchial rings for study in organ bath. We have revealed an in situ production of APN by human lung tissue, which is correlated with patient weight. We have verified that APN receptors (AdipoR1 and AdipR2) were both expressed by pulmonary macrophages, bronchial explants, and bronchial epithelial cells. We have treated human lung macrophages with APN (3-10-30 μg/ml) before stimulation with LPS (10 ng / ml) or Poly I: C (10 ng/ml) or IL-4 (10 ng/ml).We have shown that the APN decreased the production of M1 cytokines induced by LPS and Poly I: C (IL-6, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL8, TNFa) as well as those of M2 cytokines induced by IL-4 (CCL13, CCL18, CCL22). AdipoRon, a synthetic adiponectin receptor agonist, exhibited the same effects as the recombinant protein. In comparison, leptin at its highest concentration (1000 ng/ml) induced the production of M1-type cytokines (IL-6, CCL3, CCL4, CCL5, TNF-α) by unstimulated macrophages whereas visfatin and chemerin did not reveal any effect on cytokine production by macrophages. Only APN demonstrated an effect on bronchial epithelial cells: decreasing the production of CXCL1 and CCL2 at basal state and after stimulationwith TNF (50 ng / ml) but increasing production of IL6, CCL20 and CXCL8 in the basal situation. We have completed this work by experiments on the regulation of bronchial tone by adipokines, using bronchial rings in isolated organ baths. These results have been the subject of a European patent application. This work is the first looking at the effect of APN and AdipoRon on primary human pulmonary macrophages and bronchial epithelial cells. APN is able to modulate the polarization of these cells. Adipokines are essential for understanding the respiratory burden of obesity.

L’obésité est un problème de santé publique, de par son incidence et son association avec d’autres pathologies. La leptine est une hormone clé pour l’homéostasie énergétique et glucidique, en activant son récepteur OBR, exprimé majoritairement dans l’hypothalamus. L’obésité est fréquemment associée à une résistance à la leptine, caractérisée par une diminution de la sensibilité à l’hormone. Comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine de cette résistance, afin de la prévenir ou de la corriger, constitue un enjeu thérapeutique majeur. L’objectif de mes travaux de thèse a été d’étudier deux nouveaux mécanismes de la régulation de la fonction d’OBR, suspectés être à l'origine de la résistance à la leptine associée à l’obésité.Concernant le premier mécanisme, notre laboratoire a découvert la protéine Endo1, qui interagit avec OBR, et le retient dans des compartiments intracellulaires, limitant ainsi la sensibilité de la cellule à l’hormone. Mon travail a contribué à montrer que l'extinction d'Endo1, dans le noyau arqué de l’hypothalamus, associée au retour à un régime classique, permet de corriger l’installation de la résistance à la leptine et de l’obésité de souris rendues obèses par régime gras. En revanche, l'extinction d'Endo1 n’arrive pas à corriger l’altération de l’homéostasie glucidique de ces animaux sous régime gras, montrant ainsi une dissociation entre obésité et diabète de type II. Sur le plan moléculaire, nous montrons qu'Endo1 régule de façon différentielle les voies de signalisation d’OBR. Endo1 inhibe, comme attendu, l'activation de la voie anorexigène STAT3 ; mais de façon plus surprenante, Endo1, en interagissant avec la sous-unité régulatrice de la PI3K (p85), semble nécessaire à l'activation de la voie PI3K/AKT, voie impliquée dans le métabolisme du glucose. Ces résultats suggèrent le rôle crucial d’Endo1 comme (i) régulateur de la sensibilité neuronale à la leptine, (ii) et médiateur de la signalisation de la leptine.Le second projet, mené en collaboration avec l'équipe du Dr Prévot, a permis d’identifier une nouvelle modification post-traductionnelle (PTM) affectant OBR. Nous avons étudié les conséquences de cette PTM sur l’activation d’OBR, sa signalisation et sur le développement de la résistance à la leptine et l'obésité. Des résultats in vivo ont montré que l’enzyme responsable de la PTM voit son activité augmentée dans l’hypothalamus de souris rendues obèses par régime gras. L’inactivation génétique ou pharmacologique de cette enzyme prévient la mise en place d’une résistance à la leptine, de façon dépendante d’OBR. Au niveau moléculaire, nous avons identifié certains résidus d’OBR comme cibles de cette PTM. La modification de ces résidus cruciaux altère l’état d’activation moléculaire d’OBR et abolie l’activation des voies de signalisation induites par la leptine. En outre, cette enzyme interagit avec OBR dans des cellules hypothalamiques ; sa suractivation au niveau cellulaire, après traitement au palmitate mimant le régime gras, abolit l’activation de la voie PI3K/AKT induite par la leptine. Aussi, ces résultats démontrent que cette PTM affectant OBR est un nouveau mécanisme à l’origine de la résistance à la leptine et ouvre donc de nouvelles perspectives thérapeutiques. / Obesity is a major issue of public health because of its incidence and association with other pathologies. Leptin is a key hormone involved in the regulation of energy and glucose homeostasis, through the activation of its receptor OBR, mainly expressed in the hypothalamus. Obesity is frequently associated with leptin resistance, characterized by a decreased sensitivity to the hormone. Understanding the molecular mechanisms related to leptin resistance, in order to prevent or reverse it, represents major therapeutic concerns. The objective of my PhD work was to explore two new mechanisms involved in the regulation of OBR function, suspected to be related to leptin resistance associated with obesity.Regarding the first mechanism, the laboratory described a new protein namely Endo1, which interacts with OBR and retains the receptor in intracellular compartments, leading to decreased cellular leptin sensitivity. We showed that Endo1 silencing, specifically in the arcuate nucleus of hypothalamus, combined with a switch to chow diet, reverses the establishment of leptin resistance and obesity of obese mice fed a high fat diet (HFD). However, Endo1 silencing cannot reverse the alteration of glucose homeostasis upon HFD feeding, underlying a disassociation between obesity and type II diabetes. At the molecular level, we showed that leptin-induced signaling pathways are differentially regulated by Endo1. Endo1 inhibits, as expected, the anorectic STAT3 pathway; but surprisingly, by interacting with the PI3K regulatory subunit (p85), Endo1 seems to be necessary for the activation of PI3K/AKT pathway, which is involved in glucose homeostasis. These results indicate a crucial role for Endo1 as (i) a regulator of neuronal leptin sensitivity, (ii) a scaffolding protein involved in leptin signaling transduction.The second mechanism, investigated in collaboration with Dr. Prevot’s team, is based on the discovery of a new post-translational modification (PTM) on OBR. We studied the functional consequences of this PTM on OBR activation state, its signaling and the development of leptin resistance and obesity. In vivo results showed that the enzyme responsible for the PTM has an increased activity in the hypothalamus of obese mice fed a HFD. Genetic or pharmacological inactivation of this enzyme prevents the establishment of leptin resistance, in an OBR dependent manner. At the molecular level, we identified some OBR residues that can undergo this PTM. Modifications of those crucial residues by the PTM impair the molecular activation state of OBR and subsequently abolish the activation of leptin-induced signaling pathways. Likewise, this enzyme interacts with OBR in hypothalamic cell; and its overactivation at the cellular level after palmitate treatment (mimicking HFD), abolishes the leptin-induced PI3K/AKT activation. These results demonstrate that the PTM targeting OBR is a new mechanism underlying leptin resistance and thus open new therapeutic perspectives against obesity.

L’apparition de la puberté et la régulation de la fertilité chez les mammifères sont contrôlées par un réseau neuronal complexe, situé principalement dans l'hypothalamus, et qui converge vers les neurones synthétisant l'hormone de libération des gonadotrophines (GnRH). Ces neurones régulent la sécrétion des gonadotrophines, la croissance et le fonctionnement des gonades. Le développement correct du système à GnRH, incluant des changements rapides dans l'expression et la signalisation de l’hormone GnRH au sein de cette population clairsemée de quelques centaines de neurones, est essentiel pour la maturation sexuelle et le fonctionnement normal de l'axe hypothalamo-hypophyso-gonadique. Lors du développement embryonnaire, ces neurones migrent de la placode olfactive vers leur emplacement définitif, l’hypothalamus, pour y recevoir les connexions afférentes qui permettront une libération pulsatile de la GnRH et la libération subséquente des gonadotrophines (l'hormone de stimulation des follicules (FSH) et l'hormone lutéinisante (LH)). Dès les années 90, l'oxyde nitrique (NO) a été identifié comme molécule clé dans la décharge pré-ovulatoire de GnRH/LH. En effet, de nombreux travaux ont suggéré que des interactions entre les neurones exprimant la forme neuronale de l’enzyme de synthèse du NO (la nNOS) et le système GnRH étaient impliquées dans le contrôle central de la fonction de reproduction à l'âge adulte. De plus, si le NO est reconnu depuis longtemps comme un acteur majeur du contrôle central de l’ovulation à l’âge adulte, la possibilité qu’il soit aussi impliqué dans la maturation sexuelle en régulant l’activité des neurones à GnRH à des stades précoces précédant la puberté n’a pas été explorée auparavant. Cependant, même si nous avons progressé dans la connaissance des interactions entre les neurones à nNOS et des différents acteurs importants de l’axe gonadotrope, l’identité moléculaire de ces neurones reste mal connue. Au cours de cette étude, nous avons recherché 1) l'identité moléculaire des neurones á nNOS dans l'hypothalamus au cours de développement 2) si le NO régule la migration et l’intégration des neurones à GnRH dans l’hypothalamus et 3) si le NO régule la maturation sexuelle. Pendant ma thèse nous avons répertorié pour la première fois les différents neurotransmetteurs et les principaux récepteurs dans les neurones à nNOS au cours du développement post-natal. De plus, les résultats de ma thèse montrent pour la première fois une implication de la signalisation du NO dans la migration des neurones à GnRH vers l'hypothalamus et font échos à l'identification d'une série de mutations de la NOS1 chez des patients atteints du syndrome de Kallmann, une maladie génétique congénitale rare qui associe une carence en GnRH, due à un défaut de migration neuronale, et une anosmie. Enfin, mes travaux montrent que le NO est un nouveau protagoniste dans la maturation post-natale du système à GnRH, la survenue de la puberté et l’acquisition de la capacité à se reproduire. Plus généralement, les résultats de ce travail de thèse permettent d’identifier de nouveaux mécanismes potentiellement responsables de troubles développementaux dans la mise en place des circuits neuronaux contrôlant l’axe gonadotrope chez les mammifères en général et l’homme en particulier. Nous espérons que ces résultats élargiront notre compréhension de la régulation de l'axe reproducteur, offrant ainsi des possibilités nouvelles de stratégies thérapeutiques contre les troubles de la fertilité. / The onset of puberty and the regulation of fertility in mammals are governed by a complex neural network, primarily in the hypothalamus, that converges onto gonadotropin-releasing hormone (GnRH)-producing neurons, the master regulators of gonadotropin secretion and postnatal gonadal growth and function. The proper development of the GnRH system, including timely changes in GnRH expression and signaling by this sparse population of a few hundred neurons, is essential for sexual maturation and the normal functioning of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. As the brain develops during embryogenesis, these neurons should move from the olfactory placode into the correct brain location in adequate numbers, and then establish the afferent connections that will allow the pulsatile release of GnRH peptide, and the subsequent release of the gonadotropins (follicle stimulating hormone, i.e FSH and luteinizing hormone, ie. LH). As early as in the 90’s NO was presented as a key molecule in the preovulatory GnRH/LH surge, and results from different groups, have suggested the interaction of NOS-containing neurons with the GnRH system, and their involvement in the regulation of reproductive capacity. Even though nitric oxide has now been long recognized as a key player in the central hormonal regulation of ovulation during adulthood, no one has considered the possibility that it could act in an earlier stage as the master regulator of GnRH neurons before puberty, hence participating in the actual maturation of the neuroendocrine axis. The relationship of nNOS-expressing neurons with other important molecules of the hypothalamic axis has been well studied, whilst the molecular identity of this neuronal NOS-expressing population is poorly documented. . To this end, we address the hitherto unaddressed questions concerning 1) the molecular identity of nNOS-expressing neurons in the developing hypothalamus, 2) the putative involvement of the NO molecule in the migration of GnRH neurons and the proper establishment of their afferent connections in the hypothalamic region and 3) the plausible determinant role of NO signaling in the maturation of the reproductive system. During this study we identified for the first time the cohort of the principal neurotransmitters and important receptors expressed by these cells in the hypothalamic region during development. Additionally, our results reveal for the first time an involvement of NO signaling in the migration of GnRH neurons in the hypothalamus and are in line with the identification of a series of NOS1 mutations in Kallmann syndrome (KS), a rare congenital genetic condition presenting a unique combination of GnRH deficiency, arising from a faulty migration of the neuronal population, and anosmia. Lastly, our study identifies NO as a novel protagonist during postnatal development, in the regulation of the onset of puberty and the acquisition of reproductive competence. Overall, the results of my Phd thesis identify putative new targets causing alterations of developmental programming under pathophysiological gestational environment in mammals in general, and in humans in particular. Here we thus provide new insights into the mechanisms by which the alteration of GnRH neuronal function leads to hypogonadotropic hypogonadism and infertility. We are hopeful that our results will expand our understanding of how the neuroendocrine axis is regulated and will possibly provide opportunities for therapeutic strategies against debilitating conditions.

La compréhension des mécanismes cérébraux régulant la prise alimentaire est devenue cruciale face à la pandémie mondiale d’obésité. L’ingestion d’aliments est sous le contrôle d’un large réseau de structures cérébrales qui régulent la balance énergétique en régulant l’apport de nourriture et la dépense énergétique. Etant donné l’importance de l’olfaction dans l’appréciation des aliments, il est primordial d’identifier des mécanismes précis liant olfaction et nutrition.Nous avons choisi d’étudier l’activité dans le Bulbe Olfactif principal (BO), la première structure cérébrale qui permet la représentation spatiotemporelle des odeurs. De façon intéressante, des récepteurs aux hormones anorexigènes et orexigènes sont exprimés à la fois dans l’hypothalamus et le BO. Toutefois, l’impact de la leptine (et de l’obésité) sur l’activité du BO in vivo demeure inconnu.Pour évaluer l’action de la leptine et de l’obésité sur la plasticité olfactive, nous avons choisi le modèle murin ob/ob. Nous avons d’abord décrit la répartition spatiale de l’activité dans le BO en réponse à une odeur alimentaire et à une odeur neutre chez ces souris en les comparant à des souris témoins grâce une technique de neuroimagerie fonctionnelle, l’Imagerie par Résonance Magnétique renforcée au Manganèse (MEMRI). Par le développement d’une méthode de comparaison statistique indépendant de l’utilisateur, le SPM (Statistical Parametric Mapping), nous avons mis en évidence une augmentation de l’activité spontanée et de l’activité induite par odeur alimentaire dans le BO des ob/ob. Cependant, l’activité induite par une odeur neutre n’était pas plus élevée. L’injection de leptine a pour résultat d’augmenter le signal MEMRI dans les couches profondes du BO et ne restaure que partiellement l’activité des ob/ob. En quantifiant la neurogenèse dans le BO par injections de BrdU, nous avons mis en évidence une survie accrue des cellules granulaires et périglomerulaires chez les ob/ob.Pour évaluer la dynamique temporelle de l’activité du BO, nous avons enregistré par électrophysiologie les variations de l’activité oscillatoire du potentiel de champ local dans les couches profondes du BO pendant l’apprentissage d’une tâche de discrimination olfactive, le Go/NoGo. L’apparition d’une oscillation lente dite bêta (15-40 Hz) pendant cet apprentissage est un marqueur fonctionnel de l’état du réseau olfactif. Elle est dépendante des retours centrifuges provenant du cortex olfactif, majoritairement du cortex piriforme. Si nous n’avons pas observé de différence importante dans la discrimination olfactive, nous avons en revanche mis en évidence un problème motivationnel chez les animaux ob/ob, qui n’effectuaient la tâche que si la récompense hydrique contenait du sucre. Nos enregistrements montrent une forte augmentation des oscillations bêta chez les souris obèses après apprentissage comparé aux souris témoins. / Olfaction makes possible both the detection and the processing of odors related to food location and palatability. Interestingly, receptors to anorexigen and orexigen hormones and neuropeptides found in the hypothalamus are also expressed in the main olfactory bulb (MOB), suggesting that feeding state has an impact on odor representation. However, neuronal mechanisms linking olfaction, food intake and metabolic disorders are still unclear. In this PhD thesis, we wanted to further understand mechanisms of the olfactory-feeding crosstalk and tested the effects of obesity on olfactory activity in the MOB. Leptin, a peptidergic hormone produced by adipocytes, is a major regulator of the energy balance and inhibits food intake. Ob/ob mice are deficient in leptin from birth and are widely used as a murine model of obesity. We used a functional neuroimaging technique, Manganese Enhanced Magnetic Resonance Imaging (MEMRI), in association with statistical parametric mapping (SPM) to monitor food odor-evoked spatial activity in the MOB of these mice. Using MEMRI, we found that odor-evoked signal is different, both in terms of intensity and localization between lean and ob/ob mice for the spontaneous activity and in response to food odor. However, this is not the case for a neutral odor. Moreover, leptin impacts both spontaneous activity and food odor-evoked signal intensity in both groups. Interestingly leptin strongly activates deep layers (mitral cell layer and mainly granule cell layer) of the MOB. To pinpoint what cellular/molecular mechanisms can be responsible for these changes in the spatial distribution of activity, we analyzed the effects of the lack of leptin on the composition and activity of the MOB cellular network.We quantified bulbar adult neurogenesis and found that 21 days after BrdU injections, a cell birth marker, ob/ob mice showed an increased number of both new periglomerular and granular cells as compared to control, suggesting that leptin regulates new neuron elimination. We also tested whether an inflammation could be occurring in the MOB. Using RTPCR of different neuronal and glial markers we did not observe strong signs of inflammation. Then we probed changes in local network activity in the deep layers of the MOB by recording local field potentials during a Go/NoGo odor discrimination task. We observed that the power of beta oscillations, the functional marker of the olfactory network between the MOB and the olfactory cortex, is way higher in the MOB of ob/ob mice compared to control mice.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'obésité est une maladie chronique complexe qui augmente le risque de complications cardio-métaboliques. Parmi les altérations qui lui sont associées, on retrouve la détérioration du profil lipidique-lipoprotéique, la résistance à l'insuline, le syndrome métabolique et les maladies cardiovasculaires. Au cœur de l'obésité se trouve le tissu adipeux, un organe de stockage et de mobilisation des lipides également doté d'une fonction sécrétoire. L'adiposopathie, caractérisée entre autres par une dysfonction sécrétoire du tissu adipeux, est couramment observée dans l'obésité. Le rapport plasmatique de deux hormones sécrétées par le tissu adipeux , l'adiponectine et la leptine, est souvent utilisé afin d'évaluer la fonction sécrétoire de cet organ. Un rapport faible entre ces deux adipokines, ou adiposopathie sécrétoire, s'ajoute à d'autres marqueurs de dysfonctions du TA, comme l'hypertrophie adipocytaire et l'infiltration macrophagique. Dans cette optique, la contribution du rapport adiponectine/leptine au niveau du profil cardio-métabolique et, plus précisément, l'homéostasie du glucose, a été comparée à celle de l'hypertrophie d'adipocytes sous-cutanés abdominaux et omentaux et de l'infiltration macrophagique, chez des femmes d'âge et d'adiposité variables. Les relations entre le rapport plasmatique adiponectine/leptine et le métabolisme des lipides ainsi que l'expression de gènes impliqués dans ce dernier ainsi que le développement du tissu adipeux ont été examinées au niveau des deux dépôts adipeux, chez ce même groupe de femmes. La combinaison d'un faible rapport adiponectine/leptine et de l'hypertrophie adipocytaire était observée chez les patientes ayant les niveaux les plus élevés de résistance à l'insuline. Par ailleurs, un faible rapport adiponectine/leptine était également associé à une réponse lipolytique plus importante, tant au niveau des adipocytes sous-cutanés abdominaux qu'omentaux. Ainsi, le rapport adiponectine/leptine est un marqueur important des dysfonctions du tissu adipeux et du risque cardio-métabolique associé, chez des femmes d'âge et d'adiposité variable. / Obesity is a complex chronic disease which increases the risk of cardiometabolic complications. Alterations associated with this disease include the deterioration of the lipid-lipoprotein profile, insulin resistance, metabolic syndrome, and cardiovascular disease. At the heart of obesity is the adipose tissue, a lipid storing and mobilizing organ to which is also attributed a secretory function. Adiposopathy characterized by a secretory dysfunction of adipose tissue is commonly observed in obesity. The plasma ratio of two hormones secreted by the adipose tissue, adiponectin/leptin, is often used as a marker of the secretory health of this organ. Beyond a low ratio between these two adipokines, other adipose tissue dysfunctions such as adipocyte hypertrophy and macrophage infiltration exist. In the context of obesity, the relationships between the plasma adiponectin/leptin ratio and the cardiometabolic profile, and more specifically glucose-insulin homeostasis, was compared to that of hypertrophy of subcutaneous abdominal and omental adipose cells and macrophage infiltration in women of variable age and adiposity. In addition, the association between the plasma adiponectin/leptin ratio and gene expression involved in lipid metabolism and adipose tissue development was examined in the two fat depots, in this same group of women. The combination of a low adiponectin/leptin ratio and adipocyte hypertrophy was observed in patients with the highest levels of insulin resistance. Moreover, a low adiponectin/leptin ratio was associated with a greater lipolytic response, both in subcutaneous abdominal and omental adipocytes. Thus, the adiponectin/leptin ratio is an important marker of adipose tissue dysfunctions and its increased cardiometabolic risk in women of varying age and adiposity.