Dans le contexte actuel d'allongement de l'espérance de vie, la prévalence et le coût de prise en charge des maladies liées à l'âge telles que l'ostéoporose sont de plus en plus importants. Dans le cadre du développement de nouvelles stratégies de prise en charge des pathologies osseuses, la nutrition offre un potentiel évident et représente une excellente solution alternative aux traitements habituels. Bien que trop marginales, les études des activités biologiques de certains aliments ont pourtant d'ores et déjà montré des effets protecteurs sur l'acquisition du capital osseux et sa préservation par le biais de leurs propriétés anti-inflammatoires et antioxydantes. A ce titre, la consommation de grenade est envisagée car elle fait actuellement l'objet d'intérêts scientifiques croissants ayant déjà suggéré ses avantages nutritionnels et pharmacologiques pour la prévention de certaines pathologies chroniques associées au vieillissement. Dans le cadre du projet de thèse, les premiers travaux réalisés, focalisés donc sur la grenade, ont permis de dégager le concept selon lequel les propriétés biologiques de ce fruitexceptionnel seraient expliquées par la composition particulière de ses différentes parties : en polyphénols pour le jus (anthocyanines) et la peau (ellagitannins) et en acide punicique pour les pépins, et surtout au potentiel anti-oxydant et anti-inflammatoire de ces molécules. Cette hypothèse a donné lieu à une première étude à vocation phytochimique qui a permis de déterminer, de standardiser, produire et caractériser deux types d'extraits de grenade titrés en molécules d'intérêt (acide punicique et ellagitannins). Nous avons ensuite étudié l'impact de la consommation du fruit (donné dans sa totalité) ou de ses principales parties (jus et peau) ou encore d'extraits concentrés en ellagitannins et en acide punicique, sur la biologie osseuse, dans un modèle expérimental d'ostéoporose post-ménopausique bien décrit (ostéopénie consécutive à une carence oestrogénique induite par ovariectomie chez des souris C57bl6/j). Cette étude préclinique a permis de montrer que tous les régimessupplémentés en grenade (quelle que soit la partie) permettent de limiter les processus de déminéralisation et l'altération micro-architecturale de l'os, s'expliquant par une réduction des marqueurs de résorption osseuse et une amélioration de ceux de la formation ; et une diminution des paramètres inflammatoires, et oxydants. Ensuite, afin de déterminer les structures médiatrices de ces effets, une approche originale ex-vivo a permis d'étudier plus finement les mécanismes cellulaires ostéoblastiques et ostéoclastiques associés à la consommation des extraits de grenade testés. Cette analyse a été développée de façon à tenir compte du métabolisme particulier de ces micronutriments et donc des modifications systémiques engendrées suite à l'ingestion des extraits. Ce travail a permis de mettre en évidence que les effets observés in-vivo sur l'os,pouvaient être expliqués par une action directe aussi bien sur les ostéoblastes que sur les ostéoclastes, et donc une optimisation du remodelage osseux. De fait, la consommation d'ellagitannins et d'acide punicique augmente l'activité des ostéoblastes (activité alcaline phosphatase et formation de nodules de calcium) et l'expression des principaux acteurs et facteurs de transcription impliqués dans leur différenciation, tout en diminuant l'expression de ceux responsables de la différenciation ostéoclastique. Dans le même temps, l'analyse des transcrits met en évidence que les extraits de grenade favorisent l'activation d'acteurs impliqués dans les mécanismes de défenses contre le stress oxydant et l'inflammation, au niveau du microenvironnement osseux. Ces résultats révèlent pour la première fois le potentiel de la grenade au regard de la physiologie osseuse en proposant ses possibles mécanismes d'actions, via une approche nutritionnelle complète et intégrée respectant la physiologie. / In the current context of increased life expectancy, prevalence and socioeconomic consequences of age-related diseases such as osteoporosis represent a major public health problem worldwide. This is why development of new strategies of prevention is highly suitable to provide a wide array of options (alternatives to usual therapies) for health professionals. So far, studies targeting nutrient biological activities have been mainly focused on both calcium and vitamin D. Nevertheless, other nutrients have shown a protective effect on bone mass acquisition and preservation through their anti-inflammatory and antioxidant properties. In this light, pomegranate is endowed with such a potential. Indeed there is an increasing scientific interest that has already suggested its nutritional and pharmacological benefits on prevention of some chronic age-associated diseases. As part of this project, the initial work focused on pomegranate has highlighted the link between its health benefit potential and the exceptional composition of its main parts: polyphenols from the juice (anthocyanins) and the peel (ellagitannins) and punicic acid from seed, those micronutrients being able to elicit antioxidant and anti-inflammatory capacities. Our work hypothesis resulted from a first phytochemical study leading to identify, standardize, characterize and produce two types of pomegranate extracts titrated on 2 molecules of interest (punicic acid and ellagitannins). We thus investigated the outcome of consumption, first of the whole fruit or its principal parts (peel and juice) and in a second time of concentrated ellagitannins and punicic acid extracts on bone biology in a well described experimental model of postmenopausal osteoporosis (osteopenia induced by estrogen deficiency after ovariectomy in C57bl6/j mice). In this preclinical study, wedemonstrated that all the diets supplemented with pomegranate significantly prevented bone loss and micro-architecture impairment. Those findings are associated with transcriptional changes in bone tissue, suggesting involvement of both osteoclastogenesis inhibition and osteoblastogenesis improvement, and reduced inflammatory and oxidative parameters, as well. Then, to determine more accurately the molecules and the signaling pathways involved in those effects, an original ex-vivo study was set up on both osteoblasts and osteoclasts, with respect to physiological conditions (i.e., the aim being to mimic systemic changes and generation of specific circulating metabolites associated with the extractsingestion). This work allowed clarifying the bone sparing effects observed in-vivo. Indeed, pomegranate extracts had the ability to elicit a significant increase in alkaline phosphatase activity, matrix mineralization and transcriptional levels of major osteoblast lineage markersinvolving key signaling pathways, while the expression of specific osteoclast differentiation markers and RANK-RANKL downstream signaling targets were down-regulated. In addition, transcripts analysis revealed that pomegranate extracts were able to induce defense mechanisms against oxidative stress and inflammation in the bone microenvironment. Our results show for the first time the pomegranate potential regarding bone physiology, underlying its possible mechanisms on bone remodeling through a complete and integrated nutritional approach respecting the physiology.

Devant le grand nombre de tumeurs du sein triple négatif résistant aux traitements, il est essentiel de comprendre les mécanismes de résistance et de trouver de nouvelles molécules efficaces. En premier lieu, nous analysons deux ensembles de données pharmacogénomiques à grande échelle. Nous proposons une nouvelle classification basée sur des profils transcriptomiques de lignées cellulaires, selon un processus de sélection de gènes basé sur des réseaux biologiques. Notre classification moléculaire montre une plus grande homogénéité dans la réponse aux médicaments que lorsque l’on regroupe les lignées cellulaires en fonction de leur tissu d'origine. Elle permet également d’identifier des profils similaires de réponse aux traitements. Dans un second travail, nous étudions une cohorte de patients atteints d’un cancer du sein triple négatif ayant résisté à la chimiothérapie néoadjuvante. Nous effectuons des analyses moléculaires complètes basées sur du RNAseq et WES. Nous constatons une forte hétérogénéité moléculaire des tumeurs avant et après traitement. Bien que nous observons une évolution clonale sous traitement, aucun mécanisme récurrent de résistance n’a pu être identifié. Nos résultats suggèrent fortement que chaque tumeur a un profil moléculaire unique et qu'il est important d'étudier de grandes séries de tumeurs. Enfin, nous améliorons une méthode pour tester la surreprésentation de motifs connus de protéines de liaison à l'ARN, dans un ensemble donné de séquences régulées. Cet outil utilise une approche innovante pour contrôler la proportion de faux positifs qui n'est pas réalisé par l'algorithme existant. Nous montrons l'efficacité de notre approche en utilisant deux séries de données différentes. / Given the large number of treatment-resistant triple-negative breast cancers, it is essential to understand the mechanisms of resistance and to find new effective molecules. First, we analyze two large-scale pharmacogenomic datasets. We propose a novel classification based on transcriptomic profiles of cell lines, according to a biological network-driven gene selection process. Our molecular classification shows greater homogeneity in drug response than when cell lines are grouped according to their original tissue. It also helps identify similar patterns of treatment response. In a second analysis, we study a cohort of patients with triple-negative breast cancer who have resisted to neoadjuvant chemotherapy. We perform complete molecular analyzes based on RNAseq and WES. We observe a high molecular heterogeneity of tumors before and after treatment. Although we highlighted clonal evolution under treatment, no recurrent mechanism of resistance could be identified Our results strongly suggest that each tumor has a unique molecular profile and that that it is increasingly important to have large series of tumors. Finally, we are improving a method for testing the overrepresentation of known RNA binding protein motifs in a given set of regulated sequences. This tool uses an innovative approach to control the proportion of false positives that is not realized by the existing algorithm. We show the effectiveness of our approach using two different datasets.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le cancer épithélial sporadique des ovaires se situe en quatrième position des causes de décès par cancer chez la femme après ceux du sein, du poumon et du côlon. Nous avons initié et mis au point un modèle pour déterminer les altérations moléculaires dans les cancers ovariens et corréler les résultats aux différentes étapes de la progression clinique de la maladie. Nous avons établi et caractérisé des cultures primaires dérivées d'ovaires normaux et de différentes tumeurs ovariennes qui couvrent différents types histologiques et différentes étapes de la maladie. Plusieurs analyses morphologiques, immunohistochimiques et moléculaires ont démontré que ces cellules sont représentatives des populations cellulaires du matériel clinique initial. Ces cultures représentent un système unique pour mener des analyses de détection de changements du point de vue génétique ou biologique qui jouent un rôle important dans la progression tumorale du cancer épithélial de l'ovaire. De plus nous avons obtenu à partir des cultures primaires des lignées cellulaires immortalisées de façon spontanée en culture. Ces lignées possèdent plusieurs avantages à savoir qu'elles ont été dérivées de tumeurs de patientes n'ayant pas subi de traitements de chimiothérapie et proviennent dans trois cas (TOV21G, TOV-81D et TOV112D) de tumeurs primaires solides et dans un cas (OV-90) d'ascite malin. Ces lignées représentent différents types histologiques du cancer épithélial de l'ovaire. Ce système nous a permis de faire quelques corrélations entre le comportement des cellules in vitro et les paramètres cliniques de la maladie et nous a fourni un indice sur la croissance in vitro qui semble épouser les paramètres cliniques de ces tumeurs. En premier lieu le modèle a été utilisé pour étudier et caractériser les altérations géniques au niveau du bras court du chromosome 3. Nous avons choisi d'étudier ce chromosome en particulier car c'est le plus fréquemment touché dans les cancers d'origine épithéliale, suggérant la présence de gènes suppresseurs de tumeurs dans les régions délétées dont l'inactivation fonctionnelle peut être impliquée dans le cancer épithélial de l'ovaire. Dans cette étude nous avons utilisé 33 biopsies tumorales et 47 cultures primaires ovariennes. Ce large répertoire d'échantillons contient des tumeurs ovariennes bénignes, des tumeurs épithéliales de l'ovaire de faible potentiel de malignité ainsi que des cancers épithéliaux de l'ovaire ou de l'ascite. En utilisant 15 marqueurs polymorphiques nous avons observé des LOH dans 25 (31%) des échantillons analysés: 21 sur 58 échantillons malins, 2 sur 12 de faible potentiel de malignité et 2 sur 10 tumeurs bénignes. Le profil de délétion affiché par ces 25 échantillons a permis la détermination d'au moins deux régions distinctes de délétions communes sur le bras court du chromosome 3 qui s'étendent du marqueur D3S1270 à D3S1597 (Région l) et du marqueur D3S1293 à D3S1283 (Région II). De plus une autre région proximale au marqueur D3S1300 (Région Ill) est délétée dans certains échantillons. Bien que parmi les tumeurs bénignes et malignes des délétions ont été observées dans les trois régions de délétion (Région I, Région II et Région Ill) les tumeurs de faible potentiel de malignité ne démontrent de délétions que seulement dans la région III. D'autre part, ces régions minimales de délétions semblent, à l'exception de RARB et THRB contenus dans la Région II, exclure les gènes VHL, TGFBR2, PTPasey et FHIT comme gènes suppresseurs candidats dans la tumorigénèse du cancer épithélial de l'ovaire.

Le cancer épithélial de l’ovaire (CÉO) est le cancer gynécologique le plus létal. Le CÉO de type séreux, la forme la plus commune avec plus de 50% des cas, est souvent diagnostiqué tardivement et associé à un mauvais pronostic. Le CÉO avancé, surtout traité par chimiothérapie, va devenir chimiorésistant chez la majorité des patientes traitées. Bien que des lignées cellulaires du CÉO aient été dérivées à partir de tumeurs solides et d’ascites de patientes ayant ou non subi une chimiothérapie, aucune des lignées cellulaires du CÉO provenant d’une même patiente avant et après ses traitements de chimiothérapie n’ont été établies précédemment. Notre laboratoire est le premier à développer de telles lignées cellulaires. Nos nouvelles lignées cellulaires sont dérivées de trois patientes différentes (1369, 2295 et 3133) et classées selon leur provenance, soit la tumeur solide (TOV) ou l’ascite (OV). Nous avons donc caractérisé ces nouvelles lignées de cellules pré-chimiothérapie (TOV1369TR, OV2295, TOV3133D et TOV3133G) et post-chimiothérapie (OV1369(2), OV2295(2), TOV2295, OV3133 et OV3133(2)) par diverses approches. Par immunohistochimie et immunobuvardage de type Western, nous avons caractérisé les niveaux d’expression de marqueurs épithéliaux typiques de kératines (KRT7, KRT8, KRT18, KRT19, KRT20) pour confirmer l’origine épithéliale et ovarienne des cellules. Nous avons également analysé le niveau d’expression de HER2 et p53, deux marqueurs importants dans le CÉO. Cependant, il ne semble pas y avoir d’expression différentielle évidente de ces marqueurs entre les lignées pré-chimiothérapie et post-chimiothérapie. Plus encore, nous avons étudié plusieurs caractéristiques tumorigéniques des lignées cellulaires, dont la prolifération cellulaire (par compte cellulaire), la migration cellulaire (par recouvrement de plaie), la capacité à former des sphéroïdes en 3D (par la méthode des gouttelettes inversées), et la formation de tumeurs in vivo dans des souris SCID (xénogreffes sous-cutanées). En général, il ne semble pas y avoir de différences claires entre les cellules pré-chimiothérapie et post-chimiothérapie au niveau du comportement cellulaire, à l’exception du fait qu’aucune des lignées post-chimiothérapie semblent être en mesure de former des structures tridimensionnelles compactes, contrairement à certaines lignées post-chimiothérapie. Nos résultats pourront servir à mieux comprendre les différents mécanismes régissant les tumeurs malignes du CÉO de type séreux et à mieux comprendre la progression de la maladie à travers les différents traitements, ce qui nous permettra d’acquérir des informations essentielles pour mieux évaluer et traiter différentes patientes. / Epithelial ovarian cancer (EOC) is the deadliest of all gynecologic cancers. The serous type of EOC is the most common form of the disease, and it accounts for more than 50% of the cases. It is often diagnosed at advanced stages where its prognosis is poor. Advanced EOC is treated mainly with chemotherapy. However, chemoresistance development eventually impedes the success of the treatments for most patients. Researchers have derived cell lines from EOC from solid tumors or from ascites. So far, there has not been EOC cell lines established from samples taken before and after chemotherapy treatments within the same patient. Our laboratory is thus the first to develop a new and powerful model of pre-chemotherapy and post-chemotherapy cell lines. All cell lines were derived sequentially from 3 different patients (1369, 2295 and 3133), from either solid tumors (TOV) or ascites (OV). We therefore characterized these new pre-chemotherapy cell lines (TOV1369TR, OV2295, TOV3133D and TOV3133G) and post-chemotherapy cell lines (OV1369(2), OV2295(2), TOV2295, OV3133 and OV3133(2)) through several approaches. Using immunohistochemistry and Western blot, we have characterized the level of expression of typical epithelial keratin markers (KRT7, KRT8, KRT18, KRT19, KRT20) to confirm the epithelial and ovarian nature of the cells. We have also analysed the expression level of important EOC markers, such as that of HER2 and p53, and found no clear difference between the pre-chemotherapy and post-chemotherapy EOC cells. Moreover, we have studied various tumorigenic features of the cell lines, such as cell proliferation (by cell count), cell migration (by the wound healing assay), 3D spheroid formation (by the hanging drop method), in vivo tumor formation in SCID mice (subcutaneous xenografts). In general, there were no notable differences between the two categories of cell lines at the cellular level, except that post-chemotherapy cell lines seemed to be unable to form compact 3D structures, contrary to some pre-chemotherapy cell lines. The obtained results would aid in better understanding the different mechanisms that malignant serous EOC tumors undergo and the progression of the disease with respect to the different treatments. Such study would allow us to gain valuable insight into the optimal treatment decisions to take for different EOC patients.

Le cancer épithélial de l’ovaire (CÉO) est le cancer gynécologique le plus létal. Le CÉO de type séreux, la forme la plus commune avec plus de 50% des cas, est souvent diagnostiqué tardivement et associé à un mauvais pronostic. Le CÉO avancé, surtout traité par chimiothérapie, va devenir chimiorésistant chez la majorité des patientes traitées. Bien que des lignées cellulaires du CÉO aient été dérivées à partir de tumeurs solides et d’ascites de patientes ayant ou non subi une chimiothérapie, aucune des lignées cellulaires du CÉO provenant d’une même patiente avant et après ses traitements de chimiothérapie n’ont été établies précédemment. Notre laboratoire est le premier à développer de telles lignées cellulaires. Nos nouvelles lignées cellulaires sont dérivées de trois patientes différentes (1369, 2295 et 3133) et classées selon leur provenance, soit la tumeur solide (TOV) ou l’ascite (OV). Nous avons donc caractérisé ces nouvelles lignées de cellules pré-chimiothérapie (TOV1369TR, OV2295, TOV3133D et TOV3133G) et post-chimiothérapie (OV1369(2), OV2295(2), TOV2295, OV3133 et OV3133(2)) par diverses approches. Par immunohistochimie et immunobuvardage de type Western, nous avons caractérisé les niveaux d’expression de marqueurs épithéliaux typiques de kératines (KRT7, KRT8, KRT18, KRT19, KRT20) pour confirmer l’origine épithéliale et ovarienne des cellules. Nous avons également analysé le niveau d’expression de HER2 et p53, deux marqueurs importants dans le CÉO. Cependant, il ne semble pas y avoir d’expression différentielle évidente de ces marqueurs entre les lignées pré-chimiothérapie et post-chimiothérapie. Plus encore, nous avons étudié plusieurs caractéristiques tumorigéniques des lignées cellulaires, dont la prolifération cellulaire (par compte cellulaire), la migration cellulaire (par recouvrement de plaie), la capacité à former des sphéroïdes en 3D (par la méthode des gouttelettes inversées), et la formation de tumeurs in vivo dans des souris SCID (xénogreffes sous-cutanées). En général, il ne semble pas y avoir de différences claires entre les cellules pré-chimiothérapie et post-chimiothérapie au niveau du comportement cellulaire, à l’exception du fait qu’aucune des lignées post-chimiothérapie semblent être en mesure de former des structures tridimensionnelles compactes, contrairement à certaines lignées post-chimiothérapie. Nos résultats pourront servir à mieux comprendre les différents mécanismes régissant les tumeurs malignes du CÉO de type séreux et à mieux comprendre la progression de la maladie à travers les différents traitements, ce qui nous permettra d’acquérir des informations essentielles pour mieux évaluer et traiter différentes patientes. / Epithelial ovarian cancer (EOC) is the deadliest of all gynecologic cancers. The serous type of EOC is the most common form of the disease, and it accounts for more than 50% of the cases. It is often diagnosed at advanced stages where its prognosis is poor. Advanced EOC is treated mainly with chemotherapy. However, chemoresistance development eventually impedes the success of the treatments for most patients. Researchers have derived cell lines from EOC from solid tumors or from ascites. So far, there has not been EOC cell lines established from samples taken before and after chemotherapy treatments within the same patient. Our laboratory is thus the first to develop a new and powerful model of pre-chemotherapy and post-chemotherapy cell lines. All cell lines were derived sequentially from 3 different patients (1369, 2295 and 3133), from either solid tumors (TOV) or ascites (OV). We therefore characterized these new pre-chemotherapy cell lines (TOV1369TR, OV2295, TOV3133D and TOV3133G) and post-chemotherapy cell lines (OV1369(2), OV2295(2), TOV2295, OV3133 and OV3133(2)) through several approaches. Using immunohistochemistry and Western blot, we have characterized the level of expression of typical epithelial keratin markers (KRT7, KRT8, KRT18, KRT19, KRT20) to confirm the epithelial and ovarian nature of the cells. We have also analysed the expression level of important EOC markers, such as that of HER2 and p53, and found no clear difference between the pre-chemotherapy and post-chemotherapy EOC cells. Moreover, we have studied various tumorigenic features of the cell lines, such as cell proliferation (by cell count), cell migration (by the wound healing assay), 3D spheroid formation (by the hanging drop method), in vivo tumor formation in SCID mice (subcutaneous xenografts). In general, there were no notable differences between the two categories of cell lines at the cellular level, except that post-chemotherapy cell lines seemed to be unable to form compact 3D structures, contrary to some pre-chemotherapy cell lines. The obtained results would aid in better understanding the different mechanisms that malignant serous EOC tumors undergo and the progression of the disease with respect to the different treatments. Such study would allow us to gain valuable insight into the optimal treatment decisions to take for different EOC patients.

Le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) est le cancer gynécologique le plus létal. Plus de 70% des patientes diagnostiquées avec une tumeur de stade avancé rechutent suite aux traitements chimiothérapeutiques de première ligne, la survie à cinq ans étant ainsi très faible. Afin de mieux comprendre l’évolution de la maladie, nous avons recherché de nouveaux gènes, responsables de l’initiation et de la progression du CEO. Précédemment, des lignées cellulaires ont été dérivées à partir de la tumeur primaire et récurrente et/ou d’ascites de trois patientes. Le séquençage de l’ARN de ces lignées par la technologie de séquençage de nouvelle génération (TSNG) nous a permis d’identifier des mutations ponctuelles qui pourraient nous indiquer des gènes dérégulés dans le CEO. La TSNG est un bon outil qui permet d’identifier et de cribler à grande échelle des mutations. Nous avons sélectionné PLEC1, SCRIB, NCOR2, SEMA6C, IKBKB, GLCE et ITGAE comme gènes candidats présentant des mutations dans nos lignées et ayant une relation fonctionnelle avérée avec le cancer. Étant donné que la TSNG est une technique à taux de fiabilité limité, nous avons validé ces mutations par séquençage Sanger. Ensuite, nous avons étudié l’effet de ces mutations sur la structure protéique et l’expression de PLEC1, de SCRIB et de SEMA6C. Seules certaines mutations dans les gènes PLEC1, SCRIB et SEMA6C ont pu être confirmées. PLEC1 et SCRIB sont deux protéines d’échafaudage dont la mutation, rapportée dans plusieurs cancers, pourrait induire des changements de leurs conformations et affecter leurs interactions et leurs fonctions. Les conséquences de ces mutations sur la tumorigenèse de l’ovaire devront être étudiées. / Epithelial ovarian cancer (EOC) is the most lethal gynecological cancer. Over 70% of the patients diagnosed with advanced stage of cancer relapse following first-line chemotherapy treatments; consequently the five-year survival is very low. To better understand the evolution of the disease, our aim was to identify new genes responsible for the initiation and progression of EOC. Previously, cell lines derived from solid tumors or ascites were developed from the primary and recurrent tumor or ascites of three patients. RNA sequencing of these cell lines by next-generation sequencing technology (NGST) allowed us to identify mutations that might point to genes whose deregulation is important in EOC. Mutations were detected in PLEC1, SCRIB, NCOR2, SEMA6C, IKBKB, GLCE and ITGAE. We selected these genes for further studies as they have previously been identified as being associated with cancer. First, we validated these mutations by Sanger sequencing in order to determine the concordance with NGST data. Secondly, we studied the impact of the validated mutations on protein structure and gene expression. Only certain mutations in PLEC1, SCRIB and SEMA6C were confirmed. Of interest, PLEC1 and SCRIB are two scaffold proteins, where mutations have been reported in several cancers and, possibly leading to changes in their conformation and thereby affecting their interactions and functions. The consequences of these mutations on ovarian tumorigenesis remain to be determined.

Le Mélanome Uvéal (MU) est la tumeur de l’œil la plus fréquente dans les adultes. Aucune thérapie pour la prévention ou le soins des métastases a donné preuve d’efficacité. Nous avons établi 7 lignées cellulaires de MU à partir soit de la tumeur du patient soit du matériel tumorale provenant de xénogreffes dérivées de patients (Patient-derived Xenografts, PDXs). Ces lignées cellulaires présentent les altérations cytogénétiques et les mutations « drivers » qui ont été jusqu’au présent identifiées dans la maladie; quatre d’entre elles présentent une déficience de la protéine BAP1 (BRCA1 associated protein-1), l’ altération qui caractérise la progression tumorale dans le MU. Cette collection de lignées a été utilisée pour identifier des nouvelles stratégies thérapeutiques. Une analyse in vitro avec une série d’inhibiteurs specifiques des vois de signalisation MEK/ERK, PKC, et PI3K/mTOR a montré l’efficacité de l’inhibiteur de mTOR Everolimus sur la prolifération cellulaire, effet qui a été confirmé dans 4 PDXs ou le composé a ralenti significativement la croissance cellulaire. Nous avons ensuite effectué une analyse systématique de la synergie en combinant les inhibiteurs. La synergie la plus importante est produite par l’association d’ Everolimus et de l’inhibiteur de PI3K GDC0941, résultat confirmé par une forte augmentation de l’apoptose quand les 2 drogues sont utilisées en combinaison. Pour conclure nous avons établi un instrument utile pour l’étude préclinique du MU . Nos résultats montrent que Everolimus est efficace dans l’inhibition de la croissance de MU in vitro et in vivo et que la combinaison d’un inhibiteur de mTOR et d’un inhibiteur de PI3K est très efficace dans l’induction de l’apoptose des cellules de MU. Enfin, des dérivées de la vitamine D pourraient exercer un effet antiprolifératif spécifique sur les MU avec mutation de BAP1. / Uveal melanoma (UM) is the most common primary tumor of the eye in adults. There is no standard adjuvant treatment to prevent metastasis and no effective therapy in the metastatic setting. We have established a unique panel of 7 UM cell lines from either patient’s tumors or patient-derived tumor xenografts (PDXs). These cell lines bear the cytogenetic alterations and driver mutations associated with UM so far. Importantly four of them display BAP1 (BRCA1 associated protein-1) deficiency, the hallmark of tumor progression in UM. We used this panel of cell lines to identify novel therapeutic strategies for UM patients. In vitro analysis of a series of specific inhibitors of the MEK/ERK, PKC and PI3K/mTOR pathways showed the efficacy of mTOR inhibitor Everolimus in reducing the viability of UM cell lines, a finding confirmed by significantly delayed tumor growth in 4 PDXs. We then preformed a systematic analysis of drug synergy examining the effect of combinations of the selected inhibitors. The best synergy was found with PI3K inhibitor GDC0941 and Everolimus. This was confirmed by a strong increase in apoptosis with this drug combination. In conclusion we have established an useful tool for performing preclinical studies in UM . Our results show that Everolimus efficiently inhbits UM growth in vitro and in vivo, and that mTOR inhibition coupled with PI3K inhibition is a highly effective in inducing apoptosis in UM cells. Finally Vitamin D derivatives might possibly exert a specific anti proliferative effect on BAP1 mutated UM cell lines.

Le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) est le cancer gynécologique le plus létal. Plus de 70% des patientes diagnostiquées avec une tumeur de stade avancé rechutent suite aux traitements chimiothérapeutiques de première ligne, la survie à cinq ans étant ainsi très faible. Afin de mieux comprendre l’évolution de la maladie, nous avons recherché de nouveaux gènes, responsables de l’initiation et de la progression du CEO. Précédemment, des lignées cellulaires ont été dérivées à partir de la tumeur primaire et récurrente et/ou d’ascites de trois patientes. Le séquençage de l’ARN de ces lignées par la technologie de séquençage de nouvelle génération (TSNG) nous a permis d’identifier des mutations ponctuelles qui pourraient nous indiquer des gènes dérégulés dans le CEO. La TSNG est un bon outil qui permet d’identifier et de cribler à grande échelle des mutations. Nous avons sélectionné PLEC1, SCRIB, NCOR2, SEMA6C, IKBKB, GLCE et ITGAE comme gènes candidats présentant des mutations dans nos lignées et ayant une relation fonctionnelle avérée avec le cancer. Étant donné que la TSNG est une technique à taux de fiabilité limité, nous avons validé ces mutations par séquençage Sanger. Ensuite, nous avons étudié l’effet de ces mutations sur la structure protéique et l’expression de PLEC1, de SCRIB et de SEMA6C. Seules certaines mutations dans les gènes PLEC1, SCRIB et SEMA6C ont pu être confirmées. PLEC1 et SCRIB sont deux protéines d’échafaudage dont la mutation, rapportée dans plusieurs cancers, pourrait induire des changements de leurs conformations et affecter leurs interactions et leurs fonctions. Les conséquences de ces mutations sur la tumorigenèse de l’ovaire devront être étudiées. / Epithelial ovarian cancer (EOC) is the most lethal gynecological cancer. Over 70% of the patients diagnosed with advanced stage of cancer relapse following first-line chemotherapy treatments; consequently the five-year survival is very low. To better understand the evolution of the disease, our aim was to identify new genes responsible for the initiation and progression of EOC. Previously, cell lines derived from solid tumors or ascites were developed from the primary and recurrent tumor or ascites of three patients. RNA sequencing of these cell lines by next-generation sequencing technology (NGST) allowed us to identify mutations that might point to genes whose deregulation is important in EOC. Mutations were detected in PLEC1, SCRIB, NCOR2, SEMA6C, IKBKB, GLCE and ITGAE. We selected these genes for further studies as they have previously been identified as being associated with cancer. First, we validated these mutations by Sanger sequencing in order to determine the concordance with NGST data. Secondly, we studied the impact of the validated mutations on protein structure and gene expression. Only certain mutations in PLEC1, SCRIB and SEMA6C were confirmed. Of interest, PLEC1 and SCRIB are two scaffold proteins, where mutations have been reported in several cancers and, possibly leading to changes in their conformation and thereby affecting their interactions and functions. The consequences of these mutations on ovarian tumorigenesis remain to be determined.

Le glioblastome multiforme (GBM) est la tumeur cérébrale primaire la plus fréquente. Une dérégulation des voies de signalisation de l’EGFR et un fort potentiel invasif sont les caractéristiques principales du GBM. Malheureusement, les essais cliniques impliquant des thérapies anti-EGFR dans le traitement des GBM demeurent inefficaces. Nous avons précédemment montré que le récepteur de la fibronectine, l’intégrine α5β1, est associé avec un mauvais pronostic et une résistance des patients au temodal. Les intégrines peuvent coopérer avec les récepteurs aux facteurs de croissance et ainsi amplifier leur potentiel oncogénique. Ici, nous avons cherché à déterminer le rôle de l’intégrine α5 dans la résistance aux thérapies anti-EGFR. Utilisant la lignée U87 de GBM, on a dans un premier temps confirmé que l’activation de l’intégrine sous l’influence de la fibronectine, potentialisait la signalisation de l’EGFR. La perte d’expression d’α5 sensibilise les cellules U87 aux anti-EGFR (cetuximab, gefitinib) dans des essais de clonogénicité en soft agar. L’expression d’ α5 favorise la résistance aux 2 drogues lors de la migration cellulaire. Pour aller plus loin, nous avons développé un nouveau test basé sur la quantification de l’évasion cellulaire à partir d’une sphère tumorale. La perte d’ α5 augmente la sensibilité des cellules U87 à 2 TKI réversibles spécifiques de l’EGFR, gefitinib et erlotinib, mais n’a pas d’effet sur l’efficacité du lapatinib, un TKI irréversible ciblant EGFR, ErbB2, ErbB3 et ErbB4. Grâce à la microscopie confocale, nous avons montré l’effet important du gefitinib sur l’endocytose de l’intégrine et de l’EGFR. Ces résultats suggèrent que l’expression d’ α5 favorise la résistance aux TKI par l’activation des voies de signalisation des récepteurs ErbB ou en contrôlant le trafic membranaire de l’EGFR. On a aussi montré que pour favoriser l’adhésion cellulaire, l’intégrine α5 stimulait la fibrillogénèse. Dans les cellules migrant à distance de la sphère, l’intégrine α5 est strictement engagée dans des adhésions cellule-substrat contenant la protéine FAK activée. Nos résultats soulignent le rôle central du couple fibronectine/ intégrine α5 dans l’invasivité du GBM et la résistance aux thérapies anti-EGFR. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common primary brain tumor. Alteration of the EGFR pathway and high invasive potential are hallmarks of GBM. Unfortunately, trials using anti-EGFR therapies for the treatment of GBM reveal limited efficacy. We previously showed that overexpression of the fibronectin receptor, α5β1 integrin, is associated with a poor prognosis for patients and is responsible for chemoresistance to temodal. Integrins can cross-talk with growth factor receptors and amplified their oncogenic activity. Here, we sought to determine the potential role of α5 integrin in resistance to anti-EGFR therapy. Using U87 GBM cell line, we first confirmed that fibronectin-mediated integrin activation potentiated EGFR signaling. Loss of α5 integrin expression sensitized U87 cells to anti-EGFR drugs (cetuximab, gefitinib) in soft agar clonogenic assay. α5 expression can trigger resistance to both drugs on cell migration. To go further, we developed a new assay based on the quantification of cell evasion from tumor spheroids. α5 depletion increased U87 cell sensitivity to gefitinib and erlotinib, 2 EGFR-selective reversible TKI, but had not effect on lapatinib efficacy, an irreversible TKI that target EGFR, ErbB2, ErbB3 and ErbB4. Confocal microscopy revealed a strong impact of gefitinib on EGFR and integrin endocytosis. These results suggested that α5 expression may trigger resistance to TKI either by activating ErbB pathways or by controlling EGFR membrane trafficking. We also showed that to promote cell adhesion, α5 integrin stimulated fibronectin fibrillogenesis. As cells moved away from the spheroids, α5 became strictly engaged in cell-substratum adhesion sites where it recruited activated FAK. Our work highlights the pivotal role of fibronectin/α5β1 integrin in invasivity of GBM and resistance to anti-EGFR drugs.

Les thiopurines sont des médicaments cytotoxiques et immunosuppresseurs largement prescrits, notamment dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Ils représentent l’un des meilleurs exemples d’application clinique de la pharmacogénétique avec le dépistage du déficit en thiopurine S-méthyltransférase (TPMT), enzyme clé du métabolisme des thiopurines. La variabilité interindividuelle de la réponse à ces médicaments rend nécessaire leur optimisation thérapeutique. Ce travail de thèse a d’une part, analysé les relations entre activité TPMT et concentrations des métabolites thiopuriniques, et d’autre part, recherché des facteurs associés à la résistance aux thiopurines. A l’aide d’une base de données pharmacogénétiques hospitalière et d’une étude « PheWAS » à partir d’un entrepôt de données cliniques, nous avons analysé la distribution et la corrélation génotype-phénotype pour la TPMT, en lien avec les concentrations des métabolites thiopuriniques. Nous avons observé qu’une activité TPMT très élevée (phénotype « ultra-rapide ») était associée à des paramètres clinico-biologiques reflétant une maladie évolutive et un traitement inefficace dans les MICI. De plus, une étude clinique rétrospective dans les MICI pédiatriques a permis d’identifier des facteurs associés à la lymphopénie observée sous thiopurines. Enfin, à partir d’un modèle in vitro fondé sur des lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCL) sélectionnées, nous avons établi une signature transcriptomique, incluant 32 gènes, prédictive de la résistance aux thiopurines. Une analyse fonctionnelle bioinformatique a abouti à l’identification de voies métaboliques liées à la protéine p53 et au cycle cellulaire, ainsi que des mécanismes moléculaires associés à la résistance aux thiopurines. En conclusion, ce travail de thèse, qui a exploré la variabilité de réponse aux thiopurines et tout particulièrement la résistance à ces médicaments, propose des hypothèses pour l’individualisation et l’optimisation thérapeutique des thiopurines. / Thiopurines are cytotoxic and immunosuppressive drugs widely prescribed, mainly in inflammatory bowel disease (IBD). They constitute one of the best success story of pharmacogenetic implementation into clinical practice based on the screening of thiopurine S-methyltransferase (TPMT) deficiency, a key enzyme in thiopurine metabolism. Optimization of thiopurine response is challenging because of its large interindividual variability such as inefficacy and toxicities. This thesis has explored, on one hand, the relationships between TPMT activity and metabolite concentrations, and on the other hand, factors associated with thiopurine inefficacy. Using a primary care pharmacogenetic database, we first analyzed TPMT distribution and genotype-phenotype correlation, in relation with thiopurine metabolites in a large population. Using a PheWAS study based on a clinical data warehouse we then reported that a very high TPMT activity (“ultra-rapid” phenotype) was associated with parameters of active IBD and poor response to thiopurines. Furthermore, a retrospective study in pediatric IBD identified factors predicting the occurrence of lymphopenia during thiopurine therapy. Finally, using a lymphoblastoid cell line (LCL) in vitro model, we established a transcriptomic signature, including 32 genes predicting thiopurine cellular resistance. A bioinformatic functional analysis identified metabolic pathways in relation with p53 and cell cycle, as well as molecular mechanisms associated with thiopurine resistance. To conclude, this research work, focusing on the variability of thiopurine response and mainly therapeutic resistance, provides new hypotheses to individualize and optimize therapeutic response to thiopurines.