Resumo: Camundongos experimentalmente infectados com estirpes patogênicas de Leptospira interrogans sorovar Pomona e Canicola foram avaliados quanto à produção de anticorpos antileptospiras e distribuição do microrganismo em tecidos, em diferentes momentos após infecção. A técnica de soroaglutinação microscópica foi avaliada após tratamento das amostras de soro com 2-mercaptoetanol (SAM-2ME), e pela comparação do seu resultado com as respectivas amostras não tratadas (SAM) foi possível determinar a presença de anticorpos da classe IgM e, dessa forma, diferenciar a fase da infecção. Pela SAM, não houve reação para qualquer outro sorovar testado, diferente do homólogo inoculado, podendo indicar resposta imunológica específica em camundongos para os sorovares inoculados experimentalmente. Em relação à distribuição do microrganismo nos tecidos, pesquisado pela reação em cadeia pela polimerase (PCR), observou-se que os camundongos infectados não apresentaram fase de leptospiremia, e não houve colonização renal e ovariana, sugerindo que esses animais, talvez, não participem de forma importante na epidemiologia da leptospirose para os sorovares Pomona e Canicola. / Abstract: Experimentally infected mice with pathogenic strains of Leptospira interrogans serovar Pomona and Canicola were evaluated to anti-leptospiral antibodies production and to verify the distribution of the microrganism in tissues in different moments of the infection. Microscopic agglutination test was evaluated after treatment of the sera samples with 2-mercathoethanol (MAT-2ME), and by the comparison of its results with the respective samples not-treated (MAT) was possible to determine the presence of IgM antibodies and, thus, to differentiate the stage of infection. MAT does not present reaction for any other serovar tested, different the homologous serovar inoculated, indicating specific immunological response in mice to the experimentally inoculated serovars. In relation to the distribution of the microrganism in the tissues detected by polymerase chain reaction (PCR), the infected mice didn't present leptospiremia, and there was not renal and ovarian colonization, suggesting that these animals, maybe do not participate of the epidemiology of leptospirosis to the serovar Pomona and Canicola. / Orientador: Paulo Francisco Domingues / Coorientador: Hélio Langoni / Banca: Paulo Roberto de Oliveira / Banca: Silvio Arruda Vasconcelos / Banca: Marcio Garcia Ribeiro / Banca: Luiz Carlos de Souza / Doutor

Orientador: Luis Antonio Mathias / Banca: Sílvio Arruda Vasconcellos / Banca: Vera Cláudia Magalhães Curci / Banca: Luiz Augusto do Amaral / Banca: Samir Issa Samara / Resumo: Propriedades de agricultura familiar são importantes locais a serem considerados como unidades de estudos na área de medicina veterinária preventiva, pois seu ambiente e as características de manejo dos animais normalmente empregadas favorecem o contato entre as diferentes espécies e, dessa forma, há maiores chances de transmissão de agentes infecciosos com potencial zoonótico. O objetivo do trabalho foi descrever aspectos epidemiológicos da infecção por Leptospira spp. e da ocorrência de anticorpos contra Leptospira spp. em populações humanas e animais em propriedades rurais nos biomas brasileiros. Foram colhidas amostras de sangue e de urina de animais selvagens de vida livre, animais domésticos e de seres humanos. Para o diagnóstico sorológico de leptospirose, foi realizada a prova de soroaglutinação microscópica (SAM). As amostras de urina foram semeadas em meios de cultura Ellighausen, McCullough, Johnson e Harris - DifcoR (EMJH) e Fletcher - DifcoR. As amostras das quais houve isolamento das bactérias foram genotipadas, utilizando a técnica Multiple Locus Variable number tandem repeat (MLVA), no Laboratório de Leptospirose do Instituto de Patobiologia, Centro de Investigação em Ciências Veterinárias e Agronômicas, do Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuária (INTA), Buenos Aires, Argentina. Para a determinação dos fatores de risco de leptospirose, foi aplicado um questionário aos indivíduos de cada propriedade. Realizou-se uma análise univariada, utilizando- se o teste exato de Fisher, a fim de verificar a associação de cada um dos possíveis fatores de risco com a variável dependente. Posteriormente foi realizada uma análise multivariada, na qual foi construído um modelo de regressão logística. Nas diferentes espécies, as sorovariedades de Leptospira spp. contra as quais foram encontrados títulos de anticorpos foram Icterohaemorrhagiae, Copenhageni, Grippotyphosa, Pomona, Canicola ... / Abstract: Family farming properties are important places to be considered units of study in the field of Preventive Veterinary Medicine because their environment and handling characteristics of animals typically employed promote the contact between the different species and thus there are greater chances of transmission of infectious agents with zoonotic potential. The objective of this study was to describe epidemiological aspects of the Leptospira spp. infection and of the occurrence of antibodies against Leptospira spp. in humans and animals populations in farms in the Brazilian biomes. Were harvested from free-living wild animals, domestic animals and humans, samples of blood and urine. For serological analysis, the microscopic agglutination test (MAT) was performed. Urine samples were seeded on media Ellighausen, McCullough, Johnson and Harris culture - DifcoR (EMJH) and Fletcher - DifcoR. Samples of which was isolated the bacteria were genotyped, using the technique Multiple Locus Variable number tandem repeat (MLVA), in Leptospirosis Laboratory of the Institute of Pathobiology, Center for Research in Veterinary and Agricultural Sciences, National Institute of Agricultural Technology (INTA), Buenos Aires, Argentina. To determine the risk factors of leptospirosis, a questionnaire was applied to the people of each property. Univariate analysis was performed using the Fisher exact test in order to verify the association of each of the possible risk factors with the dependent variable. Subsequently, was performed a multivariate analysis, which was built a model of logistic regression. In different species, serovars of Leptospira spp. against which antibody titers were found were Icterohaemorrhagiae, Copenhageni, Grippotyphosa, Pomona, Canicola, Wolffi, Hardjo, Panama, tarassovi, Hebdomadis, Shermani, Bratislava, Bataviae, Australis, Castellonis, Andamana, Autumnalis, Pyrogenes, Whiticombi, Javanica and Patoc. There was isolation of ... / Doutor

A leptospirose é uma zoonose, amplamente difundida pelo mundo, causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira, que colonizam os túbulos renais de animais silvestres e domésticos. A transmissão ocorre, principalmente, pelo contato direto com água e solo contaminados com a urina de animais infectados que podem ser clinicamente assintomáticos. As leptospiras patogênicas invadem os tecidos do hospedeiro através da penetração da pele lesada ou mucosas da boca, narina e olhos. Logo após ultrapassar as superfícies de contato, as bactérias chegam rapidamente à corrente sanguínea e espalham-se para todos os órgãos causando lesões, principalmente, no fígado e rins onde produzem hemorragia e necrose tecidual. Após a entrada no hospedeiro, a progressão da infecção envolve a adesão das bactérias às células eucarióticas e às proteínas de matriz extracelular seguida pela invasão aos tecidos. Estudos recentes demonstraram que as leptospiras são capazes de se translocarem através das monocamadas celulares, o que poderia ser um mecanismo de evasão do sistema imune e também facilitaria a entrada e saída da corrente sanguínea para infectar órgãos-alvo. O mecanismo envolvido na invasão do patógeno através das barreiras extracelulares não está bem elucidado. Enzimas capazes de degradar proteínas da matriz extracelular poderiam contribuir com a motilidade e quimiotaxia das bactérias durante a invasão. Bactérias patogênicas sintetizam e secretam diferentes tipos de proteases, que atuam degradando colágeno e glicoproteínas entre outras proteínas do hospedeiro. Recentemente, um estudo, utilizando gelatina e caseína como substratos e lisado bacteriano, mostrou haver uma variedade de proteases em Leptospira spp. Análises do genoma indicam a presença de vários genes que codificam prováveis proteases. A comprovação experimental da existência e a caracterização funcional destas proteínas poderão contribuir no entendimento da patogenia da leptospirose. Neste sentido, este trabalho teve como objetivos a clonagem, expressão e caracterização funcional de uma provável colagenase (ColA) de L.interrogans sorovar Copenhageni. As sequências codificantes do domínio de colagenase 1 (D1), do domínio de colagenase 2 (D2) e de ambos os domínios (Full) da ColA foram amplificadas por PCR a partir de DNA genômico de Leptospira e clonadas no vetor de expressão pAE. Os fragmentos D1, D2 e Full da ColA foram expressos em E. coli BL21 - SI e purificados a partir das frações insolúveis por cromatografia de afinidade a níquel. Os fragmentos recombinantes purificados foram utilizados na obtenção dos antissoros policlonais, e as atividades enzimáticas de cada um foram avaliadas. Os antissoros policlonais produzidos em coelho apresentaram elevados níveis de anticorpos detectados por ELISA. Experimentos de Western - blotting demonstraram a presença de proteína ColA em diferentes sorovares patogênicos de Leptospira spp. As proteínas Full e D2 apresentaram atividade catalítica sobre o colágeno desnaturado e sobre peptídeo sintético e atividade hemorrágica em camundongos. Estes resultados indicam que ColA é provavelmente uma proteína de leptospira envolvidas na invasão de tecidos do hospedeiro. / Leptospirosis is a zoonosis widespread throughout the world, caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira, which colonize the renal tubules of wild and domestic animals. Transmission occurs mainly through direct contact with water and soil contaminated with urine of infected animals that may be clinically asymptomatic. Pathogenic leptospires invade host tissues by penetrating damaged skin or the mucous membranes of the mouth, nostrils and eyes. Soon after passing the contact surfaces, leptospires come quickly into the bloodstream and spread to all organs causing damage mainly in the liver and kidneys where they produce hemorrhage and tissue necrosis after entering the host, the progression of the infection involves the adhesion of bacteria to eukaryotic cells and extracellular matrix proteins followed by invasion of tissues. Recent studies have shown that leptospires are able to translocate across cell monolayers, which could be a mechanism for evasion of the immune system and also facilitate the entry and exit from the bloodstream to infect target organs. The mechanism involved in pathogen invasion through extracellular barriers is not well elucidated. Enzymes capable of degrading extracellular matrix proteins could contribute to motility and chemotaxis of bacteria during the invasion. Pathogenic bacteria synthesize and secrete different types of proteases that degrade collagen and glycoproteins among other host proteins. Recently, a study using gelatin and casein as substrates and bacterial lysate showed a variety of proteases in Leptospira spp. Analysis of the genome indicate the presence of several genes encoding probable protease. The experimental proof of the existence and functional characterization of these proteins may contribute to the understanding of the pathogenesis of leptospirosis. In this sense, this work aimed the cloning, expression and functional characterization of a probable collagenase (ColA) from L.interrogans serovar Copenhageni. Coding sequences of the collagenase domain 1 (D1), collagenase domain 2 (D2), and both domains (Full) of the ColA gene were amplified by PCR from genomic Leptospira DNA and cloned into the pAE expression vector. The D1, D2 and Full fragments of ColA protein were expressed in E. coli BL21-SI and purified from the insoluble fractions by nickel affinity chromatography. The purified fragments were used to obtain the polyclonal antiserum, and their enzymatic activities were evaluated by zymography. Rabbit polyclonal antiserum against the recombinant protein fragments were produced with a high antibody level detected by ELISA. Western-blotting experiments demonstrated the presence of ColA protein in different pathogenic serovars of Leptospira. The Full and D2 proteins showed catalytic activity on denatured collagen and synthetic peptide and hemorrhagic activity in mice. These results indicated that ColA is probably a leptospiral protein involved in invasion of host tissues.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_gustavo_cerqueira.pdf: 9683705 bytes, checksum: a1d0f93c3566774a1f0e953cc32fb912 (MD5) Previous issue date: 2009-03-06 / In this study, Himar1 was used to obtain a total of 929 transposon mutants, of which, 721 correspond to coding sequences (CDS) disrupted by the transposon in 551 different genes. Some mutants were evaluated regarding the effect of gene disruption to virulence in the hamster model, and two attenuated mutants containing the transposon into hypothetical genes were identified. Another study aimed to develop a new genetic tool to help in the study of specific genes. Thus, an inducible expression system for L. biflexa was developed. Such inducible expression system employed as reporter genes the green fluorescence protein (gfp) and the gene encoding for the flagelin B protein (flaB). Fluorescent L. biflexa (GFP) and motile leptospires (FlaB) were observed after induction by IPTG. Finally, another study was conducted to determine, by PCR amplification, the presence of the lig genes in different pathogenic species. ligB appeared to be ubiquitously distributed, while ligA and ligC were detected only in a reduced number of serovars. In addition, a 214 bp specific ligB fragment was used to constitute a new method for pathogenic Leptospira species classification. / Neste estudo, o Himar1 foi utilizado para a obtenção de um total de 929 mutantes, dos quais, 721 correspondem a seqüências codificadoras (CDS) interrompidas pelo transposon, cobrindo 551 genes diferentes. Alguns mutantes foram avaliados com relação aos efeitos da interrupção gênica sobre a virulência em modelo animal, e dois mutantes atenuados contendo o transposon em genes hipotéticos foram identificados. Outro estudo realizado buscou desenvolver uma nova ferramenta genética para auxiliar no estudo da função de genes específicos. Assim, foi desenvolvido um sistema de expressão induzível para L. biflexa. Este sistema de expressão empregou como repórter o gene da proteína verde fluorescente (gfp) e o gene da proteína flagelina B (flaB). L. biflexa fluorescente foi observada, assim como leptospiras que voltaram a ter mobilidade após a adição do agente indutor (IPTG). Finalmente, foi conduzido um estudo para a determinação da presença dos genes da família lig nas diversas espécies de leptospiras patogênicas, através da técnica de PCR. O gene ligB apareceu amplamente distribuído, enquanto que ligA e ligC foram detectados apenas em um reduzido número de sorovares. Além disso, a sequência de um fragmento específico de 214 pb do gene ligB pode ser usada para a constituição de um novo método para a classificação das espécies patogênicas de Leptospira

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Leptospirosis es una enfermedad reemergente y zoonótica diseminada a nivel mundial. Ha sido poco estudiada en equinos, especie en que su presentación generalmente es subclínica. El objetivo del presente estudio fue determinar la seroprevalencia a Leptospira spp. en una población de equinos de un centro ecuestre militar de la Región de Valparaíso. Para esto se analizó una población de 259 ejemplares, compuesta por hembras y machos de distintas edades y funciones. Las muestras de suero sanguíneo fueron sometidas a la prueba de microaglutinación en placa (micro-MAT) presentada a seis serovares del género Leptospira spp. La frecuencia de presentación de sueros positivos a uno o más serovares de Leptospira spp. con títulos mayores o iguales a 1:100 fue de un 23,55%. Los serovares más frecuentes correspondieron a Autumnalis (45,9%), Ballum (39,34%) y Canicola (14,75%). Los sueros no reaccionaron a los serovares Hardjo, Pomona e Icterohaemorrhagiae. Se obtuvieron títulos de 1:100 hasta 1:1600. Estos resultados confirman que los equinos del centro ecuestre militar están expuestos a leptospirosis. El sexo y la edad de los ejemplares no mostraron tener una relación significativa con la seropositividad a Leptospira spp. La función de formación tiene una relación significativa con la seropositividad, mostrando 2,94 veces menos probabilidades de contraer la infección. Eventos competitivos fuera del centro ecuestre, una alta tasa de reposición anual y una redistribución periódica de pesebreras, podrían estar relacionados con la mayor probabilidad de exposición de los equinos de deporte. / Leptospirosis is a re-emerging and zoonotic disease disseminated worldwide. It has not been studied in detail in equines, species that generally presents the subclinical form of the disease. The objective of this study was to determine the seroprevalence of Leptospira spp. in a population of horses from a military equestrian center of Valparaíso region. A population of 259 individuals was assessed, consisting of males and females of various ages and functions. The serum samples were subjected to microscopic agglutination test (micro-MAT) towards to six serovars of Leptospira spp. The frequency of positive serums to one or more serovars of Leptospira spp., with titles egual or over 1: 100 was a 23.55%. The most frequent serovares present were Autumnalis (45.9%), Ballum (39.34%) and Canicola (14.75%). Serums did not react to Hardjo, Pomona and Icterohaemorrhagiae. Titers obtained varied from 1: 100 to 1: 1600. These results confirm that the military equestrian center horses are exposed to leptospirosis. Sex and age of the specimens did not have a significant relationship with seropositivity to Leptospira spp. The training function (protocole mounted ceremony horses) resulted as a protection factor, being 2.94 times less likely to contract the infection. Competitive events outside the equestrian center, a high rate of annual replacement and periodic redistribution of stables, could be related with the higher risk of sport horses for contracting leptospirosis. / Financiamiento: Proyecto U - Inicia 121017019102049.

A imunização transcutânea (TCI) é uma via atrativa para o desenvolvimento de vacinação livre de agulhas, atuando nas APCs da pele, podendo substituir algumas das imunizações convencionais, em termos de facilidade, segurança e eficácia. O presente estudo avaliou a resposta imune da TCI com proteína recombinante de leptospira LipL32, uma proteína altamente conservada em cepas patogênicas e potente candidata vacinal. A TCI com a LipL32 na região abdominal de C57BL-6 foi capaz de primar o sistema imune, suscitando resposta sistêmica com altos níveis de anticorpos contra o antígeno, após reforços subimunizantes, ID e Tc. O padrão de citocinas em cultivo de células do sangue total dos grupos imunizados indicou que a imunização Tc foi capaz de primar o sistema imune, tanto inato quanto adaptativo. O tratamento local ou a coadministração com surfactantes ou PEG não evidenciou ação emoliente ou adjuvante. A coadministração Tc da LipL32 com MPL-A levou a efeito moderador da reação pro-inflamatória, redirecionando a resposta adaptativa, tanto humoral quanto celular. / Transcutaneous immunization (TCI) offers an attractive pathway for the development of needle-free vaccination by acting on APCs of the skin, showing potential to replace conventional immunization, in terms of safety and efficacy. In this study we evaluated the immune response by TCI with recombinant protein of leptospira LipL32, a highly conserved protein among pathogenic strains, a potential vaccine candidate. TCI with LipL32 was evaluated in C57BL-6 mice abdominal region and was able to confer systemic response with high levels of antibodies after subimmunizing ID and Tc boosters. The pattern of cytokines in cell cultures from whole blood of immunized groups indicated that the TCI was able to prime the immune system, for both innate and adaptive response. Local treatment of the skin or coadministration with surfactants and PEG did not show an emollient and an adjuvant action. Co-administration of LipL32 with MPL-A influenced the antibody response as well as showed a moderating effect of the pro-inflammatory reaction, redirecting the adaptive response.

A agropecuária familiar brasileira produz 70% da alimentação da população, possuindo importante papel social e econômico neste país. Os assentamentos do Pontal do Paranapanema produzem alimentos que são ofertados ao estado de São Paulo, sendo atividade leiteira a mais importante. As doenças infecciosas reprodutivas dos bovinos, causados por Leptospira spp., Herpes Virus Bovino Tipo 1(BoHV-1), Diarreia Viral Bovina (BVD), agentes da classe Mollicutes são importantes para a rentabilidade das produções agropecuárias do mundo inteiro. Dados epidemiológicos nos assentamentos do estado de São Paulo não existem. Este estudo teve como objetivo analisar a prevalência das enfermidades reprodutivas bacterianas e virais em bovinos de leite criados nos assentamento de Presidente Epitácio e Mirante do Paranapanema. Todos os animais foram submetidos ao exame específico do sistema reprodutivo e colheram-se amostras de soro e swab vaginal. A prevalência para BoHV-1, BVDV, Leptospira spp., e classe Mollicutes foi de 69,05%, 57,74%, 58,93% e 50%, respectivamente. Foi observado uma relação entre vacas multíparas e a presença de BoHV-1 e Leptospira spp. Foi observado também uma relação de animais com retenção de placenta com a presença de bactérias da classe Mollicutes e animais reagentes a anticorpos contra Leptospira spp. A prevalência destas enfermidades prova a existência destas em assentamentos na região do Pontal do Paranapanema, faz-se necessário o desenvolvimento de programas de políticas públicas para o monitoramento desta região / Brazilian\'s family settlements are responsible for 70% of total population feeding. It has an important social and economic role in Brazil. Settlements from Pontal do Paranapanema offering feed to the state of São Paulo and milk production is the most important activity. Bovine reproduction infectious diseases caused by Leptospira spp., Bovine Herpesvirus Type 1(BoHV-1), Bovine viral Diarrhoea (BVD) and Mollicutes are important to the dairy cattle industry all over the world. Epidemiological datas from settlements located in the state of São Paulo are not available. The aim of this study was to evaluate the prevalence of bacterial and viral reproductive infectious diseases dairy cattle raised in settlements from Presidente Epitácio e Mirante do Paranapanema. Specific physical examination of reproduction female system was performed and after that vaginal swabs samples and serum samples were collected. The prevalence of BoHV-1, BVDV, Leptospira spp., and Mollicutes was 69,05%, 57,74%, 58,93%, and 50%, respectively. An association between multiparous cows and the presence of BoHV-1 and Leptospira spp., was detected. Also an association between females with retained placenta and Mollicutes and cows with antibodies against Leptospira spp. was observed. The results showed the presence of reproduction diseases in settlements in Pontal do Paranapanema and it is necessary the development of public politics programs to control them

Diferentes mecanismos têm sido mostrados por estar envolvidos na evasão à morte mediada por complemento. Neste estudo, demonstramos que a aquisição do FH pela Leptospira é crucial para a sobrevivência das bactérias no soro e que estas espiroquetas interagem com FH, FHL-1, FHR-1 e C4BP. Nós também demonstramos que a ligação à estes reguladores é mediada pelas proteínas leptospiral immunoglobulin-like (Lig). FH se liga as proteínas Lig via short consensus repeat (SCR) principalmente pelos domínios 5 e 20. Ensaios de competição sugerem que FH e C4BP têm sítios de ligação diferentes nas proteínas Lig. Além disso, FH e C4BP ligados nas proteínas Lig mantêm a atividade de cofator, mediando a degradação de C3b e C4b pelo FI. Nós demonstramos que a aquisição de FH e C4BP pela L. biflexa transgênica para LigA e LigB exercem um papel de proteção na sobrevida destas bactérias. Análise por citometria de fluxo também confirmaram a capacidade das leptospiras transgênicas para controlar a deposição de C3, C4 e MAC. As proteínas Lig também foram capazes de ligar plasminogênio, o qual foi ativado em plasmina e esta enzima foi capaz de degradar fibrinogénio, C3b e C5. Estas clivagens inativam C3b e C5, evitando a progressão da cascata, e bloqueando as três vias de complemento. / Different mechanisms have been shown to be involved in evasion of complement-mediated killing. In this study, we demonstrate that acquisition of FH on the Leptospira surface is crucial for bacterial survival in the serum and that these spirochetes interact with FH, FHL-1, FHR-1 and C4BP. We also demonstrate that binding to these regulators is mediated by leptospiral immunoglobulin-like (Lig) proteins. FH binds to Lig proteins via short consensus repeat (SCR) domains 5 and 20. Competition assays suggest that FH and C4BP have distinct binding sites on Lig proteins. Moreover, FH and C4BP bound to immobilized Ligs display cofactor activity, mediating C3b and C4b degradation by FI. We demonstrated that acquisition of FH and C4BP by the LigA and LigB transformed L. biflexa have the protective role, being crucial by bacterial survival. Analysis by Cytometer fluid also confirmed the ability of L. biflexa expressing LigA and LiB to controller the deposition of C3, C4 and MAC. Lig proteins were able to bind plasminogen, which was activated to plasmin and this enzyme was able to degrade the fibrinogen, C3b and C5. These cleavages inactivate C3b and C5, preventing progression of the complement cascade and blocking the three complement pathways.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-07-16T21:26:49Z No. of bitstreams: 1 Elsio Augusto Wunder Júnior Patogênese da leptospirose...pdf: 2609622 bytes, checksum: aa34c959355bc105a6e849e74258cf78 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-16T21:26:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Elsio Augusto Wunder Júnior Patogênese da leptospirose...pdf: 2609622 bytes, checksum: aa34c959355bc105a6e849e74258cf78 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A leptospirose é uma zoonose de importância global e um importante problema de saúde pública principalmente em países em desenvolvimento. É causada por bactérias do gênero Leptospira, uma espiroqueta móvel e de alta morbidade capaz de se disseminar nos tecidos e causar doença crônica em animais hospedeiros. Uma barreira importante para o controle e prevenção da doença tem sido o pouco conhecimento da patogênese do agente, em parte pela falta de ferramentas disponíveis e eficazes de manipulação genética. Um dos objetivos desse estudo foi caracterizar duas cepas mutantes de Leptospira interrogans. A interrupção do gene lipl32, que codifica para a proteína LipL32, a mais abundante proteína no gênero Leptospira e expressa somente na superfície das leptospiras patogênicas, foi realizada através da inserção do transposon Himar1 no sorovar Manilae. A cepa mutante não apresentou nenhuma diferença de crescimento ou de aderência em componentes da matriz celular, comparada com a cepa parental. O mutante foi capaz de produzir doença aguda no modelo animal de hamster e causar colonização crônica no modelo animal de rato, mostrando que LipL32 não possui um papel nestes modelos de infecção. A interrupção do gene ligB foi realizada com a utilização, pela primeira vez em leptospiras patogênicas, da técnica de recombinação homóloga por mutagênese dirigida, onde o gene que codifica para a proteína LigB teve uma parte substituída por um cassete de resistência de espectinomicina (Spcr). Essa proteína, identificada como um possível fator de virulência, reconhecida pelo soro de pacientes infectados e importante para a aderência em componentes da matriz celular, mostrou não ser importante para a infecção aguda ou crônica, quando testada frente aos modelos animais, além de não ser necessária para a aderência em cultura de células. Outro objetivo desse trabalho foi estudar a cinética de disseminação da Leptospira interrogans no modelo animal de hamster, utilizando uma dose alta (108 leptospiras) e baixa (250 leptospiras) de inóculo, além de diferentes rotas de infecção. Nossos resultados demonstraram que leptospiras se disseminam rapidamente em todos os tecidos 01 hora após a infecção com uma alta dose de inóculo e que possivelmente a carga do agente nos tecidos é mais importante para a patogênese do que a sua habilidade para a disseminação. Também demonstramos que a motilidade não é essencial para disseminação, mas pode ser essencial para a carga nos tecidos e letalidade. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis and a major public health problem especially important in developing countries. Caused by bacteria of Leptospira genus, a motile lifethreatening spirochete which is able to disseminate to tissues and causes chronic carriage in animal hosts. A significant barrier to the control and prevention of leptospirosis has been the limited understanding of its pathogenesis, due in part to the lack of tools available for the genetic manipulation of this pathogen. One of the purposes of this study was to characterize two mutant strains of Leptospira interrogans. Interruption of lipL32 gene, encoding LipL32, the most abundant protein of pathogenic leptospires and its major outermembrane lipoprotein, was achieved in serovar Manilae using transposon mutagenesis with Himar1. The mutant had normal morphology and growth rate compared to the wild type and was equally adherent to extracellular matrix. The mutant was able to cause acute severe disease manifestations in the hamster model and chronic colonization in the rat model, showing that LipL32 doesn’t play a role in neither of those models of infection. Interruption of ligB gene was achieved using the homologous recombination by target mutagenesis for the first time in pathogenic leptospires and a spectinomycin resistance (Spcr) gene replaced a portion of the ligB coding sequence. This Lig protein, previously identified as a putative virulence factor, recognized by the sera of infected patients and important for the adherence in extracellular matrix components, showed not to be important for acute or chronic infection when tested with animal models and it’s not required to mediate bacterial adherence to cultured cells. Another purpose of this study was to determine and analyze the kinetics of dissemination of Leptospira interrogans in the hamster model, using a high (108 leptospires) and low (250 leptospires) dose of inoculum and different routes of infection. Our results demonstrated that leptospires can rapidly disseminate through all tissues after 1 hour post-challenge with a high inoculum dose and that perhaps the load of the agent in target tissues is more important for pathogenesis than its ability for dissemination. We also demonstrate that motility is not essential for dissemination but can be essential for tissue load and lethality.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Leptospirosis is a zoonotic disease caused by spirochetes of the genus Leptospira and it is one of the most important diseases with worldwide distribution. Although leptospirosis is recognized as one of the most commonly reported infectious diseases in dogs, there are no morphological criteria to achieve a definitive diagnosis based only on necropsy lesions. The objective of this study is to establish criteria for the pathological diagnosis of leptospirosis. The necropsy files of the Laboratório de Patologia Veterinária (LPV) of the Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) were acessed and all cases diagnosed as leptospirosis between the years of 1965 and 2011 (n=135) were reviewed. Immunohistochemistry for confirmation of definitive diagnosis was performed only in those cases where the kidney tissue was considered viable in quantity and quality (n=79). The positive cases were identified and correspond to the results shown here (n=53). Main necropsy lesions included icterus (79.2%) and hemorrhage (75.5%), mainly in the lungs (56.6%). Gross hepatic (56.6%) and renal (50.9%) changes were frequently found and were characterized mainly by discoloration (respectively 30.2% and 32.1%), accentuation of hepatic lobular pattern (26.4%) and white streaks in the cut surface of kidneys (22.6%). Extrarenal lesions secondary to uremia occurred in half of the cases (50.9%). Enlarged livers (11.3%), and kidneys (9.4%), and rough renal capsular surfaces (3.8%) were less common findings. In the histopathology of the kidneys (n=53), the encountered lesions (98.1%) were almost exclusively acute or subacute (96.2%) and were characterized by varying degrees of tubular nephrosis (86.8%) and non-suppurative interstitial nephritis (60.4%), with evident degenerativeinflammatory dissociation. In the histopathology of the liver (n=42), the encountered lesions (97.6%) consisted mainly of hepatocellular dissociation (78.6%), intracanalicular cholestasis (33.3%) and hepatocellular necrosis (31%). Reactive lesions, such as Kupffer cell hypertrophy, sinusoidal leucocytostasis and inflammatory mononuclear infiltrate within portal triads were observed in several cases (42.8%). In the histopathology of the lung (n=28), alveolar hemorrhage (85.7%) and edema (57.1%) were rather frequent lesions. Neutrophils and macrophages in the alveolar spaces (35.7%) and neutrophils within small pulmonary vessels (17.9%) were also frequent findings. The findings stemming from the current study should serve as an alert for Brazilian veterinary pathologists, since the pathological presentations of canine leptospirosis in this region (Central Region of the State of Rio Grande do Sul, Brazil) did not change in the last 50 years, and is still similar to that described worldwide up to the decade of 1980 s, but rather different from that currently recognized in the United States, Canada and part of West Europe. We recommend that the histopathological criteria for the diagnosis of canine leptospirosis should include the concomitant occurrence of acute or subacute tubulointerstitial nephritis, non specific reactive hepatitis and diffuse alveolar damage, including diffuse alveolar hemorrhage with capillaritis, in dogs which at necropsy had presented icterus, hemorrhage and extrarenal lesions of uremia without splenomegaly. / Leptospirose é uma zoonose causada por espiroquetas do gênero Leptospira e constitui uma das mais importantes doenças de distribuição mundial. Embora leptospirose seja reconhecidamente uma das doenças infecciosas mais frequentemente descritas em cães, não existem critérios morfológicos para a realização do diagnóstico definitivo com base apenas na necropsia. Assim, o objetivo principal deste trabalho é estabelecer critérios anatomopatológicos para o diagnóstico da leptospirose. Os arquivos de necropsia do Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Santa Maria (LPV-UFSM) foram acessados e todos os casos diagnosticados como leptospirose entre os anos de 1965 e 2011 foram revisados (n=135). Foi realizada imuno-histoquímica para confirmação do diagnóstico definitivo apenas nos casos em que o tecido renal foi considerado viável em quantidade e qualidade (n=79). Os casos positivos foram identificados e correspondem aos resultados aqui demonstrados (n=53). Na necropsia, as principais lesões observadas incluíram icterícia (79,2%) e hemorragia (75,5%), principalmente no pulmão (56,6%). Alterações macroscópicas hepáticas (56,6%) e renais (50,9%) foram frequentes e caracterizavam-se principalmente por descolorações (30,2% e 32,1% respectivamente), acentuação do padrão lobular hepático (26,4%) e estriações brancas na superfície de corte dos rins (22,6%). Lesões extrarrenais de uremia ocorreram na metade dos casos (50,9%). Hepatomegalia (11,3%), nefromegalia (9,4%) e irregularidade da superfície capsular dos rins (3,8%) foram menos comuns. Na histologia dos rins (n=53), as lesões encontradas (98,1%) foram quase que exclusivamente agudas ou subagudas (96,2%) e caracterizavam-se por graus variados nefrose tubular (86,8%) e nefrite intersticial não supurativa (60,4%), com evidente dissociação degenerativo-inflamatória. Na histologia do fígado (n= 42), as lesões encontradas (97,6%) eram constituídas principalmente por dissociação dos cordões de hepatócitos (78,6%), colestase intracanalicular (33,3%) e necrose hepática (31%). Lesões reativas, como hipertrofia das células de Kupffer, leucocitostase sinusoidal e infiltrado inflamatório mononuclear nos espaços porta, foram vistas em muitos casos (42,8%). Na histologia do pulmão (n=28), hemorragia (85,7%) e edema (57,1%) alveolares foram muito prevalentes. Neutrófilos e macrófagos nos espaços alveolares (35,7%) e neutrófilos no interior de pequenos vasos pulmonares (17,9%) também foram achados frequentes. Os resultados aqui demonstrados devem servir de alerta aos patologistas veterinários brasileiros, pois a apresentação anatomopatológica da leptospirose canina em nossa região (Região Central do Rio Grande do Sul, Brasil) não se modificou nos últimos 50 anos, mantendo-se semelhante àquela descrita internacionalmente até a década de 1980, mas muito diferente do que é atualmente reconhecido para os Estados Unidos, o Canadá e parte da Europa Ocidental. Recomendamos que os critérios histopatológicos para o diagnóstico da leptospirose canina devem incluir a presença concomitante de nefrite tubulointersticial aguda ou subaguda, hepatite reativa não específica e lesão alveolar difusa, incluindo hemorragia alveolar difusa com capilarite, em cães que durante a necropsia demonstrem icterícia, hemorragias e lesões extrarrenais de uremia na ausência de esplenomegalia.