Introduction : Le Test de Marche de 6 Minutes (6MWT) est le test le plus utilisé chez les patients atteints de cancer, évaluant la capacité fonctionnelle, tout en demeurant simple, sécuritaire et standardisé. Toutefois, aucune équation actuelle ne peut prédire la consommation maximale d’oxygène ("V" ̇O2 max) chez les survivants de cancer. Ainsi, l’objectif principal est de valider une équation spécifique pour prédire le "V" ̇O2 max à partir du 6MWT, alors que le second est de valider une équation spécifique pour prédire la distance de marche (6MWD) à partir du 6MWT. Méthodes : Au total, 250 survivants d’au moins cinq ans de la leucémie lymphoblastique aigüe (LLA) (n=80 femmes (48%); n=88 hommes (52%)) avec un âge moyen de 22 ans (22.2 ± 6.3) ont été recrutés. Parmi ceux-ci, 168 survivants ont réalisé un 6MWT ainsi qu’un test d’effort maximal sur ergocycle pour évaluer respectivement leur capacité fonctionnelle et leur fonction cardiorespiratoire. Une évaluation de leur pratique d’activités physiques a été réalisée par questionnaire. Les survivants ont ensuite été randomisés en deux groupes : le premier (n=118 (70%)) pour créer les équations et le deuxième groupe (n=50 (30%)) pour valider les équations créées. Des régressions linéaires multiples ont été réalisées pour prédire chacune des équations ("V" ̇O2 max et 6MWD) à partir du 6MWT. Les variables incluses dans les équations comprenaient l’âge, le poids, la taille, la fréquence cardiaque à la fin du test (FCfin), la distance de marche effectuée (6MWD), le niveau de la pratique d’activités physiques (MVLPA), la perception d’effort (EPE) ainsi que la durée des traitements (DT). La méthode de Bland et Altman a été utilisée pour valider chacune des équations en déterminant les différences moyennes et en comparant nos équations avec des équations de références. Résultats : Équation spécifique "V" ̇O2 max (différence moyenne = 2.51mL.kg-1.min-1) = (-0,236 * âge(années)) - (0,094 * poids(kg)) - (0,120 * FCfin(bpm)) + (0,067 * 6MWD(mètres)) + (0,065 * MVLPA(min/jour)) - (0,204 * DT(années)) + 25,145 ; R2=0.61. Équation spécifique 6MWD (différence moyenne = 10.86 mètres) = (3,948 * taille(cm)) - (1,223 * poids(kg)) + (1,913 * FCfin(bpm)) - (6,863 * EPE(/10)) + (0,556 * MVLPA(min/jour)) - 242,241 ; R2=0.36. Conclusion : Il s’agit de la première étude qui prédit le "V" ̇O2 max et la 6MWD en utilisant des variables cliniques et spécifiques des survivants de LLA. Nos résultats permettent d’évaluer la capacité cardiorespiratoire des survivants de LLA et facilitera leur suivi. / Introduction: In cancer patients, the 6-Minute Walking Test (6MWT) is the most widely used test because it can assess the functional capacity in patients, while remaining simple, safe and standardized. However, it is reported that the actual equations cannot accurately predict a valid "V" ̇O2 peak value or a 6-minute walk distance (6MWD) in cancer survivors. Thus, the first aim is to validate a specific equation using the 6MWT to predict "V" ̇O2peak, while the second is to validate a specific equation to predict walk distance during 6MWT. Methods: A total of 250 childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL) survivors were enrolled in this study, among which 168 participants aged 22 years on average (22.2 ± 6.3) (n=80 females (48%); n=88 males (52%)) underwent a cardiopulmonary exercise test (CPET) and a 6MWT to assess their functional capacity and their cardiorespiratory fitness. Additionally, participants completed a physical activity questionnaire. Participants were randomly divided in two groups to create (n=118 (70%)) and to validate (n=50 (30%)) the equations. Multiple linear regression analyses were used to determine a new prediction equation for "V" ̇O2 peak and 6MWD from 6MWT. The validity in between the measured and predicted "V" ̇O2 peak and between the measured and predicted 6MWD was assessed using the Bland and Altman method. Results: Specific "V" ̇O2 peak equation (mean of bias=2.51mL.kg-1.min-1) = (-0.236*age(years)) - (0.094*weight(kg)) - (0.120*HR end(bpm)) + (0.067*6MWD(meters)) + (0.065*MVLPA(min/day)) - (0.204*DT(years)) + 25.145. Specific 6MWD equation (mean of bias=10.86meters) = (3.948*height(cm)) - (1.223*weight(kg)) + (1.913*HR end(bpm)) - (6.863*RPE) + (0.556*MVLPA(min/day)) - 242.241 Conclusion: This is the first study that predicted "V" ̇O2 peak and 6MWD using clinical and specific variables related to the disease from a 6MWT in childhood ALL survivors. It refines an already available tool that will strengthen an objective evaluation of the patient.

La leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC) est une hémopathie myéloïde rare du sujet âgé. Les caractéristiques cliniques, génétiques et moléculaires de la maladie sont bien connues. L’expression très hétérogène de la maladie ne peut être expliquée par la seule hétérogénéité génétique du clone leucémique. Les altérations épigénétiques jouent manifestement un rôle important. Le rôle de facteurs extrinsèques issus du microenvironnement est plus obscur. La niche hématopoïétique est le siège d’interactions entre cellules. Deux schémas non-exclusifs d’altération primaire ou secondaire de la niche sont proposés. Le premier implique que l’émergence d’un clone hématopoïétique modifie son environnement. Le second postule que le premier évènement dans l’émergence d’une hémopathie clonale est une altération de l’environnement. Mon travail de thèse a étudié les altérations du microenvironnement médullaire chez les patients et leur impact sur la physiopathologie de la maladie selon 2 axes: 1) la mise au point d’un modèle murin de reconstitution de la niche hématopoïetique humaine et 2) la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses des patients. Dans une première partie, j’ai transposé un modèle rapporté en 2016 à l’étude de la LMMC. Ce modèle de greffe de cellules médullaires humaines chez la souris immunodéprimée s’est avéré difficilement reproductible. Dans la seconde partie, j’ai analysé les cellules souches mésenchymateuses de patients atteints de LMMC. J’ai identifié la production excessive d’IGFBP2 (Insuline-like Growth Factor Binding Protein 2), conséquence probable d’une dérégulation épigénétique. Le séquençage des CSM à l’échelle unicellulaire a révélé une restriction de l’hétérogénéité de ces cellules dont une fraction seulement produit IGFBP2. Finalement, j’ai montré qu’IGFBP2 favorise la différenciation des progéni-teurs myéloïdes vers la lignée monocytaire. IGFBP2 pourrait donc contribuer à amplifier la monocytose caractéristique de cette maladie.En conclusion, la LMMC s’accompagne de modifications des cellules de la niche hématopoÏétique dont certaines produisent des quantités excessive d’IGFBP2. La recherche de l’origine de ce dérèglement et de son importance dans la progression de la maladie permettra d’évaluer l’intérêt potentiel d’une neutralisation de cette cytokine à des fins thérapeutiques. / Chronic myelomonocytic leukemia (CMML, is a rare myeloid hemopathy of the elderly. Clinical, genetic and molecular characteristics of the disease are well-known. The highly heterogeneous expression of the disease can’t be solely explained by genetic heterogeneity of the leukemic clone. Epigenetic alterations obviously play an important role. However, the role of extrinsic factors from the medullar microenvironment in CMML physiopathology is still poorly understood. The hematopoietic niche hosts a lot of bi-directionnal interactions between cells. Two non-exclusive schemes of primary and secondary alterations of the niche can be proposed. First postulate implies that the emergence of a hematopoietic clone alters its environment. The second one supposes that the first event causing the emergence of a clonal hemopathy is an alteration of the environment. My PhD work consisted of studying medullar alterations in patients and their impact on CMML physiopathology upon 2 axes: 1) to set up a murine model of human hematopoietic niche reconstitution 2) to caracterise mesenchymal stem cells from CMML patient ex vivo. During the first part of my PhD, I adapted a model published in 2016 to CMML. This model of human MSC graft in immunodeficient mice proved to be hardly reproducible. During the second part, I analysed of CMML patients MSC. I identified an excessive production of IGFBP2 (Insuline-like Growth Factor Binding Protein 2) probably secondary to an epigenetic disregulation. Single cell RNA sequencing revealed a restriction of MSC heterogeneity of which only a fraction produces IGFBP2. Finally, I showed that IGFBP2 favors myeloid progenitors differenciation towards monocytic lineage. IGFBP2 could therefore contribute to the amplification of CMML characteristic monocytosis.To conclude, CMML goes along with modifications of hematopoietic niche cells, some of which produce excessive amounts of IGFBP2. Investigation on the origin of this alteration and its significance in disease progression should allow to evaluate the potential interest of its neutralization for therapeutic strategies.

La FAK est une tyrosine kinase cytoplasmique qui régule divers processus cellulaires, dont la survie, la prolifération, la différenciation et la motilité. Bien que diverses études aient démontré l'importance du FAK dans la pathogenèse du SMD et de la LAM, le rôle de cette molécule dans le microenvironnement des tumeurs du SMD et de la LAM reste à déterminer davantage. En examinant les CSM de la moelle osseuse qui dérivent de patients atteints de SMD et de LAM, nous avons observé une augmentation continue de l'expression et de l'activation de la FAK pendant la progression du SMD vers de la LAM, semblable à celle observée chez les patients hémopoïétiques. Dans le SMD à faible risque, on a constaté que les CSM se caractérisaient par une faible expression et une faible activation du FAK. Ils présentaient une morphologie modifiée, un immunophénotype, une différenciation et l'expression de facteurs favorables à l'hématopoïèse. Il convient de noter que ces caractéristiques pourraient être largement reproduites dans les CSM saines par inhibition FAK. De plus, l'appauvrissement en FAK dans la lignée cellulaire stromale pourrait induire une expansion massive et l'apoptose des CSH normaux. Nos résultats mettent en évidence le rôle crucial du FAK dans le maintien des fonctions des CSM et fournissent la preuve que la dysrégulation du FAK dans les CSM contribue à la perturbation de l'hématopoïèse et éventuellement à la progression des tumeurs malignes myéloïdes. Une meilleure compréhension du rôle que joue le microenvironnement du SMD et de la LAM permettra de mieux reconnaître les patients à faible risque et de mettre au point des traitements ciblant les CSM défectueuses, améliorant ainsi le résultat clinique / FAK is a cytoplasmic tyrosine kinase that regulates diverse cellular processes, including survival, proliferation, differentiation, and motility. Though various studies have demonstrated the importance of FAK in MDS and AML pathogenesis, the role of this molecule in MDS and AML tumor microenvironment remained to be further determined. By examining BM MSCs derived from MDS and AML patients, we have observed a continues increase of FAK expression and activation during MDS progression to AML, similar to those detected in hemopoietic counterparts. In LR-MDS, MSCs were found to be characterized by low FAK expression and activation. They exhibited altered morphology, immunophenotype, differentiation, and expression of hematopoiesis-supporting factors. Of note, these features could be largely reproduced in normal MSCs by FAK inhibition. Furthermore, FAK depletion in BM stromal cell line could induce massive expansion and apoptosis of normal HSPCs. Our results highlight a critical role of FAK in maintaining the functions of BM MSCs and provide evidence that dysregulation of FAK in MSCs contribute to the disturbed hematopoiesis and possibly the progression of myeloid malignancies. A greater understanding of the role that BM microenvironment plays in MDS and AML will enable an increased recognition of poor-risk patients and the development of therapies that target the defected MSCs, thereby improving the clinical outcome

La leucémie est une forme de cancer qui affecte les cellules du système hématopoïétique. Selon la lignée cellulaire affectée et la vitesse de développement du cancer, la leucémie peut être myéloïde ou lymphoïde, aiguë ou chronique, respectivement. Chez les enfants, elles sont souvent caractérisées par la présence de translocations chromosomiques, impliquant notamment le gène KMT2A. L'impact biologique de ces fusions de gènes, connues pour être des perturbateurs épigénétiques, est encore mal compris. Afin d’étudier spécifiquement les conséquences de la présence de fusion impliquant le gène KMT2A, un modèle leucémique humain chez la souris a été mis en place. Le modèle utilisé consiste à induire de manière rétrovirale l’expression d’une fusion oncogénique dans des cellules souches hématopoïétiques et progénitrices d’un unique donneur sain. Ces cellules sont ensuite injectées dans des souris immunodéficientes pour produire une leucémie aiguë myéloïde ou lymphoïde après quelques semaines. L’utilisation de ce modèle leucémique vise à définir les gènes qui sont régulés de manière épigénétique et essentiels dans le processus de leucémogenèse médié par une translocation chromosomique faisant intervenir le gène KMT2A. La première partie des travaux cartographie les changements génétiques et épigénétiques à chacun des stades de la leucémogénèse causée par la fusion KMT2A-MLLT3. Nous avons cartographié les changements épigénétiques tels que la méthylation de l’ADN (Methyl-seq), les modifications des histones (ChIP-seq) et l’accessibilité de la chromatine (ATAC-seq), puis les avons corrélés avec les niveaux d’expression des gènes (RNA-seq). Nous avons observé que les leucémies myéloïdes aiguës présentent un phénotype global d'hypométhylation tandis que les changements d'expression après l'addition de la fusion ont mis en évidence l’inactivation de gènes associés aux cellules souches et des altérations dans d'autres gènes impliqués dans la leucémogenèse tels que S100A8/9. Nos données d’ATAC-seq ont montré qu'il y avait relativement peu de changements spécifiques à la leucémie myéloïde aiguë et que la grande majorité correspondait à des régions de chromatine ouvertes et à des régions contenant des motifs pour des facteurs de transcription précédemment observés dans d'autres types de cellules sanguines. L’analyse des marques d’histones associées à des promoteurs actifs suggère également un potentiel rôle du récepteur CCR1 et de son ligand spécifique CCL23. Finalement, nos résultats suggèrent que la transformation leucémique par la fusion KMT2A-MLLT3 implique des modifications épigénétiques minimes qui requièrent également la coopération des réseaux transcriptionnels utilisés dans les cellules sanguines normales. La deuxième partie de cette thèse s’intéresse à la fusion de gènes KMT2A-MLLT4, une translocation chromosomique peu étudiée mais pour laquelle le pronostic vital des patients est connu pour être défavorable et pire que celui des patients porteurs de la fusion KMT2A-MLLT3. L’extension de notre modèle à la fusion KMT2A-MLLT4 nous permet d’appliquer les mêmes approches que précédemment et de détailler les différences génétiques et épigénétiques entre ces deux fusions, jusqu’à maintenant jamais caractérisées. Nous avons pu observer une baisse globale d’expression dans un groupe de gènes intervenant dans les processus ribosomaux et traductionnels. Par ailleurs, PROM1 (CD133) fait office de potentiel candidat biomarqueur permettant la distinction entre ces deux translocations chromosomiques tandis que le gène LPL pourrait jouer un rôle dans la leucémogenèse médiée par la fusion de gènes KMT2A-MLLT4. En conclusion, l’étude des mécanismes à chacun des stades du développement leucémique nous a fourni une meilleure compréhension des changements épigénétiques intervenant dans le processus de leucémogenèse causé par des réarrangements de type KMT2A. Une meilleure caractérisation de la pathophysiologie de la leucémie pourrait permettre d’explorer des avenues thérapeutiques plus ciblées. / Leukemia is a form of cancer that affects blood cells. Depending on the affected cell lineage and the rate at which the cancer grows, leukemia can be myeloid or lymphoid, or acute or chronic, respectively. In children, they are often characterized by the presence of chromosomal translocations, in particular involving the KMT2A gene. The biological impact of these gene fusions, known to be epigenetic disruptors, is still poorly understood. To study the consequences of the presence of gene fusions involving KMT2A, we have developed a human leukemia model. The model consists of transducing hematopoietic stem and progenitor cells (CD34+) from a single healthy donor with a retrovirus bearing an oncogenic fusion. These cells are injected into immunodeficient mice to produce acute myeloid or lymphoid leukemia after a few weeks. By using this model, we aim to define genes that are epigenetically regulated and essential in the process of leukemogenesis mediated by KMT2A gene fusions. The first part of this thesis characterized the genetic and epigenetic changes at each step of leukemogenesis caused by KMT2A-MLLT3 gene fusion. We investigated epigenetic changes such as DNA methylation (Methyl-seq), histone marks (ChIP-seq), and chromatin accessibility (ATAC-seq) and correlated these with expression changes (RNA-seq). We observed that acute myeloid leukemias exhibit a profound hypomethylation phenotype while expression changes after addition of the fusion highlighted the loss of stem cell associated genes and alterations in other genes implicated in leukemogenesis such as S100A8/9 in the early stages of leukemic transformation. Our ATAC-seq data showed that there were relatively few changes specific to acute myeloid leukemia and that the vast majority corresponded to open chromatin regions and clusters of transcription factors previously seen in other types of blood cells. Examination of ChIP-seq data for active histone marks revealed that leukemia specific expression of the chemokine CCL23 can enable autocrine signalling through its cognate receptor, CCR1. Our results suggest that KMT2A-MLLT3 induces minimal changes in the epigenome while co-opting the normal transcriptional machinery to drive leukemogenesis. The second part of this thesis focuses on KMT2A-MLLT4 gene fusion, another chromosomal translocation for which the vital prognosis of patients is known to be worse than that of patients carrying the KMT2A-MLLT3 fusion. The extension of our model to the KMT2A-MLLT4 fusion allows us to apply the same approaches and to characterize the genetic and epigenetic differences between these two different leukemias. We were able to observe a dramatic decrease in the expression level of a group of genes involved in ribosomal and translational processes. Furthermore, PROM1 (CD133) acts as a potential biomarker candidate which might be used to make the distinction between these two leukemias. LPL gene might play a role in leukemogenesis mediated by KMT2A-MLLT4 gene fusion. In conclusion, studying the mechanisms at each stage of leukemic development has provided us with a better understanding of the epigenetic changes involved in the process of leukemogenesis mediated by KMT2A rearrangements. A better characterization of the pathophysiology of leukemia could make it possible to eventually develop more targeted therapeutic treatments.

La leucémie lymphoblastique aiguë à cellules T (LLA-T) figure parmi les cancers infantiles les plus fréquents, représentant environ 15 % des cas de leucémie lymphoblastique aiguë pédiatrique et 25 % des cas chez les adultes. Cette maladie se caractérise par un blocage de la différenciation dans la lignée T et une accumulation de lymphoblastes non fonctionnels. Au cours des dernières décennies, les taux de survie se sont améliorés grâce à des protocoles de chimiothérapie agressifs. Cependant, ce traitement est associé à des effets secondaires graves qui affectent la qualité de vie des patients et imposent un fardeau important à leurs familles. De plus, les rechutes présentent un mauvais pronostic. Des travaux antécédents au laboratoire ont montré comment les oncogènes SCL et LMO1 reprogramment les thymocytes immatures au stade DN3 en cellules souches pré-leucémiques qui s’auto-renouvelent (pré-LSC). Les pré-LSCs sont à l'origine de la leucémie, elles sont résistantes à la chimiothérapie et causent des rechutes. Les pré-LSCs dépendent autant des oncogènes initiateurs que des signaux provenant de l'environnement thymique qui activent la voie NOTCH1/MYC. Finalement, un crible de petites molécules visant à inhiber les pré-LSCs dans leur niche a permis d’identifier le 2-MeOE2 comme un composé qui tue les pré-LSCs et diminue les niveaux de la protéine MYC. Dans cette thèse, nous avons cherché à comprendre les mécanismes de régulation de MYC dans les cellules pré-LSC, en utilisant le 2-MeOE2 comme outil pour des approches complémentaires pharmacologiques, génétiques et biochimiques. Ces stratégies nous ont amené à définir l'importance fonctionnelle d'affiner la régulation de MYC dans les cellules pré-LSC. Ainsi, la déstabilisation de MYC via une dégradation protéasomale affecte la viabilité des cellules pré-LSC, tandis qu'un MYC résistant au protéasome induit une signature génétique apoptotique et de sénescence. Ainsi, nos données expliquent l’absence de mutations MYC dans les leucémies LLA-T. Exploitant la capacité de 2-MeOE2 à réduire les niveaux de MYC, nous avons combiné ce médicament avec les principaux agents de chimiothérapie dans la LLA-T. Nos résultats démontrent que, tant dans un modèle murin de leucémie que dans des essais précliniques utilisant des échantillons primaires de leucémies humaines, 2-MeOE2 sensibilise les cellules pré-LSC et les cellules leucémiques à la chimiothérapie. Finalement, le crible de viabilité des pré-LSCs nous a permis aussi d’Identifier des inhibiteurs de la co-chaperone de type HSP90, Cdc37, qui réduisent les niveaux de DL1, le ligand de NOTCH1, exprimés par le stroma, et représentent ainsi de nouveaux régulateurs cellulaires non autonome de l'activité d'auto-renouvellement des cellules pré-LSCs. En effet, plusieurs inhibiteurs agissant sur CDC37/HSP90 in vitro et in vivo reproduisent le phénotype induit par la déplétion de Cdc37, y compris l'inhibition de l'activité des cellules pré-LSC. En conclusion, cette thèse met en lumière le potentiel de la dégradation de MYC en tant qu'approche prometteuse pour améliorer le traitement de la LLA-T en combinaison avec une chimiothérapie standard. De plus, une nouvelle stratégie ciblant le stroma thymique avec des inhibiteurs de Cdc37/Hsp90 a émergé, offrant une nouvelle approche pour inhiber les cellules pré-LSC. Ces découvertes font progresser notre compréhension de la LLA-T et ouvrent des perspectives pour des traitements plus efficaces et moins onéreux, dans le but ultime d'améliorer la qualité de vie des patients et les résultats du Traitement. / T acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) is a common type of childhood cancer, representing approximately 15% of paediatric and 25% of adult Acute Lymphoblastic Leukemia cases. This disease is characterized by differentiation arrest in the T-lineage and excessive accumulation of non-functional lymphoblasts. During the last decades, survival rates have improved due to the intensification of chemotherapy regimens. However, we reached the limits of intensification, due to severe secondary effects that reduce the quality of life of patients and impose a burden on their families. Moreover, disease relapse is of poor outcomes. Previous work in the laboratory showed that the SCL and LMO1 oncogenes reprogram immature thymocytes at the DN3 stage into self-renewing pre-leukemic stem cells (pre-LSCs). Mechanistically, we showed that pre-LSCs depend on both the initiating oncogenes and the signals that these cells receive from the thymic microenvironment, triggering the NOTCH1/MYC pathway. Pre-LSCs give rise to leukemia, are chemoresistant and cause relapse. Previously, in a niche-based pre-LSCs inhibition screen we identified 2-MeOE2 as a compound that kills pre-LSCs and downregulated MYC. In this thesis, we aim to understand the mechanisms of regulation of MYC in pre-LSCs, using 2-MeOE2 as a tool compound for complementary pharmacological, genetic and biochemical approaches. These strategies led us to define the functional importance of fine-tuning MYC regulation in pre-LSCs. Indeed, destabilizing MYC via proteasomal degradation is lethal for pre-LSCs whereas a proteasome resistant MYC induces a senescent and apoptotic gene signature. Our results are consistent with the lack of MYC mutations in T-ALL, despite MYC essentiality. Then, we leveraged the capacity of 2-MeOE2 to decrease MYC levels and combined this drug with the main chemotherapeutic agents in T-ALL. We show that 2-MeOE2 sensitizes pre-LSCs to chemotherapy in our genetic model of leukemia and in pre-clinical models using primary human T-ALL samples xenografted in immune-deficient mice. Additionally, the niche-based viability screen identified a cluster of compounds that target the HSP90 co-chaperone CDC37, causing decreased expression of the NOTCH1 ligand, DL1 in the stroma, and therefore, decreased pre-LSC viability. Indeed, several inhibitors acting on CDC37/HSP90 both in vitro and in vivo reproduce the phenotype induced by depletion of Cdc37, including the inhibition of pre-LSC activity. Therefore, our work identified noncell autonomous inhibitors of pre-LSC self-renewal by their capacity to regulate DL1 in stroma cells. In conclusion, this thesis shed light on the potential of MYC degradation as a promising approach to enhance T-ALL treatment when combined with standard chemotherapy. Additionally, targeting the thymic stroma with CDC37/HSP90 inhibitors emerged as novel means to inhibit pre-LSCs. Collectively, these findings advance our understanding of T-ALL and open up avenues for more effective and less burdensome treatments, ultimately aiming to improve patient quality of life and treatment outcomes.

La 5-azacytidine (AZA) est un médicament approuvé pour le traitement des leucémies myéloïdes aiguës des patients qui ne sont pas éligibles à une greffe de cellules souches hématopoïétiques. Bien que l’AZA est augmenté significativement le pronostic des patients, le mécanisme d’action précis de l’AZA demeure nébuleux. En plus de son activité d’hypométhylation, il a été montré que l’AZA a aussi des effets immunologiques. Des études précédentes suggèrent que ces réponses immunitaires sont causées par des modifications du répertoire de peptides présentés par le CMH-I (MAPs), dont l’expression de MAPs dérivés de rétroéléments endogènes (EREs) et des cancer-testis antigens (CTAs). Ces gènes sont généralement réprimés par la méthylation de l’ADN. Dans cette thèse, nous avons testé cette hypothèse à l’aide de séquençage à haut débit et de spectrométrie de masse appliqués à quatre lignées cellulaires d’AML différentes. Notre approche protéogénomique d’avant-garde a révélé que l’AZA induit la présentation de MAPs dérivés de CTAs, mais pas d’EREs, malgré le fait que ces deux groupes de séquences soient surexprimés au niveau transcriptomique. Ces résultats indiquent que les réponses des lymphocytes T observées chez les patients suite au traitement à l’AZA dépendent probablement des MAPs dérivés des CTAs, et non pas des EREs. Les EREs stimulés par l’AZA ont tout de même un impact sur la réponse immunitaire en formant des ARN double-brins menant à une activation de l’immunité innée. L’incorporation de l’AZA et l’inhibition subséquente de la DNMT2 mène cependant à des agrégats protéiques et à l’autophagie, qui dégrade les transcrits EREs et limite leur surexpression. Nous avons démontré que les effets immunologiques de l’AZA peuvent être amplifiés par un traitement combiné de l’AZA et d’inhibiteurs de l’autophagie. De plus, le travail contenu dans cette thèse a montré que bien qu’elles soient un modèle expérimental pratique, les lignées cellulaires ont des limitations et doivent être utilisés avec prudence. Des différences majeures ont été observées entre des lignées cellulaires supposément identiques provenant de fournisseurs établis. Nos analyses ont permis de démontrer quelle lignée cellulaire était la plus similaire à la lignée parentale. Ainsi, ce travail fourni des recommandations pour améliorer les lignes directrices d’utilisation des lignées cellulaires en recherche. / 5-azacytidine (AZA) is approved for the treatment of acute myeloid leukemia (AML) patients ineligible for hematopoietic cell transplantation. Although AZA treatment has substantially improved patient outcomes, there remains a lack of clear understanding of the mechanisms driving these responses. In addition to its hypomethylating activity, AZA has been shown to have immunological effects. Previous reports suggest that these immune responses occur due to alterations in the repertoire of MHC-I-associated peptides (MAPs), including the expression of MAPs deriving from endogenous retroelements (EREs) and cancer-testis antigens (CTAs). These genes are typically silenced by methylation. With this thesis, we aimed to test this hypothesis using high-coverage RNA sequencing and mass spectrometry in four different AML cell lines. Our state-of-the-art proteogenomic approach uncovered that AZA treatment induced MAPs deriving from CTAs, but not EREs, despite both being upregulated at the RNA level. This indicates that T-cell responses post-AZA treatment are more likely to be dependent on CTA- than ERE-derived MAP presentation. AZA-induced EREs produced at the RNA level still contributed to immune responses by forming double-stranded RNA leading to a state of viral mimicry. However, AZA incorporation into RNA and subsequent DNMT2-inhibition led to protein aggregation and autophagy responses. These responses were responsible for degrading EREs, which limited their upregulation. We further demonstrate that the immune effects of AZA can be enhanced by the combination of AZA with autophagy inhibitors. Additionally, the work in this thesis has shown that although a practical model, cell lines have their caveats and must be used with caution. This work has highlighted the grave discrepancies between supposedly identical cell lines supplied by established repositories. Moreover, our analyses determine which of the two is closer to the parental cell line. Finally, this work provides recommendations for improving the current guidelines for cell line-based research.

Contexte : Chaque année de multiples enfants guérissent des cancers pédiatriques, principalement de la leucémie lymphoblastique aiguë (LLA), le cancer le plus important chez les enfants. Ces enfants sont à risque de plusieurs comorbidités à la suite des traitements contre le cancer qui peuvent nuire à leur qualité de vie. La cardiotoxicité est la comorbidité la plus fréquente. Les maladies cardiaques découlant de cette cardiotoxicité sont la cause de décès non cancéreuse la plus fréquente chez les enfants survivants de cancer. La cardiotoxicité est une maladie hétérogène avec de multiples présentations cliniques et des mécanismes physiopathologiques qui ne sont pas encore totalement compris. L’exposition du cœur et des tissus adjacents à la radiothérapie et à la chimiothérapie peut induire des lésions cardiaques en entraînant une dégénérescence des cardiomyocytes qui mène éventuellement à la mort des cardiomyocytes. La perte progressive des cardiomyocytes fonctionnels entraîne un remodelage ventriculaire pathologique, dont les symptômes peuvent ne pas se manifester immédiatement. À un certain stade, les cardiomyocytes restants ne peuvent plus compenser pour les demandes cardiaques, ce qui cause l’apparition initiale de la dysfonction diastolique et de l’apparition ultérieure de la dysfonction systolique et de l’insuffisance cardiaque. La détection précoce des lésions cardiaques est donc devenue une nécessité pour réduire le risque et le fardeau de la cardiotoxicité chez les survivants de LLA pédiatrique. Il est possible que les paramètres de dépistage actuels sous-estiment le risque chez les survivants du cancer et qu'une évaluation cardiaque plus large soit nécessaire. L’électrocardiogramme est un test utilisé pour évaluer la fréquence et le rythme cardiaques et permet de montrer des signes précoces de dommages cardiaques sous cliniques. Il peut montrer des arythmies, des changements plus subtiles qui précèdent les arythmies ou des changements ischémiques. L'évaluation cardiaque en situation de stress peut également révéler un dysfonctionnement myocardique. Ce qui nous mène à nous poser les questions suivantes : Quelle est la prévalence des anomalies à l’électrocardiogramme à la suite des traitements contre le cancer chez les survivants de LLA pédiatrique ? Est-ce que la cardiotoxicité entraîne des anomalies de la fréquence cardiaque à l’effort ? Est-ce que l’électrocardiogramme à l’effort permet d’identifier des anomalies de la repolarisation ventriculaire qui n’apparaissent pas au repos ? L’objectif est de détecter les anomalies à l’électrocardiogramme au repos et à l’effort pour améliorer la détection précoce de la cardiotoxicité. Résultats principaux : Nous avons confirmé l'apparition d'anomalies de l’électrocardiogramme, notamment des anomalies de la fréquence cardiaque, des intervalles QTc prolongés, des modifications de l'onde ST-T, des ondes Q pathologiques, des arythmies, des troubles de la conduction et des voltage QRS bas, qui étaient associés au traitement de la LLA pédiatrique. Les anomalies de la fréquence cardiaque pendant l’effort et à l’effort maximal sont fréquentes dans notre cohorte de 251 survivants de LLA pédiatrique. Nous avons montré que la majorité des survivants de LLA pédiatrique ont une fréquence cardiaque anormale au maximum de leur effort. Certains participants présentaient aussi de l’incompétence chronotrope, ce qui est une condition anormale pour de jeunes adultes. Nous avons identifié des allongements de l’intervalle QT au repos, mais davantage à l’effort. Nous avons également comparé l’utilisation de différentes approches pour la correction de l’intervalle QT afin d’avoir une évaluation précise de l’intervalle QTc. Conclusions : L’épreuve d’effort avec un électrocardiogramme est un moyen non invasif et rentable d'évaluer l'activité électrique cardiaque, permettant de détecter des changements subtils qui peuvent indiquer une cardiotoxicité sous-jacente. Cette recherche est cruciale pour s'assurer que les survivants de LLA pédiatrique vivent non seulement plus longtemps, mais qu'ils mènent également une vie saine et épanouie. / Backgrounds: Every year, many children recover from pediatric cancers, especially acute lymphoblastic leukemia (ALL), the most common childhood cancer. These children are at risk of several comorbidities following cancer treatment, which can adversely affect their quality of life. Cardiotoxicity is the most frequent comorbidity. Heart disease is the most common non-cancerous cause of death in childhood cancer survivors. Cardiotoxicity is a heterogeneous disease with multiple clinical presentations and often poorly understood pathophysiological mechanisms. It can lead to electrophysiological dysfunction and morphological and functional alterations. Exposure of the heart and surrounding tissues to radiotherapy and chemotherapy can induce cardiac lesions, leading to cardiomyocyte degeneration and eventually leading to cardiomyocyte death. Continued loss of functional cardiomyocytes leads to pathological ventricular remodeling, the symptoms of which may not be immediately apparent. At a certain stage, the remaining cardiomyocytes can no longer compensate for cardiac demands. This leads to the initial onset of diastolic dysfunction and the subsequent development of systolic dysfunction and heart failure. Early detection of cardiac damage has therefore become a key to reducing the risk and burden of cardiotoxicity in pediatric ALL survivors. It is possible that current screening parameters underestimate risk in pediatric cancer survivors and that a broader cardiac evaluation is required. An electrocardiogram is a test used to assess heart rate and rhythm and may show early signs of subclinical cardiac damage in pediatric cancer survivors who have received cardiotoxic treatments. The electrocardiogram can show cardiotoxicity through arrhythmias, the more subtle changes that precede arrhythmias, or ischemic changes. Stress cardiac evaluation can also reveal myocardial dysfunction. This leads us to ask the following questions: What is the prevalence of electrocardiogram abnormalities following cancer treatment in pediatric ALL survivors? Does cardiotoxicity lead to heart rate abnormalities during exercise? Does the exercise electrocardiogram identify ventricular repolarization abnormalities caused by cardiotoxicity that do not appear at rest? The aim is to detect electrocardiogram abnormalities at rest and during exercise to improve early detection of cardiotoxicity. Main results: We confirmed the occurrence of electrocardiogram abnormalities, including heart rate abnormalities, prolonged QTc intervals, ST-T wave changes, pathological Q waves, arrhythmias, conduction disturbances and low QRS voltage, which were associated with treatment of pediatric ALL. Heart rate abnormalities during exercise and at maximal effort are common in our cohort of 251 pediatric ALL survivors. We showed that the majority of pediatric ALL survivors have an abnormal heart rate at peak exertion. Some participants also exhibited chronotropic incompetence, which is an abnormal condition for young adults. We identified QT interval prolongations at rest, but more so during exercise. We also compared the use of different approaches to QT correction in order to obtain an accurate assessment of the QTc interval. Conclusions: Exercise testing with an electrocardiogram is a non-invasive and cost-effective means of assessing cardiac electrical activity, allowing detection of subtle changes that may indicate underlying cardiotoxicity. This research is crucial to ensuring that pediatric ALL survivors not only live longer, but also lead healthy, fulfilling lives.

Malgré l’amélioration du taux de survie, les survivants de la leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) pédiatrique souffrent toujours de séquelles de la maladie et des traitements, dont au niveau neuromusculosquelettique (NMSQ). L’objectif de ce mémoire était de décrire les déficiences, limitations d’activité et restrictions de participation que présentent les survivants de LAL pédiatrique à long terme ainsi que d’explorer la prise en charge usuelle en physiothérapie de ces séquelles NMSQ. Le premier article est un d’étude descriptive rétrospective. Les résultats de cette étude supportent les séquelles NMSQ documentées dans la littérature en plus d’apporter des précisions sur les différences entre les survivants présentant ou non une ostéonécrose de la hanche. Le niveau d’association a également été évalué entre certaines variables de déficiences et limitations d’activité. Le second article est une étude de cas unique. Cette étude a permis de constater que, bien que les physiothérapeutes d’un des centres spécialisés en hémato-oncologie pédiatrique du Québec soient expertes dans le domaine, il n’existe actuellement aucune prise en charge standardisée des séquelles NMSQ des survivants de la LAL à long terme. L’identification des barrières et facilitateurs à l’implantation d’une prise en charge perçue comme optimale par les physiothérapeutes apporte des pistes de solution pertinentes à l’amélioration des pratiques. Les projets de recherche présentés dans ce mémoire permettent de constater que les déficiences et les limitations d’activité des survivants de la LAL pédiatrique sont importantes. Les physiothérapeutes sont parmi les détenteurs d’enjeux clés dans l’optimisation de la prise en charge de cette population grandissante. / Although survival rate has improved, survivors of childhood acute lymphoblastic leukemia (cALL) still suffer from late adverse effects related to the disease and its treatment including neuromusculoskeletal (NMSK) morbidities. The aims of this research were to describe the impairments, activity limitations, and participation restrictions of long-term survivors of cALL and explore current physiotherapy clinical practice regarding these NMSK late adverse effects. The first manuscript is a retrospective descriptive study. Results of this study confirm the long-term NMSK late adverse effects documented in the literature and provide additional information about differences between survivors with and without hip osteonecrosis. Furthermore, relationships between some variables of impairments and activity limitations were identified. The second manuscript is a case study. A focus group with expert physiotherapists in pediatric hemato-oncology from a specialized centre revealed that standardized clinical practice guidelines for the management of long term NMSK late adverse effects of survivors of cALL are lacking. Identification of barriers and facilitators to the implementation of clinical practice perceived as optimal by physiotherapists provides relevant solutions to improve long-term care of this population. Findings from these studies highlight that impairments and activity limitations of survivors of cALL are important. Physiotherapists are key stakeholders in optimizing long-term care of this growing population.

La leucémie lymphoïde aiguë (ALL) est le cancer pédiatrique le plus fréquent. Une proportion importante de ces cas sont des leucémies lymphoïdes aiguës à cellules T (T-ALL). Présentement, le traitement implique l’utilisation d’une chimiothérapie hautement toxique pour une durée s’échelonnant sur plusieurs années. Bien que la rémission soit possible, les séquelles physiques et psychologiques peuvent être dévastatrices, particulièrement dans un contexte pédiatrique. Des rechutes sont également possibles à long terme. Des approches génétiques, cellulaires et moléculaires ont permis d’identifier le thymocyte au stade DN3 comme étant la cellule à l’origine de la leucémie. En effet, dans les cas où la leucémie est induite par l’expression aberrante de SCL/TAL1, des données ont démontré que les thymocytes au stade DN3 sont reprogrammés en cellules souches pré-leucémiques (pré-LSCs) par l’action du complexe SCL-LMO1. Ces cellules acquièrent par la suite une mutation activatrice de NOTCH1, qui accélère le développement de la leucémie. Le stade DN3 est le point de convergence de signaux collaborant pour favoriser survie, différentiation et prolifération cellulaire. Les deux voies de signalisation principales sont celles de NOTCH1 et du pré-TCR. Ces deux signaux sont connus pour jouer un rôle tant au stade pré-leucémique qu’en progression au stade leucémique. Alors qu’il était connu que NOTCH1 était en mesure d’augmenter la fréquence des pré-LSCs, nos travaux révèlent que le pré-TCR favorise leur expansion clonale. Nous démontrons également que les effecteurs de NOTCH1 et du pré-TCR dans les pré-LSCs sont la voie mTOR et la voie de ERK, respectivement. Ces voies de signalisation peuvent être ciblées pharmacologiquement par le Trametinib (inhibiteur MEK1) et le Dactolisib (inhibiteur PI3K/mTOR), menant à un effet additif avec la chimiothérapie (VXL : Vincristine, Dexaméthasone et L-asparaginase) sur les pré-LSCs en essais ex vivo. Nous démontrons également que le Trametinib est synergique avec VXL contre des blastes humains de T-ALL en essais ex vivo. Les résultats de cette même association sont encourageants en essais in vivo de xénogreffe de blastes humains de T-ALL chez des souris immunosupprimées. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common childhood cancer. T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) accounts for a significant portion of these cases. The current standard of care unfortunately involves the use of highly toxic chemotherapy over multiple years. In spite achievement of high remission rate, the life-long physical and psychological sequalae are devastating and cannot be overlooked, especially in the pediatric setting. Genetic, cellular, and molecular approaches have identified thymocyte at the DN3 stage of differentiation as the cell of origin of leukemia. When leukemia is induced by aberrant expression of SCL/TAL1, data show that DN3 cells are reprogrammed into self-renewing pre-leukemic stem cells (pre-LSCs) by the action of the SCL-LMO1 complex. Then, reprogrammed cells gain a NOTCH1 gain-of-function mutation that speeds up development of leukemia. Interestingly, the DN3 stage is a point at which multiple collaborating signals converge to drive cell survival, differentiation, and proliferation. The two main signaling pathways operating at the DN3 stage are NOTCH1 and the pre-TCR. Both signals are recognized for playing a role in leukemogenesis, both at the pre-leukemic stage and in the transition to acute leukemia. While it was known that NOTCH1 increases pre-LSC frequency, we demonstrate herein that pre-TCR promotes pre-LSC clonal expansion. Additionally, we provide evidence that the mTOR pathway and the ERK pathway are effectors of NOTCH1 and pre-TCR signaling, respectively. These pathways can be targeted pharmacologically with Trametinib (MEK1 inhibitor) and Dactolisib (PI3K/mTOR inhibitor), leading to additive effects on pre-LSC viability when combined with chemotherapy (VXL: Vincristine, Dexamethasone and L-asparaginase) in ex vivo assays. We also demonstrate that association of VXL with Trametinib is synergistic against primary human leukemic blasts in ex vivo assays. Results from in vivo testing of this association through patient-derived xenografts (PDX) conducted on immunocompromised mice look promising.

L’ostéonécrose (ON) et les fractures (FR) sont des complications qui prennent de plus en plus place dans le traitement pédiatrique de la leucémie aiguë lymphoblastique (LAL). L’ON peut être causée par différents facteurs, dont principalement l’utilisation de glucocorticoïdes. Les glucocorticoïdes sont administrés lors du traitement de la leucémie dans le but d’initier l’apoptose des cellules malignes tout en ayant un effet anti-inflammatoire. Cependant, l’utilisation de ces corticostéroïdes comprend des effets secondaires sérieux, notamment le développement d’ostéonécrose. Des variantes génétiques peuvent mettre certains patients plus à risque que d’autres. Plusieurs gènes ont déjà été signalés comme régulés par les actions glucocorticoïdes (GC). Les variations génétiques présentes dans les régions régulatrices de ces gènes peuvent affecter leur fonctionnement normal et, en fin de compte, de déterminer un risque accru de développer l’ON associé au traitement contre la leucémie. Pour cette raison, plusieurs polymorphismes ont été identifiés et étudiés dans la cohorte QcALL de Ste-Justine, concernant les gènes suivants : ABCB1, ACP1, BCL2L11, NFKB1, PARP1, et SHMT1. Ces gènes jouent majoritairement un rôle dans les mécanismes d’action des glucocorticoïdes, mais quelques-uns ont plutôt un effet direct sur le développement d’ostéonécrose. Nos recherches ont démontré une corrélation entre ces polymorphismes et l’apparition d’ostéonécrose chez les patients de la cohorte QcALL, traités aux glucocorticoïdes. L'incidence cumulative de l'ostéonécrose a été évaluée rétrospectivement chez 305 enfants atteints de la leucémie qui ont subi un traitement à l’hôpital Ste-Justine selon les protocoles DFCI de Boston (87-01, 91-01, 95-01 et 2000-01). Parmi les huit polymorphismes de BCL2L11 étudiés, les 891T> G (rs2241843) et 29201C> T (rs724710) ont été significativement associés à ON (p = 0.01 et p = 0.03, respectivement). L'association du polymorphisme 891T> G a été modulée par le type de corticostéroïde (CS), l’âge, le sexe et le groupe à risque (p ≤ 0,05). Le polymorphisme 29201C> T était particulièrement apparent chez les patients à haut risque (p = 0,003). La même étude était conduite en parallèle sur des patients de la cohorte DFCI de Boston (N = 192), et montrait des résultats significatifs pour les polymorphismes étudiés. En conclusion, les résultats de cette étude permettront de confirmer l’association de ces polymorphismes au développement d’ON chez les patients de LLA traités aux GC. / Osteonecrosis (ON) and fractures (FR) are complications that take place in the treatment of children acute lymphoblastic leukemia (cALL). They can be caused by various factors, mainly using glucocorticoids. The corticosteroids, dexamethasone (DXM) and prednisone (PDN) are administered during the treatment of leukemia to initiate apoptosis of malignant cells; while having an anti-inflammatory effect. However, the use of these corticosteroids has severe side effects, including the development of osteonecrosis. Moreover, some patients develop resistance to treatment, and are at risk of developing side effects. The genetic variants predispose some patients at higher risk than others. Several genes have been previously reported as up- or down regulated by the GCs actions. The genetic variations present in gene coding or regulatory regions can affect their function and ultimately determine an increased risk of developing ON associated to ALL therapy. Therefore, we investigated the association between several single nucleotide polymorphisms (SNPs) in six candidate genes: BCL2L11, NFKB1, PARP1, ABCB1, ACP1, and SHMT1. These genes play a role in the mechanisms of action of glucocorticoids, but some have more of a direct effect on the development of osteonecrosis. Our research has shown a correlation between these polymorphisms and the occurrence of osteonecrosis in patients in the QCALL cohort, treated with glucocorticoids. Cumulative incidence of osteonecrosis was assessed retrospectively in 305 children with ALL who underwent treatment with DFCI protocols (87-01, 91-01, 95-01 and 2000-01) in childhood ALL cohort from Quebec (QcALL). Among the eight tag BCL2L11 polymorphisms studied the 891T>G (rs2241843) and 29201C>T (rs724710) were significantly associated with ON (p = 0.01 and p = 0.03, respectively). Association of 891T>G polymorphism was modulated by type of corticosteroid (CS), age, sex and risk group (p ≤ 0.05 and that of 29201C>T was particularly apparent among high risk (p = 0.003) patients. These polymorphisms have shown significant ON association in several QcALL risk groups, mainly in corticosteroid groups, age < 10 years, and high risk (HR) group. Furthermore, the same study was conducted in parallel with patients in the replication (DFCI) cohort (N = 192), and we showed significant genetic association results for all studied polymorphisms. In conclusion, this study identifies that some ALL children have a high incidence of ON during the treatment that is highly associated with polymorphisms in different genes regulated by corticosteroids and ALL prognostic factors.