The production of very low density lipoprotein and high density lipoprotein particles by the liver is a tightly regulated process, which begins with synthesis and assembly of core protein components in the rough endoplasmic reticulum. Factors influencing the production and metabolism of these particles are of immediate medical relevance, as their malfunction or hyperactivity can lead to an assortment of disease states. Hepatic lipase is a secreted liver enzyme, with many previously described roles in the metabolism and clearance of both high and low density lipoproteins. Increased production and assembly of this enzyme is an indicator of metabolic dysfunction, while its absence or insufficiency leads to pre-mature atherosclerosis and death. The present study shows that this enzyme’s role in lipoprotein metabolism is not confined to the degradation and clearance of these particles after they have been secreted. Experiments using co-immunoprecipitation targeted at hepatic lipase demonstrate that this protein interacts with ApoA1 and ApoB100, the core protein components of HDL and VLDL respectively, at the ER level in hepatocytes, as part of an enormous multi-subunit protein complex. This interaction with ApoA1 leads to decreased competence of hepatocytes to secrete HDL, which confers a pro-atherogenic phenotype. Analysis of ER to Golgi VLDL transport vesicles, produced with a cell-free in vitro budding assay, has revealed that hepatic lipase is co-secreted between these compartments with immature VLDL particles. Further analysis of cytosol isolated from hepatocytes demonstrates an interaction between hepatic lipase and the LDL-receptor related protein in a post-Golgi vesicle; the significance of which will be investigated in future studies.

No description available.

Egg yolk contamination of egg whites continues to be a serious problem in the egg industry. The ability of egg whites to form stable and voluminous foams is greatly inhibited by accidental yolk contamination, even at extremely small levels. Experiments were conducted to determine if lipase can regenerate the functional properties of yolk-contaminated egg whites. Treatments included control, 0.2% yolk-contamination, and 0.2% yolk-contamination that was treated with lipase and colipase and heated at 37°C for 1 hour. Lipase from Mucor meihei and colipase from porcine pancreas were added to yolk-contaminated egg white samples to target and hydrolyze the triglycerides from egg yolk. Enzymatic hydrolysis was confirmed using thin-layer chromatography. Treatment of yolk-contaminated samples with lipase, colipase and heat yielded a drastic improvement in a number of the functional properties, including the final foam volume, foam capacity, and foaming power. These functional properties showed complete restoration to control levels. However, foam stability and foam drainage levels were not statistically different from yolk-contaminated samples that had not been enzymatically treated. Enzyme treated yolk-contaminated egg whites were also tested in an angel food cake system. There were three treatments, including an uncontaminated control, a contaminated control, and a lipase and colipase treated yolk-contaminated sample. Comparison between treatments was performed by volume analysis. The enzyme treated yolk-contaminated egg whites performed similarly to uncontaminated control angel food cakes. / Master of Science

The applicability of an isotopically labelled assay system to determine the lipase production in Pseudomonas aeruginosa was evaluated. Supernatant from cultures of Pseudomonas aeruginosa grown in a medium containing olive oil was incubated with a substrate containing labelled trioleate. Fatty acids were isolated by means of a liquid-liquid partition system. Enzyme activity was determined by measuring the amounts of free fatty acid by liquid scintillation counting. Findings indicate that the isotopicallylabelled, liquid-liquid partitioning assay is reliable, sensitive and adaptable to rapid assay conditions. It was also determined that different strains of Pseudomonas aeruginosa produce varying amounts of lipase. Partial purification of supernatant by gel filtration produced two protein peaks showing enzymatic activity.

O presente trabalho teve como objetivo o aproveitamento da matéria-prima residual óleo fúsel como fonte de baixo custo de álcool isoamílico para a síntese de ésteres com diferentes propriedades pela rota enzimática. Utilizou-se como proposta a esterificação do óleo fúsel com ácidos carboxílicos de diferentes tamanhos de cadeia carbônica mediada pela enzima lipase em processos descontínuo ou contínuo, visando obter produtos com propriedades aromáticas, emulsificantes e lubrificantes. A lipase selecionada de Rhizopus oryzae foi posteriormente imobilizada em diferentes suportes sílica-β-ciclodextrina (SiO2- βCD), sílica-hidroxietilcelulose (SiO2-HEC) ou co-polímero de estireno de divinilbenzeno (STY-DVB) e utilizada como biocatalisador para mediar as reações de esterificação do óleo fusel com os ácidos caprílico, láurico e oleico. Entre os suportes testados, apenas a sílica-hidroxietilcelulose (SiO2-HEC) apresentou resultados insatisfatórios em função da elevada afinidade desta matriz em adsorver a água formada como subproduto na reação de esterificação. Para cada par de óleo fúsel e ácido carboxílico, as condições adequadas para obtenção dos produtos alvos foram estabelecidas e os produtos resultantes analisados de acordo com a finalidade proposta. No caso do caprilato de isoamila, as condições reacionais foram determinadas por planejamento experimental, indicando que a formação do éster foi influenciada somente pela variável razão molar ao nível de 95% de confiança. O modelo matemático proposto permitiu prever as condições que favorecem o alcance de elevados rendimentos de formação do éster, sendo a reação maximizada (82% em 24 h) para meios reacionais constituídos de óleo fúsel e ácido caprílico na razão molar de 1:1,5 e temperatura de 45 ºC. O perfil sensorial do éster foi confirmado com auxílio do nariz eletrônico. Com relação ao laurato de isoamila foi possível estabelecer o processo em regime continuo utilizando a lipase de Rhizopus oryzae imobilizada em STY-DVB operando o sistema com concentrações elevadas do substrato que forneceu produtividades elevadas (1598,68 ± 135,79 μmol g-1 min-1) do éster com excelente capacidade de dispersão de pigmentos que pode ser utilizado na formulação de cosméticos com rotulagem de produto natural. Finalmente, com relação ao éster oleato de isoamila, foi constatado limitado desempenho da lipase Rhizopus oryzae imobilizada em STY-DVB devido baixa atividade sintética deste biocatalisador para ácidos carboxílicos insaturados. Mesmo assim, foi possível obter produtividades volumétricas da ordem de 286, 20 ± 18,46 μmol g-1 min-1, utilizando uma configuração de reator de leito empacotado em dois estágios acoplado a uma coluna extratora de água. As propriedades do produto formado atenderam as especificações recomendas para uso como biolubrificante. Desta forma, o presente projeto de tese demonstrou a potencialidade da aplicação do óleo fusel como fonte de baixo custo do álcool isoamílico na obtenção ésteres com propriedades adequadas para uso como aroma, emulsificante e lubrificante. O aproveitamento deste resíduo não somente retira um composto indesejado do meio ambiente, mas também permite a geração de diferentes produtos de interesse industrial, constituindo-se, assim, em um forte apelo ambiental. / The aim of the present work was to investigate the feasibility of using fusel oil as a source of low cost feedstock based on isoamyl alcohol for the synthesis of esters with different properties by enzymatic route. For this, it was proposed to perform the esterification reaction of fusel oil with carboxylic acids with different sizes of carbonic chain mediated by the enzyme lipase under batch or continuous runs, in order to obtain products with aromatic, emulsifying and lubricant properties. Rhizopus oryzae lipase immobilized on different supports silica-β-cyclodextrin (SiO2-βCD), silica-hydroxyethylcellulose (SiO2- HEC) or co-polymer of styrene divinylbenzene (STY-DVB) were chosen as biocatalysts to mediate the esterification reactions of fusel oil with caprylic, lauric and oleic acids. Among the supports tested, only the silica hydroxyethylcellulose (SiO2-HEC) provided unsatisfactory results due to its high affinity to adsorb the water generated as byproduct. For each pair of fusel oil and carboxylic acid, appropriate conditions for obtaining the target product were established, and the resulting product further analyzed according to its proposed use. In the case of isoamyl caprylate, reaction conditions were determined by factorial design, indicating that the ester formation was influenced only by the molar ratio at 95% of confidence level. The proposed mathematical model allowed predicting the conditions that favor the achievement of high yields of ester formation, being maximized (82% in 24 h) with substrate consisting of fusel oil and caprylic acid at molar ratio of 1:1.5 and temperature of 45°C. The sensory profile of the ester was confirmed with help of the electronic nose. With respect to isoamyl laurate it was possible to establish a stable process under continuous flow using Rhizopus oryzae lipase immobilized on STY-DVB feeding the reactor with high substrate concentrations, providing high ester productivity (1598.68 ± 135.79 g-1 μmol min-1) with excellent dispensability of pigments that can be used in cosmetic formulation label as natural product. Finally, with regards to the isoamyl oleate, the performance of Rhizopus oryzae lipase immobilized on STY-DVB was limited due to its low activity towards unsaturated carboxylic acids. Still, it was possible to obtain volumetric productivity of about 286. 20 ± 18.46 μmol g-1 min-1 using two-stage packed bed reactor coupled with a water column extraction. The properties of the formed product meet the specifications recommend for use as biolubricant. In this way, this work demonstrated the feasibility of applying the fusel oil as a source of low-cost isoamyl alcohol to obtain esters with appropriate properties for use as flavor, emulsifier or lubricant. The use of this waste material not only removes unwanted compounds from the environment, but also allows the generation of different products of industrial interest, thus having a strong environmental appeal.

Esse trabalho teve como objetivo a obtenção e caracterização de uma cepa transformante de Aspergilus nidulans para produção de uma lipase de Beauveria bassiana (denominada Bbl1) por meio do vetor pExpyr, utilizando xarope de milho como fonte de carbono indutora. Para isso utilizou-se o gene sob referência XP_008602131.1 (denominado bbl1) do NCBI que foi introduzido em vetores de pGEM-T, para multiplicação, e no pExpyr, para expressão. Foi feita a modelagem molecular dessa enzima, revelando cavidades hidrofóbicas para interação com substrato, e a \"tampa\", considerada característica comum das lipases \"verdadeiras\". A produção de Bbl1 em cultivos contendo maltose foi aproximadamente o dobro em relação à cepa selvagem B. bassiana. Posteriormente, com o intuito de melhorar a produção e baratear os custos de fermentação desta cepa, a maltose e o tampão HEPES (insumos caros e utilizados em escala laboratorial, porém inviáveis em padrão industrial) foram substituídos respectivamente por xarope de milho e tampão fosfato de sódio; o resultado foi a obtenção de quase 40 U.mL-1 de atividade de lipases em Erlenmeyer de 125 mL, quadruplicando a produção em relação a cepa selvagem. A Bbl1 foi purificada em colunas de Octyl-Sepharose e DEAE-celulose. Essa enzima demonstrou-se estável em solução com 0,5% de tween-20 e tween-80, e hiper-ativada na presença destes dois detergentes e de Triton X-100. Além disso, os ácidos oleico e linoleico demonstraram-se como inibidores análogos a não-competitivos. O estudo de imobilização revelou que o suporte de Octyl-Sepharose é o mais ideal para ativação de Bbl1, sendo que a atividade relativa da mesma foi cerca de 123%, em relação a mesma enzima em solução aquosa. Quanto à estabilidade térmica e ao pH, a imobilização promoveu um ganho de estabilidade nas temperaturas de 30°C até 60°C nos derivados de Octyl, Phenyl, Butyl, DEAE-celulose, MANAE e PEI, e na faixa de pH de 3 até 9 nesses mesmos suportes estudados, em comparação à enzima em solução. Por meio de estudos cinéticos, observou-se que a velocidade máxima de Bbl1 imobilizada em Octyl foi 2,39 vezes maior e o respectivo valor de K0,5, 2,7 vezes menor em relação à Bbl1 livre. O padrão de inibição pelos ácidos oleico e linoleico sofreu alteração em Bbl1 imobilizada, sendo dependente da concentração destes inibidores. Os produtos hidrólise dos óleos de açaí e buriti foram fracionados em fases polares e apolares e aplicados em culturas de monocamada de linhagens celulares de glioblastoma LN-18. Observou-se os produtos de hidrólise do óleo de buriti provocaram redução na viabilidade respiratório das células de glioblastoma até 120 horas de exposição, enquanto que nos cultivos de células de fibroblasto observou-se um \"ganho\" de viabilidade neste mesmo período de cultivo. Por fim, esse trabalho permitiu a gratificação em obter uma cepa de A. nidulans transformante para expressão de lipase - uma enzima comercialmente onerosa e com poucos trabalhos envolvendo sua produção de forma heteróloga. Além disso, tornou-se a utilização destas enzimas na hidrólise de óleos brasileiros como um potencial agente à obtenção de insumos para o tratamento de glioblastoma. / The objective of this work was to obtain and characterize a transforming strain of Aspergilus nidulans to produce a Beauveria bassiana lipase (called Bbl1) using the pExpyr vector, having corn syrup as inducing carbon source. For this purpose, the NCBI reference gene XP_008602131.1 (designated bbl1) was used, which was introduced into pGEM-T vectors for storage, and pExpyr for expression. The molecular modeling of this enzyme was performed, revealing hydrophobic cavities for the interaction with substrate, and the \"lid\", considered a common characteristic of \"true\" lipases. Production of Bbl1 in cultures containing maltose was approximately double that of B. bassiana wild strain. Later, in order to improve the production and to reduce the costs of fermentation of this strain, maltose and HEPES buffer (expensive and laboratory-grade inputs, however, not viable in an industrial standard) were replaced by corn syrup and sodium phosphate buffer; the result was the obtaining of almost 40 U.mL-1 of lipase activity in Erlenmeyer of 125 mL, quadrupling the production in relation to the wild strain. Bbl1 was purified on Octyl-Sepharose and DEAE-cellulose columns. This enzyme showed to be stable in solution with 0.5% tween-20 and tween-80, and hyperactivated in the presence of these two detergents and Triton X-100. In addition, oleic and linoleic acids have shown to be non-competitive analogues. The immobilization study revealed that Octyl-Sepharose support is the most ideal for the activation of Bbl1, and the relative enzymatic activity was about 123% in relation to the same non-immobilized enzyme. As for thermal stability and pH, immobilization promoted a stability gain at temperatures of 30 ° C to 60 ° C in the Octyl, Phenyl, Butyl, DEAEcellulose, MANAE and PEI derivatives, and in the pH range of 3 up to 9 in these same supports, compared to the enzyme in solution. By means of kinetic studies, it was observed that the maximum rate of Bbl1 immobilized on Octyl was 2.39 higher and the respective value of K0.5, 2.7 lower than the free Bbl1. The inhibition pattern for oleic and linoleic acids was altered in immobilized Bbl1, being dependent on the concentration of these inhibitors. The hydrolysis products of açai and buriti oils were fractionated in polar and nonpolar phases and applied to monolayer cultures of LN-18 glioblastoma cell lines. It was observed that the buriti oil hydrolysis products were able to cause a reduction in the respiratory viability of glioblastoma cells up to 120 hours of exposure, whereas in the fibroblast cell cultures a viability \"gain\" was observed in the same culture period. Finally, this work allowed the gratification in obtaining a strain of transforming A. nidulans for lipase expression - a commercially expensive enzyme with few studies involving its production in a heterologous way. In addition, the use of these enzymes in the hydrolysis of Brazilian oils has become a potential agent to obtain inputs for the treatment of glioblastoma.

[pt] Objetivo: Otimização da produção de lipases por células de Yarrowia lipolytica, através do planejamento experimental e avaliação dos aspectos metrológicos envolvidos no processo. Motivação: Embora existam muitos trabalhos na literatura que relatem a produção de lipases por microrganismos, poucos abordam a otimização do processo através do planejamento experimental e nenhum deles considera o rigor metrológico e a estimativa da incerteza de medição. Contextualização: As enzimas lipases serão objeto de estudo por apresentarem grande versatilidade de aplicações e por serem produzidas por muitos microrganismos. As leveduras, no entanto, apresentam inúmeras vantagens operacionais sobre os demais microrganismos e entre elas foi selecionada uma cultura de Yarrowia lipolytica, isolada no Brasil. A produção de lipases depende de muitas variáveis, como temperatura, pH, concentração da fonte de carbono e nitrogênio, inóculo, entre outras. Nos processos de fermentação, onde há interação entre estas variáveis e a influência de cada uma é importante, é essencial estabelecer um método que considere estas interações, e otimize as condições experimentais para obtenção de melhores resultados. A confiabilidade metrológica do processo é de fundamental importância uma vez que diferenças significativas nos resultados são evidenciadas, principalmente em escala industrial. Metodologia: Dez experimentos foram planejados através do método D-optimal nos quais foram variadas as concentrações da fonte de carbono, da fonte de nitrogênio e de inóculo. A estimativa da incerteza de medição da atividade lipásica foi feita com base nas recomendações do Guia para Expressão da Incerteza de Medição (GUM) e do Guia CG 4 publicado pela EURACHEM. Resultados: A maior atividade lipásica obtida foi de 4815 U/L (80,3 (mi)kat/L) com incerteza expandida de 137 U/L (2,3 (mi)kat/L), nas seguintes condições: 0,5% de óleo de oliva (fonte de carbono), 0,7% de peptona (fonte de nitrogênio) e 10 mg/mL de inóculo. Em termos de produtividade volumétrica, tais condições forneceram o valor de 69,28 U/L h. Conclusões: Com estes resultados, foi possível concluir que a utilização do planejamento D-optimal favoreceu a produção em agitador de frascos, já que foi atingida uma atividade lipásica superior às alcançadas anteriormente por outros autores sem otimização, em frascos agitados (2700 U/L) ou em fermentador (4240 U/L). Sugere-se a produção de lipases por células de Yarrowia lipolytica, nas condições citadas acima, com vistas à obtenção de materiais de referência certificados, desde que estudos posteriores de purificação e estabilidade da lipase obtida sejam feitos. / [en] Objective: Optimization of lipase production by Yarrowia lipolytica cells through experimental design and evaluation of metrological aspects related to process. Motivation: Although several published papers are found describing lipase production by microorganisms, few of them refer to process optimization through experimental design and none of them refer to metrological evaluation and the estimate of the uncertainty in measurement. Context: Microbial lipases are an important group of biotechnologically valuable enzymes that present widely diversified catalytic properties. The interest in production of these versatile enzymes increased significantly, due to the vast amplitude of their industrial applications. There are many microorganisms able to produce lipases, but yeasts present some operational advantages compared to other microorganisms, and for this reason a strain of Yarrowia lipolytica was used in this work. A serie of factors, individually or in association, can affect production of such substances leading to different levels of product concentration and productivity. Empirical studies have been traditionally used to determine the effect of these factors on process parameters. A possible approach is to vary one factor while keeping the other at a constant level, but this approach is time consuming, does not include the interaction effects among variables, and does not necessarily lead to optimized results. Nowadays, different strategies are employed to optimize production parameters. These strategies not only allow process optimization but can also establish the dependent and independent variables. Methodology: Ten experiments were planned with the D-optimal design in which concentrations of inoculum, carbon source and nitrogen source were changed. The estimate of the uncertainty in measurement of the lipase activity was developed based on the Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement (GUM) and on the Guide CG 4 published by EURACHEM. Results: The highest lipolytic activity obtained was 4815 U/L (80,3 (mi)kat/L) with an expanded uncertainty of 137 U/L (2,3 (mi)kat/L), under the following conditions: 0.5% of olive oil (carbon source),0.7% of peptone (nitrogen source) and 10 mg/mL of inoculum. In terms of volumetric productivity, these conditions provided 69.28 U/L h. Conclusions: It is possible to conclude that the D-optimal design usage enhanced lipase production in shaken-flasks. Moreover the activity obtained in this work was higher than others previously reported with the same microorganism, without experimental design, in shaken-flasks (2700 U/L) or even in bench-fermenter (4240 U/L). The production of lipases by Yarrowia lipolytica cells aiming the classification as certified reference material can be recommended after further purification and stability studies.

O presente projeto teve como objetivo selecionar componentes orgânicos para obtenção de compósitos híbridos pela técnica sol-gel utilizando como precursor tetraetilortossilicato (TEOS) visando avaliar o efeito do agente orgânico na evolução do sol para gel e nas propriedades finais dos suportes para imobilizar a lipase microbiana de Burkholderia cepacia. Foram testados três compostos orgânicos ?-ciclodextrina (?CD), carboximetilcelulose (CMC) e hidroxietilcelulose (HEC) e os resultados obtidos foram comparados com o comportamento já estabelecido para o polivinilálcool (PVA), tanto em termos morfológicos como atividade catalítica em meio aquoso (hidrólise de triacilgliceróis) e meio orgânico (síntese de éster de cadeia curta e longa). A motivação do estudo está diretamente relacionada com a elevada afinidade do suporte híbrido SiO2-PVA pelo glicerol, sendo uma das limitações do uso deste suporte para imobilizar lipases com finalidade de aplicação em reações de transesterificação conduzidas em fluxo contínuo. As características morfológicas e estruturais dos suportes resultantes foram determinadas empregando técnicas convencionais, indicando similaridade das propriedades estruturais, fornecendo suportes com áreas superficiais entre 361,6 a 529,7 m2 g-1 e morfologia amorfa. A diferença marcante entre os suportes foi verificada quanto a capacidade de adsorção do subproduto da reação de transesterificação, sendo verificado que a substituição do polivinilálcool por ?-ciclodextrina reduziu em até 50% a habilidade do suporte hibrido em absorver glicerol. Os componentes derivados de celulose apresentaram resultados similares aos obtidos com o polivinilálcool. Em termos de afinidade pelo glicerol os resultados obtidos permitiram a classificação dos suportes híbridos na seguinte ordem crescente: SiO2-CMC > SiO2-PVA > SiO2-HEC > SiO2- ?CD. Quanto a afinidade dos suportes para imobilização da lipase de B. cepacia, os valores de atividade hidrolítica dos derivados imobilizados, nas condições adotadas, revelaram que todos os suportes tiveram o mesmo tipo de interação com a enzima resultando em valores de recuperação de atividade na faixa de 56 - 63%, valores próximos aos normalmente obtidos pela matriz de SiO2-PVA (68%). Os parâmetros cinéticos (Km e Vmax) determinados indicaram que a lipase imobilizada nos diferentes tipos de suporte, apresentou afinidade semelhante pelo substrato azeite de oliva. Os valores determinados de Km e Vmax da lipase de B. cepacia na forma livre (Km = 410 mM e Vmax =12391 Ug-1) mostraram que independente do suporte, a imobilização reduziu aproximadamente 60% da afinidade da enzima pelo substrato. Em meio orgânico, tanto as reações de esterificação como de transesterificação mediadas pelos derivados imobilizados apresentaram desempenho similar com atividade de esterificação da ordem de 118 ?M.g-1min-1 e rendimentos de formação de ésteres etílicos da ordem de 98,30%. De uma forma geral, os resultados obtidos foram promissores e permitiram selecionar o composto orgânico ?CD para substituir com vantagens o polivinilálcool no preparo de matrizes hibridas para imobilização da enzima lipase. O menor poder hidrofílico desta matriz em relação às outras matrizes testadas pode ser creditado a estrutura cíclica da ?CD que reduziu a capacidade do suporte SiO2-?CD em adsorver glicerol, principal subproduto da reação de transesterificação. Testes em processos conduzidos em fluxo contínuo são sugeridos para comprovação da eficiência dessa matriz. / The objective of this work was to select organic compounds for preparing hybrid composites by the sol-gel technique using tetraethylorthosilicate (TEOS) as precursor aiming at evaluating the effect of the organic agent in the transformation of the sol into gel and in the final properties of the matrices for immobilizing lipase from Burkholderia cepacia. Three organic components ?-cyclodextrin (?CD), carboxymethylcellulose (CMC) and hydroxyethylcellulose (HEC) were tested. The organic component polyvinyl alcohol (PVA) was used as control taking into consideration its morphological properties and the catalytic activity of the immobilized derivative in aqueous medium (triacylglycerols hydrolysis) and organic medium (synthesis of short and long chain esters). The motivation of this work was directly related with the high affinity of the matrix polysiloxane-polyvinyl alcohol (SiO2- PVA) by the glycerol, limiting the use of the immobilized derivative in the transesterification reactions running on a continuous flow. The morphological and structure properties of the resulting matrices was determined using conventional techniques, showing similar structure properties, with surface area values between 361.6 and 529.7 m2g-1 and amorphous morphology. The main difference among the matrices were observed regarding their ability to adsorb glycerol, the main byproduct of the transesterification reaction. It was verify that the replacement of the polyvinyl alcohol by ?-cyclodextrin reduced in about 50% the hybrid composite capacity to adsorb glycerol. On the other hand, the cellulose components showed similar results as the polyvinyl alcohol. Considering as an evaluated parameter the glycerol affinity, the achieved results allowed classifying the hybrid composites as follows: SiO2- CMC > SiO2-PVA > SiO2-HEC > SiO2-?CD. The performance of the hybrid composites for immobilizing lipase from B. cepacia, through the hydrolytic activity reveal that all the matrices show the same interaction with the lipase, resulting in activity recovered values between 56-63%, which is close to the value attained by SiO2-PVA matrix (68%). The kinetic parameters (Km and Vmax) values determined for free lipase (Km = 410 and Vmax = 12391 Ug-1), showed that independely of the immobilization support the affinity of the enzyme for the substrate was reduced by 60%. In organic medium, all the immobilized derivatives showed similar behavior on both esterification and transesterification reactions attaining esterification activity of 118 ?M.g-1min-1 and ethyl ester yields of 98.30%. Overall, the results were promising and allowed selecting the organic component ?CD to replace, with advantages, the use of PVA for preparing hybrid composites. The lower hydrophilic capacity of this matrix compared with the others matrices can be explained by the cyclic structure of the ?CD that reduced the capacity of the SiO2-?CD matrix in the glycerol adsorption, the main byproduct of the transesterification reaction. Assays carried out in packed bed reactor running on a continuous basis are propose to confirm the efficiency of this matrix.

Lipases hidrolisam triacilgliceróis a glicerol e ácidos graxos. Neste trabalho foram estudadas as lipases digestivas no mosquito Aedes aegypti (larva e adulto) e no carrapato Amblyomma cajennense, vetores de Dengue e da Febre Maculosa. As lipases estudadas pertencem a família das lipases neutras, são estáveis em ampla faixa de pH e em altas temperaturas. Estas enzimas apresentam maior eficiência hidrolítica sobre substratos de cadeias carbônicas curtas (butirato e heptanoato). As lipases digestivas nas duas fases de desenvolvimento do mosquito são distintas cinéticamente. O estudo combinado do genoma de Ae. aegypti e PCR comprovaram a expressão diferencial destas enzimas constituintes de uma família multigênica envolvida na expressão de lipases digestivas provavelmente reguladas pela dieta. / Lipases hidrolyse triacylglycerol to glycerol and fat acids. In the present work we studied the digestive lipases from Aedes aegypti (larvae and adults) and Amblyomma cajennense. Studied lipases belong to the neutral lipase family, stable in a large range of pH and to high temperatures. These enzymes have a higher catalytic efficiency upon short substrates like butyrate and heptanoate. The digestive lipases from both larval and adult mosquitoes are kinetically distinct. Combined study of Ae.aegypti genome and PCR showed the differential expression of lipases which belong to a multigenic family of enzymes probably regulated by diet.

O presente projeto teve como objetivo sintetizar matrizes magnetizadas para imobilização da lipase de Burkholderia cepacia para aplicação na síntese de ésteres alquilicos. Foram testadas duas metodologias para síntese de compósitos formados por óxidos magnéticos dispersos em matriz de sílica, a saber: a) matriz polissiloxano-álcool polivinílico (SiO2-PVA) dopada com Fe3O4 e ?Fe2O3 e b) matriz polissiloxano-álcool polivinílico (SiO2-PVA) sintetizada com incorporação de Fe3O4 e ?Fe2O3. As matrizes polissiloxano-álcool polivinílico (SiO2-PVA) e partículas de Fe3O4 e ?Fe2O3 foram usadas como controles. As características texturais e morfológicas das matrizes magnéticas e não magnética foram determinadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV), difratograma de raios-X, espectroscopia no infravermelho (IV) e análise de tamanho de poros (BET). As partículas de magnetita (Fe3O4) e maghemita (?Fe2O3) apresentaram comportamento superparamagnético. A lipase de B. cepacia foi imobilizada nas quatro matrizes (magnetizada e não magnetizada) por adsorção física e ligação covalente e os rendimentos de imobilização similares obtidos sugerem que as partículas de ferro não interferiram na interação enzima-suporte. Entretanto, os parâmetros cinéticos (Km e Vmax) determinados indicaram que a lipase imobilizada nos suportes magnetizados tem menor afinidade pelo substrato. Os valores determinados de Km e Vmax da lipase de B. cepacia na forma livre (Km = 400 ± 32 mM e Vmax = 16019 ± 749 Ug-1) mostraram que independente do suporte a imobilização reduziu aproximadamente 50% da afinidade da enzima pelo substrato. Os derivados imobilizados obtidos por ligação covalente foram selecionados para mediar reações de transesterificação do óleo de coco pela rota etanólica e demonstraram eficiente desempenho, fornecendo conversões praticamente totais em ésteres de etila entre 72-96h. A menor velocidade de reação foi verificada para a lipase imobilizada em partículas de Fe3O4 e ?Fe2O3, provavelmente devido à interferência negativa do óxido de ferro que reduziu a afinidade da enzima pelo substrato, corroborando com os parâmetros cinéticos Km e Vmax. As amostras purificadas apresentaram propriedades que atendem às especificações exigidas pela Agência Nacional de Petróleo (ANP) para uso como biocombustível, incluindo: pureza elevada em ésteres etílicos (mínimo 96%), densidade (873-876 kgm-3) e viscosidade cinemática (3,76-3,93 mm2s-1). / The objective of this work was to synthesize magnetic matrices for immobilization of Burkholderia cepacia lipase to be used in the synthesis of alkyl esters. Two methods for the synthesis of the magnetic composites dispersed in silica matrices were tested: a) matrix polysiloxane-polyvinyl alcohol (SiO2-PVA) coating with Fe3O4 and ?Fe2O3 and b) matrix polysiloxane-polyvinyl alcohol (SiO2-PVA) synthesized with incorporation of Fe3O4 and ?Fe2O3. The matrix polysiloxane-polyvinyl alcohol (SiO2-PVA) and the composite Fe3O4 and ?Fe2O3 particles were used as controls. The morphological and textural characteristics of the magnetic and nonmagnetic matrices were determined by analysis of pore size (BET), scanning electron microscopy (MEV), X-ray diffraction and infrared spectroscopy (IV). The magnitete (Fe3O4) and maghmitite (?Fe2O3) particles showed super paramagnetic behavior. The lipase B. cepacia was immobilized in the matrices (magnetized and non-magnetized) by physical adsorption and covalent attachment and the similar immobilization yields obtained suggest that the iron particles did not affect the enzyme-support interaction. However, the determined kinetic parameters (Km and Vmax) indicated that the lipase immobilized in both magnetized SiO2-PVA matrices had lower affinity for the substrate. The Km and Vmax values determined for free lipase (Km = 400 ± 32 mM and Vmax =16019 ± 749 Ug-1), showed that independely of the immobilization support the affinity of the enzyme for the substrate was reduced by 50%. The immobilized derivatives prepared by covalent attachment were used to mediate the transesterification reactions of coconut oil by ethanolysis route. All immobilized derivatives were efficient in the ethanolysis of coconut oil attaining total conversion to ethyl esters in 72 hours, with the exception of the immobilized lipase on Fe3O4 and ?Fe2O3 particles, which provided total conversion in 96 h, probably due to the negative influence of the iron particles on the enzyme. The purified product samples (biodiesel) were essentially odorless and translucent appearance. The purity of the ethyl esters was high. In addition, other properties such as density (873-876 kg m-3) and viscosity (3.76-3.93 mm2 s-1) meet the specifications required by the National Petroleum Agency (ANP) to be used as a biofuel.