Orientadoesr: Elias Basile Tambourgi, Ranulfo Monte Alegre / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-16T02:07:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Padilha_GiovanadaSilva_D.pdf: 2518753 bytes, checksum: 6b6f99c293a070aff342e419f243fe69 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo : O presente trabalho foi dividido em três etapas e teve como objetivo a caracterização, purificação e encapsulamento da lípase a partir da cepa de Burkholderia cepacia. Para produção da enzima, o microorganismo foi cultivado em meio contendo sais, extrato de levedura, peptona bacteriológica e 6% de óleo de soja, por fermentação líquida em biorreator do tipo Bioflo III. As fermentações foram conduzidas a 150 rpm em 30ºC. Após 96 horas de cultivo, o sobrenadante foi separado das células por centrifugação e foi utilizado como extrato enzimático, uma vez que a Burkholderia cepacia produz lípase extracelular. O extrato bruto apresentou atividade usando azeite de oliva como substrato. Na primeira etapa do trabalho, analisou-se a condições ótimas de trabalho e estabilidade sob condições diversas e na presença de diferentes íons. A temperatura ótima foi a 37ºC, no entanto a 50ºC a enzima perdeu 10% da atividade em relação à temperatura em 37ºC. O cálculo de energia de ativação, seguindo a equação de ARRHENIUS, foi de 10,1 kJ/mol. O efeito do pH sobre a hidrólise do azeite de oliva pela lípase foi investigado com diferentes tampões na faixa de pH entre 3 e 11. Foram mantidas aproximadamente 80% da atividade entre os pHs 5 e 7, com atividade máxima no pH 8. Atividades razoáveis foram obtidas mesmo nos valores mais ácidos de pH e menores atividades nos valores entre 9 e 11. No entanto, no pH 11 observou-se queda de 80% de atividade em relação à atividade ótima da lípase. A estabilidade da atividade enzimática em diferentes tampões e valores de pH 5, 8 e 11 também foi investigada, onde nas 4 horas de incubação a diferentes valores de pH, a enzima mostrou-se bastante estável. Um estudo de estabilidade com diferentes íons por incubação da lípase durante 30 dias também foi realizado. Íons como Mn2+, Co2+, I- e Ca2+ mantiveram ou aumentaram a atividade enzimática, mas a enzima foi inibida na presença de Fe2+, Hg2+ e Al3+. À temperatura de 37 ºC e pH 8 foi feita a determinação dos parâmetros cinéticos. Os dados obtidos experimentalmente permitiram a obtenção da curva cinética, que mostrou a influência da emulsão óleo e água contendo diferentes proporções de azeite de oliva (0,1 a 50% v/v) na velocidade de hidrólise pela lípase. De acordo com a metodologia de LINEWEAVER-BURK, calculou-se os valores de Km e Vmáx de 43,90 mg/mL e 0,0258 U/mg, respectivamente. A segunda etapa foi purificar a lípase de Burkholderia cepacia em sistema bifásico aquoso polietileno glicol (PEG)/fosfato. Foram preparadas soluções estoques de PEG com massas molares de 1500, 4000 e 6000 Da (50% m/m) e tampão fosfato nos pHs 6, 7 e 8 (20% m/m de KH2PO4/K2HPO4). Um planejamento fatorial 23 foi feito para avaliar a massa molecular do PEG, pH e comprimento da linha de amarração (tie-line) no coeficiente de partição da atividade específica da lípase. Os resultados mostraram que maiores valores de atividade específica foram obtidos ao usar a menor massa molecular de PEG (1500 Da) em pH 6 e 8 e maior comprimento da linha de amarração. Após a purificação, determinou-se 33 kDa a massa molecular e 6,0 o ponto isoelétrico da lípase de Burkholderia cepacia. Na terceira etapa do trabalho, a enzima foi encapsulada por gelificação iônica usando alginato de sódio e cloreto de cálcio. Para a encapsulação foi feito um planejamento fatorial 22 variando o tamanho do bico atomizador (2 e 0,5 mm) e a concentração de CaCl2 (2 e 4% m/v). A enzima imobilizada foi caracterizada quanto à eficiência de encapsulamento, estabilidade, tamanho médio e sua distribuição e morfologia. No estudo de estabilidade verificou-se, em todas as condições de processo, que a enzima imobilizada manteve maior estabilidade em relação ao extrato bruto durante os 28 dias analisados. Nas análises de microscopia óptica, as microcápsulas formadas apresentaram formas esféricas, com média de tamanho de 400 e 100 ?m para os bicos de 2 e 0,5 mm, respectivamente. Nas análises por microscopia eletrônica de varredura (MEV), as microcápsulas foram secas em estufa e mantiveram as formas esféricas, com redução de tamanho, mesmo após esse processo de secagem. Usando o bico atomizador de 2 mm nas concentrações de 2 e 4% (m/v) de CaCl2, a microcápsula seca apresentou um tamanho de 139 e 150 µm, respectivamente, contra a média de 400 µm das hidratadas. Para o bico atomizador de 0,5 mm nas concentrações de 2 e 4% (m/v) de CaCl2, as microcápsulas apresentaram tamanhos de 15 e 6 µm, respectivamente / Abstract: This work was divided into three stages and aimed the characterization, purification and encapsulation of the lipase from a strain of Burkholderia cepacia. For enzyme production, the microorganism was grown in medium containing salts, yeast extract, bacteriological peptone and 6% soybean oil, liquid fermentation in bioreactor type Bioflo III. The fermentations were performed at 150 rpm and 30ºC. After 96 hours, the supernatant was separated from the cells by centrifugation and it was used as enzyme extract, since the Burkholderia cepacia produces extracellular lipase. In the first stage of this work, the enzymatic activity and stability were analyzed under different conditions and in the presence of different ions. The crude extract showed activity using olive oil as substrate. The optimum temperature was 37ºC, however at 50ºC the enzyme remained activity, with loss of activity of 10% compared to activity at 37°C. The calculation of activation energy, ARRHENIUS equation, was 10.1 kJ/mol. The effect of pH on hydrolysis of olive oil by lipase was investigated in the pH range between 3 and 11. About 80% of the activity was kept in the pH range between 5 and 7, with maximum activity at pH 8. Reasonable activities were obtained even in the more acidic pH values and lower activities in the values between 9 and 11. At pH 11 we observed a decrease of 80% of activity relative to the optimal activity of the enzyme. The stability of the enzyme activity of the crude extract in different buffers and pH values of 5, 8 and 11 was also investigated, where the 4 hour incubation at different pH values, the enzyme was stable. A stability study with different ions for incubation the lipase for 30 days was also realized. Ions such as Mn2+, Co2+, I- and Ca2+ remained stable or increased enzyme activity but the enzyme was inhibited in the presence of Fe2+, Hg2+ and Al3+. The determination of kinetic parameters was performed at 37°C and pH 8. The data obtained experimentally allowed obtaining the kinetic curve, which showed the influence of oil-water emulsion containing different proportions of olive oil (0.1 to 50% v/v) at the rate of hydrolysis by the lipase. According to the method of LINEWEAVER-BURK, it was calculated Km and Vmax values of 43.90 mg/mL and 0.0258 U/mg, respectively. The second step was to purify the lipase from Burkholderia cepacia in a polyethylene glycol (PEG)/phosphate aqueous two-phase system. Stock solutions were prepared with PEG molecular mass of 1500, 4000 and 6000 Da (50% w/w) and phosphate buffer in pHs 6, 7 and 8 (20% w/w KH2PO4/K2HPO4). A factorial design 23 was made to evaluate the molecular mass of PEG, pH and length of the tie-line in the partition coefficient of the enzyme specific activity. The results showed that higher values of specific activity of the enzyme were obtained when using the lower molecular mass PEG (1500 Da) at pH 6 and 8 and greater tie-line length. After purification, 33 kDa was determined for the molecular mass and 6.0 for the isoelectric point of the lipase from Burkholderia cepacia. In the third stage, the enzyme was encapsuled by ionic gelation using sodium alginate and calcium chloride. For the encapsulation, a factorial design 22 was made with 2 and 0.5 mm atomizer sizes and CaCl2 (2 and 4% w/v) concentration. The immobilized enzyme was characterized as to its encapsulation efficiency, stability, size and distribution size, and morphology. In the 28 day stability study, it was found in all process conditions that the immobilized enzyme remained more stable compared to the crude extract. In optical microscopy, the formed microspheres were spherical with average size of 400 and 100 µm for the 2 and 0.5 mm nozzles respectively. In the scanning electron microscope (SEM) analyses, the microspheres were dried in oven and maintained their spherical shapes with size reduction, even after the drying process. Using a 2 mm atomizer in the 2 and 4% (w/v) CaCl2 concentrations, the dry microcapsule presented a size of 139 and 150 µm respectively, against the average of hydrated 400 ?m. For the 0.5 mm atomizer in 2 and 4% (w/v) concentrations the dry microcapsules were 15 and 6 ?m, respectively / Doutorado / Sistemas de Processos Quimicos e Informatica / Doutor em Engenharia Química

Orientador: Eliana Cotta de Faria / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T19:49:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Urban_Aline_M.pdf: 815848 bytes, checksum: 55752c75065f47c7931dd73654d5a65d (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A resposta pós-prandial a uma sobrecarga de gordura apresenta efeitos pró-aterogênicos diretos por deposição de lipoproteínas remanescentes na parede arterial e, indiretos sobre o metabolismo de lipoproteínas ricas em triglicérides. Alterações durante a lipemia pósprandial podem estar relacionadas com as atividades das proteínas de transferência de ésteres de colesterol e da lipase hepática. Estas duas proteínas possuem papel ambíguo no desenvolvimento da aterosclerose e sua atuação sobre o metabolismo de lipoproteínas ricas em triglicérides pós-prandiais é muito pouco descrita na literatura. Estudamos as repercussões metabólicas em mulheres assintomáticas (n=28) após uma refeição oral única, líquida e rica em gordura em indivíduos apresentando deficiência primária de CETP e LH com coletas de sangue seriadas até 8h. A seleção dos casos foi feita através da determinação de valores de corte para CETP e LH, iguais ou menores aos percentis 10 ou iguais ou maiores que os percentis 90 de uma população normolipidêmica (n=129). Os indivíduos que possuem atividade das proteínas entre os percentis 10 e 90 foram selecionados como controles. A mulher que apresenta deficiência múltipla (CETP -79% e LH -88%) possui aumento da lipemia pós-prandial que foi atenuada após um ano de tratamento de reposição hormonal com Tibolona. Analisando um grupo de 6 indivíduos com um aumento médio de 33% de CETP, obtivemos curvas dos lipides pós-prandiais similares aos controles, em contraste com os relatos de casos com lipemia aumentada e deficiência de CETP. Este modelo demonstra uma ausência de um efeito de CETP na lipoproteína rica durante seu aumento moderado, provavelmente devido a falta das mudanças no transporte reverso do colesterol e igualmente a ausência dos triglicérides de um efeito direto da proteína de transferência no metabolismo lipoproteínas ricas em triglicérides. O estudo pós-prandial que usa modelos de roedores foram também realizados; observamos após uma sobrecarga oral da gordura que camundongos de ambos os sexos e ratos fêmeas apresentam lipemia pós-prandial com características similares aos seres humanos normolipidêmicos. Uma distinta resposta foi observada nos ratos machos que são mais sensíveis à dieta apresentando lipemia tardia. / Abstract: The postprandial response to a fat overload presents proatherogenic direct effects with remanescent lipoproteins deposition in arterial walls and indirect on the triglycerides-rich lipoprotein metabolism. Alterations during the postprandial lipemia are related with the activities of cholesteryl ester transfer protein and hepatic lipase. These two proteins possess ambiguous roles in the development of atherosclerosis and their performance on the triglycerides-rich lipoprotein metabolism is very scarcely described in the literature. We studied the metabolic repercussions in assimptomatics women (n=28) after a single liquid and rich in fat oral meal in individuals presenting primary deficiency of CETP and HL with serial collections of blood up to 8h. The selection of participants was made through cutoff values for CETP and HL either equal or lower or equal or higher than percentiles 10 and 90 of a normolipidemic population (n=129). The individuals that presented activities of proteins between percentiles 10 and 90 were selected as controls. In a a case-report here described a woman who presented multiple deficiencies (CETP= -79% and HL= -88%) had increased postprandial lipemia that was attenuated one year of hormonal treatment with Tibolona, a result not described yet in the literature. Analyzing a group of 6 individuals with an average CETP increase of 33%, we obtained postprandial lipids curves similar to controls, in a sharp contrast with the case report with increased lipemia and CETP deficiency. This model demonstrates an absence of a CETP effect on triglyceride rich lipoprotein during its moderate increase, probably due the lack of changes in the reverse cholesterol transport and also the absence of a direct effect of the transfer protein on triglyceride-rich lipoprotein metabolism. As well postprandial studies using rodent models were performed; we observed after an oral overload of fat that mice of both the sexes and female rats present postprandial lipemia with characteristics similar to normolipidemic humans. A distinguished response was observed in male rats that are more sensible to the diet with the presence of the delayed and late lipemia. / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Em face à busca por novos suportes de baixo custo para imobilizaÃÃo de enzimas e à procura por alternativas de aproveitamento para a casca de coco verde, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial da utilizaÃÃo da fibra da casca de coco verde como suporte para imobilizaÃÃo de enzimas, em especÃfico a lipase do tipo B de Candida antarctica. Foram testadas duas tÃcnicas de imobilizaÃÃo, adsorÃÃo e ligaÃÃo covalente. As variÃveis estudadas no processo de imobilizaÃÃo por adsorÃÃo foram: concentraÃÃo inicial de enzima, tempo de contato, pH do meio de imobilizaÃÃo e pH da superfÃcie da fibra. Para concentraÃÃes iniciais de enzima no sobrenadante atà 150 U/mL, o tempo de contato de 2 horas foi suficiente para imobilizaÃÃo. Um derivado bastante estÃvel foi obtido fazendo uso de uma soluÃÃo inicial de enzima contendo 40 U/mL, em tampÃo fosfato a pH 7, para imobilizaÃÃo em fibra de coco lavada com Ãgua (pH da superfÃcie = 5), sendo o tempo de contato igual a 2 horas. O fator de estabilizaÃÃo tÃrmica a 60ÂC foi igual a 92,15 e os valores de KBmB e VBmÃxB da enzima imobilizada foram iguais aos da enzima na forma solÃvel. AlÃm disso, observou-se que a fibra possui carÃter iÃnico, sendo o processo de adsorÃÃo influenciado pelo pH do meio de imobilizaÃÃo. Quanto ao processo de imobilizaÃÃo por ligaÃÃo covalente, as variÃveis estudadas foram concentraÃÃo inicial de enzima, tempo de contato, pH do meio de imobilizaÃÃo, uso de aditivos durante o processo de imobilizaÃÃo e uso de borohidreto de sÃdio como agente redutor das bases de Schiff. Observou-se a formaÃÃo de multicamadas quando se imobilizou a enzima a partir de uma soluÃÃo contendo 280 U/mL. A presenÃa de Ãcido butÃrico e PEG 6.000 durante o processo de imobilizaÃÃo nÃo tiveram influÃncia significativa sobre a atividade hidrolÃtica do derivado e sobre a conversÃo de Ãcido butÃrico na reaÃÃo de sÃntese. O uso de borohidreto de sÃdio como agente redutor resultou em derivados menos ativos e mais instÃveis tanto no processo de imobilizaÃÃo a pH 7 quanto em pH 10. Comparando a imobilizaÃÃo a pH 7 com a imobilizaÃÃo a pH 10, maior carga enzimÃtica imobilizada, maior estabilidade operacional de sÃntese e maior estabilidade à estocagem foram obtidos com derivado imobilizados em pH 7. Num paralelo entre imobilizaÃÃo por ligaÃÃo covalente e por adsorÃÃo, concluiu-se que para meios aquosos, derivados obtidos por ligaÃÃo covalentes sÃo mais adequados, contudo, para reaÃÃes em meios orgÃnicos a imobilizaÃÃo por adsorÃÃo à mais indicada por ser uma tÃcnica simples, de baixo custo e que promove derivado bastante estÃvel. Por fim, buscando aumentar a Ãrea superficial e caracterizar o suporte estudado, foram realizados estudos investigativos da morfologia da superfÃcie da fibra e suas modificaÃÃes por tratamentos quÃmicos. / For the last few years, many researches have sought for inexpensive support matrixes to enzyme immobilization. Meanwhile, in Brazil, an effort is being made to find alternative uses to green coconut husk, an agroindustrial waste. Therefore, the present study investigates the feasibility of using green coconut fiber for the immobilization of Candida antarctica lipase B. Two immobilization strategies were investigated: adsorption and covalent attachment. The effect of different variables on adsorption process have been studied, such as: lipase loading, contact time, pH of the coupling media and pH of the support surface. A stable immobilized enzyme was obtained by contacting coconut fiber washed with water (surface pH = 5) with an enzyme solution containing 40 U/mL in sodium phosphate buffer (pH 7.0) for 2h at room temperature. The thermal stabilization factor at 60ÂC was 92.15. Kinetic parameters for Michaelis-Menten model (Km and VmÃx) were the same for both immobilized enzyme and soluble enzyme. It was also observed that coconut fiber is an ion exchange material because of the influence of the coupling media pH on adsorption. Afterwards, we have studied the effect of some variables on the covalent immobilization on coconut fiber activated with GPTMS, such as: lipase loading, contact time, pH of the coupling media, use of additives during the immobilization and sodium borohydride as reducing agent of the Schiffâs bases formed on the covalent attachment. It was observed that a high enzyme loading, for instance 280 U/mL of initial enzyme concentration on the supernatant, promoted a multilayer immobilization. The effect of butyric acid and PEG 6.000, both used as additives during immobilization, were not significant on hydrolytic activity or butyric acid conversion. The use of sodium borohydride as a reducing agent of the Schiffâs bases promoted a loss on the immobilized enzyme activity. Moreover, the immobilized enzyme obtained after the reduction was less stable considering thermal stability in all the cases studied. Best results of enzyme loading, operational stability of synthesis and storage stability were obtained when the enzyme was immobilized covalently at pH 7. Drawing a comparison between adsorption and covalent attachment, results allow concluding that, for aqueous media reactions, the use of immobilized enzyme by covalent attachment is more indicated. However, the immobilization by adsorption a suitable method for organic media reactions, since it is cheaper and a very stable immobilized enzyme is obtained. Finally, searching to increase the surface area of the support and to characterize it, somo studies have been made on the fiber morphologic characteristics and on its modifications after each treatment.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A produÃÃo de biodiesel pela reaÃÃo de esterificaÃÃo enzimÃtica por intermÃdio de fluidos supercrÃticos pode ser usado na sÃntese de biocombustÃveis. O objetivo deste trabalho foi avaliar parÃmetros operacionais de sÃntese enzimÃtica de oleato de etila em meio supercrÃtico. A primeira etapa foi a preparaÃÃo do biocatalisador atravÃs da imobilizaÃÃo da lipase de Candida antarctica tipo B (CalB), por ligaÃÃo covalente, utilizando quitosana como suporte. No procedimento de imobilizaÃÃo, realizou-se a ativaÃÃo do suporte, utilizando como agentes ativantes: glicidol, glutaraldeÃdo e/ou etilenodiamina (EDA). O segundo passo consistiu da medida da hidrÃlise da enzima imobilizada, que foi avaliada pela hidrÃlise do butirato de para-nitrofenila (pNPB). Em ordem para determinar a melhor condiÃÃo operacional da reaÃÃo, foi conduzido um planejamento experimental (2^3), com os seguintes parÃmetros: razÃo molar Ãlcool:Ãcido graxo, temperatura, e tempo de reaÃÃo, entÃo o melhor resultado foi obtido usando quitosana 5% (m/V) - Glioxil-EDA-GlutaraldeÃdo, de 18,95 U/g. No terceiro passo, realizou-se as reaÃÃes de esterificaÃÃo utilizando Ãcido oleico, Ãlcool etÃlico e diÃxido de carbono como fluido supercrÃtico. A quantidade de Ãleo usada nestas reaÃÃes foi constante, com 1,0 g de biocatalisador correspondendo a 10% da massa de Ãleo. Um planejamento experimental foi realizado para se avaliar as condiÃÃes operacionais (razÃo molar, tempo de reaÃÃo e temperatura). O maior valor de conversÃo foi de 46,9% para uma temperatura de 29,9 ÂC, razÃo molar etanol: Ãcido oleico igual 4,50: 1 e tempo reacional de 6,5 horas. O aumento da temperatura influenciou a conversÃo positivamente, dentro do intervalo estudado. O parÃmetro razÃo molar Ãlcool: Ãcido oleico nos intervalos estudados (2,5:1; 4,5:1; 6,5:1) mostrou que os valores com a menor relaÃÃo de razÃo molar possuem as maiores taxas de conversÃo. Ocorreu a perda de atividade catalÃtica durante os procedimentos de reciclo. Adicionalmente, a baixa conversÃo de Ãsteres etÃlicos pode ser solucionada com o uso de zeÃlita para remoÃÃo de Ãgua do meio, uma vez que se acredita que a presenÃa de Ãgua impossibilita a mÃxima conversÃo. / Biodiesel production by enzymatic esterification reaction using supercritical fluids can be used for the synthesis of biofuel. The objective of this study was to evaluate the operational parameters of enzymatic synthesis in supercritical medium. The 1st step was the preparation of the biocatalyst by immobilization of lipase from Candida antarctica type B (Calb) by covalent bond using chitosan as support. In the immobilization procedure, it was the following as activating agents: glycidol, glutaraldehyde and ethylenediamine (EDA). The 2nd step was the measurement of hydrolysis of the immobilized enzyme, this was evaluated by hydrolysis of butyrate p.nitrophenyl butyrate (PNPB). In order to determine the best operational conditions of the reacton, it was enzyme suport conducted a experimental design (2^3), in the following parameters: molar rather alcohol oil, temperature, and then the best result was obtained when using chitosan 5% (w/v) - glyoxyl -EDA-glutaraldehyde, of 18.95 U / g. In Step 3, we carried out the esterification reactions using oleic acid, ethanol and carbon dioxide as supercritical fluid. It should be noticed that the amount of oleic acid used in these reactions was constant, with 1 g of immobilized enzyme, corresponding to 10% by weight oleic acid. An experimental design was conducted to evaluate the operational conditions molar ratio, reaction time and temperature. The highest rate was 46.9% at a temperature of 29.9 ÂC, molar ratio ethanol: oleic acid equal to 4.50:1, and a reaction time of 6.50 hours. The temperature affected the conversion within the range studied. The parameter molar ratio alcohol: oleic acid in the intervals studied (2.5:1, 4.5:1, 6.5:1) showed that the values with the lowest ratio of molar ratio with the highest conversion rates. It was observed a lost of catalytic activity during the recycling procedure. Additionally, it should be mentioned that a low conversion of ethyl esters, might be solved with the use of zeolite to remove water from medium, once it believed that that the presence of water precludes the maximum conversion.

A leptospirose é causada por bactérias do gênero Leptospira e constitui um problema de saúde pública mundial, por acometer humanos e animais. Sua patogênese ainda é pouco esclarecida, especialmente quanto aos processos de invasão, adesão e colonização dos hospedeiros. Recentemente, proteínas secretadas por leptospiras foram identificadas por proteômica e análises in silico, algumas das quais apresentam possível envolvimento no desenvolvimento de quadros hemorrágicos, bem como podem ser possíveis antígenos para diagnóstico. Sendo assim, o presente trabalho propôs a clonagem em vetor de expressão heteróloga bacteriano das sequências codificantes das proteínas Sph2, LipA, ColA e LipL32 de L. interrogans sorovar Copenhageni, caracterização funcional das proteínas recombinantes purificadas e estudo do seu potencial uso no diagnóstico para a leptospirose. Essas proteínas foram escolhidas por possivelmente estarem envolvidas na patogênese de leptospiras. Para tanto, as sequências correspondentes aos genes das proteínas foram clonadas nos vetores de expressão em Brevibacillus choshinensis e Escherichia coli. A produção de soro policlonal e técnicas de ELISA, western-blotting e imuno-histoquímica foram realizadas para avaliar a funcionalidade das proteínas recombinantes purificadas. Também foram realizados testes de comprovação e caracterização da atividade enzimática para proteína LipA, que se apresenta como uma provável lipase na análise in silico. Os resultados obtidos mostraram que o sistema de expressão em Brevibacillus foi eficiente na expressão das proteínas, porém com baixo rendimento na purificação das proteínas Sph2, ColA e LipA. A proteína recombinante LipL32 purificada não apresentou diferença na sua atividade antigênica, em relação aos dois sistemas de expressão utilizados. Experimentos de Western - blotting demonstraram a presença de proteína LipA em diferentes sorovares patogênicos de Leptospira spp. A proteína LipA apresentou atividade lipásica sobre ésteres graxos de p-nitrofenil, sendo uma provável lipase euritérmica. Os dados obtidos com a análise de imuno-histoquímica sugerem que esta proteína possa participar dos eventos que levam a lesões na membrana celular no tecido hepático. Resultados de ELISA com soro de pacientes mostraram que as proteínas ColA e Sph2 são potenciais antígenos para diagnóstico da leptospirose. Apenas a proteína ColA apresentou ação hemorrágica na pele de camundongos. Estes resultados indicam que as proteínas LipA, ColA e Sph2 podem estar envolvidas em mecanismos patogênicos na leptospirose. / Leptospirosis is caused by bacteria of the genus Leptospira and it is a public health problem worldwide, for affecting humans and animals. Its pathogenesis is still unclear, especially regarding the processes of invasion, adhesion and colonization of hosts. Recently, proteins secreted by leptospires were identified by proteomics and in silico analyzes, some of which present possible involvement in the development of hemorrhagic conditions, as well they could be possible antigens for the diagnosis. Thus, the present work proposed the cloning into bacterial heterologous expression vectors of the coding sequences of the Sph2, LipA, ColA and LipL32 proteins of L. interrogans serovar Copenhageni, the functional characterization of the purified recombinant proteins and the study of their potential use in the diagnosis for the Leptospirosis. These proteins were chosen because they may be involved in the pathogenesis of leptospires. To that end, the coding sequences were cloned into the expression vectors in Brevibacillus choshinensis and Escherichia coli. The production of polyclonal serum and ELISA, Western-blotting and immunohistochemistry techniques were performed to evaluate the functionality of the purified recombinant proteins. Also, tests were carried out to prove and characterize the enzymatic activity of LipA protein, which presents as a probable lipase in the in silico analysis. The obtained results showed that the expression in the Brevibacillus system was efficient, but with low yield in the purification of Sph2, ColA and LipA proteins. The purified recombinant LipL32 protein showed no difference in its antigenic activity, in relation to the two expression systems used. Western-blotting experiments demonstrated the presence of LipA protein in different pathogenic serovars of Leptospira spp. The LipA protein showed lipase activity on p-nitrophenyl fatty esters, being a probable eurythermic lipase. The data obtained with the immunohistochemical analysis suggest that this protein can participate in the events that lead to cell membrane lesions in the hepatic tissue. ELISA results using serum from patients showed that ColA and Sph2 proteins are potential antigens for the diagnosis of leptospirosis. Only the ColA protein presented hemorrhagic action on the mice skin. These results indicate that LipA, ColA and Sph2 proteins may be involved in pathogenic mechanisms in leptospirosis.

Lipases ativas em temperaturas frias estão amplamente distribuídas em micro-organismos que sobrevivem em temperaturas baixas, neste contexto, o isolamento de fungos de ambiente antártico pode ser considerado estratégico para obtenção de lipases a baixas temperaturas. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a produção de lipases e a diversidade de fungos filamentosos isolados de amostras do ambiente Antártico. Um total de 253 isolados foi recuperado a partir de 10 amostras marinhas e quatro terrestres, dos quais 68 apresentaram resultados positivo e foram submetidos aos experimentos de avaliação da produção de lipase e caracterização da biodiversidade. Os fungos lipolíticos foram identificados como pertencentes aos gêneros: Geomyces, Penicillium, Cosmospora, Thelebolus, Chaetomium, Hypocrea, Antarctomyces, Mortierella e Cadophora. Em adição, alguns isolados de um mesmo ribotipo foram afiliados à ordem Mucorales e, outro, revelou ser uma potencial nova espécie pertencente ao filo Basidiomycota. O fungo Geomyces pannorum. AL1-1B foi selecionado como o melhor produtor de lipase e apresentou atividade de 761,68 U/L no 5° dia de cultivo em pH 8,0 a 15 °C, evidenciando o potencial biotecnológico na produção de lipase a baixas temperaturas. / Cold-active lipases are widely distributed in micro-organisms which survive in low temperatures, in this context; fungal isolation from Antarctic environment can be considered strategic for obtaining lipases at low temperatures. The present work aimed to assess the production of lipases and diversity of filamentous fungi isolated from samples of the Antarctic environment. A total of 253 isolates were retrieved from 10 marine and four terrestrial samples collected on the Antarctic continent, amongst then 68 presented positive results and were subjected to the experiments of lipase production evaluation and biodiversity characterization. Lipolytic fungi were identified as representatives of the genera: Geomyces, Penicillium, Cosmospora, Thelebolus, Chaetomium, Hypocrea, Antarctomyces, Mortierella and Cadophora. In addition, some isolates of the same ribotype were affiliated to the order Mucorales, and another one, showed to be a putative new species from phylum Basidiomycota. The fungus Geomyces pannorum AL1-1B was selected as the lipase best producer and showed activity of 761.68 U/L in the 5th day of cultivation at pH 8.0 at 15 °C, highlighting the biotechnological potential for lipase production at low temperatures.

O objetivo desse trabalho foi avaliar estratégias de imobilização de lipases produzidas pelo fungo endofítico Cercospora kikuchii através do uso de suportes não convencionais (subprodutos agroindustriais e quitosana). Investigou-se o uso de equipamentos de secagem (estufa, leito de jorro, leito fluidizado, liofilizador e \"spray dryer\") para desidratação dos derivados imobilizados obtidos. A imobilização por ligação covalente, usando glutaraldeído, epicloridrina e metaperiodato de sódio como agentes ligantes, apresentou valores para retenção da atividade enzimática superiores à imobilização por adsorção e encapsulação. Nos ensaios de imobilização utilizando glutaraldeído e secagem em leito de jorro, os melhores valores obtidos foram para a celulose microcristalina com retenção da atividade enzimática de 179,1%, seguido da casca de arroz 173,9%. A palha de milho foi o melhor suporte na imobilização covalente e secagem em estufa, com retenção de mais de 100% da atividade enzimática inicial. Na secagem por liofilização houve destaque para a casca de arroz (163,6%) seguida de palha de milho (157,2%) e cana de açúcar (154,6%). Utilizando quitosana como suporte e secagem em leito fluidizado, o valor para a retenção da atividade enzimática foi de 93,9% empregando-se o glutaraldeído como agente ligante. Na secagem do sistema quitosana-lipase em estufa a retenção da atividade enzimática foi de 68,2% e para secagem por liofilização esse valor foi superior a 80,0%. Realizou-se a caracterização dos materiais utilizados como suportes e estes apresentaram área superficial relativamente alta, elevada porosidade e estrutura constituída de macroporos. Estas características foram importantes por proporcionar a obtenção da enzima imobilizada com alta retenção da atividade catalítica. Alguns parâmetros bioquímicos e cinéticos da lipase na forma livre foram diferentes da lipase imobilizada. A alteração mais evidente foi a afinidade ao substrato (Km), que se mostrou dependente do protocolo de imobilização utilizado. Avaliou-se o potencial de aplicação biotecnológica dos derivados imobilizados que apresentaram maior retenção da atividade enzimática. Para a lipase imobilizada em casca de arroz o rendimento de transesterificação (produção de biodiesel) foi superior a 96,0% após 72 horas de reação enquanto que para as microesferas de quitosana esse valor foi atingido após 120 horas. Os produtos obtidos da transesterificação do óleo de coco estão de acordo com a especificação da Agência Nacional de Petróleo (ANP). Na avaliação da atividade de esterificação, a máxima concentração de butirato de butila foi obtida após 6 horas de reação, correspondendo a uma taxa de conversão de aproximadamente 99,0%, quando utilizou-se quitosana como suporte. Para o uso da casca de arroz, a máxima concentração de butirato de butila foi obtida também após 6 horas de reação, correspondendo a uma taxa de conversão de 92,5%. Este trabalho demonstrou que suportes de baixo custo permitiram a obtenção de derivados imobilizados com características semelhantes àqueles obtidos com o uso de polímeros sintéticos, os quais apresentaram excelente potencial para síntese de biodiesel e de butirato butila. / The objective of this study was to evaluate strategies for immobilization of lipases produced by the endophytic fungus Cercospora kikuchii through the use of unconventional supports (agroindustrial by-products and chitosan). The use of different drying process (oven, spouted bed, fluidized bed, freeze drying and spray drying) for dehydration of immobilized derivatives obtained by adsorption, covalent binding and encapsulation was investigated. The covalent immobilization (using glutaraldehyde, epichlorohydrin and sodium metaperiodate as crosslinking agents) was the best process for the enzymatic activity retention. For covalent immobilization using glutaraldehyde and spouted bed drying, the best values were obtained for microcrystalline cellulose with enzymatic activity retention of 179.1%, followed by rice husk and corn straw with 173.9% and 169.8%, respectively. Corn stover was the best support in the covalent immobilization and oven drying, with retention 100.0% of the initial enzyme activity. For freeze-drying rice husk was the best support (163.6%) followed by corn stover (157.2%), sugar cane bagasse (154.6%) and corn cob (129.5%). Utilizing chitosan as support and fluidized bed drying, the value for the retention of enzymatic activity was 93.9% employing glutaraldehyde as activating agent. For chitosan-lipase drying using oven, the enzymatic activity retention was 68.2% and using freeze-drying the retention of enzymatic activity was higher than 80.0%. The support characterization was carried out and showed high surface area, high porosity and macropore structure. These characteristics were important for providing immobilized derivatives with high catalytic activity retention. Some biochemical and kinetic parameters of lipase in free form were different from the immobilized lipase. The most important changes was the substrate affinity (Km) which was dependent of immobilization protocol used. The last experimental part of this study was the biotechnological applications of the best immobilized derivatives produced. For the immobilized lipase onto rice husk the transesterification yield (biodiesel production) was above 96.0% after 72 hours of reaction while for the use of chitosan microspheres this value was reached after 120 hours. The viscosity values for the biodiesel samples are in accordance with specifications recommended by Brazilian Petroleum Agency (ANP) to be used as biofuel. The immobilized derivatives catalytic power was measured in terms of esterification activity too. The maximum concentration for butyl butyrate was obtained after 6 hours, corresponding to conversion rate of 99.0% when chitosan was used as support. Using rice husk, the maximum butyl butyrate concentration was obtained after 6 hours of reaction, corresponding to conversion rate of 92.5%. This work demonstrated that cheap supports are biocompatible with lipases, rendering immobilized derivatives with characteristics similar to or better than those previously obtained with synthetic polymers. The immobilized derivatives showed excelente potential for biodiesel production and butyl butyrate synthesis.

Sabe-se que as águas residuárias, contendo elevadas concentrações de lipídios, causam problemas às unidades convencionais de tratamento podendo gerar lodo altamente biodegradável e sistemas com baixos rendimentos na remoção da matéria orgânica. Com o intuito de estudar a possibilidade de se obter eficiências maiores de remoção de matéria orgânica no tratamento de águas residuárias com elevados teores de lipídios, empregou-se na presente pesquisa processo alternativo de tratamento denominado de sistema combinado, composto de um reator enzimático (R1) e de um reator de lodos ativados (R2). Visando realizar a pré-hidrólise dos lipídios afluentes, o reator enzimático, contendo a enzima lipase LIPOLASE 100T, imobilizada em suporte de polietileno, foi instalado antecedendo o reator de lodos ativados. Paralelamente, foi construída outra unidade de lodos ativados (Rc) similar a primeira, porém sem o reator enzimático acoplado, denominada sistema de controle, visando possibilitar a comparação dos resultados obtidos. A unidade experimental foi operada durante 94 dias, em regime contínuo com a temperatura em torno de 30ºC. Os reatores de lodos ativados, R2 e Rc, foram operados, cada, com TDH de 8 horas e vazão de 3,4 L/dia. As eficiências médias de remoção de DQO bruta obtidas foram respectivamente de 85% e 79% para os sistemas combinado e de controle. A eficiência média de remoção de óleos e graxas do sistema combinado foi de 91%, enquanto que para o sistema de controle a eficiência média foi de 84%. Assim, os resultados obtidos no presente trabalho, demonstraram que as vantagens obtidas com o emprego do sistema combinado proposto, sob as condições específicas da presente pesquisa, foram significativas. / The wastewaters containing high concentrations of lipids, cause problems to the conventional units of treatment being able to produce highly biodegradable sludge and systems with low organic matter removal. In order to study the possibility of obtaining high efficiencies of organic matter removal in the treatment of wastewater with high contents of lipids, it was used in the present research an alternative procedure of treatment named combined system, composed of an enzymatic reactor (R1) and an activated sludge reactor (R2). In order to achieve the pre-hydrolysis of the affluent lipids, the enzymatic reactor, containing the lipase enzyme LIPOLASE 100T immobilized in polyethylene support, was installed preceding the activated sludge. Parallely, it was built another unit of activated sludge (Rc) similar to the first, but without the enzymatic reactor coupled, named control system, in order to enable the comparisons of the results obtained. The experimental unit was operated during 94 d, in continuous operation, with the temperature around 30°C. The activated sludge reactors, R2 and Rc, were operated, respectively, with hydraulic time residence of 8 h and flow rate of 3,4 L/d. The average efficiencies of removal raw COD obtained were respectively, of 85% and 79% for the combined and control systems. The average efficiency of removal of oil and greases of the combined system was of 91%, while for the control system the average efficiency was of 84%. So, the results obtained in this present work, showed that the advantages obtained with the use of the proposed system, under the specific conditions of the present research, were significant.

Orientadores: Andréa Dessen de Souza e Silva, David Neves / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:11:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Madeira_PauloViniciusdaMata_M.pdf: 3508240 bytes, checksum: 40070baffe8469acd5f3a60f9e82a931 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Segundo a Organização Mundial da Saúde, doenças infecciosas são a segunda principal causa de morte no mundo. Essas doenças são causadas por organismos patogênicos que podem compartilhar certas similaridades em seu modo de infecção. Bactérias patogênicas são responsáveis por diversas doenças de acometimento humano, sua patogenicidade, na maioria das vezes, apresenta-se associada a secreção de fatores de virulência que são responsáveis pela adesão, invasão e por danos ás células e tecidos do hospedeiro. P. aeruginosa é um patógeno oportunista, multiresistente a antibióticos e é a bactéria Gram negativa principal causadora de infecções hospitalares, podendo levar à óbito por pneumonia e sepse pacientes imunocomprometidos, principalmente pacientes com fibrose cística, AIDS e vítimas de queimadura. A proteína ExoU de P. aeruginosa é um fator de virulência, altamente citotóxico, secretado pela bactéria que apresenta atividade fosfolipase A, degradando a membrana celular e levando a rápida morte celular. ExoU é pertencente a família das proteínas tipo patatina, essas proteínas apresentam regiões homólogas a fosfolipase A2 citosólica humana e regiões homólogas a proteínas patatinas. A proteína PlpD encontrada em linhagens que não codificam ExoU, a saber: PA01 e PA14 de P. aeruginosa apresentam todas as regiões conservadas, classificando-a como uma proteína bacteriana do tipo patatina, assim como a ExoU. Além disso foi mostrado que seu domínio catalítico é secretado pela bactéria e apresenta atividade de lipase, importante para o processo infectivo do patógeno. Como P. aeruginosa, assim como outros patógenos, se tornaram multiresistentes a antibióticos, a busca por novos alvos terapêuticos vem sendo incentivada. A compreensão estrutural dos componentes envolvidos no processo infectivo é essencial para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos. Nesse trabalho a estrutura da porção secretada da proteína PlpD, com atividade catalítica, foi resolvida à uma resolção de 2.14 Angstroms. A análise da proteína mostrou diferenças interessantes entre sua estrutura e de seu homólogo ExoU, fornecendo pistas para a caracterização de seu mecanismo de ação à nível estrutural. Essa tese foi desenvolvida em colaboração com o grupo do Laboratório de Engenharia de Sistemas Macromoleculares de Marselha, França sob coordenação da Drª Sophie Bleves / Abstract: According to the World Health Organization, infectious diseases are the second leading cause of deaths worldwide . These diseases are caused by pathogenic organisms that may share certain similarities in their mode of infection. Pathogenic bacteria are responsible for many human diseases, their pathogenicity, most often appears associated with the secretion of virulence factors that are responsible for adhesion, invasion and damage to the cells and tissues of the host. P. aeruginosa is an opportunistic pathogen, multidrug-resistant and the main Gram negative cause of nosocomial infections, this pathogen may lead to death due to pneumonia and septcemia immunocompromised patients, especially patients with cystic fibrosis, AIDS and burn victims. The ExoU protein of P. aeruginosa is a highly cytotoxic virulence factor secreted by the bacterium which has phospholipase A activity by degrading the cell membrane and leading to rapid cell death. ExoU belongs to patatin-like protein family, these proteins have regions homologous to human cytosolic phospholipase A2 and regions homologous to patatins. The PlpD protein is found in strains that do not encode ExoU, namely P. aeruginosa PA01 and PA14. This protein shows all conserved regions of patatin-like proteins, classifying it as a bacterial patatin-like protein, as well as the ExoU. Furthermore it was shown that its catalytic domain is secreted by the bacterium and shows lipase activity, important for the infection process. As P. aeruginosa, as well as other pathogens have become multidrug resistant, the search for new therapeutic targets is being encouraged. The understanding of the structural components involved in the infective process is essential for the development of new therapeutic agents. In this work the structure of the secreted portion of PlpD protein which has catalytic activity was resolved at 2.14 angstroms resolution. The protein analysis showed interesting differences between its structure and its homologous ExoU, providing evidences to the characterization of its mechanism of action at a structural level. This thesis was developed in collaboration with the Macromolecular Engineering Systems Laboratory group in Marseille, France under the coordination of Dr Sophie Bleves / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Gabriela Alves Macedo, Ana Paula Badan Ribeiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-25T18:56:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Speranza_Paula_D.pdf: 7220198 bytes, checksum: 8b6f66b900cc6f1b3afb59b799b23584 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Este trabalho teve como objetivos produzir, caracterizar e avaliar as propriedades antimicrobianas de bases lipídicas interesterificadas produzidas com óleos e gorduras da Amazônia utilizando diferentes lipases. No trabalho foram utilizadas duas misturas de óleo e gordura da Amazônia para a produção das bases lipídicas, sendo a primeira delas composta pelo óleo de buriti e a gordura de murumuru e a segunda composta pelo óleo de patauá e a estearina de palma. As reações de interesterificação foram catalizadas por duas lipases em três sistemas enzimáticos diferentes: lipase comercial Lipozyme TL-IM (Novozymes), lipase do micro-organismo Rhizopus sp. e a mistura de ambas as enzimas (comercial + Rhizopus sp.). Em ambas as misturas, os lipídios produzidos apresentaram diferentes características dependendo da enzima utilizada. Na mistura buriti: murumuru, a lipase de Rhizopus sp., além de ser específica pelas posições sn-1,3 do triacilglicerol, foi específica para o tipo de ácido graxo (insaturado). A lipase comercial foi específica apenas pelo tipo de ácido graxo (insaturado), enquanto que a utilização de ambas as enzimas não apresentou efeito sinérgico nesta mistura, os resultados obtidos foram intermediários aos obtidos com as enzimas individualmente. Na mistura patauá: estearina de palma, a lipase de Rhizopus sp. foi específica para o tipo de ácido graxo (insaturados), enquanto que a lipase comercial não demonstrou específicidade para esta mistura. No sistema catalisado por ambas as enzimas também não foi observado efeito sinérgico; os resultdos obtidos foram similiares aos obtidos com a enzima de Rhizopus sp. Para ambas as misturas, com os três sistemas enzimáticos, houve redução nos triacilglceróis trisaturados e tri-insaturados após as reações, com a formação de bases lipídicas predominantemente mono e di-insaturados. Estes lipídios formados mantiveram a concentração elevada de tocoferóis, carotenos e fenóis, indicando que a reação não influenciou na concentração dos compostos minoritários. Na avaliação antimicrobiana, as misturas antes e após a interesterificação foram emulsificadas, produzindo diferentes respostas. Emulsões produzidas com os lipídios interesterificados apresentaram menor tamanho de partícula e maior potencial antimicrobiano, exibindo efeito bactericida; emulsões produzidas com as misturas não-interesterificadas, apresentaram maior tamanho de partícula e menor potencial antimicrobiano, exibindo efeito bacteriostático. Portanto, as lipases foram capazes de catalisar as reações de interesterificação entre os óleos da Amazônia, indicando o potencial destes catalisadores nestas reações. As frações lipídicas obtidas apresentaram atividade antimicrobiana, o que abre precedentes para que estudos biológicos mais aprofundados sejam realizados / Abstract: This study aimed to produce, characterize and evaluate the antimicrobial properties of interesterified Amazonian oils produced by different lipases. Two blends of Amazonian oils were subjected to enzymatic interesterification: the first one was composed by buriti oil and murumuru fat and the second one was composed by patauá oil and palm stearin. The interesterification reactions were catalyzed by two microbial lipases in three different enzymatic systems: one with a commercial lipase Lipozyme-TL-IM (Novozymes); a second with a lipase from the microorganism Rhizopus sp.; and the third with a mixture of both lipases (commercial and Rhizopus sp.). In both blends, depending on the enzyme used, the lipids produced presented different characteristics. In the buriti: murumuru blend, the lipase from Rhizopus sp. besides being specific for the sn-1,3 positions of triacylglycerol was specific for the type of fatty acids (unsaturated). The commercial lipase was specific only for the type of fatty acids (unsaturated), while the use of both enzymes showed no synergistic effect in this blend; the results were intermediate to those obtained with the individual enzymes. In the patauá: palm stearin blend, the lipase from Rhizopus sp. is specific for the type of fatty acid (unsaturated), while commercial lipase showed no specificity to this blend. In the system with both enzymes no synergistic effect was also observed; the results obtained were similiar to those obtained using only the enzyme from Rhizopus sp. In both blends, with the three enzymatic systems, there was a reduction in the proportions of triacylglycerols of the types trisaturated and tri-unsaturated after the reactions, with the formation of predominantly mono -and di- unsaturated lipids. These lipids produced maintained the high concentration of tocopherols, carotenoids and phenolics, indicating that the reaction did not influence the concentration of minor compounds. In the antimicrobial evaluation, the blends before and after interesterification were emulsified, producing different responses. Emulsions produced with interesterified lipids showed lower droplet size and higher antimicrobial activity (bactericidal effect); emulsions produced with non-interesterified blends showed larger droplet size and lower antimicrobial activity (bacteriostatic effect). Therefore, lipases were able to catalyze the interesterification reactions between Amazonian oils, indicating the potential of these catalysts in these reactions. Lipids obtained showed antimicrobial activity, which encourages more detailed biological studies / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutora em Ciência de Alimentos