Manifiesta que en la actualidad el Perú es considerado un potencial minero de cobre, zinc, hierro, estaño, plata, oro, entre otros. Lo cual tiene un impacto positivo en la economía nacional, mejorando los índices macroeconómicos en las últimas décadas. Sin embargo, dichas actividades mineras generan problemas en zonas Altoandinas, donde se realiza estás actividades mineras. La problemática abarca desde el ámbito social y ambiental, con impactos negativos en los ecosistemas terrestres y acuáticos, afectando la calidad del agua, transformando lagunas en depósitos de relaves mineros, alterando la cadena trófica que rodean las lagunas contaminadas y capa freática. Los monitoreos fueron realizados en las lagunas Huacracocha, Santa Catalina, lago Junín, relaveras Yanamate y Quiulacocha. Se aislaron 11 cepas de levaduras, identificadas molecularmente mediante marcadores de la región LSU D1/D2 de la subunidad mayor ribosomal 28S. Las cepas identificadas fueron Rhodotorula mucilaginosa, Rhodotorula toluroides, Meyerozyma guillermondii y Pichia fermentans. Se seleccionó la levadura que presento la mejor resistencia según CMI para cobre y cadmio, se realizó la cinética de crecimiento, se encontró la fase logarítmica alrededor de las 78 horas. Así mismo se determinó la concentración letal media (CL50) con estos metales. Se diseñaron cebadores para determinar la presencia de los genes CUP1, ATM1, ACE2, ACT, GPH1, ENA1, CYS4 con la finalidad de determinar la presencia de estos marcadores moleculares en nuestras levaduras aisladas, y determinar la predominancia en los diferentes taxones aislados de cuerpos de agua Altoandinos en la sierra central del Perú. Se concluyó que los genes CUP1, ACE2, GPH1, ACT están presentes en las levaduras de la zona, y los cebadores diseñados podrían ser utilizados para la búsqueda de potenciales marcadores moleculares de expresión diferencial frente a estos metales pesados. / Tesis

Evalúa la protección en cerdos mediante el uso de dos vacunas recombinantes desarrolladas con el péptido TSOL18 de Taenia solium, con dos tipos de adyuvantes y dos esquemas de vacunación controlados en un ensayo de infección experimental. Cuarenta y nueve cerdos de dos meses de edad fueron distribuidos en los siguientes tratamientos: T1Vacuna IILTSOL18+ISA206V; T2Vacuna UMTSOL18+QuilA; T3Vacuna IILTSOL18+QuilA; T4Vacuna IILTSOL18+ISA206V; T5Control. La vacunación se realizó al día 0 y al día 23 de estudio para los cerdos de T2, T3 y T4, mientras que los cerdos de T1 fueron únicamente vacunados al día 23. Se realizó el desafío oral con proglótidos de Taenia solium al día 37 de estudio y los cerdos fueron mantenidos 12 semanas adicionales bajo condiciones controladas. Se realizaron pruebas de ELISA indirecto en suero sanguíneo para la detección de anticuerpos anti-TSOL18, los cuales fueron interpretados mediante el porcentaje de positividad (PP+). Posteriormente, los cerdos fueron eutanasiados para la evaluación y conteo de cisticercos en la canal, los cuales se clasificaron como viables o degenerados. No se observaron cisticercos sanos en cerdos que recibieron dos dosis de vacuna; además se observaron mejores resultados mediante el uso de la vacuna IILTSOL18+Adyuvante QuilA (ausencia tanto de quistes sanos como degenerados). Los cerdos de T3 presentaron valores más altos de PP+, con una mediana de 67.3. Se concluye que la vacuna IILTSOL18+Adyuvante QuilA aplicada al día 0 y 23 del estudio presenta un mejor nivel de protección en comparación a los otros protocolos de vacunación, al no observarse quistes sanos ni degenerados en las canales de los cerdos y presentar valores más altos de PP+ mediante la prueba de ELISA. / Tesis

En esta Tesis Doctoral se propone una alternativa a la coyuntura actual de rechazo social frente al uso de OMGs en la industria agroalimentaria, mediante la demostración y el desarrollo de un nuevo concepto sobre el uso de las técnicas de biología molecular en la obtención de levaduras modificadas genéticamente, el concepto de Evolución Genómica mediante Diseño Molecular. La idea básica de este nuevo concepto es simple y se basa en imitar a la propia naturaleza en su constante evolución, pero acelerando y dirigiendo el proceso evolutivo con el objeto de seleccionar en un corto periodo de tiempo aquellos cambios genéticos que específicamente hayamos diseñado a escala molecular. Las levaduras no son una entidad invariable en el tiempo, al contrario, como todos los organismos vivos evolucionan con el tiempo. Mediante esta nueva metodología que hemos desarrollado, se consigue acelerar el proceso evolutivo, pues las modificaciones genéticas que hemos introducido se podrían haber efectuado espontáneamente por la levadura en su entorno natural como consecuencia de procesos de recombinación, duplicación o eliminación de elementos genéticos a lo largo de su ciclo reproductivo, aunque indudablemente se habrían perdido sin la presencia de determinadas condiciones de selección y, dada la baja probabilidad de que esos eventos ocurrieran, habrían necesitado de un inmenso periodo de tiempo. Se ha demostrado el concepto de Evolución Genómica mediante Diseño Molecular, mediante la construcción e integración cromosómica de un casete de selección basado en la sobreexpresión del gen YAP1, que da origen a un marcador dominante que confiere resistencia a diversos compuestos tóxicos para las levaduras, tales como cicloheximida y cerulenina. Para el desarrollo de dicho casete de selección nos hemos impuesto y respetado las siguientes condiciones: 1) Utilización de la capacidad de recombinación homóloga de las levaduras del género Saccharomyces; 2) Utilización de material genético procedente exclusivamente de la propia cepa de levadura a evolucionar; 3) El material genético no ha de sufrir ningún paso intermedio de clonaje o expresión en otros sistemas biológicos. Una vez cumplidas todas estas condiciones, las cepas resultantes no deberían responder a la definición oficial de organismos modificados genéticamente de la Unión Europea: ¿organismos en los que su material genético ha sido alterado de una manera que no sucede de forma natural mediante los procesos de reproducción sexual y/o recombinación natural¿. Para alcanzar el objetivo fundamental del proyecto, hemos trabajado inicialmente con un sistema modelo más sencillo, como es el caso de una cepa de una levadura de laboratorio, y a continuación hemos abordado la misma aproximación experimental pero trabajando con una levadura que se emplea en la producción industrial de cerveza tipo ¿lager¿. La metodología experimental que se ha diseñado ha consistido en obtener, sólo mediante reacciones de PCR, una construcción que, posteriormente a su inserción cromosómica mediante recombinación homóloga, pone al gen YAP1 bajo el control de un promotor fuerte de un gen de la ruta de la glicólisis, el promotor del gen PGK1. Se determinó si la sobreexpresión del gen YAP1 en la cepa cervecera evolucionada, era capaz de disminuir la aparición espontánea de mutantes deficientes en respiración (¿petites¿) durante la fermentación del mosto cervecero. La continuada reutilización industrial de la levadura cervecera está asociada con un incremento en la frecuencia de la aparición de ¿petites¿, con el consiguiente efecto negativo sobre el proceso fermentativo. Según los resultados obtenidos, la cepa evolucionada, presenta claramente una menor formación de ¿petites¿ durante su reutilización a lo largo de 10 microfermentaciones sucesivas, con respecto a la cepa parental. Una vez demostrada la viabilidad del concepto de Evolución Genómica mediante Diseño Molecular, el paso siguiente consistió en la aplicación de dicha metodología al desarrollo de levaduras con características de interés industrial. Se han diseñado reorganizaciones cromosómicas sobre 3 tipos de levaduras industriales: a) Una levadura de producción de cerveza tipo¿ lager¿ evolucionada para dar lugar a una baja producción de diacetilo; y en la que el fenotipo buscado se ha obtenido mediante la sobreexpresión del gen ILV5 que codifica para una isomerorreductasa que convierte el ¿-acetolactato en ¿-ß-dihidroxivalerato. De esta forma, se evita la acumulación de ¿-acetolactato en la cerveza y se acorta sensiblemente el proceso de maduración al haberse reducido la producción de diacetilo. La cepa evolucionada consigue disminuir en más de 10 días con respecto a la cepa parental el tiempo necesario para que la concentración de diacetilo esté al nivel que la práctica industrial considera aceptable para dar por finalizado el proceso de ¿lagering¿. b) Una levadura en la que se ha aumentado notablemente su actividad pectinolítica, lo que presenta aplicaciones para su uso en el procesado industrial de material vegetal rico en pectina; y en la que el fenotipo buscado se ha obtenido mediante la sobreexpresión del gen PGU1 que codifica para una endopoligalacturonasa. Se obtuvieron dos nuevas variantes de la cepa parental, una conteniendo el casete de selección y otra en la que dicho casete se eliminó mediante un proceso denominado ¿pop out¿, permitiendo de esta forma la reutilización de dicho casete en sucesivos diseños de reordenación genómica sobre la misma cepa. Ambas variantes presentan un notable incremento de la actividad hidrolítica sobre la pectina sin perjuicio de su producción de etanol ni de su capacidad fermentativa. c) Una levadura vínica comercial que se ha evolucionado en busca de una mejor tolerancia frente a bajas temperaturas. Se ha intentado obtener el fenotipo deseado mediante inactivación del gen INP51 que codifica una enzima inositol polifosfato 5- fosfatasa, implicada en la homeostasis del inositol 4, 5-difosfato, cuya pérdida de función provoca la acumulación de dicho metabolito y, según se ha descrito en la literatura, un aumento de la tolerancia al frío. Se han obtenido nuevas cepas en las que se ha inactivado bien una copia del gen INP51 de la cepa industrial, bien ambas copias. Sin embargo, y contrariamente a lo descrito para la cepas de laboratorio, la inactivación del gen INP51 no aumenta la capacidad de crecimiento frente a bajas temperaturas de la cepa industrial evolucionada. Todos estos ejemplos de aplicación de la metodología desarrollada demuestran la utilidad del concepto de Evolución Genómica mediante Diseño Molecular en la mejora de las cepas de levaduras industriales del género Saccharomyces / Sani, D. (2013). Evolución genómica por diseño molecular de levaduras industriales [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/34325 / TESIS

Se identificaron taxonómicamente los microorganismos aislados de la fermentación espontánea de ají charapita “Capsicum frutescens” mediante técnicas moleculares, fenotípicas y microbiológicas. Para ello, se realizó el seguimiento al proceso fermentativo mediante técnicas fisicoquímicas y microbiológicas tanto de bacterias ácido lácticas (BAL) y levaduras en medios MRS y YPD. En la identificación molecular de especies bacterianas se utilizaron los genes ribosómicos 16S amplificados y cortados con AluI, HaeIII y MseI; y para levaduras se amplificó la región 5.8S con los espaciadores intergénicos colindantes (ITS) y se cortaron con HinfI, CfoI y HaeIII. De igual forma, se realizó la genotipificación de cepas, bacterias y levaduras mediante la técnica REP - PCR usando el primer (GTG)5. Asimismo, se realizó la secuenciación parcial de los genes ribosómicos amplificados 16S y la región 5.8S - ITS para bacterias y levaduras respectivamente. Además, se analizó la microbiota del ají charapita sin fermentar. De este modo, se identificó a Lactobacillus plantarum, Leuconostoc pseudomesenteroides y Weissella confusa, la última especie se aisló solo en el ají charapita sin fermentar. Con respecto a las levaduras se identificaron a Kodamaea ohmeri, Hanseniaspora opuntiae, Debaryomyces nepalensis, Pichia kudriavzevii y Candida parapsilosis. En conclusión, mediante técnicas microbiológicas y moleculares, se identificaron a las BAL y levaduras, siendo Lactobacillus plantarum predominante en la fermentación espontánea del ají charapita. / Perú. Ministerio de la Producción. Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad (Innóvate Perú). Fondo para la Innovación, la Ciencia y la Tecnología (FINCyT) / Tesis

DNA damage is an ongoing threat to both the ability of the cell to faithfully transmit genetic information to its offspring as well as to its own survival. In order to maintain genomic integrity, eukaryotes have developed a highly conserved mechanism to detect, signal and repair damage in DNA, known as the DNA damage response (DDR). In fission yeast the two DDR pathways converge at the regulation of single transcriptional factor complex (MBF) resulting in opposite directions. We have shown that when the DNA-synthesis checkpoint is activated, Max1 is phosphorylated by Cds1 resulting in the abrogation of its binding to MBF. As a consequence, MBF-dependent transcription is maintained active until cells are able to overcome the replication challenge. In contrast, upon DNA damage, Chk1 the effector kinase of DNA damage checkpoint is activated and blocks the cell cycle progression, inducing DNA repair and repressing the MBF dependent transcription. We have revealed that Cdc10 is the target of the DNA-damage checkpoint and when cells are treated with MMS or are exposed to IR, Chk1 phosphorylates Cdc10 inducing the exit of MBF from chromatin. The consequence is that under these conditions, MBF-dependent transcription is repressed. Thus, Max1 and Cdc10 couple normal cell cycle regulation and the DNA-synthesis and DNA-damage checkpoints into MBF.

Selecciona las cepas que puedan ser usadas en la remoción de cadmio (Cd+2) en hidroponía, se trabajaron con cinco cepas de levaduras proporcionadas por el laboratorio de Microbiología Ambiental y Biotecnología, las cuales fueron sometidas a ensayos de resistencia, concentración letal media (CL50), cinética de crecimiento, cinética de biosorción. En base a los parámetros mencionados se seleccionaron a las cepas IM y 25.1. Debido a que se determinó que la CL50 para el Cd+2 fue de 70 ppm para ambas cepas, la biosorción en medio base (MB) con 40 ppm de Cd+2 fue de 64,2 y 52,0% respectivamente. Para los ensayos de biosorción en hidroponía, un grupo de plantas de tomate fueron inoculadas con levaduras a una concentración aproximada de 107 UFC/ml, además de ello se tuvieron dos grupos control correspondiente a plantas expuestas a 10 ppm de Cd+2 y plantas cultivadas en solución hidropónica ambos sin inóculo de levaduras. Luego de 20 días, se retiraron y se midieron el tamaño de las plantas de ambos grupos y se determinaron las concentraciones de Cd+2 acumulado en raíces, tallos y hojas mediante espectrofotometría de absorción atómica. Las levaduras IM y 25.1 disminuyeron la acumulación de Cd+2 en las plantas de tomate en 36,45% (1,49 ppm) y 29,39% (1,20 ppm) respectivamente. Además se logró evidenciar que dichas cepas estimularon el crecimiento de las plantas de tomate con respecto a los controles. Las cepas IM y 25.1 fueron identificadas molecularmente como Yarrowia lipolytica. Por tanto las levaduras presentan potencial para ser usados en procesos de biorremediación de Cd+2 y también como bioestimulantes en el crecimiento de plantas. / Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima). Vicerrectorado de Investigación y Posgrado / Perú. Ministerio de la Producción. Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad (Innóvate Perú). Fondo para la Innovación, la Ciencia y la Tecnología (FINCyT) / Tesis

The meiotic cell cycle is modified from the mitotic cell cycle by having a premeiotic S phase which leads to high levels of recombination, two rounds of nuclear division with no intervening DNA synthesis, and a reductional pattern of chromosome segregation. Rem1 is a cyclin that is expressed only during meiosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Cells in which rem1 has been deleted show a decreased intragenic meiotic recombination and a delay at the onset of meiosis I. When ectopically expressed in mitotically growing cells, Rem1 induces a G1 arrest followed by severe mitotic catastrophes. Here we show that rem1 expression is regulated at the level of both transcription and splicing, encoding for two proteins with different function depending on the intron retention. We have determined that the regulation of rem1 splicing is not dependent on any transcribed region of the gene. Furthermore, when the rem1 promoter is fused to other intron-containing genes, the chimeras show a meiotic-specific regulation of splicing, exactly as endogenous rem1. This regulation is dependent on two transcription factors of the forkhead family, Mei4 and Fkh2. While Mei4 induces both transcription and splicing of rem1, Fkh2 is responsible for the intron retention of the transcript during vegetative growth and pre-meiotic S phase. / El ciclo meiótico se diferencia del ciclo mitótico por tener una fase S pre-meiótica caracterizada por altos niveles de recombinación, dos rondas de división nuclear sin síntesis de DNA entre las dos y una segregación cromosómica reduccional. Rem1 es una ciclina que sólo se expresa en meiosis en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe. Celulas con rem1 deleccionado presentan una tasa de recombinación intragénica disminuida y un retraso en el inicio de meiosis I. Cuando se expresa ectópicamente en células creciendo vegetativamente, Rem1 induce un arresto en G1 seguido de catástrofe mitótica. Este trabajo describe que la expresión de rem1 está regulada a nivel de la trascripción y el procesamiento, codificando para dos proteínas con funciones diferentes dependiendo de la retención intrónica.. Hemos determinado que la regulación del splicing de rem1 no depende de ninguna región transcrita del gen. Además, cuando el promotor se fusiona a otros genes que contienen intrones, las quimeras presentan una regulación específica de meiosis como el rem1 endógeno. Esta regulación depende de dos factores de transcripción de la familia Forkhead, Mei4 y Fkh2. Mientras Mei4 induce la transcripción y el splicing de rem1, Fkh2 es responsable de la retención intrónica del tránscrito durante crecimiento vegetativo y fase S pre-meiótica.

When DNA replication is challenged, cells activate a DNA synthesis checkpoint blocking cell cycle progression until they are able to overcome the replication defects. In fission yeast, Cds1 is the effector kinase of this checkpoint, inhibiting M phase entry, stabilizing stalled replication forks and triggering transcriptional activation of S-phase genes; the molecular basis of this last effect remains largely unknown. The MBF complex controls the transcription of S-phase genes. We have purified novel interactors of the MBF complex and among them we have identified the repressor Max1. When the DNA synthesis checkpoint is activated, Max1 is phosphorylated by Cds1 resulting in the abrogation of its binding to MBF. As a consequence, MBF-dependent transcription is maintained active until cells are able to overcome this challenge. / Cuando la replicación del DNA se ve alterada, las células activan un mecanismo de control bloqueando la progresión del ciclo celular hasta que son capaces de superar el daño. En la levadura de fisión, Cds1 es la proteína kinasa efectora de dicha respuesta, mediante inhibición de la entrada en fase M, estabilización las horquillas de replicación bloqueadas, e inducción de la activación de la transcripción de los genes de fase S; siendo la base molecular de este último proceso poco conocida. El factor de transcripción MBF controla la transcripción de los genes de fase S. Hemos purificado proteínas que interaccionan con MBF, y entre ellas, hemos identificado al represor Max1. Cuando el checkpoint de síntesis de DNA es activado, Max1 es fosforilado por la kinasa Cds1, y esto se traduce en la disociación de Max1 del complejo MBF. Como consecuencia, la transcripción MBF-dependiente se mantiene activa hasta que las células son capaces de superar el daño.

Las levaduras del género Saccharomyces se encuentran entre los primeros microorganismos que fueron explotados por el hombre. Su habilidad para transformar diferentes azúcares en etanol y CO2, ha sido utilizada en la producción de bebidas alcohólicas y en la elaboración de alimentos como el pan, constituyendo así uno de los primeros ejemplos de la aplicación biotecnológica de un microorganismo. En los últimos años la levadura se ha revelado como el microorganismo eucariótico más útil para estudios biológicos y para la los nuevos desarrollos en el campo de la Biotecnología. Las razones que justifican el uso continuado de cepas industriales de S. cerevisiae son su habilidad para transformar eficazmente azúcares en etanol, dióxido de carbono y numerosos metabolitos secundarios que dan lugar al sabor y aroma característico de cada producto y su capacidad para soportar el estrés causado principalmente por la temperatura, la presión osmótica, la presión hidrostática, alta densidad celular, el etanol y la competición con bacterias y otras levaduras silvestres. No obstante, se puede mejorar su tolerancia al estrés consiguiendo así beneficios potenciales en los procesos de producción de alimentos y bebidas alcohólicas. La fermentación a bajas temperaturas resulta clave en los procesos de elaboración de determinadas bebidas alcohólicas con características organolépticas que se ajusten a los perfiles de calidad sensorial y de preferencia del consumidor. La respuesta celular que se desencadena tras someter las células a bajas temperaturas no está bien caracterizada, pues aunque se sabe que tiene como consecuencia la síntesis de una serie de proteínas, éstas no están conservadas en un rango amplio de organismos. El objetivo de la presente Tesis es la identificación y caracterización de aquellos genes que por un aumento de su expresión, confieran una mayor capacidad de crecimiento a temperaturas bajas en cepas de S. cerevisiae. Así, demostramos que los efectos del frío se v / Vicent González, IE. (2009). Aislamiento e identificación de genes de saccharomyces cerevisiae implicados en la tolerancia a frío [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/4504 / Palancia

Se desarrolló cinco sistemas automatizados utilizando análisis por inyección secuencial (SIA) y análisis por inyección en flujo multijeringa (MSFIA). Se desarrolló un SI-analizador para la determinación de formaldehído utilizando la reacción de Hantzsch. El analizador fue aplicado a la monitorización en un cultivo de P. pastoris. Se desarrolló un SI-analizador para la determinación de glicerol y sorbitol. Se utilizó periodato para la reacción de Malaprade. El formaldehído generado fue cuantificado con la reacción de Hantzsch. El sistema incluyó la dilución de la muestra y procedimientos seleccionado por decisión inteligente del programa o por el usuario. Se lo aplicó a la monitorización en cultivos de P. pastoris.Se desarrolló un sistema de electroforesis capilar (CE) acoplado a un SIA aplicado a la separación de nitrofenoles. Se acopló por primera vez MSFIA con CE para pre-concentración en fase sólida y separación de nitrofenoles. Ambos sistemas mostraban recuperaciones satisfactorias para aguas ambientales. / Five analytical systems using Sequential Injection Analysis (SIA) and Multisyringe Flow Injection Analysis (MSFIA) were developed and applied with satisfactory analytical performance. A SI-analyzer for formaldehyde was developed automating Hantzsch reaction. It was successfully applied to formaldehyde monitoring in continuous medium filtrate of P. pastoris cultivation. A second SI-analyzer was developed for the determination of glycerol and sorbitol. Periodate was used as additional reagent to carry out Malaprade reaction and formaldehyde generated by polyalcohol oxidation was quantified. The system included automated sample dilution and procedures for two working ranges, selected by smart software decision or user-input. It was applied to monitoring of P. pastoris cultivations.A capillary electrophoresis (CE) system was developed and coupled to SIA. It was applied to the determination of nitrophenols. MSFIA and CE were coupled for the first time. Solid phase concentration and separation of nitrophenols were automated. The systems were applied to environmental water samples.