Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de ce projet avaient pour objectif d'étudier le rôle de la lipase endothéliale (LE) dans le métabolisme des lipoprotéines chez l'humain. L'impact de l'obésité et de l'inflammation sur les concentrations de LE a d'abord été étudié. Nous avons rapporté que les concentrations plasmatiques de LE étaient fortement corrélées à l'indice de masse corporelle (IMC) et à l'accumulation de tissu adipeux (TA) viscéral. L'absence d'ARNm de la LE dans les tissus adipeux viscéral et sous-cutané suggère qu'il serait très improbable que l'association entre la LE et l'obésité soit due à une augmentation de production de LE par les tissus adipeux. En revanche, ceci pourrait être le reflet de perturbations métaboliques majeures sous-jascentes, telles que l'inflammation. Nous avons effectivement rapporté que la variance des concentrations plasmatiques de LE étaient expliquée à 26.6% par un score inflammatoire (basé sur les concentrations plasmatiques de CRP, de IL-6 et de sPLA2-IIA), et ce, indépendamment de l'âge, des concentrations d'apoB, et de l'accumulation de TA viscéral. Ceci suggère que la relation entre l'obésité et les niveaux de LE en circulation pourraient en partie être reliée à l'inflammation. Nous avons par la suite observé une augmentation croissante des niveaux plasmatiques de LE chez les femmes préménopausées, les femmes postménopausées et les hommes. Nous avons rapporté que ces concentrations élevées de LE étaient associées à un profil lipidique pro-athérogène i.e. à des concentrations élevées de cholestérol, de triglycérides (TG), d'apoB et de LDL petites et denses ainsi qu'à une réduction de C-HDL. Les résultats d'études cinétiques chez ces sujets ont révélé que l'association entre la LE et un profil lipidique pro-athérogène pourrait s'expliquer par une élimination diminuée d'apoB-VLDL et par une production ralentie d'apoA-I. Finalement, l'étude du variant T111I dans le gène de la LE dans l'Étude des Familles de Québec a montré que ce polymorphisme semblait avoir un effet modeste sur les concentrations plasmatiques de HDL. Toutefois, la découverte d'une interaction gène-diète chez les femmes à l'étude suggère que le variant T111I pourrait conférer une protection contre la réduction des concentrations plasmatiques d'apoA-I et C-HDL3 habituellement causée par une alimentation riche en acides gras polyinsaturés. Ces observations demandent d'être reproduites chez un plus grand nombre de sujets. De plus, l'élévation des concentrations intravasculaires de LE chez les individus obèses ou ayant le syndrome métabolique pourraient être dues à la présence concomitante d'un état pro-inflammatoire. Cet aspect mérite davantage d'attention dans les études futures. / The objective of the present thesis was to investigate the role of endothelial lipase (EL) in human lipoprotein metabolism. First, we studied the impact of obesity and of a pro-inflammatory state on plasma EL concentrations. We reported that plasma EL Ievels were positively correlated with body mass index and visceral adipose tissue (AT) accumulation. The absence of EL mRNA in visceral and subcutaneous AT suggested that it would be unlikely that the association between EL and obesity might be due to an increased production of EL by AT. However, this could reflect major metabolic complications like inflammation. We have, indeed, reported that variance in plasma EL concentrations were explained at 26.6% by an inflammatory score (based on plasma concentrations of CRP, IL-6 and sPLA2- IIA), independently of age, apoB Ievels and visceral AT accumulation. This suggests that the relationship between obesity and plasma EL in circulation might be related, to some extent, to inflammation. We then observed progressively higher plasma EL Ievels among premenopausal women, postmenopausal women and men. We have reported that these higher Ievels in plasma EL were associated with a pro atherogenic lipid profile along with increased Ievels of cholesterol, TG, apoB and small dense LDL and reduced HDL-C. Results from kinetic studies in these subjects revealed that this association between EL and a deleterious lipid profile could be explained by a delayed clearance in VLDL-apoB and a reduced production of apoA-I. Finally, the investigation of the T111I variant in the EL gene in subjects of the Québec Family Study has shown that this SNP has a modest effect on plasma HDL concentrations. However, the apparent interplay between T111I and unsaturated fatty acid consumption suggests that this variant might protect against the réduction in plasma apoA-I and HDL3-C usually caused by a diet rich in polyunsaturated fatty acids. Thèse results need to be reproduced in a larger sample of subjects. The concomitant presence of a pro-inflammatory state in obesity and the metabolic syndrome might be an explanation for the increased plasma EL Ievels, and this issue deserves more attention in future studies.

Cette étude a porté sur l’analyse de l’énantiosélectivité de la lipase de Burkholderia cepacia (BCL) pour les acides 2-substitués, synthons chiraux d’intérêt pharmaceutique, avec pour objectif d’examiner le rôle de l’accès au site actif enfoui de BCL sur l’énantiosélectivité et de développer une procédure d’ingénierie permettant de créer des mutants d’énantiosélectivité améliorée. Pour traiter le problème, une nouvelle approche de calcul, basée sur des algorithmes de planification de mouvements issus de la robotique a été développée. Elle permet l’exploration conformationnelle des espaces multi-dimensionnels contraints et a été appliquée au calcul des trajectoires de plusieurs racémiques dans le site actif de BCL et à l’identification de résidus pouvant potentiellement gêner le déplacement du substrat le long du site actif. Les résultats obtenus in silico ont révélé une corrélation qualitative avec les valeurs d’énantiosélectivité et ont permis de proposer des cibles de mutagénèse. Sur cette base, l’ingénierie du site actif de BCL a été entreprise pour moduler sélectivement l’accès des énantiomères R et S à la triade catalytique. Un système d’expression hétérologue de BCL chez E. coli compatible avec une expression en microplaque, a été développé. Une librairie de 57 (3x19) mono-mutants sur les positions : Leu17, Val266 et Leu287 a été construite par iPCR puis criblée en utilisant une procédure à moyen débit pour identifier les variants actifs pour l’hydrolyse du pNPB. L’énantiosélectivité de ces mutants a ensuite été évaluée pour l’hydrolyse du racémique (R,S)-2 bromophényl acétate de 2-chloro-éthyle, par utilisation d’une nouvelle procédure de criblage en deep-wells. Ce crible a permis de mettre en évidence plusieurs mutants dont les plus prometteurs ont été caractérisés. Ainsi les mutants Leu17Ser et Leu17Met présentent une augmentation de l’énantiosélectivité d’un facteur 10 accompagnée d’une augmentation de leur activité d’un facteur 4 à 5. Le mutant Val266Gly présente, quant à lui, une inversion de l’énantiosélectivité pour le substrat d’intérêt. L’étude des trajectoires par les techniques de planification combinée à une représentation sous la forme de carte de voxels a été réalisée en parallèle. Pour les mutants sélectionnés, une bonne corrélation a été observée entre les résultats obtenus in silico et expérimentalement. De plus, cela a permis de proposer de nouvelles combinaisons de mutations ayant conduit à l’identification de deux double-mutants Leu17Met/Val266Met et Leu17Ser/Leu287Ile d’énantiosélectivité supérieure à 150 pour le substrat modèle, révélant ainsi l’intérêt de l’approche semi-rationnelle proposée / This work has been focused on the understanding of the Burkholderia cepacia lipase (BCL) enantioselectivity towards 2-substituted acids which are chiral building blocks of pharmaceutical interest. The main objective of this work was the investigation of the potential role of substrate accessibility toward the buried active site of BCL on enantioselectivity and the development of an engineering procedure for the design of enantioselective mutants. To study further this hypothesis, a novel computational approach, based on motion-planning algorithms, originally used in robotics, was developed. It allows the conformational exploration of constrained high-dimensional spaces and was applied to the computation of trajectories for a set of racemates within the catalytic site. This methodology also enables the identification of residues potentially hindering substrates displacement along the active site. Results obtained in silico were correlated qualitatively with experimental values of enantioselectivity. On the basis of these results, engineering of the narrow active site of BCL has been undertaken to modulate selectively the access of R and S enantiomers to the catalytic triade. An heterologous expression system of BCL in E. coli compatible with production at microplate scale was developed. A library of 57 (3x19) variants targeted at positions Leu17, Val266 and Leu287 was built by iPCR and subsequently screened using a medium-throughput procedure to identify active variants against pNPB hydrolysis. Next, the enantioselectivity of these mutants was evaluated towards a given racemate, the (R,S)-2-chloro ethyl 2-bromophenylacetate, using a novel screening procedure developed in deep wells. Such screening enabled the identification of several variants amongst which the most promising were characterized. Mutants Leu17Ser and Leu17Met showed a remarkable 10-fold increase of their enantioselectivity and a 4- and 5-fold improvement of their specific activity. Compared to the wild-type enzyme, mutant Val266Gly displayed a reversed enantioselectivity for the substrate of interest. Investigation of the trajectories using motion-planning techniques combined to a voxel map representation was carried out. For selected variants, a fair correlation was observed between in silico and experimental results. Moreover, this enabled us to suggest novel combinations of mutations that led to the identification of two double-mutants Leu17Met/Val266Met and Leu17Ser/Leu287Ile showing an enantioselectivity value higher than 150 for the racemic substrate, revealing thus the effiency of the semi-rational strategy

Les céramides sont des lipides de la classe des sphingolipides issus de la N-acylation d’une base sphingoide par un acide gras. Ces lipides et leurs analogues suscitent un grand intérêt comme composants actifs dans les industries pharmaceutique et cosmétique. Parmi les biocatalyseurs capables de réaliser la synthèse de ce type de lipide, la lipase B de Candida antarctica semble être l’enzyme la plus adaptée à la production de « pseudo-céramides » à partir d’amino-polyols. Dans ce contexte, nous avons abordé l’étude de l’acylation de composés de type « amino-alcool »catalysée par la lipase B de Candida antarctica, en gardant à l'esprit une approche fondamentale afin d’élargir les connaissances actuelles sur ce sujet. La première partie de notre travail a ainsi traité de l’étude cinétique de l’acylation de composés monofonctionnels afin de déterminer les mécanismes réactionnels et l’énantio sélectivité de la lipase B de Candida antarctica pour les réactions de N-acylation et de O-acylation. Les parties suivantes de notre travail ont porté sur une étude structure-réactivité du substrat accepteur d’acyle et sur l’étude de l’influence du solvant utilisé (solvant organique ou liquide ionique) afin de déterminer les facteurs clés influençant la chimio sélectivité et la régio sélectivité de la lipase B de Candida antarctica lors de l’acylation de composés multifonctionnels de type « amino-alcool ». Finalement, à partir des connaissances acquises dans les différentes parties, nous avons développé et optimisé un procédé de synthèse enzymatique de « pseudo-céramides » (O,N-diacyl aminopropanediols) mis en oeuvre en réacteur continu à « lit fixe ». / Ceramides are lipids from the sphingolipide class derived from the N-acylation of a sphingoid base from a fatty acid. These lipids and their analogs are compounds of interest used as active components in pharmaceutical and cosmetic industries. Among biocatalysts able to synthesize this type of lipids, Candida antarctica lipase B appears to be the most appropriate enzyme for the production of "pseudo-ceramides" derived from amino-polyols. In this context, we have studied the acylation of amino-alcohol-like compounds catalyzed by Candida antarctica lipase B, keeping inmind a fundamental approach to expand the current knowledge on this subject. The first part of our work aimed to determine the reaction mechanisms and the enantio selectivity exhibited by Candida antarctica lipase B during O-acylation and N-acylation reactions, by conducting a kinetic study of mono functional compound acylation. In the following parts of our work, we performed a structurere activity study of the acyl acceptor substrate and evaluated the effect of the solvent used (organic solvent or ionic liquid) to determine the key factors influencing the chemo selectivity and the regio selectivity of the Candida antarctica lipase B-catalyzed acylation of polyfunctional amino alcohol compounds. Finally, starting from the knowledge acquired in the previous parts, we have developed and optimized an enzymatic process of “pseudo-ceramide” (O,N-diacylaminopropanediol) synthesis performed in a continuous packed-bed reactor.

Les recherches que nous présentons dans ce mémoire s'inscrivent dans le cadre du projet européen IBIOLAB[1] qui vise à la création de biolubrifiants écolabellisables. Tout d'abord, une approche d'ingénierie inverse a été réalisée pour déterminer le rôle des tensioactifs natifs des graines oléoprotéagineuses dans la stabilisation des oléosomes dans l'eau. Ceci a permis par la suite une approche générique avec la mise en œuvre d'un procédé intégré qui permet la libération des lipides sous forme émulsionnée. Une étape optionnelle consiste en l'hydrolyse enzymatique in situ des triglycérides. L'activité de la lipase utilisée a été évaluée lors d'une étude d'estérification des acides gras avec différents alcools par une méthode de séparation triphasique (TPP three-phase partitioning). / The present work was performed within the framework of the European project IBIOLAB* which aims to create environmentally friendly biolubricants (able to be eco-labelled). First of all, a reverse engineering methodology was developed to understand the role of oilseed native surfactants in the stability of oil-bodies in water. Subsequently, using a general approach, it was possible to develop a process that allows releasing the lipid fraction into an emulsion. If an in-situ enzymatic hydrolysis of triglycerides is added to this process, an emulsion containing the free fatty acids will be obtained. The activity of the remaining lipase in the emulsion was used to study the esterification of free fatty acids with different alcohols using a three-phase partitioning method.

Les lipases sont des enzymes présentant un grand intérêt industriel. L’intérêt de ces enzymes a conduit à caractériser ces enzymes, à mieux comprendre leur mécanisme réactionnel et leur cinétique, et à établir des méthodes efficaces de production en système d’expression homologue et hétérologue. Plus récemment, l’ingénierie enzymatique permet d’améliorer les caractéristiques des enzymes. Ce thèse s’est fixé deux objectifs principaux: premièrement, la purification et la fonctionnalisation d’acides gras poly-insaturés de type Omega-3 (PUFAs), et spécialement l’acide cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaénoique (DHA) et deuxièmement la production de lipides structurés (SL). Un premier objectif fut de produire une molécule pharmaceutique, le nicotinyl DHA ester. Le co-substrat du DHA est le nicotinol, un alcool qui après absorption, il est rapidement converti en acide nicotinique (Vitamine B3). La trans-esterification enzymatique entre l’ester éthylique du DHA et le nicotinol a été optimisée dans le but de synthétiser un ester présentant les propriétés cumulatives des deux réactants. Après la sélection de l’enzyme optimale (lipase immobilisée de Candida antarctica; Novozyme 435) et le choix du milieu réactionnel (milieu sans solvant), le procédé a été optimisé. Une conversion supérieure à 97 % a été obtenu en 4 heures avec 45 g.L-1 d’enzyme. Dans ces conditions, une productivité de 4.2 g de produit .h-1.g d’enzyme-1 a été obtenue. Ce projet nécessite une haute pureté en DHA. Un procédé de purification enzymatique a été choisi. Les lipases sont capables de discriminer entre les acides gras en fonction de la longueur de chaine et du degré d’insaturation. Les lipases agissent par résolution cinétique, en réagissant plus efficacement avec les acides gras saturés et mono-insaturés qu’avec les PUFAs résistants. La lipase YLL2 de Yarrowia lipolytica apparait comme un bon candidat car elle est homologue à une des lipases les plus efficaces, la lipase de Thermomyces lanuginosus. YLL2 a permis d’obtenir une discrimination très efficace. Les raisons de la sélectivité de l’enzyme ont été identifiées : il s’agit du positionnement de la double liaison la plus proche de la fonction carboxylique. La concentration en DHA la plus élevée a été obtenue avec YLL2 (73%) avec un pourcentage de récupération du DHA-EE de 89%. YLL2 est par conséquent l’enzyme décrite la plus efficace pour la purification du DHA.La mutagénèse ciblée dans le site actif de YLL2 a été utilisée pour améliorer la sélectivité de cette enzyme. L’analyse de la structure 3D et les alignements avec des lipases homologues a permis de choisir les cibles de mutagénèse dirigée. Les acides aminés cibles ont été changés de manière à restreindre ou élargir le site actif. De ce premier screening de variantes deux positions ont permis d’améliorer la spécificité de l’enzyme, les positions I100 et V235. Finalement la saturation de ces 2 positions a été réalisée. Le dernier objectif de la thèse était la production de SL par acidolysis enzymatique entre l'huile d'olive vierge et les acides caprylic ou capric utilisant la lipase YLL2 immobilisé. Le SL obtenu devrait être riche en acide oléique à la position sn-2 tandis que les C8:0 et C10:0 devraient être principalement estérifiés aux positions sn-1,3. YLL2 immobilisé sur Accurel 1000 a été testé dans un système sans solvant. La réaction d’acidolysis d'huile d'olive avec C8:0 ou C10:0 a été optimisée avec la méthodologie de surface de réponse (RSM). / Lipases are enzymes with applications extended to a wide variety of industries. The variety of lipases applications led to increased research to characterize them and better understand their kinetics and reaction mechanisms and to establish methods for lipase production in homologous and heterologous expression systems. Lately enzymatic engineering allowed the improvement of lipase characteristics. This thesis project studies the use of lipases for two main objectives: lipase-catalyzed purification and functionalization of Omega-3 polyunsaturated fatty acids (PUFAs), especially cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenoic acid (DHA) and production of structured lipids (SL). DHA was used for the synthesis of a pharmaceutical molecule, the nicotinyl DHA ester. The co-substrate of the reaction was nicotinol, an alcohol from the group B pro-vitamin, which after absorption is rapidly converted into nicotinic acid (Vitamin B3). The enzymatic trans-esterification of DHA ethyl esters with nicotinol was optimised to synthesise an ester presenting the cumulative properties of the two reactants. After enzyme (immobilized lipase from Candida antarctica; Novozym 435) and reaction medium (solvent-free system) selection, the process was optimised. A conversion to nicotinyl-DHA superior to 97 % was obtained in 4 hours using 45 g.L-1 of enzyme. With a productivity of 4.2 g of product .h-1.g of enzyme-1.This project requires DHA of high purity. Enzymatic purification was chosen for the production of DHA concentrates. Lipases can discriminate between fatty acids in function of their chain length and saturation degree. Lipases react more efficiently with the bulk of saturated and mono-unsaturated fatty acids than with the PUFAs. The objective was the discovery of more specific enzymes for DHA purification. The lipase Lip2 from Yarrowia lipolytica (YLL2) appears as a good candidate since it is homologous to one of the most efficient lipase, the lipase from Thermomyces lanuginosus. YLL2 enables a high discrimination to be obtained, enzyme selectivity being principally due to the positioning of the double-bond the closest from the carboxylic group. The highest concentration of DHA was obtained with YLL2 (73%) with a recovery percentage of DHA-EE of 89%. YLL2 is the most efficient described lipase for DHA purification.Site directed mutagenesis was used to improve YLL2 from Y. lipolytica. Using its three dimensional structure and alignment with homologous lipases, targets for site directed mutagenesis were chosen. Chosen amino acids were substituted by two amino acids of different sizes. From the screening of variants two positions with promising specificities where chosen, positions I100 and V235. Finally saturation of both positions and the analysis of their performances in the selected reactions were carried out. The last objective was the production of SL by enzymatic acidolysis between virgin olive oil and caprylic or capric acids using immobilized Lip2 from Y. lipolytica. The SL obtained should be rich in oleic acid at the sn-2 position while C8:0 and C10:0 should be mainly esterified at the sn-1,3 positions. Lip2 from Y. lipolytica immobilized on Accurel MP 1000 was tested in a solvent-free system. The acidolysis reaction of olive oil with C8:0 or C10:0 was optimized by response surface methodology (RSM)

Dislipidemia é implicada no processo aterosclerótico do LES. A descrição de aLPL no LES associado a hipertrigliceridemia levou-nos a analisar esse anticorpo no contexto da inflamação envolvida na aterogênese. aLPL foi encontrado em 38% dos pacientes com LES com altos níveis de triglicérides. Correlação positiva significante foi observada entre aLPL e PCR, VHS, SLEDAI, anti-DNA, anti-cardiolipina e CH100 baixo. Análise de regressão múltipla confirmou a forte associação entre aLPL e PCR. Esses dados dão suporte à associação entre inflamação, resposta imune e dislipidemia, introduzindo o aLPL como um novo componente nos complexos eventos da aterogênese do LES / Dyslipidemia is implicated in the atherosclerosis process of SLE. The description of aLPL in SLE associated with hypertrigliceridemia prompted us to analyze this antibody in the context of the inflammation involved in the atherogenesis. aLPL was found in 38 por cento of SLE patients with high levels of triglycerides. Significant positive correlation was observed between aLPL and CRP, ESR, SLEDAI, anti-DNA, anti-cardiolipin and low CH100. Multiple regression analysis confirmed the strong association between aLPL and CRP. These data support the link between inflammation, immune response and dyslipidemia, introducing anti-LPL as new player in the complex events of atherogenesis in SLE

Neste trabalho, enzimas álcool-desidrogenases provenientes de fungos marinhos e a lipase imobilizada de Candida antarctica foram utilizadas para produção de compostos de interesse sintético e biológico. No capítulo 1, enzimas álcool-desidrogenases de fungos isolados da alga marinha Bostrychia radicans foram empregadas em reações de redução de cetonas fluoradas 1-5. Os fungos identificados como Botryosphaeria sp. CBMAI 1197, Eutypella sp. CBMAI 1196, Hidropisphaera sp. CBMAI 1194 e Xylaria sp. CBMAI 119 atuaram como biocatalisadores nestas reações levando à produção de álcoois com elevada pureza enantiomérica. O fungo Botryosphaeria sp. CBMAI 1197 destacou-se frente aos demais microrganismos, produzindo os álcoois (S)-2,2,2-trifluoro-1-feniletanol (1a) e (R)-1-(2,4,5-trifluorofenil)etanol (3a) com excelentes conversões (100% e 97%) e excessos enantioméricos (ee >99%). Este fungo também apresentou enzimas álcool-desidrogenases ativas frente a cetonas dicarboniladas 4-5, produzindo os álcoois 4,4,4-trifluoro-1-fenil-1,3-butanodiol (4a) e 4,4,4-trifluoro-1-(2-naftalenil)-1,3-butanodiol (5a) com 100% de conversão em ambos os casos e com purezas enantioméricas respectivas a 99% e 97%. Este foi o primeiro estudo realizado no Brasil com fluorocetonas dicarboniladas e com os fungos isolados da alga marinha Bostrychia radicans. No capítulo 2, a lipase comercial de Candida antarctica foi o biocatalisador empregado em reações de aminólise entre os ésteres linoleato de etila (1) e salicilato de etila (3), a amina graxa N-dodecilamina (2) e os aminoálcoois (4-9). A amina graxa N-dodecilamina (2) também foi utilizada em reações com o linoleato de etila (1), onde a lipase de Candida antarctica produziu a respectiva amida graxa 10 com rendimentos superiores a 95%. Os aminoálcoois foram selecionados para reações com o salicilato de etila (3), onde a lipase exibiu quimiosseletividade pelo grupo amino, produzindo predominantemente amidas fenólicas (12-19) com rendimentos entre 23-68%. A enzima CALB apresentou quimiosseletividade reduzida na reação com o 5-aminopentanol (6) onde os produtos amida 14 e éster 15 foram obtidos com rendimentos de 44 e 33%, respectivamente. O produto 2-hidroxi-N-(2-hidroxipropil)benzamida (19) foi obtido com rendimento superior a 90% a partir da reação catalisada pela lipase de Candida antarctica. Este produto foi selecionado como intermediário para a síntese de uma molécula hidrofóbica 21 que apresenta o éster oleato de etila em sua constituição. O produto 21 foi obtido com 75% de rendimento. As amidas fenólicas 12-21 produzidas neste trabalho são derivadas do ácido linoleico (ômega 6) e do ácido salicílico, os quais apresentam propriedades emolientes e antioxidantes. Estes compostos são interessantes para a formulação de produtos cosméticos de aplicação cutânea. Neste processo biotecnológico as reações foram conduzidas na ausência de solventes orgânicos, evitando o tratamento de solventes voláteis e a formação de subprodutos. Os compostos foram analisados por Cromatografia líquida de alta eficiência e caracterizados por RMN (1H, 13C), EMAR e IV. A aplicação de reações de biocatálise seja através de células microbianas ou de enzimas isoladas foram muito promissoras na síntese de compostos orgânicos de interesse como álcoois enantiomericamente puros ou amidas graxas. / In this work, alcohol dehydrogenase (ADHs) enzymes from marine fungi and immobilized lipase from Candida antarctica were employed for the production of compounds of biological and synthetic interest. In chapter 1, ADHs of fungi isolated from the marine alga Bostrychia radicans were used in reduction reactions of fluorinated ketones 1-5. The fungi identified as Botryosphaeria sp. CBMAI 1197, Eutypella sp. CBMAI 1196, Hidropisphaera sp. CBMAI 1194 and Xylaria sp. CBMAI 119 acted as biocatalysts in these reactions leading to production of alcohols with high enantiomeric purity. The fungus Botryosphaeria sp. CBMAI 1197 presented highlighted compared to other microorganisms producing the alcohols (S)-2,2,2-trifluoro-1-phenylethanol (1a) and (R) -1 - (2,4,5-trifluorophenyl) ethanol (3a) with excellent conversions (100% and 97%) and enantiomeric excesses (ee > 99%). This fungus also exhibited ADHs enzymes active with dicarbonylateds ketones, leading to the production of the alcohols 4,4,4-trifluoro-1-phenylbutane-1,3-diol (4a) and 4,4,4-trifluoro-1-(naphthalen-2-yl)butane-1,3-diol -1,3-butanediol (5a) with conversions of 100% in both cases and enantiomeric excess of 99%-97%, respectively. This was the first study conducted with dicarbonilated fluoroketones 4-5 and with fungi isolated from the marine alga Bostrychia radicans in Brazil. In chapter 2, immobilized lipase from Candida antarctica was used as biocatalyst in the aminolysis reaction between esters of ethyl linoleate (1) and ethyl salicylate (3), the fatty amine N-dodecylamine (2) and the aminoalcohols (4-8). Six aminoalcohols were selected for reactions with ethyl salicylate (3), where the lipase exhibited chemoselectivity by the amino groups, producing predominantly phenolic amides in yields of 23-63%. The CALB exhibited um reduction in chemoselectivity in the reaction with 5-aminopentanol (6) where the amide 14 and ester 15 products were obtained with 44% and 33% yields. The product 2-hydroxy-N-(2-hydroxypropyl) benzamide (19) was obtained in yield greater than 90% from the reaction catalyzed by lipase from Candida antarctica. This product was selected as reagente for the synthesis of a hydrophobic molecule 21 presenting ester ethyl oleate in its constitution. The product 21 was obtained in 75% yield. The phenolic amides 12-21 produced in this work are derived from linoleic acid (omega 6) and salicylic acid, which presents emollient and antioxidants properties. These compounds are interesting for the formulation of cosmetic products for skin application. In this biotechnological process, the reactions were carried out under solvent-free conditions and vacum, avoiding the treatment of volatile solvents and by-product formation. The compounds were analyzed by high performance liquid chromatography and characterized by NMR (1H, 13C), IR and HRMS. Applying biocatalysis reactions, either through microbial cells or isolated enzymes were promising for the synthesis of organic compounds such as enantiomerically pure alcohols and fatty phenolic amides.

Dislipidemia é implicada no processo aterosclerótico do LES. A descrição de aLPL no LES associado a hipertrigliceridemia levou-nos a analisar esse anticorpo no contexto da inflamação envolvida na aterogênese. aLPL foi encontrado em 38% dos pacientes com LES com altos níveis de triglicérides. Correlação positiva significante foi observada entre aLPL e PCR, VHS, SLEDAI, anti-DNA, anti-cardiolipina e CH100 baixo. Análise de regressão múltipla confirmou a forte associação entre aLPL e PCR. Esses dados dão suporte à associação entre inflamação, resposta imune e dislipidemia, introduzindo o aLPL como um novo componente nos complexos eventos da aterogênese do LES / Dyslipidemia is implicated in the atherosclerosis process of SLE. The description of aLPL in SLE associated with hypertrigliceridemia prompted us to analyze this antibody in the context of the inflammation involved in the atherogenesis. aLPL was found in 38 por cento of SLE patients with high levels of triglycerides. Significant positive correlation was observed between aLPL and CRP, ESR, SLEDAI, anti-DNA, anti-cardiolipin and low CH100. Multiple regression analysis confirmed the strong association between aLPL and CRP. These data support the link between inflammation, immune response and dyslipidemia, introducing anti-LPL as new player in the complex events of atherogenesis in SLE

La caractérisation de l'activité enzymatique des (phospho)lipases requiert des tests enzymatiques spécifiques, continus, utilisant des substrats lipidiques et adaptés au criblage à haut débit des activités et/ou des inhibiteurs de (phospho)lipases. Afin de développer de tels tests, la synthèse de glycérophosphatidylcholine (PC) estérifiée en position sn-1 et/ou sn-2 par l'acide alpha-éléostéarique (acide 9Z, 11E, 13E, octadécatriénoïque) a été effectuée. La triple insaturation conjuguée présente au sein de cet acide gras constitue un chromophore intrinsèque qui confère une forte absorption dans le domaine de l'ultra-violet à cet acide gras et aux lipides le contenant. Les PC contenant l'acide alpha-éléostéarique ont été adsorbées par « coating » au fond des puits d'une microplaque de titration. L'hydrolyse du substrat lipidique par une phospholipase A1 (PLA1) ou phospholipase A2 (PLA2), injectée dans le milieu réactionnel, est suivie en continu par l'augmentation de l'absorbance à 272 nm, due à la transition de l'acide alpha-éléostéarique de la phase adsorbée à la phase aqueuse. Des PC hétérogènes ont été synthétisées à partir de rac-glycidol pour effectuer un marquage sélectif de la PC par l'acide alpha-éléostéarique sur la position sn-1 (EOPC) ou sn-2 (OEPC). Pour empêcher la migration de la chaîne acyle, un lien éther non hydrolysable par les PLA1 ou PLA2 a été introduit sur l'autre position sn de la PC avec une chaîne alkyl (C18). Ces PC chimiquement définies ont permis d'élaborer une méthode de dosage en continu de l'activité enzymatique et discriminant les activités PLA1 ou PLA2, ce qui représente un caractère innovant par rapport à toutes les méthodes existantes / The characterization of the catalytic activity of (phospho)lipases requires specific assays, that are continuous, sensitive, use lipidic substrates and could be applied to high throughput screening. In order to perform these tests, several tailor-made alpha-eleostearic (9Z, 11E, 13E-octadecatrienoic acid) containing glycerophosphatidylcholines (PC) have been synthetized with the alpha-eleostearic acid at the position sn-1 and/or sn-2. The conjugated triene present in this fatty acid constitutes an intrinsic chromophore and, consequently, confers strong UV absorption properties of the fatty acid and the lipids harboring it. PC substrates were coated onto a microplate well and the phospholipase A1 (PLA1) or phospholipase A2 (PLA2) activity was measured continuously by the increase in absorbance, at 272 nm, due to the transition of alpha-eleostearic acid from the adsorbed to the soluble state. Moreover, two structured analogues of PC labeled at the sn-1 (EOPC) or sn-2 (OEPC) position with the alpha-eleostearic acid have been synthetized from rac-glycidol. A non-absorbing and non-hydrolysable by PLA1 and PLA2 O-ether alkyl(C18) was introduced at the other sn position to prevent intramolecular acyl chain migration during the synthesis and the lipolysis. These structured PC were coated onto a microplate and used in a continuous assay, to discriminate, with excellent accuracy, between PLA1 or PLA2 activities. The development of a sensitive enzymatic method using coated substrates analogues to natural lipid is a relevant improvement from current assays for measuring continuously (phosphor)lipases activities and/or their inhibitors due to the alpha-eleostearic acid UV spectroscopic properties

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