La sécrétion de lipase, la lipolyse extracellulaire et l’absorption des acides gras (AGL) ont été étudiés chez Yarrowia lipolytica (YL) en présence d’huile d’olive et/ou de sucrose. Des mesures d’activité lipase et d’immuno-révélation ont montré que l’activité lipase présente dans le milieu de culture provenait principalement de la lipase YLLIP2. L’huile d’olive induit la production de lipase qui est principalement associée aux cellules pendant les premières heures de cultures. YLLIP2 est ensuite libérée dans le milieu de culture avant d’être totalement dégradée par les protéases. Les triglycérides (TG) sont dégradés alors que la lipase est encore attachée aux cellules. Les produits de lipolyse présents dans le milieu de culture et à l’intérieur des cellules ont été quantifiés par chromatographie TLC-FID et GC. Les niveaux intracellulaires d’AGL et de TG augmentent transitoirement et dépendent de la source de carbone utilisée. Une accumulation maximum de 37,8 % w/w de lipides est observée avec l’huile d’olive seule. Cette étude montre que la levure YL est un modèle intéressant pour étudier la lipolyse extracellulaire et l’absorption des acides gras par les cellules / Lipase secretion, extracellular lipolysis and fatty acid (FFA) uptake were quantified in Yarrowia lipolytica (YL) grown in the presence of olive oil and/or sucrose. Lipase assays and western blot analysis indicated that the lipase activity measured in YL cultures mainly resulted from YLLIP2 lipase. Lipase production was triggered by olive oil and YLLIP2 remained associated with the yeast cells during the first hours of culture. It was then released in the culture medium before it was totally degraded by the alkaline protease. Olive oil triglycerides (TG) were degraded when the lipase was still attached to the cell wall. The fate of lipolysis products in the culture medium and inside the yeast cell were investigated by quantitative TLC-FID and GC analysis. Intracellular levels of FFA and TG increased transiently and were dependent on the carbon sources. A maximum fat storage of 37.8% w/w was observed with olive oil alone. The present study shows that yeasts are interesting models for studying extracellular lipolysis and fat uptake by the cell

Depuis quelques décennies, la communauté scientifique s'intéresse de plus en plus à la recherche de nouvelles levures pour de nouvelles applications dans le domaine des biotechnologies blanches. De l'étude de la biodiversité à l'étude des propriétés métaboliques, les recherches visant à sélectionner de nouvelles levures avec des propriétés intéressantes pour l'industrie se sont intensifiées. Localisées dans le Sud-Ouest de l'océan Indien, les îles de La Réunion et de Madagascar sont aujourd'hui considérées comme des Hot Spot de la biodiversité. La grande diversité de plantes et de fruits tropicaux fournis des habitats naturels pour la propagation de nombreux microorganismes tels que les levures. A l'instar de ce qui se passe chez les plantes endémiques, nous avons formulé l'hypothèse que certains microorganismes ne peuvent être trouvés nulle part ailleurs que dans ces îles tropicales. 101 souches de levures réparties en 26 espèces différentes ont ainsi été isolées dans cette étude à partir de 13 fruits tropicaux récoltés aléatoirement dans les régions d'Antsirabe à Madagascar et de St-Paul à La Réunion. L'identification des espèces a été réalisée par analyse des séquences des domaines D1/D2 de la grande sous-unité des gènes de l'ARN ribosomique (ARNr). Les souches caractéristiques ont ensuite fait l'objet d’une analyse systématique par micro-extraction en phase solide couplée à une analyse chromatographique en phase gazeuse et couplé à un spectromètre de masse (ET-MEPS-CPG/SM) pour déterminer leurs capacités à produire des arômes. Parmi elles, deux souches isolées sur le fruit du poc-poc (Physalis peruviana) et sur le cacao (Theobroma cacao var. Criollo) semblent appartenir à de nouvelles espèces, probablement endémiques de la zone géographique étudiée. En effet, ces souches, EGPOC17 et EB23, présentent un faible pourcentage d'identité avec les séquences de l'ARNr des levures Rhodotorula mucilaginosa (97,1% d'identité) et Candida pararugosa (97,4% d'identité). 52 composés organiques volatiles (COVs) différents, classés en cinq grandes classes de molécules, les acides, les alcools, les aldéhydes, les cétones et les esters ont ainsi été identifiés. Une analyse statistique a ensuite été réalisée pour tenter de classer ces souches par catégories en fonction de leurs caractéristiques métaboliques. Avec une production de 32 molécules différentes sur les 52 identifiées, la levure Saprochaete suaveolens (anciennement connue sous le nom de Geotrichum fragrans) est de loin la souche produisant le plus grand nombre de composés d'arômes, en particulier d'esters et de composés insaturés. D'autres souches comme Candida quercitrusa, Debaryomyces nepalensis, Pichia kluyveri et Sporidiobolus pararoseus semblent également être intéressantes pour la production d'acides, d'alcools et de cétones. Parmi les COVs identifiés, des composés comme le 2 méthylbut-2-énoate d'éthyle (tiglate d'éthyle), le 2-méthylbut-2-énoate de 3 méthylbutyle (tiglate d'isoamyle), le 2-méthylbut-2-énoate de butyle (tiglate de butyle), 3-méthylbut-2-énoate d'éthyle, 2-méthylbut-2-énoate de 2-méthylpropyle et le but-2-énoate d'éthyle ont été retrouvés spécifiquement chez la levure Saprochaete suaveolens. La présence de ces molécules, très peu décrites chez les levures dans la littérature, suggère des relations taxonomiques de type «arôme-espèce» ou «arôme-genre » chez les levures. / In recent years, there has been an increasing interest in identifying and characterizing the yeast ecosystems associated with diverse types of habitat because of the many potential desirable technological properties of these microorganisms, especially in food applications. In this study, a total of 101 yeast strains were isolated directly from the skins of tropical fruits collected in several locations in the South West Indian Ocean (in the regions of Anstirabe in Madagascar and Saint Paul in Reunion Island). Species identification was determined by sequence analysis of the D1/D2 domains of the large subunit (LSU) ribosomal RNA gene. The strains were classified into 26 different species and tested for their potential to produce aromatic flavouring compounds. Among the isolated strains, two species isolated from the skins of Cape gooseberry and Cocoa beans appeared to represent putative new yeast species. Strains EGPOC17 and EB23 showed LSU D1/D2 sequence homologies of only 97.1% and 97.4% with the yeasts Rhodotorula mucilaginosa and Candida pararugosa, respectively. In total, 52 Volatile Organic Compounds (VOCs) were detected by Head Space Solid Phase Micro Extraction coupled to Gas Chromatography and Mass Spectroscopy (HS-SPME-GC/MS) analysis and these were classified into five main groups, namely, acids, alcohols, aldehydes, ketones and esters. In order to classify and discriminate the yeast biodiversity, statistical analysis was performed which allowed the yeasts to be categorized according to their flavour production. With a production of 32 compounds among 52 VOCs, Saprochaete suaveolens (Geotrichum fragrans) seemed to be the best producer of flavour compounds, especially esters and unsaturated compounds. Other yeast species including Candida quercitrusa, Debaryomyces nepalensis, Pichia kluyveri and Sporidiobolus pararoseus also appeared of potential interest based on their abilities to produce acid, alcohol and carbonyl compounds. Among the VOCs detected, 6 uncommon compounds namely ethyl but-2-enoate, ethyl 2-methylbut-2-enoate (ethyl tiglate), ethyl 3-methylbut-2-enoate, 2-methylpropyl 2-methylbut-2-enoate, butyl 2-methylbut-2-enoate and 3 methylbutyl 2-methylbut-2-enoate were identified as possible yeast species specific flavour markers.

Un nouveau procédé intensifié de vinification continue avec un mélange de levures S.cerevisiae et Sch.pombe immobilisées dans des billes d’alginate est proposé. A l’échelle laboratoire, l’étude de la teneur en billes et de la configuration du réacteur conduit à l’obtention d’un réacteur de type lit fixe permettant une production de vin en 35 heures. Des validations du procédé aux échelles pilote (170 L) puis industrielle (120 hL) montrent que, en cave, du vin de qualité semblable au témoin est produit en 2 à 3 jours. Une analyse du comportement du réacteur a identifié des raisons de pertes de performances liées à l’hydrodynamique lors du changement d’échelle ainsi que des axes améliorations possibles. Ce procédé permet d’obtenir un vin de qualité maitrisée et un gain de temps de plusieurs semaines / From a batch to another, produced wines are usually different because of the different alcoholic and malolactic fermentation courses. To blend wines quality and continue wine production industrialization, a new continuous process, using Ca-alginate immobilized yeast cells, was developed for red wine-making. Working with a blending of S.cerevisiae and Sch.pombe allowed the regrouping of the alcoholic and malolactic fermentations in a unique step. After testing different reactor set-ups at lab scale, the selected process, a vertical bed reactor, was used in real wine-making conditions, firstly in a pilot reactor (170 L) and then in an industrial one (120 hL). The results showed that continuous wine-making was possible in 2 to 3 days. The wine presented nearly the same sensory profile compared to a classical one. Thanks to the analysis of the reactor behaviour, we were able to explain the efficiency losses linked to the hydrodynamic, observed during the scale-up. This new intensified process enables to obtain a wine with a controlled quality and to save several weeks of production time

Le développement des techniques d'ingénierie génétique et celles d'imagerie en microscopie de fluorescence ont ouvert la voie à l'étude du mouvement et de la structure des chromosome dans les cellules vivantes. Depuis quelques années, l'avènement de ces outils a fait naître une biophysique du noyau, dont l'objectif est de comprendre avec des modèles physiques comment s'organise le génome dans une cellule et comment il se réorganise sous l'effet de stimuli biologiques ou chimiques. L'objectif de mon travail de thèse a consisté à développer des outils permettant de mesurer précisément les déplacements des chromosomes dans les cellules vivantes, d'automatiser le processus de traitement des données et de développer des modèles quantitatifs d'analyse des données expérimentales. Dans ce travail de thèse pluridisciplinaire, nous avons à la fois optimisé une chaîne d'acquisition de microscopie de fluorescence afin de maximiser la qualité de films de levures vivantes, réalisé un algorithme de suivi de particules et de reconnaissance de forme dédiés à la levure, ainsi que des outils de traitement automatisés des trajectoires pour systématiser le processus de traitement des données. Ces méthodes ont permis de construire des modèles originaux de structure et de dynamique des chromosomes in vivo chez la levure saccharomyces cerevisiae.

En fonction du contexte génétique d’un individu et de son environnement, les mutations responsables de certaines maladies génétiques peuvent avoir des effets différents. Ces effets créent donc un besoin pour des traitements médicaux personnalisés. Ces traitements, pour être développés, demandent une meilleure compréhension de l’implication du contexte génétique au niveau moléculaire, incluant le mode d’action des gènes modificateurs. Pour mieux comprendre leur mode d’action, dans le cadre de mon projet, j’utilise un modèle du Syndrome de Wiskott-Aldrich chez la levure Saccharomyces cerevisiae impliquant le gène LAS17. Grâce à des expériences d’évolution expérimentale, des gènes ciblés par des mutations et, par la suite, une molécule ont été identifiés permettant de corriger le phénotype malade. Dans certains cas, cette correction est spécifique au contexte génétique et la majorité des gènes ciblés codent pour des partenaires d’interaction physique de Las17p. Une exception est la sous-unité Cnb1p de la calcineurine, la protéine ciblée par la cyclosporine A, qui ne fait pas partie de ces partenaires. La réponse à cette molécule est pourtant spécifique à un contexte génétique. J’ai utilisé différentes approches, dont des analyses QTL, pour identifier les gènes modificateurs sous-jacents à cette spécificité. Plusieurs locus ont été identifiés et la plupart incluaient des gènes au niveau du réseau d’interaction protéique ou génétique de Las17p et des sous-unités de la calcineurine. Le gène candidat principal, END3, un interactant physique de Las17p, semble présenter des effets de dosage au niveau protéique. Les liens avec la littérature suggèrent une importance dans la balance protéique de réseaux d’interaction à la fois du gène causant la maladie et celui ciblé par le traitement. L’ensemble des résultats du modèle soutiennent l’importance de tenir compte du contexte génétique pour élaborer de nouveaux traitements et suggèrent que les partenaires d’interactions devraient être les principales cibles de ces interventions. / Depending on the genetic background of an individual and their environment, the mutations responsible for some genetic diseases may have different effects. These effects create a need for personalized medical treatments. To be developed, these treatments require a better understanding of the implication of the genetic background at the molecular level, including the mode of action of modifier genes. To better understand their mode of action, as part of my project, I used a model of the Wiskott-Aldrich Syndrome in the yeast Saccharomyces cerevisiae involving the LAS17 gene. Through experimental evolution experiments, several genes targeted by mutations and, subsequently, a molecule have been identified to rescue the diseased phenotype in yeast. In some cases, this phenotypic rescue was specific to the genetic context and the majority of the targeted genes coded for Las17p physical interaction partners. An exception was the Cnb1p subunit of calcineurin, the protein targeted by cyclosporin A, which was not one of these partners. The response to this molecule was nevertheless specific to a genetic background. I used different approaches, including QTL analysis, to identify modifier genes underlying this specificity. Several loci were identified and most of them included genes in the protein or genetic interaction networks of Las17p and of calcineurin subunits. The main candidate gene, END3, a physical interactant of Las17p, appeared to exhibit protein-level effects. The literature suggests an importance in the protein balance of the interaction networks of both the gene causing the disease and the one targeted by the treatment. The overall model results support the importance of considering the genetic background for developing new treatments and suggest that interaction partners should be primary targets for these interventions.

L'objectif du travail effectué était la recherche de nouvelles substances actives d'origine végétale, présentant soit une activité antiplasmodiale soit une activité antifongique. Cette étude a été menée suivant deux stratégies différentes: l'étude de remèdes traditionnels antipaludiques identifiés suite à des enquêtes ethnopharmacologiques, et la mise en évidence des propriétés antifongiques d'huiles essentielles grâce à une stratégie bioinspirée. La première partie du travail a permis de mettre en évidence le rôle d'un quassinoïde connu, la simalikalactone D, dans l'activité antipaludique d'une tisane de jeunes feuilles fraîches de Quassia amara L. (Simaroubaceae). Dans le cas de la décoction de rameaux de Psidium acutangulum DC. (Myrtaceae), c'est cette fois un mélange de flavonoïdes glycosylés qui est responsable de l'activité du remède. Dans le cadre de la recherche de nouvelles substances antifongiques, le criblage effectué a permis d'identifier de nombreuses huiles essentielles présentant des activités intéressantes, validant ainsi la démarche bioinspirée retenue dans ce cas. L'huile essentielle d'Otacanthus azureus (Linden) Ronse a en particulier démontré une activité remarquable, à la fois seule et en combinaison avec des antifongiques azolés. Enfin, l'étude métabolomique de la composition des huiles essentielles a permis de mettre au point un outil pouvant orienter la sélection des huiles en fonction des données obtenues en GC/MS dans l'optique de la recherche de nouvelles substances antifongiques. Ce travail démontre donc la validité des stratégies retenues - ethnopharmacologie et bioinspiration - dans la recherche de nouvelles substances bioactives.

Une question centrale de la génétique moderne est de mieux comprendre comment la variation génétique présente au sein d’individus d’une même espèce influence la diversité phénotypique et l’évolution. La levure modèle Saccharomyces cerevisiae offre une occasion unique d’apporter des éléments de réponse à cette question à travers la dissection de l’architecture génétique de la variation de tolérance à des stress environnementaux à l’échelle d’une population. Mon étude révèle un niveau supplémentaire de complexité de la relation génotype-phénotype où finalement les caractères supposés les plus simples, dits Mendéliens (déterminisme strictement monogénique) peuvent se révéler être complexes (déterminisme multigénique) selon le fond génétique en raison de l’action de gènes modificateurs, d’interactions épistatiques et/ou de suppresseurs. Toutefois, les processus évolutifs peuvent être bien différents en fonction des espèces. Afin de mieux les décrypter, je me suis également intéressée à Lachancea kluyveri, une levure phylogénétiquement distante de S. cerevisiae. Cette espèce présente une diversité génétique plus élevée et constitue une ressource encore peu exploitée. L’exploration de la diversité phénotypique et la détermination de leurs origines génétiques initiées dans cette étude sont extrêmement prometteuses et apportent de solides fondations pour l’étude à la fois de l’architecture génétique des caractères et de l’évolution de la relation génotype-phénotype au sein de diverses espèces de levures. / A central issue of modern genetics is to better understand how genetic variations between individuals within a species influence the phenotypic diversity and the evolution. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae as a model organism offers a unique opportunity to address this issue through the dissection of the genetic architecture of stress tolerance across a population. My study reveals an additional level of complexity of the genotype-phenotype relationship. Indeed, simple Mendelian traits (monogenic determinism) may become more complex (multigenic determinism) depending on genetic background due to the action of modifier genes, epistatic interactions and / or suppressors. However, evolutionary processes can be very different depending on the species. That is why a non-conventional yeast species namely Lachancea kluyveri (formerly S. kluyveri) was also studied. This species distantly related to S. cerevisiae has a higher genetic diversity and remains a relatively unexplored resource. The exploration of the phenotypic diversity and the determination of the genetic origins initiated in this study lay foundations for the analysis of the genetic architecture of traits and the evolution of the genotype-phenotype relationship within diverse yeast species.

Les protéines associées aux membranes sont d'une importance cruciale pour la cellule. Cependant, en raison d'une plus grande difficulté de manipulation, les données biochimiques les concernant sont très lacunaires, notamment au point de vue de la formation de complexes entre ces protéines.<p><p>L'objectif global de notre travail consiste à combler ces lacunes et à préciser les interactions entre protéines membranaires chez la levure Saccharomyces cerevisiae et plus précisément, entre les transporteurs. Nous avons commencé notre travail par l'étude d'un jeu de données d'interactions à grande échelle entre toutes les perméases détectées par une méthode de double hybride spécialement adaptée aux protéines insolubles (split ubiquitin). Premièrement, la qualité des données a été estimée en étudiant le comportement global des données et des témoins négatifs et positifs. Les données ont ensuite été standardisées et filtrées de façon à ne conserver que les plus significatives. Ces interactions ont ensuite été étudiées en les modélisant dans un réseau d'interactions que nous avons étudié par des techniques issues de la théorie des graphes. Après une évaluation systématique de différentes méthodes de clustering, nous avons notamment recherché au sein du réseau des groupes de protéines densément interconnectées et de fonctions similaires qui correspondraient éventuellement à des complexes protéiques. Les résultats révélés par l'étude du réseau expérimental se sont révélés assez décevants. En effet, même si nous avons pu retrouver certaines interactions déjà décrites, un bon nombre des interactions filtrées semblait n'avoir aucune réalité biologique et nous n'avons pu retrouver que très peu de modules de protéines de fonction semblable hautement inter-connectées. Parmi ceux-ci, il est apparu que les transporteurs d'acides aminés semblaient interagir entre eux.<p><p>L'approche expérimentale n'ayant eu que peu de succès, nous l'avons contournée en utilisant des méthodes de génomique comparative d'inférence d'interactions fonctionnelles. Dans un premier temps, malgré une évaluation rigoureuse, l'étude des profils phylogénétiques (la prédiction d'interactions fonctionnelles en étudiant la corrééélation des profils de présence - absence des gènes dans un ensemble de génomes), n'a produit que des résultats mitigés car les perméases semblent très peu conservées dès lors que l'on considère d'autres organismes que les \ / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les structures d'acto-myosine sont impliquées dans de nombreuses fonctions cellulaires. Comprendre leur organisation et leur comportement collectif est toujours difficile. Nous avons étudié l'anneau cytokinétique dans les cellules de mammifères et dans les levures de fission, en orientant les cellules dans les microcavités, ce qui permet de voir l'anneau dans un seul plan focal. Avec cette configuration, nous révélons de nouvelles structures et des dynamiques distinctes pour les deux systèmes cellulaires. Dans les cellules de mammifères, nous trouvons des motifs réguliers de la myosine et la formine. Les caractéristiques de ces motifs sont stables tout au long de sa fermeture et leur apparition coïncide avec la constriction. Nous proposons que ce phénomène est une propriété inhérente du réseau d'acto-myosine et que la formation de ces motifs entraîne une augmentation du stress. Ces hypothèses sont confirmées par notre modèle en champ moyen. Par contraste, l'anneau de levure de fission montre des inhomogénéités tournantes de l'actine, de la myosine, des protéines de la construction de la paroi (Bgs) et d'autres protéines. La dynamique des inhomogénéités de myosine est inchangée, si la croissance de la paroi est inhibée. Cependant, l'inhibition du mouvement des inhomogénéités conduit à l'arrêt de la fermeture. Nous proposons que la fermeture de l'anneau est entraînée par la rotation de l'actine et de la myosine qui tirent des protéines Bgs, lesquelles construisent ainsi le septum. Cette hypothèse est confirmée par nos calculs et par des simulations numériques. Nous suggérons que la transition entre les états de différents ordres et dynamiques pourrait être une façon de réguler in vivo les systèmes d'acto-myosine. / Actomyosin structures are involved in many cell functions. Understanding their organization and collective behavior is still challenging. We study the cytokinetic ring in mammalian cells and in fission yeasts, by orienting cells in microcavities. This allows seeing the ring in a single plane of focus. With this setup, we reveal new structures and distinct dynamics for both cellular systems. In mammalian cells we find a pattern of regular clusters of myosin and formin. The characteristics of this pattern are stable throughout closure and its formation coincides with the onset of constriction. We propose that its characteristic is an inherent property of the actomyosin network and that its formation leads to an increase in stress generation. These hypotheses are supported by our theoretical mean field model. In contrast, fission yeast rings show rotating inhomogeneities (speckles), i.e. rotations of actin, myosin, cell wall building proteins (Bgs) and other proteins. Myosin speckles dynamic is unchanged, if wall growth is inhibited. However, the inhibition of speckle motion leads to stalled closure. We propose that the ring closure is driven by the rotation of actin and myosin, which pull Bgs thereby building the septum. This model is supported by our calculations and by numerical simulations. We suggest that the transition between states of different orders and dynamics might be a way to regulate actomyosin systems in vivo.

Les microorganismes sont essentiels au maintien et au fonctionnement des écosystèmes. Dans certains produits alimentaires, la communauté microbienne, composée principalement de levures et de bactéries lactiques, fermente les sucres, affecte positivement les qualités organoleptiques du produit et augmente sa durée de conservation. C’est le cas du levain de panification. Cette thèse visait principalement à décrire les patterns de diversité des levures de levains français produits à partir de farine issue de l’agriculture biologique et à conserver une partie de cette diversité. Grâce à des méthodes d’analyses culturales et non culturales de la diversité des levures, nous avons mis en évidence une diversité spécifique caractéristique de chaque levain étudié. Nous avons aussi montré la dominance du genre Kazachstania et la convergence des souches isolées de levain pour la capacité à consommer du raffinose et du saccharose. Bien que la densité et la composition en espèces varient entre deux levains, aucune structuration spatiale de la diversité n’a été mise en évidence. Les pratiques de panification et leurs effets sur la diversité des communautés microbiennes ont également été analysés. Deux typologies de pratiques de panification (plutôt « intensives » et plutôt « extensives »), affectant l’espèce dominante des populations de levures, ont été révélées. / Microorganisms are essential for the maintenance and functioning of the ecosystems. In some food products, microbial community, mainly composed by yeasts and lacid actic bacteria which ferment sugars, positively affects organoleptic qualities and shelf life of the product. It is the case of bread sourdough. This PhD aimed at describing yeast diversity patterns of organic French bread sourdoughs and conserving a part of this diversity. Using cultural-Based and non-Cultural based analyses of yeast diversity, we highlighted a unique specific diversity of each sourdough. We also shown the predominance of Kazachstania genus and a convergence of sourdoughs’ yeasts isolates for the ability to consume raffinose and sucrose. Although density and species composition varied between sourdoughs, no spatial pattern was highlighted. Bread-Making practices and their effects on microbial communities’ diversity were also analyzed. Two bread-Making practice typologies (quite « intensive » and quite « extensive »), affecting dominant yeast species were also revealed.