Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2015 / Made available in DSpace on 2016-10-19T12:57:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 339437.pdf: 2605350 bytes, checksum: c883cca8465955fc3011e9a0980ecf6b (MD5) Previous issue date: 2015 / O presente trabalho apresenta como objetivo principal a síntese de partículas poliméricas via miniemulsão para a imobilização das lipases de Candida antarctica B (CalB) e Thermomyces lanuginosus (TLL) e aplicação dos derivados enzimáticos na produção de ésteres etílicos de ácidos graxos. Na primeira etapa do trabalho, CalB foi imobilizada em nanopartículas de poliuretano via miniemulsão utilizando diisocianato de isoforona (IPDI) e poli(e-caprolactona) (PCL530) e crodamol. A fase aquosa foi composta por água deionizada, SDS, PEG400 e enzima. Diferentes intensidades da sonda de ultrassom foram testadas (70 e 90%) por 1, 2 ou 3 min. A atividade enzimática foi determinada por esterificação do ácido láurico e n-propanol, e o maior valor alcançado foi de 21 U/mg (70% por 2 min), com Dp=158 nm. CalB também foi imobilizada em nanopartículas de polimetilmetacrilato (PMMA) via miniemulsão. AIBN e KPS foram testados como iniciadores. A atividade enzimática foi avaliada por hidrólise do pNPP. CalB imobilizada em PMMA manteve a atividade por 20 ciclos de hidrólise, com atividade relativa acima de 40%. Na segunda etapa do trabalho, o suporte de poliuretano (PU) foi sintetizado como citado anteriormente, com exceção do crodamol, e antes de utilizado, as partículas foram liofilizadas. TLL foi imobilizada em PU sintetizado com diferentes tamanhos de cadeia de PEG. A atividade enzimática foi determinada por hidrólise do pNPB. TLL-PU-PEG6000 apresentou os melhores resultados de Km (0,183 mM) e Vmax (45,79 µmol/min/mg). O derivado se destacou também da produção de ésteres etílicos (EE) de ácidos graxos (260 mM.U-1). Os derivados foram recobertos com polietilenoimina (PEI) a 10 e 20% e trealose (10%). Os derivados recobertos com PEI 20% apresentaram os melhores resultados em termos de estabilidade à temperatura. O uso de agentes de ligação possibilitou um aumento de no mínimo 4 vezes na produção de EE de ácidos graxos. CalB também foi imobilizada em PU PEGuilado com diferentes cadeias de PEG. CalB-PU-PEG6000 apresentou os melhores valores de Km (0,815 mM) e Vmax (41,15 µmol/min/mg). O recobrimento com trealose possibilitou maior estabilidade térmica. CalB-PU-PEG400 apresentou os melhores valores de produção de EE, 43,72 e 16,83 mM.U-1 EE-EPA e DHA, respectivamente. C imobilizada em PU-PEG400, 4000 e 6000 também foi aplicada na hidrólise do etil éster de (R,S)ácido mandélico, apresentando razões enantioméricas satisfatórias (E>20). Foi possível imobilizar as lipases CalB e TLL nas partículas poliméricas via miniemulsão com elevadas porcentagens de imobilização e atividade recuperada. Elevadas concentrações de EE de EPA e DHA foram obtidas com os derivados propostos. <br> / Abstract: This current work shows as the main objective, the synthesis of polymeric particles via miniemulsion for the immobilization of Candida antarctica lipase B (CalB) and Thermomyces lanuginosus lipase (TLL) and application of the enzymatic derivatives for production of ethyl esters of fatty acids. In the first phase of the work, CalB was immobilized on polyurethane nanoparticles via miniemulsion using isophorone diisocyanate (IPDI) and poly(e-caprolactone) (PCL530) and crodamol. The aqueous phase was comprised of deionized water, SDS, PEG400 and enzyme. Differents ultrasound power intensities were tested (70 and 90%) by 1, 2 or 3 min. The enzyme activity was determined by esterification of lauric acid and n-propanol, and the highest value achieved was 21 U/mg (70% for 2 min), with Dp=158 nm. CalB was also immobilized on polymethylmethacrylate (PMMA) nanoparticles via miniemulsion. AIBN and KPS were tested as initiators. The enzymatic activity was evaluated by hydrolysis of pNPP. CalB immobilized on PMMA retained its activity over 20 cycles of hydrolysis, with relative activity above 40%. In the second phase of the work, the polyurethane support (PU) was synthesized as previously mentioned, with the exception of crodamol, and before using it, the particles were lyophilized. TLL was immobilized on synthesized PU with different sizes of PEG chain. The enzymatic activity was determined by hydrolysis of pNPB. TLL-PU-PEG6000 showed the best results of Km (0.183 mM) and Vmax (45.79 mmol/min/mg). The derivatives also highlighted the production of ethyl esters (EE) of fatty acids (260 mM.U-1). The derivatives were coated with polyethyleneimine (PEI) at 10 and 20%, and trehalose (10%). The derivatives coated with PEI 20% showed the best results in terms of temperature stability. The use of linking agents has enabled an increase of at least 4 times the production of EE of fatty acids. CalB was also immobilized on PU PEGylated with different PEG chains. CalB-PU-PEG6000 showed the best values of Km (0.815 mM) and Vmax (41.15 mmol/min/mg). The coating with trehalose allowed greater thermal stability. CalB-PU-PEG400 showed the best values of EE production, 43.72 and 16.83 mM.U-1 of EE-EPA and DHA, respectively. Calb immobilized on PU-PEG400, 4000 and 6000 was also applied for the hydrolysis of the (R,S) mandelic acid ethyl ester, presenting satisfactory enantiomeric ratios (E> 20). It was possible to immobilize the CalB and TLL lipases in polymeric particles via miniemulsion with high percentages of immobilization and recovered activity. High concentrations of EE of EPA and DHA were obtained with by proposed enzymatic derivatives.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-01-24T03:14:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 343424.pdf: 1465364 bytes, checksum: 86b6f448a12857f25eded71b8261eba0 (MD5) Previous issue date: 2016 / Os ésteres derivados de ácido cinâmico são cada vez mais utilizados na indústria farmacêutica, alimentícia e de cosméticos, devido às suas propriedades antioxidantes, antimicrobianas e também aos seus aromas. Neste trabalho foi produzido um éster derivado de ácido cinâmico, o cinamato de geranila, empregando-se uma reação de transesterificação, utilizando solvente orgânico como meio reacional e temperatura de 60°C, catalisado por uma lipase em três processos reacionais distintos: um utilizando agitação mecânica e banho de ultrassom, outro apenas com agitação mecânica e outro com apenas banho de ultrassom. As reações foram conduzidas durante seis horas e a conversão de éster de geraniol foi determinada por cromatografia gasosa. A confirmação da molécula do composto obtido foi determinada por ressonância magnética nuclear (RMN). Na análise preliminar dos processos, o sistema utilizando apenas ultrassom apresentou uma baixa conversão se comparado com os demais, não sendo utilizado nos experimentos seguintes. Um estudo cinético foi realizado ao longo das seis horas de reação e a conversão obtida foi de aproximadamente 99% nos demais processos (agitação mecânica e agitação mecânica combinada com ultrassom). Isso possibilita concluir que apenas a agitação mecânica é suficiente para que sejam alcançados rendimentos elevados nas condições reacionais estudadas. Posteriormente, a mesma somente com agitação mecânica foi empregada numa ampliação de escala, com volume cinquenta vezes superior ao utilizado anteriormente, que resultou em uma conversão de aproximadamente 89%, evidenciando que este sistema é eficiente para a produção de cinamato de geranila em maiores escalas e a custos reduzidos, se comparado com os processos que empregam ultrassom ou irradiação com microondas. O produto obtido da reação escolhida foi submetido a testes de atividade antimicrobiana com as bactérias Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Bacillus cereus, demonstrando resultados muito satisfatórios, comprovando que o cinamato de geranila pode ser considerado ativo contra estas bactérias.<br> / Abstract : Derivatives of cinnamic acid have wide applications in food, pharmaceutical and cosmetic industry, due to their antioxidant, antimicrobial, flavor and fragrance properties. This work investigated the geranyl cinnamate production by transesterification of ethyl cinnamate and geraniol, in organic media and temperature of 60 °C, catalyzed by the commercial immobilized lipase Novozym 435. This reaction was conducted in three different conditions bath ultrasound and mechanical stirring, only mechanical stirring and only bath ultrasound. The reactions were carried out for six hours, the conversion was determined by gas chromatography and the geranyl cinnamate characterization was confirmed by H-nuclear magnetic resonance spectroscopy (H-NMR). The first analysis, a very low conversion with the system with just bath ultrasound are obtained, because of this, they are not used for the kinetic. Under kinectic reaction of six hours a conversion of 99% was obtained in both reaction systems, bath ultrasound with mechanical stirring and just mechanical stirring. These results showed that mechanical stirring is an efficient method for achieving high conversion rates. Furthermore, this method was raised fifty times at scale-up procedure and result a conversion of 89%, showing a very good result for geranyl cinnamate production without ultrasound or microwave and saving energy. The antimicrobial activity of the geranyl cinnamate was tested on bacteria Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Bacillus cereus the results were considered satisfactory, proving high antimicrobial activity against these bacterias.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-20T16:51:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 234080.pdf: 1076097 bytes, checksum: 81eff8679684c81260e0a77fc8e61d28 (MD5)

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-20T17:15:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 197989.pdf: 1029654 bytes, checksum: 80be5a94f789dc228c1ecb590ceebf6c (MD5) / Neste trabalho foram exploradas metodologias alternativas de imobilização de enzimas e microrganismos para a manutenção das atividades e estereosseletividades dos mesmos em meio orgânico. As células de Saccharomyces cerevisiae (FP) foram suportadas em montmorilonita (K10), recobertas ou não com gelatina (G), na presença ou ausência de sacarose (S) ou trealose (T). Estes sistemas foram utilizados para a redução enantiosseletiva do acetoacetato de etila e a-cloroacetofenona em hexano. Para a redução do acetoacetato de etila com os sistemas FP/K10/G/S e FP/K10/G/T o biocatalisador tornou-se mais estável em meio orgânico, formaram-se menos subprodutos e a atividade foi mantida. O S-(+)-álcool foi obtido com ee>99% até a quarta reutilização, com valores de %c de 19 e 20% a 20oC, que foi a temperatura mais adequada para evitar a desativação das células. Para a biorredução do acetoacetato de etila constatou-se que a função principal da sacarose, da mesma forma que a trealose e a água, é de proteção da parede celular do microrganismo. Os valores de ee e %c foram similares com todos os sistemas. Na redução da a-cloroacetofenona obteve-se o R-(-)-2-cloro-1-feniletano após 72h de reação com ee 78-79%, quando o sistema FP/K10/G/S foi utilizado a 20 e 30oC, respectivamente. A biorredução em presença do sistema FP/K10/G/S forneceu %c superiores e valores de ee(%) inferiores aos obtidos em presença do sistema FP/K10/G/T (99%). Estes resultados evidenciam a influência da difusão para este reagente e produtos nos sistemas mais protegidos, ao contrário do observado para o acetoacetato de etila. O sistema FP/T foi o que apresentou a maior conversão em R-(-)-2-cloro-1-feniletanol e após 48h de reação obteve-se o produto com ee 80% e conversão de 45%, a 20oC. Para este substrato pode-se constatar o papel importante da trealose como agente protetor. O FP, imobilizado ou não, não foi eficiente quando utilizado como biorredutor de acetofenonas que não possuíam grupos ativantes próximos à carboníla, e os produtos desejados não foram obtidos.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-21T03:54:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 205509.pdf: 1076097 bytes, checksum: 81eff8679684c81260e0a77fc8e61d28 (MD5)

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-21T09:38:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Lipases de diferentes fontes foram imobilizadas em vários materiais poliméricos. Estes sistemas foram utilizados em reações de esterificação. Foram avaliados parâmetros tais como tempo, temperatura de reação, concentração de enzima no suporte, variação da concentração ácido:álcool, efeito do doador acila e tamanho da cadeia do álcool. Foi, também, verificada a aplicação preliminar destes sistemas para a transesterificação enantiosseletiva do acetato de vinila com (R,S)-2-hexanol. As lipases utilizadas foram as de R. miehei (LRM), M. miehei (LMM), T. lanuginosus (LTL), A. niger (LAN), R. oryzae (LRO), C. rugosa (LCR), M. javanicus (LMJ), Pseudomonas sp e pancreática de porco (LPP). As micrografias para a LRO e LMJ mostraram que as lipases estão localizadas preferencialmente na superfície dos polímeros. Não foi verificada dessorção de LRO e LMJ imobilizadas após 66h. A formação do laurato de n-pentila catalisada pelas lipases de diferentes procedências imobilizadas, foi dependente do tipo de suporte e fonte de enzima. A esterificação do ácido láurico com n-pentanol catalisada pela LRO e LMJ foi dependente do tempo e temperatura reacional, concentração de enzima no suporte, concentração dos substratos e do solvente. A LRO imobilizada manteve sua atividade após oitenda dias de armazenagem e com dez ciclos reacionais. A reação de esterificação catalisada pela LRO e LMJ imobilizada, foi dependente do tamanho da cadeia do doador acila e do álcool. Na reação de transesterificação do acetato de vinila com (R,S)-2-hexanol, a enantiosseletividade da LPS na forma livre foi superior comparando-se com a imobilizada.

Made available in DSpace on 2016-03-07T19:20:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-06-24. Added 1 bitstream(s) on 2016-03-07T19:24:45Z : No. of bitstreams: 1 000849834_20170624.pdf: 1817877 bytes, checksum: 6529269723628cd64b4ebb458eb00ecc (MD5) Bitstreams deleted on 2017-06-30T13:45:02Z: 000849834_20170624.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-06-30T13:45:55Z : No. of bitstreams: 1 000849834.pdf: 4488346 bytes, checksum: 33829b4f27a436cb052b3a5f1ed811f3 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-08-24T16:17:00Z: 000849834.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-08-24T16:17:47Z : No. of bitstreams: 1 000849834.pdf: 4488346 bytes, checksum: 33829b4f27a436cb052b3a5f1ed811f3 (MD5) / Os fungos endofíticos são micro-organismos que vivem nos espaços intercelulares das plantas e são reconhecidos por seu potencial na produção de importantes produtos de interesse biotecnológico, tal como as enzimas. Estas vem sendo amplamente utilizadas nos setor industrial pois catalisam reações com maior especificidade que as formas convencionais de reações químicas, fazendo assim dos fungos endofíticos uma alternativa promissora na produção desses biocatalisadores. Desta forma, este trabalho teve como objetivo a prospecção de enzimas de interesse biotecnológico como lipase, esterase, epóxido-hidrolase, nitrilase, acilase, protease e amidase em fungos endofíticos e a avaliação da sua aplicação biotecnológica, com enfoque na utilização do extrato bruto contendo lipase em processos de biorremediação e transesterificação. Setenta e cinco fungos endofíticos foram submetidos à prospecção de atividade biocatalítica, onde 66 apresentaram atividade lipases/ esterases, 16 epóxido hidrolase, 24 acilases, 50 proteases, 10 nitrilase e 64 amidase. Foram encontrados fungos com satisfatória atividade biocatalítica frente a diferentes metodologias e substratos, mostrando a grande versatilidade dos endófitos na produção de enzimas. O fungo Mycosphaerella coacervata foi selecionado para avaliação da atividade e caracterização parcial da lipase extracelular em extrato bruto. O micro-organismo apresentou produção máxima da enzima quando cultivado por 48 horas a 28oC (486 U/L), e se manteve estável até 6 meses estocada a - 2oC. O extrato bruto contendo a enzima apresentou atividade máxima a 37oC em pH 8,0. A estabilidade térmica foi observada na faixa de 30 a 60oC (atividade residual acima de 80%) e sua estabilidade ao pH entre 6,0 e 9,0.(atividade residual superior a 80%). A enzima se manteve estável (atividade residual acima de 90%) na presença de acetona, metanol... / The endophytic fungi are microorganisms that live in the intercellular spaces of plants and are known for their potential for the production of important products of biotechnological interest, such as enzymes. These have been widely used in industry because they catalyze reactions with greater specificity than conventional forms of chemical reactions, thereby making the endophytic fungus a promising alternative to produce these biocatalysts. Thus, this study aimed to prospect for enzymes of biotechnological interest as lipase, esterase, epoxide hydrolase, nitrilase, acylase, amidase and protease in endophytic fungi and evaluate their biotechnological applications, focusing on the use of the crude extract containing lipase in the transesterification process and bioremediation. Seventy five endophytic fungi were submitted to prospecting biocatalytic activity, where 66 showed lipase / esterase activity, 16 epoxide hydrolase, 24 acylases, 50 proteases, 10 nitrilase and 64 amidase. Fungi with satisfactory biocatalytic activity against different methodologies and substrates were found, showing the versatility of endophytes in the production of enzymes. The fungi Mycosphaerella coacervata was selected to evaluate the activity and partial characterization of extracellular lipase crude extract. The microorganism showed maximum enzyme production when grown for 48 hours at 28°C (486 U / L), and remained stable up to 6 months stored at -2°C. The crude extract containing the enzyme showed maximum activity at 37°C at pH 8.0. The thermal stability was observed in the range of 30 to 60°C (residual activity above 80%) and its stability at the pH between 6.0 and 9.0 (residual activity exceeding 80%). The enzyme was stable (residual activity above 90%) in the presence of acetone, methanol, ethanol, isopropanol and hexane at concentrations of 20 and 50%. Good stability was observed also in relation to different...

Orientador: Nadia Krieger / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Exatas, Programa de Pós-Graduação em Química / Inclui bibliografia / Resumo: As lipases fazem parte da classe de hidrolases, cuja classificação internacional é "glicerol éster hidrolases E.C. 3.1.1.3 ". De origem bacteriana, fúngica ou de mamíferos e propriedades diversas, estas enzimas podem catalisar a hidrólise e a síntese de um grande número de compostos em diferentes meios e condições reacionais. O objetivo deste trabalho foi estudar a biocatálise em sistemas bifásicos micro-heterogêneos e macro-heterogêneos, utilizando o extrato lipolítico de Penicillium corylophilum (IOC 4211). Para tanto, foram estudadas a reação de hidrólise de ésteres em meio aquoso e em micelas reversas AOT/n-heptano, bem como, a síntese do oleato de n-butila no sistema micro-heterogêneos (micelas reversas) e em sistemas macro-heterogêneos (bifásicos). Foi estudada a eficiência de várias preparações enzimáticas nos sistemas, usando n-heptano como meio reacional, a saber: 1) adição direta da enzima liofilizada; 2) adição direta da enzima co-liofilizada com (3-ciclodextrina e 3) adição da enzima imobilizada em gel hidrofóbico. Inicialmente, investigou-se a produção da enzima e as propriedades do extrato lipolítico, como o efeito do pH e da temperatura na atividade enzimática, e a estabilidade da enzima à temperatura e em presença de solventes orgânicos. Verificou-se que a produção máxima da enzima foi de 6,8 U.mL"1, após 144 h, a 29°C e agitação orbital de 120 rpm, em um meio composto por sais minerais, glucose e 2 % (v/v) de óleo de oliva. O extrato lipolítico apresentou maior atividade na faixa de pH entre 6,0 e 8,0, e na faixa de temperatura entre 45 e 60 °C. As lipases contidas no extrato bruto não são termoestáveis, mas apresentam estabilidade quando incubadas em presença de solventes orgânicos apoiares, de fato, quando o extrato lipolítico foi incubado em n-heptano, a enzima mostrou ativação de 14 e 30 % com atividade de água (aw) inicial no sistema de 0,53 e 0,95, respectivamente. As maiores atividades enzimáticas do extrato bruto de P. corylophilum foram encontradas para o pNPP em meio aquoso e para a trioleína em meio micelar. No meio aquoso foi observada ainda uma ativação da enzima de aproximadamente 7 vezes após a coliofilização com (3-ciclodextrina, e 2 vezes após a imobilização no gel hidrofóbico. Nas reações de esterificação, a reação modelo utilizada foi a síntese do oleato de n-butila. A síntese foi acompanhada por CCD e por CLAE, e os rendimentos foram determinados pelo método de Lowry-Tinsley. O melhor sistema para a síntese do oleato de n-butila foi de micelas reversas com Wo (teor de água) de 10 e 100 % de rendimento (12 h), seguido do sistema onde se adicionou a enzima liofilizada, com 100 % de rendimento (48 h) obtido com a"- inicial no meio reacional de 0,11. Para o sistema onde a enzima foi co-liofilizada com (3-ciclodextrina, o rendimento foi de 63 % (48 h), em aw inicial de 0,11. O sistema menos eficiente foi o que utilizou a enzima imobilizada em gel hidrofóbico, com 14 % (48 h) e aw inicial de 0,11. Os resultados obtidos neste trabalho mostraram que o extrato lipolítico de P. corylophilum, um fiingo isolado localmente, pode ser utilizado em reações de síntese em meios aquo-restritos, e sugerem a importância da continuidade dos estudos no sentido de purificação e caracterização bioquímica das lipases produzidas por P. corylophilum, e uma investigação em profundidade do potencial de uso das enzimas purificadas para a produção de compostos de química fina. Palavras-chave: Lipases, Penicilium corylophilum, biocatálise, sistemas aquo-restritos, micelas reversas. / Abstract: Lipases belong to the class of hydrolases, and are classified as "glycerol ester hydrolases E C 3.1.1.3". This group includes bacterial, fungal and mammalian enzymes with diverse characteristics, united by their ability to catalyze the hydrolysis and the synthesis of a large number of compounds in different reaction media and under different conditions. The objective of this work was to study biocatalysis in macroheterogeneous and micro-heterogeneous biphasic systems, utilizing the lipolytic extract from Penicillium curylophilum (IOC 4211). The following aspects were studied: the hydrolysis of esters in aqueous solution and in AOT/n-heptano reversed micelles, and the synthesis of butyl oleate ester in a micro-heterogeneous system (reversed micelles), and in macro-heterogeneous systems (biphasic) systems. The performance of various enzyme preparations in these systems, using n-heptane as the reaction media, was studied: 1) direct addition of the lyophilized enzyme; 2) direct addition of the enzyme co-lyophilized with P-cyclodextrin and 3) addition of the enzyme immobilized on a hydrophobic support. The initial studies were undertaken to characterize the production of the enzyme and the properties of the lipolytic extract, such as the effect of pH and temperature on enzyme activity and the stability of the enzyme at elevated temperatures and in the presence of organic solvents. The maximum enzyme concentration obtained in the production studies was 6.80 U.mL"1, after 144 h of incubation on a rotary shaker at 29 °C and 120 rpm, in a medium containing mineral salts, glucose e 2 % (v/v) olive oil. The lipolytic extract showed greatest activity in the pH range 6.0-8.0 and in the temperature range 45 - 60 °C. The lipases within the crude extract are not thermostable, but do show stability when incubated in the presence of organic apolar solvents: in fact, when the extract was incubated in n-heptane, the enzyme was activated by 14 to 30 % for an initial water activity of the system (aw) of 0,53 and 0,95, respectively. The highest activities measured for the crude lipolytic extract were for the hydrolysis of pNPP in aqueous solution and for the hydrolysis of triolein in the reversed micelle system. In aqueous solution the enzyme was activated approximately seven-fold after colyophilization with p-cyclodextrin, and approximately 2-fold after immobilization in hydrophobic gel. In the esterification reactions the model reaction used was the synthesis of butyl oleate ester, with the reaction being followed by TLC and HPLC, and the yields being determined by the Lowry-Tinsley method. The best system for the synthesis of butyl oleate ester was the reversed micellar system with a Wo (water content) of 10, which gave a yield of 100 % (12 h), followed by the system in which the enzyme lyophilized was added to the medium, with a yield of 100 % (48 h), obtained at an initial aw of 0.11 in the reaction medium. For the system in which the enzyme was co-lyophilized with P-cyclodextrin, the yield was 63 % (48 h), also obtained at an initial a", of 0.11. The least efficient system was the enzyme immobilized on hydrophobic gel, with a 14 % (48 h) yield, obtained at the same initial aw of 0.11. The results obtained in this study show that the lipolytic extract of P. corylophihim, a locally-isolated fungus, can be used in synthesis reactions in low-water systems, and suggest that the studies should now proceed to the purification of lipases from the crude extract, the biochemical characterization of these lipases and an in-depth investigation of the potential for the use of purified enzymes in biocatalysis, for the production of fine chemicals. Palavras-chave: Lipases, Pemcilium corylophihim, biocatalysis, low-water systems, reversed micelles.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-11-19Bitstream added on 2015-04-09T12:47:49Z : No. of bitstreams: 1 000817170.pdf: 893124 bytes, checksum: ec79ee6704498c3749ce75120e54f120 (MD5) / A metagenômica é uma ferramenta poderosa na descoberta de novos genes microbianos com potencial biotecnológico, pois não são necessárias as técnicas tradicionais de cultivo. Para suprir as necessidades de enzimas no mercado esta técnica tem sido muito utilizada para a descoberta de novos genes codificadores de lipases e esterases microbianas muito utilizadas em processos biotecnológicos como produção de detergentes, biodiesel e biorremediação. Em trabalhos anteriores, foram prospectadas sequências codificadoras para enzimas lipolíticas em uma biblioteca metagenômica de DNA com 4224 clones, de um consórcio microbiano obtido de solo contaminado com hidrocarbonetos de petróleo, localizado na cidade de Ribeirão Preto – São Paulo - Brasil, obtendo-se 30 clones com possível atividade lipolítica em Tributirina. No presente trabalho, um dos clones foi selecionado após ensaio em placa de Petri com Tributirina para a construção de uma sub-biblioteca, com 480 subclones. O sequenciamento foi realizado em aparelho ABI Prism 3100 e o “contig” obtido analisado no ORF Finder do National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, Maryland, USA). Foi possível identificar um gene de 1032 pb, 344 aminoácidos , denominado ORF2, que codifica uma enzima lipolítica com identidade de 94 % com uma hidrolase de Pseudomonas denitrificans (YP_007656829.1). As sequências que representam as oito famílias de enzimas lipolíticas propostas por Arpying e Jaeger (1999) foram extraídas do banco de dados do NCBI e comparadas com a sequência da ORF2, possibilitando afirmar que esta enzima é um novo membro da família V de enzimas lipolíticas bacteriana. O gene codificador da ORF2 foi clonado em vetor de expressão pET28a e superexpressado em Escherichia coli BL21(D3). A fração solúvel da proteína foi analisada em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), em condição desnaturante. A atividade lipolítica das bandas da proteína ... / The metagenomics is a powerful tool in the discovery of new microbial genes with biotechnological potential, they are not necessary traditional cultivation techniques. With increasing demand for enzymes in the market this technique has been widely used for the discovery of new genes encoding microbial lipases and esterases widely used in biotechnological processes such as the production of detergents, biodiesel and bioremediation. In previous work, coding sequences for lipolytic enzymes were prospected in 4224 clones from a metagenomic DNA library from a microbial consortium obtained from soil contaminated with petroleum hydrocarbons, located in the city of Ribeirão Preto - São Paulo - Brazil, obtaining 30 clones with possible lipase activity on tributyrin. In this study, one clone was selected after testing in a Petri dish with Tributyrin to build a sub-library, with 480 subclones. Sequencing was performed on ABI PRISM 3100 instrument and analyzed “contig”s obtained in the ORF finder from the National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, Maryland, USA). It was possible to identify a gene of 1032 bp, 344 amino acids, termed ORF2, encoding a lipolytic enzyme with 94% identity with a hydrolase from Pseudomonas denitrificans (YP_007656829.1). The sequences representing eight families of lipolytic enzymes and Arpying proposed by Jaeger (1999) were extracted from the NCBI database and compared with the sequence of ORF2, allowing affirm that this enzyme is a new member of the family V bacterial lipolytic enzymes . The encoder ORF2 gene was cloned into pET28a expression vector and overexpressed in Escherichia coli BL21 (D3). The soluble protein fraction was analyzed by polyacrylamide (SDS-PAGE) gel in denaturing condition. The lipolytic activity of the recombinant protein bands on the SDS-PAGE gel was confirmed by a zymogram indicating its functionality in a specific substrate. Three-dimensional modeling was also ...

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-01-20. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:49:19Z : No. of bitstreams: 1 000832663.pdf: 538584 bytes, checksum: 81fee38f3cfc289b846abd1af73e7813 (MD5) / Objetivou-se com a execução deste trabalho o estudo a respeito dos níveis recomendados de inclusão de óleo de descarte aos dejetos de suínos bem como a influencia da inclusão de níveis de lipase ou Biol®, com o intuito de avaliar o efeito do acréscimo de produção de biogás, metano e redução dos teores de sólidos. Foram realizadas duas etapas, sendo a primeira a respeito dos níveis recomendados de adição de óleo e a segunda utilizando os níveis de óleo que apresentaram efeito negativo adicionados à lipase ou Biol®. Para desenvolvimento do ensaio de co-digestão da primeira etapa foram preparados substratos contendo 4% de sólidos totais (ST), compostos por dejetos de suínos, óleo de descarte (nas proporções de 0, 2, 4, 6, 8, 10 e 12%) além de água para diluição destes resíduos e inóculo, para abastecimento de biodigestores batelada. Para desenvolvimento da segunda etapa foi realizado abastecimento de biodigestores batelada com substratos contendo 4% de ST, compostos por dejetos de suínos, óleo de descarte (nas proporções de 8, 10 e 12%), lipase (nas proporções de 0,05; 0,10; 0,15; 0,20 e 0,25%) ou Biol® (10 g/m3 ou 15 g/m3) além de água para diluição destes resíduos e inoculo. Com relação a influencia da adição de níveis de óleo verificou-se que as máximas reduções de ST e SV foram de 36,8 e 41,1% e ocorreram nos níveis de 5,2 e 5,8% de óleo aos substratos, as inclusões de 5,4 e 6,1% de óleo permitiram o alcance de potenciais de 222,9 e 263,6 litros de biogás por kg de ST e SV adicionados. Referindo-se a influencia da adição de níveis de óleo e lipase verificou-se que as reduções máximas de ST e SV foram de 56,13 e 64,49% e ocorreram nos níveis de inclusão 0,15 e 0,13% de lipase e 12% de óleo adicionado aos substratos e ainda que os maiores potenciais de produção de metano por g de ST e sólidos voláteis (SV) adicionados (0,23 e 0,29 litros) foram alcançados pela ... / The objective of the implementation of this work the study on the recommended levels of disposal of oil addition to swine manure as well as the influence of the inclusion of lipase levels or Biol®, in order to evaluate the effect of increased production of biogas, methane and reduction of solids. Two steps were conducted, the first with respect to recommended levels of oil addition and using the second oil levels that were negative effect on lipase or Biol® added. For assay development co-digestion of the first stage substrates were prepared containing 4% total solids (TS), composed of swine manure disposal of oil (in the ratios of 0, 2, 4, 6, 8, 10 and 12 %) addition of water for dilution of this waste and inoculum to supply batch digesters. For development of the second stage was performed supply of batch digesters with substrates containing 4% TS, composed of swine manure disposal of oil (in the ratios of 8, 10 and 12%), lipase (in the proportions of 0.05; 0.10, 0.15, 0.20 and 0.25%) or Biol® (10 g/m3 to 15 g/m3) than water for dilution of these residues and inoculum. Regarding the influence of the oil addition levels found that the maximum TS and VS reductions were 36.8 and 41.1% and occurred at levels of 5.2% oil and 5.8 to substrates, the additions of 5.4 and 6.1% enabled the oil potential range of 222.9 and 263.6 liters of biogas per kg TS and VS added. Referring to influence of adding oil and lipase was found that reductions of TS and VS were 56.13 and 64.49% and were in inclusion levels of 0.15 and 0.13% lipase and 12% of oil added to the substrates and that the greatest potential of methane production per g of TS and volatile solids (VS) added (0.23 and 0.29 liters) were achieved by greater inclusion of oil (12%) was added when the levels of 0.12 and 0.11% lipase. Regarding the inclusion of Biol®, it was found that the higher potential production of methane per g TS and VS added (0.22 and 0.27 liters, respectively) were ...