Las paredes celulares de levadura (PCL) de S. cerevisiae vienen siendo utilizadas en avicultura por hace más de una década, algunas de las finalidades de esta práctica son las de mejorar la productividad y salud del ave. Los polisacáridos tipo beta-glucanos y mánanos presentes en la PCL, pueden ejercer efectos en el sistema inmune del pollo y exclusión de patógenos a escala digestiva. No obstante, debido a que la industria de la fermentación genera gran diversidad levaduras y PCL de diferente origen y características, el estudio acerca del mejor conocimiento y definición de estos nuevos aditivos puede ser clave para optimizar su utilización alimentación animal. En la presente tesis, se realizaron 6 experimentos (Exp.) con pollos de engorde machos (Ross 308) con el objetivo de evaluar las respuestas en la productividad y la salud de las aves al proporcionarles dietas elaboradas con maíz o trigo-cebada-centeno (TCC), con diferentes levaduras activas de S. cerevisiae (pecuario, panadería y "killer" vinícola) y sus componentes: 2 distintas paredes celulares de levadura (PCL), extractos, beta-glucanos (BG) y manano-proteínas (MP), en ninguno de los experimentos se emplearon aditivos en el alimento de tipo antibióticos, coccidiostatos o enzimas. En los Exp. 1 y 2, se observo que las características propias de las distintas levaduras de S. cerevisiae y de sus componentes (extractos y PCL), así como el tipo de dieta empleada (TCC o maíz), adquieren importantes implicaciones en las respuestas que pueden ejercer en el animal. Las PCL-2 derivada de la producción de extractos de levadura, y con mayor contenido de MP y BG, adicionadas (500 mg/kg) en dietas con TCC (Exp. 1) o maíz (Exp. 2), fueron capaces de mejorar el peso vivo y el índice de conversión del ave de forma similar al empleo de avilamicina (0.01 mg/kg alimento). Los distintos aditivos derivados de S. cerevisiae no afectaron claramente variables ileales como la viscosidad, absorción de nutrientes y recuentos bacterianos. En el Exp. 2, se encontró que el empleo de la PCL-2, favoreció el desarrollo de la mucosa digestiva del ave al incrementar la altura, el grosor de la mucina y el número de células caliciformes de las vellosidades del yeyuno (dietas con TCC o maíz). Además, la utilización en la dieta (TCC) de MP y BG purificados de PCL, resultó en mayor altura de las vellosidades de la mucosa del yeyuno (Exp. 3). Por otra parte, el empleo de MP+BG en concentraciones parecidas a las presentes en la PCL-2, representó efectos similares en el peso relativo del timo respecto a la PCL-2 (Exp. 4). La utilización de la PCL-2, MP, BG, o MP+BG en la dieta de pollos, no mostró diferencias claras en la productividad del ave en favor de alguno de los aditivos (Exp.4 y 5). En el Exp. 6, se observo que las PCL-2, incrementaron la reacción de hipersensibilidad cutánea tardía o determinación indirecta de la inmunidad celular en los pollos. Este efecto inmunomodulador de las PCL, pudo brindar beneficios en las pollos sometidos a estrés inflamatorio por la inoculación con lipopolisacárido (LPS) de E. coli, los cuales fueron traducidos en una mejor eficiencia alimenticia y % de peso relativo de la bolsa de Fabricio similares a los observados en pollos control sin estrés inmunitario (no desafiados con LPS). Los resultados de estos experimentos mostraron que las PCL adicionadas a dietas de pollos de engorde pudieron mejorar su eficiencia productiva, parte del mecanismo podría estar relacionado con favorecer el desarrollo de la mucosa digestiva y mantener un mejor estado de inmunocompentencia del ave, situación que puede tener beneficios en ambientes con mayor presencia desafíos microbianos. / The yeast cell walls (YCW) from S. cerevisiae have been used in poultry feeding for more than one decade; some of the purposes of this practice are to improve the chicken productivity and health. The polysaccharides such as beta-glucans and mannans presents in the YCW can exert effects in the immune system of chicken and also pathogen exclusion at digestive scale. However, the fermentation industry generates great diversity of active yeast and YCW from different origin and characteristics thus, the study about the correct definition and origin of these new additives can be necessary to optimize its use animal feeding. In the present thesis, there were carried out six experiments (Exp.) with male broiler chickens (Ross 308), with the objective of evaluating the effects of dietary supplementation of active yeast from S. cerevisiae (pecuary, bakery and "killer" winery) and their components: 2 YCW, extract, beta-glucans (BG) and manno-proteins (MP), to maize and wheat+barley+rye based diets on productivity and health of broiler chickens. In all experimental diets there were not used additives such as antibiotic, coccidiostates and feed enzymes. In the Exp. 1 and 2, It was observed that the own characteristics of different yeast (S. cerevisiae) and its components (extracts and YCW) as well as the type of diet used (TCC or maize) in these experiments, were important in the productive and digestive responses evaluated in the broiler chickens. The YCW-2 from the industrial production of yeast extracts, and with greater content of MP and BG, added (500 mg/kg) to WBR (Exp. 1) and maize (Exp. 2) based diets, improved the live weight and feed conversion ratio of broiler chickens in a similar magnitude to that obtained with dietary avilamycin (0.01 mg/kg feed). The different dietary additives derived from S. cerevisiae did not affect clearly variables at ileal level such as viscosity, bacterial counts and nutrients absorption. In the Exp. 2, the use of YCW-2 in WBR and maize based diets, improved the mucosa development of chickens by increasing the height, the mucin mucus thickness and the number of goblets cells of villous (jejune mucosa). In addition, in WBR based diet, dietary MP and BG purified from YCW, increased the villous height of jejune mucosa (Exp. 3). On the other hand, dietary MP+BG in a similar concentration respect to that present in YCW-2, represented similar effects in the percentage relative thymus weight respect to the dietary YCW-2 use (Exp. 4). The dietary use of YCW-2, MP, BG, or MP+BG in broiler diets did not show clearly differences in the productivity of chickens in favour of some of them (Exp.4 and 5). In the Exp. 6, dietary YCW-2 increased the delayed cutaneous hypersensitivity response or indirect determination of cellular immune response in chickens. This immunomoduladory effect of dietary YCW-2, could bring some benefits to chickens with immunitary stress (challenge with lipopolysaccharide or E. coli-LPS), because chickens fed YCW-2 and challenge with LPS showed similar feed efficiency and percentage relative bursa of Fabricius weighs than those not challenge chickens. The results of these experiments showed that the dietary supplementation with YCW-2 to broiler chickens diets can improve the animal productive performance; part of the mode of acting of dietary YCW could involve favouring intestinal health and maintaining a better state of immune-competence in the chickens. These positive effects can bring some benefits to chickens when raised under stress conditions or in environments causing great microbial challenges.

Las proteínas Ppz1 y Ppz2 de Saccharomyces cerevisiae son Ser/Thr fosfatasas involucradas en diferentes procesos celulares, tales como el mantenimiento de la integridad celular, la tolerancia salina y la regulación del ciclo celular en la transición G1/S. La mayor parte de los fenotipos asociados con la ausencia o la sobreexpresión de las fosfatasas Ppz son la consecuencia de la inhibición que ejercen estas fosfatasas sobre los transportadores de potasio de alta afinidad Trk1/2. En las primeras fases de este trabajo, sólo se había identificado una subunidad reguladora para estas fosfatasas, la proteína Hal3, y aunque el mecanismo mediante el cual ejerce esta inhibición se desconocía, sí se había descrito que esta proteína actúa como inhibidora de Ppz1 y Ppz2 en todas las funciones conocidas de Ppz1 En este trabajo presentamos nuevas dianas biológicas de las fosfatasas Ppz, como son la vía de calcio/calcineurina y el sistema de transporte de potasio de baja afinidad. En primer lugar, describimos que células que carecen de Ppz1 son hipertolerantes a altas concentraciones de sodio o litio debido a un incremento en la expresión del gen ENA1, que codifica el componente principal para la tolerancia salina en la levadura. Este efecto en la expresión de ENA1 es independiente de Trk1/2 pero totalmente dependiente de la vía de señalización de la fosfatasa calcineurina, sugiriendo así que Ppz1 inhibe, directa o indirectamente, la actividad de la calcineurina. Respecto a esta función, demostramos que Ppz1 actúa como un regulador negativo de la entrada de calcio que tiene lugar a través de la membrana plasmática. Por otro lado, células que carecen de Ppz1/2 y Trk1/2 necesitan más potasio para sobrevivir que células que carecen sólo de los transportadores de potasio de alta afinidad, hecho que sugiere que las fosfatasas Ppz son reguladores positivos de la entrada de potasio de baja afinidad Trk-independiente.También hemos identificado una segunda subunidad reguladora de las fosfatasas Ppz, denominada Vhs3. Vhs3 actúa inhibiendo las fosfatasas Ppz de igual modo a como lo hace su homólogo Hal3, aunque este último parece ser más eficiente. Además, demostramos que Hal3/Vhs3 participan en el proceso celular de la floculación. Ambas regulan negativamente la vía de señalización de la PKA que, a través de la activación del factor de transcripción Flo8, induce la expresión de la floculina Flo11 causando la floculación. Este efecto es dependiente de las fosfatasas Ppz y podría ser explicado por la regulación negativa que ejercen éstas sobre los transportadores de potasio Trk1/2.Finalmente, demostramos que Vhs3 y Hal3, que presentan homólogos en plantas y mamíferos, están involucradas en una función esencial que es independiente de su papel sobre Ppz1/2, ya que el doble mutante hal3 vhs3 y el cuádruple mutante hal3 vhs3 ppz1 ppz2 son letales mientras que el mutante ppz1 ppz2 no lo es. Además, la letalidad de la cepa hal3 vhs3 se suprime por la sobreexpresión de otros homólogos de Hal3, como es el caso de AtHal3a de Arabidopsis thaliana, sugiriendo que las funciones de Hal3 y Vhs3 Ppz-independientes están conservadas en otros eucariotas. Experimentos in vitro revelan que la proteína Hal3 de plantas (AtHal3a) cataliza uno de los pasos de la biosíntesis de coenzima A y que para ello requiere de dos residuos: la His90 y la Cys175. Aunque Vhs3 y Hal3 conservan el residuo histidina, no conservan el residuo equivalente a la Cys175, por tanto, no es evidente que esta nueva función sea participar en la síntesis de CoA. / The Saccharomyces cerevisiae Ppz1 and Ppz2 are Ser/Thr protein phosphatases involved in several cell processes, such as maintenance of cell integrity, salt tolerance and regulation of cell cycle at the G1/S transition. Most of the phenotypes associated with the absence or the overexpression of the Ppz phosphatases are the consequence of the inhibition that these phosphatases exert on the Trk1/2 high-affinity potassium transporters. At the early steps of this work, only one regulatory subunit of these phosphatases, Hal3, have been identified and, although its specific mechanism of function is still unknown, it has been described that this protein acts as an inhibitor of Ppz1 and Ppz2 for all the known functions of Ppz1.In this work we report evidences about the existence of other biological targets of the Ppz phosphatases, such as the calcium/calcineurin pathway and the low-affinity potassium uptake. First, we describe that cells lacking Ppz1 are hypertolerant to high concentrations of sodium or lithium due to an increased expression of the ENA1 gene, which codifies the major determinant for salt tolerance in yeast. This effect on ENA1 expression is independent of Trk1/2 but is fully dependent on the calcineurin pathway and suggests that Ppz1 inhibits, either directly or indirectly, the calcineurin activity. Concerning to this function, we reveal that Ppz1 acts as a negative regulator of the calcium import across the plasma membrane. On the other hand, cells lacking Ppz1/2 and Trk1/2 need more potassium than cells lacking only the high-affinity potassium transporters to survive, suggesting that the Ppz phosphatases are positive regulators of the Trk-independent low affinity potassium uptake.We also identify a second regulatory subunit of the Ppz phosphatases, named Vhs3. Vhs3 functions inhibiting the phosphatases Ppz, essentially as its homolog Hal3 does, although the last one seems to work more efficiently. In addition, we demonstrate that Hal3/Vhs3 proteins play a role in the flocculation process. They negatively regulate the PKA signalling pathway which, through the activation of the transcription factor Flo8, induces the expression of the Flo11 flocculine causing the flocculation. This effect is dependent on the Ppz phosphatases and could be explained by their inhibitory activity on Trk1/2. Finally, we demonstrate that Vhs3 and Hal3, which have homologs in both plants and mammals, are involved in an essential function that is independent of their role in regulating Ppz1/2, as the double mutant hal3 vhs3 and the hal3 vhs3 ppz1 ppz2 are lethal whereas the ppz1 ppz2 is not. The lethality of the hal3 vhs3 strain is suppressed by overexpression of other Hal3 homologs, such as the AtHal3a in Arabidopsis thaliana, suggesting that the Ppz-independent functions of Hal3 and Vhs3 are conserved in eukaryotes. In vitro experiments revealed that the plant Hal3 (AtHal3a) is involved in one step of the coenzyme A biosynthesis and that there are two residues completely necessary for this function: His90 and Cys175. Vhs3 and Hal3 have the histidine equivalent to His90, but neither of them possesses the equivalent Cys175 suggesting that the yeast homologs could not be involved in the biosynthesis of CoA.

In the present work we study the metabolic adaptation in response to stress in the yeast model, and more specifically we investigate the regulation of peroxisomal activity and the metabolism of sphingolipids. Peroxisomes are dynamic organelles and the sole location for fatty acid ß-oxidation in yeast cells. Here we find that peroxisomal function is crucial for the adaptation to salt stress, especially upon sugar limitation. Multiple layers of control regulate both peroxisomal activity and number upon stress. Activated Hog1 MAP kinase triggers the induction of genes encoding enzymes for fatty acid activation, peroxisomal import and ß-oxidation through the Adr1 transcriptional activator, which transiently associates with genes encoding fatty acid metabolic enzymes in a stress- and Hog1-dependent manner. Moreover, Na+ and Li+ stress induces an increase in peroxisomal number per cell in a Hog1-independent manner, which depends instead of the retrograde pathway and the dynamin related GTPases Dnm1 and Vps1. The strong activation of the Faa1 fatty acyl-CoA synthetase, which specifically localizes to lipid particles and peroxisomes, indicates that adaptation to salt stress requires the enhanced mobilization of fatty acids from internal lipid stores. Taken together, these results suggest that stress-induced peroxisomal ß-oxidation triggers enhanced respiration upon salt shock. Sphingolipids are regulators of mitochondria-mediated cell death in higher eukaryotes. However, how changes in sphingolipid metabolism and downstream intermediates impinge on mitochondrial function is unknown. Here we found in yeast that within the sphingolipid degradation pathway, the production via Dpl1 and degradation via Hfd1 of hexadecenal is critical for mitochondrial function and cell death. Genetic interventions, which favor hexadecenal accumulation, diminish oxygen consumption rates and increase ROS production and mitochondrial fragmentation and viceversa. The location of the hexadecenal degrading enzyme Hfd1 in punctuate structures all along the mitochondrial network depends on a functional ERMES complex, indicating that modulation of hexadecenal levels at specific ER-mitochondria contact sites might be an important trigger of cell death. This is further supported by the finding that externally added hexadecenal or the absence of Hfd1 enhance cell death caused by human Bax protein. Finally, the induction of the sphingolipid degradation pathway upon stress is controlled by the Hog1 MAP kinase. Therefore the stressregulated modulation of sphingolipid degradation might be a conserved way to induce cell death in eukaryotic organisms. / En el presente trabajo se estudia la adaptación metabólica en respuesta a estrés en el modelo de levadura, y de forma más concreta se investiga la regulación de la actividad peroxisomal y el metabolismo de esfingolípidos. Los peroxisomas son orgánulos dinámicos, encargados de forma específica de la ß-oxidación de ácidos grasos en células de levadura. Aquí se muestra cómo la función peroxisomal es crucial para la adaptación al estrés salino, especialmente en condiciones de ayuno de glucosa. Se regula a múltiples niveles tanto la actividad peroxisomal como su número ante condiciones de estrés. La activación de la MAP quinasa Hog1 desencadena la inducción de genes que codifican enzimas para la activación, importación peroxisomal y ß-oxidación de los ácidos grasos. Esta regulación génica ocurre a través del activador transcripcional Adr1, que se asocia transitoriamente con los genes que codifican enzimas metabólicas de ácidos grasos de una manera dependiente del estrés y de Hog1. Además, el estrés causado por Na+ y Li+, provoca un aumento en el número de peroxisomas por célula de manera independiente de Hog1, que depende a su vez de la ruta retrógrada y de las dinaminas GTPasas Dnm1 y Vps1. La fuerte activación de la acil-CoA sintetasa Faa1, que se localiza específicamente en las partículas lipídicas y los peroxisomas, indica que la adaptación a estrés salino requiere una mayor movilización de ácidos grasos de los almacenes de lípidos internos. Estos resultados indican que la ß-oxidación peroxisomal inducida por estrés desencadena un aumento de la respiración ante el choque salino. Los esfingolípidos son reguladores de la muerte celular mediada por la mitocondria en eucariotas superiores. Sin embargo, se desconoce cómo, cambios en el metabolismo de los esfingolípidos y en intermediarios aguas abajo, afectan a las funciones mitocondriales. En este trabajo se describe cómo en la ruta de degradación de esfingolípidos de levadura, la producción de hexadecenal a través de Dpl1 y su degradación a través de Hfd1, es crítica para la función mitocondrial y la muerte celular. Intervenciones genéticas que favorecen la acumulación de hexadecenal, disminuyen el consumo de oxígeno de las células e incrementan la producción de ROS y la fragmentación mitocondrial, y a la inversa. La localización de Hfd1, que es la enzima que degrada el hexadecenal, es puntual en lugares cercanos a la red mitocondrial. Y esta localización depende de un complejo ERMES funcional, lo que indica que la modulación de los niveles de hexadecenal en lugares específicos de contacto entre el retículo endoplasmático y la mitocondria, podría ser un importante desencadenante de la muerte celular. Estos datos son apoyados por el hecho de que el hexadecenal añadido de forma externa o la ausencia de Hfd1, promueve la muerte celular inducida por la proteína Bax humana. Finalmente, la inducción de la ruta de degradación de esfingolípidos en condiciones de estrés, está controlada por la MAP quinasa Hog1. Por lo tanto, la modulación de la degradación de esfingolípidos regulada por estrés, podría ser una vía conservada para inducir la muerte celular en organismos eucariotas. / Al present treball s'estudia l'adaptació metabòlica en resposta a estrés al model de llevat, i de forma més concreta s'investiga la regulació de l'activitat peroxisomal i el metabolisme d'esfingolípids. Els peroxisomes són orgànuls dinàmics, encarregats de forma específica de la ß-oxidació dels àcids grassos en cèl·lules de llevat. Ací es mostra com la funció peroxisomal es crucial per a l'adaptació a l'estrés salí, especialment en condicions de dejuni de glucosa. Es regula a múltiples nivells tant l'activitat peroxisomal com el seu número, davant de condicions d'estrés. L'activació de la MAP quinasa Hog1 desencadena la inducció de gens que codifiquen enzims per a l'activació, importació peroxisomal i ß-oxidació dels àcids grassos. Aquesta regulació génica té lloc mitjançant l'activador transcripcional Adr1, que s'assòcia transitoriamente amb els gens que codifiquen enzims metabòliques d'àcids grassos d'una manera dependent de l'estrés i de Hog1. A més, l'estrés causat per Na+ i Li+, provoca un augment en el número de peroxisomes per cèl·lula de manera independent de Hog1, que depén a la vegada de la ruta retrògrada i de les dinamines GTPases Dnm1 i Vps1. La forta activació de la acil-CoA sintetasa Faa1, que es localitza específicament a les partícules lipídiques i als peroxisomes, indica que l'adaptació a estrés salí necesita d'una major movilització d'àcids grassos dels magatzems de lípids interns. Estos resultats indiquen que la ß-oxidació peroxisomal induïda per estrés desencadena un augment de la respiració davant el xoc salí. Els esfingolípids són reguladors de la mort cel·lular mitjada per la mitocóndria en eucariotes superiors. No obstant, es desconeix cóm, canvis al metabolisme dels esfingolípids i en intermediaris aigües baix, afecten a les funcions mitocondrials. En aquest treball es descriu cóm en la ruta de degradació de esfingolípids de llevat, la producció d'hexadecenal mitjançant Dpl1 i la seua degradació mitjançant Hfd1, és crítica per a la funció mitocondrial i la mort cel·lular. Intervencions genètiques que afavorixen l'acumulació d'hexadecenal, disminuixen el consum d'oxigen de les cèl·lules i incrementen la producció de ROS i la fragmentació mitocondrial, i a la inversa. La localització de Hfd1, que es l'enzim que degrada l'hexadecenal, és puntual en llocs propers a la red mitocondrial. I esta localització depén d'un complex ERMES funcional, el que indica que la modulació dels nivells d'hexadecenal en llocs específics de contacte entre el reticle endoplasmàtic i la mitocòndria, podria ser un important desencadenant de la mort cel·lular. Estes dades son recolzades pel fet de que l'hexadecenal afegit de forma externa o l'absència de Hfd1, promou la mort celul¿lar induïda per la proteïna Bax humana. Finalment, la inducció de la ruta de degradació d'esfingolípids en condicions d'estrés, está controlada por la MAP quinasa Hog1. Por tant, la modulació de la degradació d'esfingolípids regulada per estrés, podria ser una via conservada per a induïr la mort cel·lular en organismes eucariotes. / Manzanares Estreder, S. (2017). Estudio de la adaptación metabólica en respuesta a estrés: Regulación de la actividad peroxisomal y del metabolismo de esfingolípidos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/79083 / TESIS

Evalúa la actividad antimicrobiana de metabolitos secundarios de Aspergillus fumigatus sobre cepas clínicas de Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae. La fermentación líquida de un aislamiento clínico de Aspergillus fumigatus fue realizada en un caldo líquido Sulfato, Papa y Dextrosa (SPG). La extracción de metabolitos del caldo de cultivo fermentado fue realizada usando acetato de etilo. Se evaluó la actividad antimicrobiana sobre cepas clínicas de cocos Gram positivos mediante los métodos de disco y pozo difusión. Se obtuvo una media de 24 y 23 mm sobre Staphylococcus aureus sensible y resistente respectivamente por disco difusión. Para las cepas sensibles y resistentes de Streptococcus pneumoniae las medias fueron de 26 mm según disco difusión. Existe diferencia significativa entre la metodología de difusión de disco y pozo (p < 0.05) Se concluye que el extracto crudo de Aspergillus fumigatus posee metabolitos secundarios de naturaleza alcaloide, esteroles insaturados y terpenos; con efectiva actividad antimicrobiana sobre cepas clínicas de Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae sensibles y resistentes. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / En Ecuador, el cultivo del camarón constituye el segundo producto no petrolero de importancia económica. La sustitución de antibióticos promotores del crecimiento por alimentos funcionales como probióticos, prebióticos, simbióticos y otros compuestos alternativos, han recibido recientemente una atención considerable por parte de los productores en el país para mantener la salud de los estanques de una forma amigable con el ambiente. Pocos estudios, sin embargo, se han centrado directamente en los efectos de la suplementación de los balanceados utilizados en la alimentación de camarones con alimentos funcionales a partir de levaduras autóctonas aisladas de los propios estanques de cultivo y fructoligosacáridos (FOS) en forma conjunta dando lugar a un alimento funcional simbiótico. En el presente trabajo se aislaron y caracterizaron tres especies de levaduras de los suelos de piscinas camaroneras de la región continental e insular de la Provincia de El Oro, Ecuador. Saccharomyces cerevisiae resultó ser la cepa de mayor potencialidad in vitro como posible organismo probiótico y antimicrobiano, lo que permitió en este trabajo obtener preparados nacionales con este microorganismo que sería la parte probiotica del simbiótico utilizado en los diferentes experimentos de esta tesis. Se describe también la producción de fructooligosacáridos, parte prebiótica del simbiótico, utilizando células inmovilizadas de un microorganismo productor de una enzima, capaz de transformar la sacarosa en 1-kestosa, prebiótico de mayor interés biotecnológico y comercial. Estos dos compuestos que constituyen la parte probiótica y prebiótica del compuesto respectivamente, se mezclaron como aditivos en el balanceado utilizado para alimentar camarones y evaluar posteriormente como influyen estos aditivos en diferentes parámetros productivos, ambientales e inmunológicos en los animales utilizados. Un primer experimento se realizó durante un periodo experimental de 30 días donde los camarones fueron alimentados con XVI un concentrado comercial sin aditivos (control) y suplementado con diferentes cantidades del aditivo funcional conformando diferentes tratamientos (T1 a T4) donde la parte prebiótica, o sea los FOS se mantuvo constante a razón de 1 mg / kg de balanceado comercial en todos los tratamientos. T1: 50 mg de levadura + FOS, T2: 100 mg de levadura + FOS, T3: 200 mg de levadura + FOS, T4: 400 mg de levadura + FOS. A partir de este experimento se escogió la mejor dosis que resultó ser T1, ya que se obtuvieron mejores valores en los diferentes parámetros físico-ambientales, productivos e inmunológicos. El segundo experimento utilizando la dosis T1 mostró una influencia positiva en parámetros físicos-ambientales como calidad de agua, nitritos, oxígeno disuelto, pH y temperatura en el tratamiento con simbiótico. Se observó además un aumento de la cantidad de proteínas así como de la presencia de la enzima superóxido dismutasa y del conteo de hematocitos en la hemolinfa lo que indica un estímulo en el sistema inmune de los animales tratados con este alimento funcional en el balanceado a diferencia de los controles sin aditivos. Los resultados obtenidos en sugieren que este compuesto simbiótico puede emplearse como alternativa a los antibióticos promotores del crecimiento. / Tesis

[EN] Any living cell needs to maintain adequate levels of nutrients and ions to ensure the continuity of its functions. The first step in the maintenance of both ion and nutrient homeostasis is their uptake from the extrenal environment, where plasma membrane transporter proteins play an important role. The regulation of both the activity and abundance of permeases in the plasma membrane is a pivotal aspect of the cellular response to different environmental conditions. Therefore, deciphering the pathways that regulate the function or the presence of these transport proteins is important for a better understanding of cell physiology and stress responses. Transcriptional regulation is a contributor to the control of the abundance of plasma membrane transporters, and more specifically in the yeast model Saccharomyces cerevisiae a strong transcriptional regulation of the hexose transporters has been demonstrated. However, there are other important levels for the control and maintenance of glucose homeostasis, such as post-translational regulation of glucose transporters, which are still being defined. Ubiquitination, as a signal for endocytosis of membrane proteins, mediated by the E3 ubiquitin ligase Rsp5 has been demonstrated for many transporters, including the HXT family. In recent years, several studies have shown the involvement of the ART protein family (Arrestin-Releated Trafficking proteins) in this process, acting as adapters for Rsp5 and providing specificity to the ubiquitination of permeases in response to changes in environmental conditions. In turn, the members of this family of adapter proteins are targets of post-translational modifications, such as phosphorylation or ubiquitination, affecting their activity and adding an additional level in the regulation of transporter interactions. Previous studies have demonstrated the existence of a genetic interaction between the high affinity glucose transporter Hxt6 and the Rsp5 adapter protein, Rod1 (Art4). In turn, the Snf1 kinase was shown to be involved in the phosphorylation of this adapter protein, suggesting a possible role in the regulation of its activity. With this background, and taking into consideration the interaction of 14-3-3 proteins with other adapter proteins, in this study the biochemical characterization of the Art4-Snf1-14-3-3 signaling pathway involved in the regulation of the endocytosis of the glucose transporter Hxt6 and the effect of Snf1 and 14-3-3 proteins (Bmh2) on intracellular traffic of the Hxt6-Art4 complex will be investigated. Similarly, the effect of Art4, and its paralogue Rog3 (Art7), on Hxt6 levels and the phenotypes of other glucose transporter mutants, such as hxt1 and hxt3 will be analyzed to determine whetherthese transporters display a common regulatory mechanism also involving Art4 and Art7. In short, this thesis aims to provide new data on the post-translational regulation of the HXT transporters through the Rsp5 adapter family of ART proteins, with emphasis on biochemical aspects, such as phosphorylation, and molecular and cellular aspects, such as intracellular trafficking and permease stability / [ES] Cualquier célula viva necesita mantener niveles adecuados de iones y nutrientes para asegurar la continuidad de sus funciones. El primer paso en la conservación de la homeostasis de iones como el potasio o nutrientes como la glucosa, es la toma de los mismos desde el medio externo, teniendo los transportadores de membrana un papel básico en este proceso. La regulación de estos transportadores tiene una función fundamental en la respuesta de las células a diferentes condiciones ambientales, siendo esenciales tanto la modulación de su actividad como la abundancia de permeasas en la membrana plasmática. Por esto, el estudio de las rutas que regulan la función o la presencia de dichos transportadores en la membrana plasmática es importante para un mejor conocimiento de la fisiología celular y la respuesta de las células al estrés. La regulación transcripcional supone un nivel importante en el control de la abundancia de transportadores en la membrana plasmática, y más concretamente en la levadura modelo Saccharomyces cerevisiae se ha demostrado que los transportadores de hexosas poseen una fuerte regulación a nivel transcripcional. Sin embargo, existen otros niveles importantes para el control y el mantenimiento de la homeóstasis de hexosas, como la regulación postraduccional, y que en el caso de los transportadores de glucosa es menos conocida. La ubiquitinación como señal para la endocitosis de proteínas de membrana a través de la E3 ubiquitín ligasa Rsp5 ha sido demostrada para gran número de transportadores, incluidos los de la familia HXT. En los últimos años, varios estudios han demostrado la implicación de la familia de proteínas ART (Arrestin Releated Trafficking proteins) en este proceso, actuando como adaptadores de Rsp5 y aportando especificidad a la ubiquitinación de transportadores en respuesta a cambios en las condiciones del medio. A su vez, esta familia de proteínas adaptadoras es diana de modificaciones postraduccionales, como la ubiquitinación o la fosforilación, que repercuten en su actividad y suman un nivel adicional en la regulación de los transportadores con los que interaccionan. Estudios anteriores demostraron la existencia de una interacción genética entre el transportador de glucosa de alta afinidad Hxt6 y la proteína adaptadora de Rsp5, Rod1 (Art4). A su vez, la quinasa Snf1 fue implicada en la fosforilación de esta proteína adaptadora, sugiriendo una posible función en la regulación de su actividad. Con estos precedentes, y teniendo en consideración la interacción de las proteínas 14-3-3 con otras proteínas adaptadoras, en el presente estudio se llevará a cabo la caracterización bioquímica de la ruta de señalización Art4-Snf1-14-3-3 implicada en la regulación por endocitosis del transportador de glucosa Hxt6 y se estudiará el efecto de Snf1 y las proteínas 14-3-3 (Bmh2) sobre el tráfico intracelular del complejo Hxt6-Art4. Del mismo modo, se analizará el efecto de Art4, y de su parálogo Rog3 (Art7), sobre los niveles de Hxt6 y se caracterizarán los fenotipos de mutantes para otros transportadores de glucosa, como Hxt1 y Hxt3, por la posibilidad de que presenten un mecanismo regulador común que implique también a Art4 y Art7. En definitiva, la presente tesis doctoral pretende aportar nuevos datos acerca de la regulación postraduccional de transportadores de la familia HXT a través de las proteínas ART, adaptadoras de Rsp5, haciendo hincapié en aspectos bioquímicos como la fosforilación y la ubiquitinación, y en aspectos moleculares y celulares, como el tráfico intracelular o la estabilidad de permeasas. / [CAT] Qualsevol cèl-lula viva necessita mantindre nivells adequats d'ions i nutrients per tal d'assegurar la continuïtat de les seues funcions. El primer pas en la conservació de l'homeòstasi d'ions com el potassi o nutrients com la glucosa, és la pressa dels mateixos des del medi extern, tot i tenint els transportadors de membrana un paper bàsic en este procés. De manera directa, la regulació d'aquests transportadors té una funció fonamental en la resposta de les cèl-lules a diferents condicions ambientals, tot i sent processos essencials tant la modulació de la seua activitat com l'abundància de permeases a la membrana plasmàtica. Per això, entendre les rutes que regulen la funció o la presència dels transportadors a la membrana és important per a un millor coneixement de la fisiologia cel-lular i la resposta a l'estrés. La regulació transcripcional suposa un nivell important en el control de l'abundància de transportadors a la membrana plasmàtica, i més concretament en el rent model Saccharomyces cerevisiae s'ha demostrat que les permeases d'hexoses tenen una forta regulació a nivell transcripcional. A banda d'aquest tipus de regulació, existeixen altres nivells importants per al control i el manteniment de l'homeòstasi de la glucosa, com la regulació postraduccional, i , que en el cas dels transportadors de glucosa, és menys coneguda. L'ubiquitinació com a senyal per a l'endocitosi de proteïnes de membrana a través de l'E3 ubiquitina ligasa Rsp5, ha sigut demostrada per a un gran nombre de transportadors, inclosos els de la família HXT. En els últims anys, diversos estudis han posat de manifest la implicació de la família de proteïnes ART (Arrestin Releated Trafficking proteins) en este procés, tot i actuant com adaptadores de Rsp5 i aportant especificitat a l'ubiquitinació de transportadors en resposta a canvis en les condicions del medi. Al mateix temps, aquesta família de proteïnes és diana de modificacions postraduccionals, com l'ubiquitinació o la fosforilació, que tenen un efecte en la seua activitat i sumen un nivell addicional a la regulació dels transportadors amb els quals interaccionen. Estudis anteriors demostraren l'existència d'una interacció genètica entre el transportador de glucosa d'alta afinitat Hxt6 i la proteïna adaptadora de Rsp5, Rod1 (Art4). De la mateixa manera, la quinasa Snf1 va ser involucrada en la fosforilació d'aquesta proteïna adaptadora, tot i suggerint una possible funció en la regulació de la seua activitat. Amb estos precedents, i tenint en compte la interacció de les proteïnes 14-3-3 amb altres proteïnes adaptadores, en el present estudi es durà a terme la caracterització bioquímica de la ruta de senyalització Art4-Snf1-14-3-3 implicada en la regulació per endocitosi del transportador de glucosa Hxt6, i s'estudiarà l'efecte de Snf1 i les proteïnes 14-3-3 (Bmh2) sobre el tràfic intracel-lular del complex Hxt6-Art4. Per altra banda, s'analitzarà l'efecte de Art4, i del seu paràleg Rog3 (Art7), sobre els nivells de Hxt6 i es caracteritzaran els fenotips de mutants per a altres transportadors de glucosa, tals com Hxt1 i Hxt3, per la possibilitat que presenten un mecanisme regulador comú que també implique a Art4 i Art7. En definitiva, la present tesi doctoral pretén aportar noves dades al voltant de la regulació postraduccional dels transportadors de la família HXT a través de les proteïnes ART, adaptadores de Rsp5, tot i aprofundint en aspectes bioquímics com la fosforilació i l'ubiquitinació, i en aspectes moleculars i cel-lulars, com el tràfic intracel-lular o l'estabilitat de permeases / Llopis Torregrosa, V. (2016). Mecanismos de regulación de transportadores de iones y nutrientes a través de proteínas de tráfico relacionadas con las arrestinas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/60149 / TESIS

[EN] One of the defining features of a eukaryotic cell is the presence of a nuclear envelope. This allowed the physical separation between nucleus and cytoplasm, although the presence of a variable number of openings called nuclear pore complexes (NPCs) allowed a constant flow of molecules and information between the two compartments. Certain molecules passively diffuse, but others need energy and specific interactions with transporters and components of the NPC to travel between through both compartments. The messenger RNAs (mRNAs) are among the molecules selectively exported from the nucleus to the cytoplasm. The physical separation between nucleus and cytoplasm isolates the processes of transcription and translation in eukaryotic cells, allowing the cell to select core transcripts competent for export and that will lead to a functional protein in the cytoplasm. The right transcript levels in a cell, depending on the nutritional requirements, reproductive or relationship with the environment is essential for life. To this end, mechanisms regulating transcription, processing, stability, degradation, export or translation of the transcripts, are physically and spatially highly coupled in order to finely regulate the transcript levels in the cell. In Saccharomyces cerevisiae, SUS1 codes for a small protein of 11 kDa highly conserved in all eukaryotes. SUS1 is part of the SAGA transcriptional co-activator, being a submodule component involved in chromatin remodeling. In addition, SUS1 is one of the components of the TREX2 complex, wich interacts with the nuclear pore in the periphery of the nucleus and it is involved in the export of messenger RNAs. The presence of SUS1 in both complexes allows the physical and spatial coupling phenomena of transcription and export of mRNAs. In addition, SUS1 has two introns which is an unusual fact for the S. cerevisiae genome. Unlike other fungi or metazoans, the percentage of genes with introns in S. cerevisiae is very low (5%) and only 10 genes have more than one intron interrupting its coding sequence. The unusual characteristics of SUS1, the role of Sus1 coordinating processes during mRNA biogenesis and its functional conservation in higher eukaryotes, led the research conducted in this dissertation. In this work we studied in detail the biogenesis of SUS1 transcripts. We have identified different factors, acting in cis and trans that are involved in regulating the expression of SUS1 and function of the protein it encodes. On the other hand, we have studied the genetic relationship of SUS1 with components of the 5 '- 3' cytoplasmic degradation machinery and expanded the knowledge about the role of SUS1 during the biogenesis of mRNAs, not only in the nucleus but also in the cytoplasm. / [ES] Una de las características que definen a una célula eucariota es la presencia de una envoltura nuclear. Aunque este hecho permite la separación física entre núcleo y citoplasma, la presencia de un número variable de aberturas, denominadas complejos del poro nuclear (NPCs), permiten un flujo constante de moléculas e información entre ambos compartimentos. Ciertas moléculas difunden de forma pasiva, pero otras necesitan energía e interacciones específicas a través de transportadores y componentes del NPC para transitar entre ambos compartimentos. Entre las moléculas selectivamente exportadas del núcleo al citoplasma se encuentran los RNAs mensajeros (mRNAs). La separación física del núcleo y del citoplasma en eucariotas, aísla los procesos de transcripción y traducción, permitiendo a la célula seleccionar en el núcleo los transcritos competentes para ser exportados y que darán lugar a una proteína funcional en el citoplasma. Adecuar los niveles de transcritos en una célula, en función de las necesidades nutritivas, reproductivas o de relación con el entorno, es esencial para la vida. Para ello, los mecanismos encargados de regular la transcripción, el procesamiento, la estabilidad, la degradación, el exporte o la traducción de los transcritos, se encuentran altamente acoplados física y espacialmente con el fin de regular finamente los niveles de mensajeros en la célula. En el núcleo de las células de la levadura Saccharomyces cerevisiae se encuentra Sus1, una proteína de 11 kDa altamente conservada en eucariotas. Sus1 forma parte del co-activador transcripcional SAGA, siendo componente de un submódulo implicado en la desubicuitinación de la histona H2B. Además, Sus1 es uno de los componentes del complejo TREX2, que interacciona con el poro nuclear en la periferia del nucleo y está implicado en el exporte de RNAs mensajeros y en estabilidad genómica. La presencia de Sus1 en ambos complejos permite el acoplamiento físico y espacial de los fenómenos de transcripción y exporte de mRNAs. Además, el gen SUS1 posee dos intrones, siendo este un evento muy inusual en el genoma de S. cerevisiae. A diferencia de otros hongos o metazoos, el porcentaje de genes con intrones en S. cerevisiae es muy reducido (5%) y solo 10 genes poseen más de un intrón interrumpiendo su secuencia codificante. Las características peculiares del gen SUS1, el papel de la proteína que codifica coordinando procesos durante la biogénesis del mRNA y su conservación funcional en eucariotas superiores, motivó las investigaciones llevadas a cabo en esta tesis doctoral. En este trabajo hemos estudiado en detalle la biogénesis de los transcritos de SUS1. Se han identificado diferentes factores, tanto en cis como en trans, implicados en la regulación de la expresión de SUS1 y en la función de la proteína que codifica. Por otro lado, hemos estudiado la relación genética de SUS1 con componentes de la maquinaria de degradación citoplasmática 5'-3' y hemos ampliado los conocimientos respecto al papel de Sus1 durante la biogénesis de los mRNAs, no solo en el núcleo sino también en el citoplasma. / [CAT] Una de les característiques que definixen a una cèl·lula eucariota és la presència d'un embolcall nuclear. Este fet permet la separació física entre nucli i citoplasma, encara que la presència d'un nombre variable d'obertures, denominades complexos del porus nuclear (NPCs), permet un flux constant de molècules i informació entre ambdós compartiments. Certes molècules difonen de forma passiva, però altres necessiten energia i interaccions específiques amb transportadors i components del NPC per a transitar entre ambdós compartiments. Entre les molècules selectivament exportades del nucli al citoplasma es troben els RNAs missatgers (mRNAs). La separació física del nucli i del citoplasma aïlla els processos de transcripció i traducció en eucariòtes, permetent a la cèl·lula seleccionar en el nucli els transcrits competents per a ser exportats i que donaran lloc a una proteïna funcional en el citoplasma. Adequar els nivells de transcrits en una cèl·lula, en funció de les necessitats nutritives, reproductives o de relació amb l'entorn, és essencial per a la vida. Per a això, els mecanismes encarregats de regular la transcripció, el processament, l'estabilitat, la degradació, l'exportació o la traducció dels transcrits, es troben altament acoblats física i espacialment amb el fi de regular finament els nivells de missatgers en la cèl·lula. En el nucli de les cèl·lules del rent Saccharomyces cerevisiae es troba Sus1, una xicoteta proteïna d'11 kDa altament conservada en eucariotes. Sus1 forma part del coactivador transcripcional SAGA, sent component d'un submòdul implicat en la modificació de histones. A més, Sus1 és un dels components del complex TREX2, que interacciona amb l'embolall nuclear a la perriferia del nucli i està implicat en l'export de RNAs missatgers. La presència de Sus1 en ambdós complexos permet l'adaptament físic i espacial dels fenòmens de transcripció i exportació de mRNAs. A més, el gen SUS1 posseïx dos introns i este fet és inusual en el genoma de S. cerevisiae. A diferència d'altres fongs o metazous, el percentatge de gens amb introns en S. cerevisiae és molt reduït (5%) i només 10 gens posseïxen més d'un intró interrompent la seua seqüència codificant. Les característiques peculiars del gen SUS1, el paper de la proteïna que codifica coordinant processos durant la biogènesi del mRNA i la seua conservació funcional en eucariotes superiors, va motivar les investigacions dutes a terme en esta tesi doctoral. En este treball hem estudiat en detall la biogènesi dels transcrits de SUS1. S'han identificat diferents factors, tant en cis com en trans, implicats en la regulació de l'expressió de SUS1 i en la funció de la proteïna que codifica. D'altra banda, hem estudiat la relació genètica de SUS1 amb components de la maquinària de degradació citoplasmática 5'-3' i hem ampliat els coneixements respecte al paper de Sus1 durant la biogènesi dels mRNAs, no sols en el nucli sinó també al citoplasma. / Cuenca Bono, B. (2016). Identificación y caracterización de elementos reguladores de la expresión de SUS1 y nuevas funciones celulares para la proteina Sus1 en Saccharomyces cerevisiae [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/62327 / TESIS

[EN] Eukaryotic cells adapt to environmental changes ("stress") through signal transduction pathways which coordinate complex adaptive responses. Mitochondria are able to respond to different external stimuli in a dynamic manner. In previous studies, mitochondria were shown to play an important role in adaptation to hyperosmotic stress and defects in many mitochondrial functions cause sensitivity to this stress. In the present work, we investigate novel mechanisms of mitochondrial adaptation in response to stress. First of all, the role of the mitochondrial pyruvate carrier complex (MPC) in this adaptation was analyzed. This carrier is composed by three proteins in yeast: Mpc1, Mpc2 and Mpc3. MPC3 is upregulated upon salt stress and during a diauxic shift, which leads to an increase in Mpc3 protein abundance. HOG pathway, implicated in osmostress response, is needed for the efficient induction of MPC3 transcription. Our analysis suggests that amino acid biosynthesis, respiration rate and oxidative stress tolerance are regulated by changes in the Mpc protein composition of the mitochondria. In this way, Mpc2 is most abundant under fermentative non stress conditions and important for amino acid biosynthesis, while Mpc3 is the most abundant family member upon salt stress or when high respiration rates are required. In addition, Mpc3 stimulates respiration and enhances tolerance to oxidative stress. Therefore, our results identify that the regulated mitochondrial pyruvate uptake via different Mpc proteins might be an important determinant of respiration rate and stress resistance. Secondly, since pyruvate flux to mitochondria is modified according to environmental conditions, here we study also possible changes in electron transport chain complex subunits. We found that a switch to partially or completely respiratory energy sources causes selective degradation of respiratory complex I and III subunits. Moreover, this degradation was also observed when there was a specific organelle damage caused by valinomycin, to maintain cell homeostasis. Interestingly, the loss of Atg32 function only partially affected the respiratory complex specific degradation, while the Atg11 protein was absolutely required in this process. Fission and fusion machinery proteins (Fzo1 and Fis1) and some mitochondrial proteases (Yme1, Pim1 and Afg3) also have a role in the valinomycin-mediated mitophagy. This process might start by Atg11 accumulation in foci close to the mitochondria shortly after valinomycin treatment. In this work, we describe for the first time a specific mechanism of mitophagy mediated by damage in yeast, which opposes to the concept of a generalized degradation of the organelle. / [ES] Las células eucariotas responden a cambios en su entorno ("estrés") a través de rutas de transmisión de señales que coordinan respuestas adaptativas muy complejas. Las mitocondrias son orgánulos muy dinámicos capaces de responder a diversos estímulos externos. En estudios anteriores, se demostró que la mitocondria tiene un papel en la adaptación a estrés hiperosmótico, ya que los mutantes con defectos en diversos componentes mitocondriales muestran mayor sensibilidad a este estrés. En este trabajo, se ha investigado nuevos mecanismos de adaptación de la actividad mitocondrial en respuesta a estrés. Por una parte, se ha estudiado el papel del complejo transportador de piruvato mitocondrial (MPC) en esta adaptación. Este transportador está conformado por tres proteínas en levadura: Mpc1, Mpc2 y Mpc3. El gen MPC3 sufre una fuerte inducción transcripcional en condiciones de estrés osmótico y cambio diáuxico, que se traduce en un aumento de la cantidad de proteína Mpc3. Esta regulación se vio que dependía de la ruta HOG, implicada en la respuesta a estrés osmótico, y no ocurría en Mpc1 y Mpc2. Se comprobó, además, que los cambios en la composición de MPC en la mitocondria regulaban la biosíntesis de aminoácidos, la capacidad respiratoria y la tolerancia a estrés oxidativo de la célula. De esta forma, Mpc2 es la proteína más abundante en condiciones fermentativas sin estrés y es necesaria para la biosíntesis de aminoácidos; mientras que Mpc3 es el miembro más abundante ante estrés salino o cuando se requiere una elevada tasa respiratoria. Además, Mpc3 estimula la respiración y aumenta la tolerancia a estrés oxidativo. Por tanto, nuestros resultados identifican que la entrada de piruvato en la mitocondria y su posterior uso están regulados por la composición específica de las subunidades del transportador y determina la tasa respiratoria y la resistencia a estrés. Por otra parte, dado que el flujo de piruvato a la mitocondria se modificaba en función de las condiciones ambientales, se quiso estudiar qué ocurría en los complejos de la cadena de transporte de electrones en estas condiciones. Se observó que los complejos I y III se degradaban ante elevadas tasas respiratorias, al parecer como un mecanismo de reciclaje. Además, ante un daño mitocondrial específico utilizando valinomicina, también existía una degradación específica de los complejos respiratorios I y III, para mantener la homeostasis celular. Este proceso es dependiente de Atg11, e independiente de Atg32. También parecen implicadas proteínas de la maquinaria de dinámica mitocondrial (Fzo1 y Fis1) y algunas proteasas mitocondriales (Yme1, Pim1 y Afg3). El inicio de este proceso parece producirse ante la aparición de foci de Atg11 cercanos a la mitocondria. Se describe por primera vez en levadura un mecanismo específico de mitofagia inducida por daño, que contrasta con el concepto de degradación generalizada del orgánulo. / [CAT] Les cèl·lules eucariotes responen a canvis al seu entorn ("estrès") a través de rutes de transmissió de senyals que coordinen respostes adaptatives molt complexes. Les mitocòndries són orgànuls molt dinàmics capaços de respondre a diversos estímuls externs. A estudis previs, es va demostrar que la mitocòndria té un paper en l'adaptació a estrès hiperosmòtic, ja què els mutants amb defectes en diversos components mitocondrials mostren major sensibilitat a aquest estrès. A aquest treball, s'ha analitzat nous mecanismes d'adaptació de l'activitat mitocondrial en resposta a estrès. Per una banda, s'ha estudiat el paper del complex transportador de piruvat mitocondrial (MPC) a aquesta adaptació. Aquest transportador està conformat per tres proteïnes en llevat: Mpc1, Mpc2 i Mpc3. El gen MPC3 pateix una forta inducció transcripcional en condicions d'estrès osmòtic i canvi diàuxic, que es tradueix en un augment de la quantitat de proteïna Mpc3. Aquesta regulació depèn de la ruta HOG, implicada en la resposta a estrès osmòtic, i no tenia lloc en Mpc1 i Mpc2. A més, es va comprovar que els canvis en la composició de MPC a la mitocòndria regulaven la biosíntesi de aminoàcids, la capacitat respiratòria i la tolerància a estrès oxidatiu de la cèl·lula. D'aquesta manera, Mpc2 és la proteïna més abundant en condicions fermentatives en absència d'estrès, mentre que Mpc3 és el membre més abundant davant d'estrès salí o quan és necessària una elevada taxa respiratòria. A més, Mpc3 estimula la respiració i augmenta la resistència a estrès oxidatiu. Per tant, els nostres resultats identifiquen que l'entrada de piruvat a la mitocòndria i el seu posterior ús estan regulats per la composició específica de les subunitats del transportador i determina la taxa respiratòria i la resistència a estrès. Per altra banda, com el flux de piruvat a la mitocòndria es modifica en funció de les condicions ambientals, es va voler estudiar què succeïa als complexes de la cadena de transport electrònic a aquestes condicions. Es va observar que els complexes I i III es degradaven davant d'elevades taxes respiratòries, com a mecanisme de reciclatge. A més, davant d'un dany mitocondrial específic utilitzant valinomicina, també existia una degradació específica dels complexes respiratoris I i III, per a mantenir l'homeòstasi cel·lular. Aquest procés és depenent d'Atg11, però independent d'Atg32. També semblen implicades proteïnes de la maquinària de dinàmica mitocondrial (Fzo1 i Fis1) i algunes proteases mitocondrials (Yme1, Afg3 i Pim1). L'inici d'aquest procés sembla produir-se per l'aparició de foci d'Atg11 propers a la mitocòndria. Per primera volta, es descriu en llevat un mecanisme específic de mitofagia induïda per dany, que contrasta amb el concepte de degradació generalitzada de l'orgànul. / Timón Gómez, A. (2016). MECANISMOS DE ADAPTACIÓN DE LA ACTIVIDAD MITOCONDRIAL EN RESPUESTA A ESTRÉS [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/64873 / TESIS

[EN] Cells respond to environmental stimuli by fine tuned regulation of gene expression. In this thesis we investigate the dose dependent modulation of the genetic response upon nutrient and stress signals in yeast. A destabilized version of firefly luciferase was used in living yeast cells as a real-time reporter for gene expression. This highly sensitive and non-invasive system can be simultaneously used upon many different experimental conditions in small culture aliquots. This allows the dose-response behaviour of gene expression driven by any yeast promoter to be reported and can be used to quantify important parameters, such as the threshold, sensitivity, response time, maximal activity and synthesis rate for a given stimulus. We applied the luciferase assay to the nutrient-regulated GAL1 promoter and the stress-responsive GRE2 promoter. We find that luciferase expression driven by the GAL1 promoter responds dynamically to growing galactose concentrations, with increasing synthesis rates determined by the light increment in the initial linear phase of activation. The GAL1 gene is activated with continuously increasing synthesis rates in a well defined range of galactose concentrations, correlating with a dynamic increase of histone remodeling and subsequent association of the RNAPII complex. Dose dependent chromatin remodeling appears to be the basis for the dynamic GAL1 expression since mutants with impaired histone dynamics show severely truncated dose response profiles. In the case of the GRE2 promoter, we demonstrate that the very short-lived version of luciferase used here is an excellent tool to quantitatively describe transient transcriptional activation. The luciferase expression controlled by the GRE2 promoter responds dynamically to a gradual increase of osmotic or oxidative stress stimuli, which is mainly based on the progressive increase of the time the promoter remains active. In contrast, the GRE2 promoter operates like an off/on switch in response to increasing osmotic stress with almost constant synthesis rates and exclusively temporal regulation of histone remodeling and RNAPII occupancy. The Gal3 inducer and the Hog1 MAP kinase seem to determine the different dose response strategies at the two promoters. Our analysis reveals important differences in the way dynamic signals create dose sensitive gene expression outputs. Taken together, the luciferase assay described here is an attractive tool to rapidly and precisely determine and compare kinetic parameters of gene expression. Additionally, the function of the specific transcriptor factor Smp1 involved in the yeast osmostress response was investigated. Location analyses upon osmotic stress reveal that Smp1 associates preferentially with the whole transcribed regions (ORFs) upon stress as opposed to other transcriptional activators involved in the osmostress response. However, Smp1 seems to be important for stress-activated gene expression only in the presence of the natural induced gene and not of artificial promoter fusions. This highlights the possible role of Smp1 in regulating gene expression from ORF sequences rather than promoter regions. / [ES] Las células responden a los estímulos ambientales a través de una regulación precisa de la expresión génica. En este trabajo se investigó la modulación dosis dependiente de la expresión de genes activados en respuesta a estrés y por nutrientes. Se utilizó una versión desestabilizada de luciferasa de luciérnaga en células vivas de levadura como reportero para la detección de la expresión génica en tiempo real. Este sistema altamente sensible y no invasivo puede ser utilizado simultáneamente en diferentes condiciones experimentales a través de pequeñas alícuotas de cultivo. Esto permite la caracterización dosis-respuesta de la regulación de los promotores de levadura y puede ser utilizado para cuantificar parámetros importantes como el umbral, la sensibilidad, el tiempo de respuesta, la actividad máxima y el ratio de síntesis provocado por un determinado estímulo. Se aplicó el ensayo luciferasa al promotor GAL1 regulado por nutrientes y al promotor GRE2 activado en respuesta a estrés. Se observó que la expresión de la luciferasa activada por el promotor GAL1 responde de forma dinámica a las crecientes concentraciones de galactosa, con un incremento del ratio de síntesis determinado por el aumento de luz en la fase lineal inicial de la activación, en función de una gama de concentraciones de galactosa bien definidas. Este mecanismo de regulación depende de un aumento en la remodelación de las histonas y la consecuente asociación del complejo ARN pol II. La remodelación de la cromatina dosis dependiente parece ser la base de la expresión dinámica de GAL1, pues los mutantes relacionados con la dinámica de las histonas muestran perfiles dosis respuesta severamente afectados. En el caso del promotor GRE2, se demostró que una versión de una luciferasa desestabilizada es una herramienta excelente para describir de forma cuantitativa la activación transcipcional transitoria. La expresión de la luciferasa controlada por el promotor GRE2 responde de forma dinámica al aumento gradual de estímulo de estrés osmótico u oxidativo. La activación se observa principalmente en el incremento progresivo del tiempo en que el promotor permanece activo. Diferentemente de GAL1, el promotor GRE2 opera a través de un cambio apagado/encendido en respuesta a un aumento de estrés osmótico a través de ratios de síntesis prácticamente constantes y cuya regulación solamente depende de la remodelación de la cromatina y de la permanencia de la ARN pol II. Finalmente, se puede especular que el inductor Gal3 y la MAPK Hog1 son las moléculas determinantes para las diferentes estrategias de respuesta dinámica para los dos promotores. En este trabajo se identifican importantes diferencias en la señalización dinámica determinada por la dosis de estímulo en la expresión génica. En conjunto, el ensayo de luciferasa presentado en este trabajo puede ser una herramienta interesante para determinar y comparar de forma rápida y precisa los parámetros de la expresión génica. Adicionalmente se investigó la función del factor de transcripción Smp1 involucrado en la respuesta a osmoestrés en levadura. Un análisis de la asociación a la cromatina in vivo bajo estrés osmótico demostró que Smp1 se une preferentemente a regiones transcritas (ORFs) lo que refleja un comportamiento diferente comparando con otros activadores transcripcionales de la respuesta a estrés osmótico. Sin embargo, Smp1 parece ser importante para la expresión génica activada por estrés osmótico sólo en la presencia del gen natural inducido y no de fusiones artificiales del promotor. Esto evidencia el posible papel de Smp1 en la regulación de la expresión génica desde secuencias ORF y no en las regiones promotoras. / [CA] Les cèl·lules responen als estímuls ambientals a través d'una regulació precisa de l'expressió gènica. A aquest treball es va investigar la modulació dosi dependent de l'expressió de gens activats en resposta a estrès i per nutrients. Es va utilitzar una versió desestabilitzada de luciferasa de cuca de llum en cèl·lules vives de llevat com a reporter per a la detecció de l'expressió gènica a temps real. Aquest sistema altament sensible i no invasiu pot ser utilitzat simultàniament en diferents condicions experimentals a través de xicotetes alíquotes de cultiu. Això permet la caracterització dosi-resposta de la regulació dels promotors de llevat i pot ser utilitzat per a quantificar paràmetres importants com el llindar, la sensibilitat, el temps de resposta, l'activitat màxima i el rati de síntesi provocat per un determinat estímul. L'assaig luciferasa es va aplicar al promotor GAL1 regulat per nutrients i al promotor GRE2 activat en resposta a estrès. Es va observar que l'expressió de la luciferasa activada pel promotor GAL1 respon de forma dinàmica a les creixents concentracions de galactosa, amb un increment del rati de síntesi determinat per l'augment de llum en la fase lineal inicial de l'activació, en funció d'una gama de concentracions de galactosa ben definides. Aquest mecanisme de regulació depèn d'un augment en la remodelació de les histones i la conseqüent associació del complex ARN pol II. La remodelació de la cromatina dosi dependent sembla ser la base de l'expressió dinàmica de GAL1, ja què els mutants relacionats amb la dinàmica de les histones mostren perfils dosi-resposta severament afectats. En el cas del promotor GRE2, es va demostrar que una versió d'una luciferasa desestabilitzada és una eina excel·lent per a descriure de forma quantitativa l'activació transcripcional transitòria. L'expressió de la luciferasa controlada pel promotor GRE2 respon de forma dinàmica a l'augment gradual d'estímul d'estrès osmòtic o oxidatiu. L'activació s'observa principalment a l'increment progressiu del temps al qual el promotor roman actiu. De forma diferent de GAL1, el promotor GRE2 opera a través d'un canvi apagat/encès en resposta a un augment d'estrès osmòtic a través de ratis de síntesi pràcticament constants i als quals la seua regulació només depèn de la remodelació de la cromatina i de la permanència de l'ARN pol II. Finalment, es pot especular que l'inductor Gal3 i la MAPK Hog1 són les molècules determinants per a les diferents estratègies de resposta dinàmica per als dos promotors. A aquest treball s'identifiquen importants diferències a la senyalització dinàmica determinada per la dosi d'estímul a l'expressió gènica. En conjunt, l'assaig luciferasa presentat a aquest treball pot ser una eina interesant per a determinar i comparar de forma ràpida i precisa els paràmetres de l'expressió gènica. Addicionalment, es va investigar la funció del factor de transcripció Smp1 involucrat en la resposta a osmoestrès en llevat. Una anàlisi de l'associació a la cromatina in vivo sota l'estrès osmòtic va demostrar que Smp1 s'uneix preferentment a regions transcrites (ORFs), el qual reflecteix un comportament diferent comparant amb altres activadors transcripcionals de la resposta a estrès osmòtic. Tot i així, Smp1 sembla ser important per a l'expressió gènica activada per estrès osmòtic només en la presència del gen natural induït i no de fusions artificials del promotor. Això evidencia el possible paper de Smp1 en la regulació de l'expressió gènica des de seqüències ORF i no a les regions promotores. / Rienzo, A. (2016). Estudio de la regulación dinámica de la expresión génica en respuesta a estrés osmótico en levadura [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/62160 / TESIS

Determina el efecto de la inmovilización de Saccharomyces cerevisiae S-33 en soportes naturales preparados a partir de cáscara de toronja (Citrus máxima) y maní (Arachis hypogaea) para su aplicación en procesos de fermentación de cerveza. Para evaluar la performance de las levaduras inmovilizadas en ambos soportes se utilizó un diseño de bloques con arreglo factorial 22 y se evaluó la cinética de fermentación analizando varianzas en cuestión de rendimiento y productividad utilizando el programa MINITAB. Adicionalmente se realizaron experimentos en un birreactor airlift con mostos de 14 °Plato (1057g/l) y 20 °Plato (1083g/l) a 25±0.5 °C y un flujo de aire de 0.44 vvm utilizando ambos soportes. Se evaluó la cinética de fermentación en cada caso incluyendo la productividad y el rendimiento de etanol. Las cervezas producidas se evaluaron sensorialmente utilizando pruebas afectivas y descriptivas. Los resultados de inmovilización mostraron que, a las condiciones ensayadas, un gramo de soporte de toronja absorbió 4.08x 108 células mientras que, en el caso del soporte de maní, 0.72x108 células/gramos de soporte. Asimismo, la velocidad de consumo de azúcares en células inmovilizadas generó una producción de etanol de 0.50 g. etanol/g. azúcares reductores, y 0.43 g. etanol/g. azúcares reductores en células libres con mostos de malta de 14 °Plato (1057g/l); rendimientos de 0.50 y 0.42 g. etanol/g. azúcares reductores a 18 °C; y productividades de 0.245 y 0.330 g. etanol/Lh independientemente del tipo de soporte utilizado. Por otro lado, el tiempo de fermentación con mostos de malta de 14 °Plato (1057g/l) fue 3 días; mientras que fermentaciones con mostos de 20 °Plato (1083 g/L), 5 días. La productividad y rendimiento en fermentaciones realizadas en el birreactor airlift en soportes de toronja a 14 ºPlato (1057g/l) resultó 0.30 g. etanol/Lh; y 0.40 g. etanol/g. azúcares reductores respectivamente. Finalmente, en cuanto a tipo de soporte utilizado en lo que respecta a productividad se obtuvo un P>0.05; y un P<0.05 para el rendimiento en consideración al tipo de soporte utilizado. / Tesis