Pacientes com doença do refluxo não erosiva apresentam sintomas típicos causados pelo refluxo do conteúdo gástrico para o esôfago. Entretanto, estes pacientes não apresentam alterações de mucosa visualizadas à endoscopia. O objetivo deste estudo é caracterizar a expressão de moléculas relacionadas à junção celular (claudinas 1, 3 e 4), da proteína pró-inflamatória Cox-2, da população global de linfócitos (CD45), população de linfócitos T (CD3), linfócitos B (CD20) e natural killer (CD57) em portadores de esofagite de refluxo erosiva e não erosiva. O estudo verificou que quanto mais intensa e crônica a inflamação no epitélio escamoso esofágico, menor a expressão das proteínas juncionais (claudinas 1 e 4), não alterando a expressão da claudina 3. Em relação à Cox-2 o estudo mostra aumento de sua expressão na forma erosiva da doença. Em relação à população de linfócitos, não foi detectada diferença significativa / Patients with non-erosive reflux disease conditions show typical symptons caused by the reflux of the gastric content to the esophagus. However, these patients dont show any alteration on the mucous membrane visualized trhough endoscopy. The aim of this study is to characterize the molecule expression related to the cell junction (claudins 1 , 3 and 4)the Cox 2 pro-inflamatory protein, the general population of (CD45) lymphocytes ,the population of lymphocytes T (CD3),the B (CD20) lymphocytes and the(CD57) natural killer in patients with erosive and non-erosive reflux esophagitis. The study found that the more intense and chronic the inflamation is in the esophageal squamous epithelium, less junction protein expressios (claudins 1 and 4) were found, not altering the 3 expressions of claudin 3. Regarding Cox 2, the study shows increase in its expression in the erosive form of the disease. Regarding the population of lymphocytes, no significant difference was detected

Idealizou-se o presente ensaio com o objetivo de padronizar o perfil hematológico, bioquímico, eletroforético (proteinograma sérico) e quantificação das células linfocitárias CD4, CD5, CD8 por citometria de fluxo de cães da raça Golden Retrivier normais (grupos GR) e de cães distróficos (grupos GRMD). Para tanto, considerou-se a divisão dos grupos de acordo com a idade dos animais, desde o nascimento até a idade adulta, compondo assim seis grupos, sendo eles GR I, II, III e GRMD I, II, III. No presente projeto realizamos os estudos eletroforéticos de cães pertencentes a todos os grupos, estudos hematológicos e bioquímicos dos cães pertencentes aos grupos GR II, III, GRMD II e III, imunofenotipagem linfocitária dos grupos GR III e GRMD III. Os resultados eritroleucométricos e trombométricos obtidos para os cães pertencentes aos grupos GR II e GR III apresentaram valores médios dentro normalidade. Com relação aos cães pertencentes aos grupos GRMD III, observamos que o eritrograma se encontra dentro dos valores de referência. Contudo, considerando o leucograma, os valores médios (3,79/ mm3) referentes à mensuração de basófilos apresentaram-se acima dos valores de normalidade, variando de 0 a 159/mm3. Ademais, considerando os valores máximos, alguns animais pertencentes ao grupo em questão, apresentaram leucocitose com neutrofilia sem desvio à esquerda, além de trombocitose, monocitose e linfopenia, no momento das coletas. As dosagens bioquímicas séricas de todos os cães afetados apresentaram valores médios acima dos valores de normalidade para a dosagem de AST, ALT e CK. Para o estudo das proteínas séricas, a técnica SDS-PAGE permitiu o fracionamento de vinte e três proteínas, cujos pesos moleculares variaram de 16.000 a 260.000 daltons em todos os grupos estudados. Destas, foi possível identificar nominalmente doze frações protéicas: IgA (PM 142.000 Da), proteína C-reativa (PM122.000 Da), ceruloplasmina (PM 110.000 Da), fosforilase (PM 95.000 Da), transferrina (PM 82.000 Da), hemopexina (PM 78.000 Da), albumina (PM 66.000 Da), alfa1 antitripsina (PM 62.000 Da), IgG de cadeia pesada (PM 55.000 Da), haptoglobina (PM 45.000 Da), glicoproteína ácida (PM 40.000 Da) e IgG de cadeia leve (PM 23.000 Da). As demais proteínas foram identificadas pelos respectivos pesos moleculares. Não foi possível identificar nominalmente as frações protéicas de pesos moleculares 260.000 Da, 230.000 Da, 180.000 Da, 165.000 Da, 158.000 Da, 91.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 28.000 Da e 16.000 Da. Dentre essas proteínas foi possível observar que a proteína de peso molecular 91.000 Da foi encontrada apenas nos grupos GR I e GRMD I não sendo identificada nos outros grupos estudados. Considerando as alterações encontradas com relação às proteínas de fase aguda, evidenciamos as respostas de fase aguda frente às lesões musculares que ocorrem progressivamente em cães distróficos, principalmente em animais distróficos jovens, podendo inferir que os mesmos apresentaram alterações protéicas perante a injúria tecidual como é relatado em vários processos inflamatórios relacionados com outras patologias. Da mesma forma, os animais afetados pela distrofia, possuem alterações imunoglobulínicas quando comparados a animais normais. Com relação a imunofenotipagem linfocitária foi confeccionado um histograma das populações de linfócitos CD4+, CD5+ e CD8+ a partir da região do gate de linfócitos. Todos os animais afetados pela distrofia apresentaram porcentagem significativamente maior com relação à população linfocitária CD4+ e CD5+ quando comparados aos cães normais. Desta forma, podemos inferir que o processo progressivo da distrofia, esta relacionado com alterações nas populações celulares que compõe o sistema imune dos pacientes, pois devido a ausência de distrofina o músculo fica mais susceptível á lesões, sendo que na sua ocorrência, há liberação de citocinas que estimulam as células hepáticas a secretarem as proteínas de fase aguda e a promoverem uma co-estimulação de linfócitos T. Assim, podemos sugerir que os resultados encontrados em nosso trabalho são conseqüências da resposta inflamatória gerada pela lesão muscular. Esperamos com esse estudo, fornecer mais informações sobre a fisiopatogenia da doença, bem como promover um maior entendimento sobre a avaliação imunológica e resposta inflamatória neste modelo de estudo. Ademais, que os valores de base encontrados possam auxiliar na avaliação de possíveis reações nos testes pré-clínicos, facilitando assim, o entendimento das reações benéficas ou adversas para validar e explicar o mecanismo de ação de uma terapia celular, gênica ou mesmo medicamentosa / Devised to test this in order to standardize the hematological, biochemical, electrophoretic (Serum protein) and quantification of CD4 lymphocyte cells, CD5, CD8 by flow cytometry of Golden Retriever dogs normal (group GR) and dogs dystrophic (GRMD groups). To this end, we considered the division of groups according to age of animals, from birth to adulthood, thus composing six groups, as Gr I, II, III and GRMD I, II, III. In this project we performed electrophoretic studies of dogs belonging to all groups, haematological and biochemical studies of dogs belonging to the groups GR II, III, II and III GRMD, lymphocyte immunophenotyping in groups III and GR GRMD III. The results obtained for trombometric, erythometric and dogs belonging to the groups and GR II GR III showed mean values within normal limits. With respect to dogs belonging to groups III GRMD, we observed that the erythrocyte is within the reference values. However, considering the WBC, the mean (3.79 / mm3) relating to the measurement of basophils were above normal values, ranging from 0 to 159/mm3. Moreover, considering the maximum, some animals belonging to the group in question had leukocytosis with neutrophilia without left shift, and thrombocytosis, monocytosis and lymphopenia at the time of collection. The biochemical serum of all affected dogs had mean values above the normal range for the determination of AST, ALT and CK. For the study of proteins, SDS-PAGE technique allowed the fractionation of twenty-three proteins whose molecular weights ranged from 16,000 to 260,000 daltons in all groups. These could be identified by name twelve fractions: IgA (PM 142,000 Da), C-reactive protein (PM122.000 Da), ceruloplasmin (PM 110,000 Da), phosphorylase (95,000 Da PM), transferrin (82,000 Da PM), hemopexin (PM 78 000 Da), albumin (66,000 Da PM), alpha1 antitrypsin (PM 62,000 Da), IgG heavy chain (55,000 Da PM), haptoglobin (PM 45,000 Da), glycoprotein (PM 40,000 Da) and IgG light chain (PM 23 000 Da). The other proteins were identified by their molecular weights. We could not identify by name the protein fractions of molecular weight 260,000 Da, 230,000 Da, 180,000 Da, 165,000 Da, 158,000 Da, 91,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 28,000 Da and 16,000 Da. Among these proteins was observed that the protein molecular weight of 91,000 Da was found only in groups GR I and GRMD I was not identified in other groups. Considering the changes found with relation to acute phase proteins, we noted the acute phase response in the face of muscle injuries that occur gradually in dystrophic dogs, especially in young dystrophic animals, which may infer that they had abnormal protein before tissue injury as reported in many inflammatory-related pathologies. Likewise, animals affected by muscular dystrophy, alterations immunoglobulin when compared to normal animals. With respect to lymphocyte immunophenotyping was made a histogram of the populations of CD4, CD5 and CD8 from the region of the gate of lymphocytes. All animals affected by muscular dystrophy showed significantly higher percentage with respect to CD4 and CD5 lymphocyte population compared to normal dogs. Thus, we can infer that the process of progressive muscular dystrophy, is associated with changes in cell populations that make up the immune system of patients, because due to the absence of dystrophin, the muscle is more susceptible to damage, and its occurrence , a release of cytokines that stimulate liver cells to secrete acute phase proteins and promote a co-stimulation of T lymphocytes Thus, we suggest that the findings in our study are consequences of the inflammatory response generated by muscle injury.We hope that this study, provide more information about the pathophysiolgy of the disease, and promote a greater understanding of the immune and inflammatory responde assessment in this study model. Moreover, the base values found could help in assessing possible responses in preclinical testing, aiding the understanding of the beneficial or adverse reactions to validate and explain the mechanism of action of a cell therapy, gene or drug treatments

Le développement d’un lymphome gastrique du MALT (LGM) émane d’un processus inflammatoire chronique initié par Helicobacter pylori.A partir du matériel issu d’un modèle animal de LGM, préalablement développé au laboratoire, basé sur des infections chez des souris thymectomisées à la naissance, la réponse inflammatoire gastrique favorable à l’émergence de LGM a été étudiée. Une dérégulation de cytokines et chimiokines au stade LGM a été identifiée permettant de recruter, faire proliférer et faire émerger des infiltrats lymphoïdes. La susceptibilité des souris thymectomisées à développer des lymphomes n’est pas liée à un déficit en lymphocytes T régulateurs. Cinq microARNs ont été retrouvés dérégulés au stade lymphome agissant probablement en synergie pour favoriser la prolifération lymphocytaire en particulier via un mécanisme anti-apoptotique. Enfin, nous décrivons un modèle original de LGM basé sur l’utilisation de souris C57BL6 exprimant la chimiokine APRIL humaine au niveau des lymphocytes T infectées par des espèces du genre Helicobacter. Ce modèle est prometteur pour une meilleure compréhension de la lymphomagénèse gastrique. / The development of gastric MALT lymphoma (GML) originates from a chronic inflammatory process initiated by Helicobacter pylori.The gastric inflammatory response was investigated in a mouse model of GML previously described by the laboratory using BALB/c mice thymectomized at day 3 post-birth and infected by H. pylori. A deregulation of numerous cytokines and chemokines at GML stage was identified which explained the recruitment, proliferation and emergence of lymphoid infiltrates. The susceptibility of thymectomized mice to develop lymphoma was not linked to a deficiency in regulatory T cells. A deregulation of 5 microRNAs was observed at lymphoma stage. These microRNAs may be involved in cell survival and lymphocyte proliferation and act in synergy to promote the development of GML. Finally, we described an original model of GML based on infection by Helicobacter species of transgenic C57BL6 mice expressing the human form of the cytokine APRIL in T cells. This model is promising for a better understanding of gastric lymphomagenesis.

L'infection par le cytomégalovirus humain (HCMV) est une cause majeure de mortalité chez les patients immunodéprimés et représente la première cause d'infection congénitale. HCMV est un virus complexe qui s'est adapté au système immunitaire humain en développant de multiples mécanismes d'évasion. L'infection primaire à HCMV est associée à une réplication virale prolongée avant l'établissement de la latence. Il a été montré que cette intense réplication lors de la phase initiale de l'infection était associée à une épuisement fonctionnel des lymphocytes T CD4 spécifiques du virus. Alors que les anticorps jouent un rôle dans la limitation de la dissémination virale et la prévention de l'infection à HCMV, les réponses des lymphocytes B sont peu caractérisées. Dans le présent travail, nous avons étudié l'impact de l'infection à HCMV sur le phénotype et la fonctionnalité des sous-populations de LB du sang circulant chez une cohorte de femme enceintes avec une primo-infection par HCMV en utilisant comme contrôles des sujets sains séropositifs et séronégatifs pour HCMV ainsi que des femmes enceintes séronégatives. Nous montrons que l'infection primaire par HCMV induit une expansion significative et prolongée de deux sous-populations de LB :les LB mémoires activés (CD27+CD21low) et mémoires atypiques (CD27-CD21low), précédemment décrites lors d'infection chroniques. Les LB mémoires atypiques démontrent des signes d'épuisement fonctionnel comme en témoigne une expression élevée de récepteurs inhibant le BCR et une moindre réponse à la stimulation in vitro mesurée par la production de TNF-α. Les expansions de ces deux sous-populations sont corrélées entre elles et liées à la virémie. Ces résultats contribuent à la compréhension de la régulation des réponses des LB lors d'infections virales, en montrant que l'épuisement fonctionnel de LB, précédemment décrit lors d'infections chroniques, peut également survenir lors d'infections primaires.<p>Dans un deuxième temps, nous avons étudié l'acquisition des réponses B mémoires spécifiques de HCMV dirigées contre la principale glycoprotéine de surface, la glycoprotéine B (gB), et deux polypeptides du tégument. Lors de l'infection primaire par HCMV, la production d'anticorps neutralisant le virus, dirigés contre les glycoprotéines d'enveloppe, est retardée par rapport aux anticorps dirigés contre le tégument qui sont non neutralisant. Nous montrons que le phénotype des LB mémoires spécifiques de gB est différent de celui des LB mémoires spécifiques du tégument. La majorité des LB mémoires spécifiques de gB exprime un phénotype CD27+CD21+ alors que la majorité de ceux du tégument exprime le phénotype CD27+CD21low. Nous montrons par la suite chez des sujets sains que ces deux sous-populations de LB mémoires présentent des différences phénotypiques, au niveau de l'expression de récepteurs liés au "trafficking" cellulaire ainsi qu'au niveau de la fonctionnalité. Les LB mémoires CD21low, contrairement au LB mémoires CD21high, expriment des taux bas des récepteurs CXCR5 et CCR7, qui permettent la migration vers les centres germinatifs, mais des taux élevés de CD11c promouvant la migration vers les tissus périphériques. Après stimulation in vitro, les LB mémoires CD21low vont avoir une capacité de production d'immunoglobulines immédiate mais une réponse proliférative plus faible comparée aux LB mémoires CD21+. Nous démontrons la relevance de cette division des LB mémoires sur base de l'expression du CD21 dans un modèle de vaccination de rappel contre la toxoïde tétanique (TT). Après rappel, nous observons une expansion significative de LB mémoires spécifiques de la TT exprimant un phénotype CD27+CD21lowCXCR5lowCD11chigh. Nous proposons ainsi un nouveau mécanisme de manipulation des réponses humorales par des pathogènes qui se traduit par une limitation de l'induction de réponses B effectrices. Nos travaux permettraient également une meilleure approche des réponses B mémoires physiologiques chez l'homme en proposant une classification des LB mémoires basées sur leur fonctionnalité et leur phénotype.<p><p>Human cytomegalovirus (HCMV) infection is a major cause of mortality in immunocompromised patients and is the first cause of congenital infection worldwide. HCMV is a complex virus that has developed multiples immune evasions mechanisms during its co-evolution with mankind. Although often asymptomatic, primary HCMV infection is associated with an intense and prolonged viral replication. It has been previously shown that this intense viral replication is associated with functional exhaustion of virus-specific CD4+ T cells. Although neutralizing antibodies limits viral dissemination and play a role in the prevention of HCMV infection, B cell responses during HCMV infection have been poorly studied so far.<p>In this work, we have studied the impact of HCMV infection on the phenotype and functionality of peripheral-blood B cell subsets in a cohort of pregnant women with a primary HCMV infection. Controls were healthy seronegative and seropositive HCMV donors and HCMV seronegative pregnant women. We show that primary HCMV infection induces a significant and prolonged expansion of two B-cell subsets, previously described in chronic infections :activated memory B cells (MBC) (CD27+CD21low) and atypical MBC (CD27-CD21low). Atypical MBC display signs of functional exhaustion with increased expression of inhibitory receptors and a lower response to in vitro stimulation as assessed by TNF-α production. Expansion of these two subsets are correlated and higher in subjects with detectable viremia. These results contribute to the understanding of the regulation of B cell responses during viral infections and indicate that B cell exhaustion, previously described during chronic infections, can be observed in primary infection.<p>Next, we have characterized the acquisition of HCMV-specific B cell responses directed against envelope glycoprotein B (gB) and two tegument polypeptides (pp150 and pp52). During primary HCMV infection, the production of neutralizing antibodies targeting envelope glycoproteins is delayed when compared to non-neutralizing anti-tegument antibodies. We show that gB and tegument-specific MBC have distinct phenotype during primary HCMV infection. The majority of gB-specific MBC have a CD27+CD21+ phenotype while the majority of tegument-specific MBC have a CD27+CD21low phenotype. We show that CD27+CD21+ and CD27+CD21low MBC express different pattern of chemokine receptors pattern but also have distinct functionality. CD27+CD21low MBC, on the contrary to CD27+CD21+ MBC, express low levels of CXCR5 and CCR7 that favor migration to lymph nodes and germinal centers but express high levels of CD11c that promotes migration to inflammatory tissues.<p>In vitro stimulation of sorted subsets of healthy individuals indicates that CD27+CD21low MBC have higher capacity of immediate immunoglobulin production but a lower proliferative potential as compared to CD27+CD21+ MBC. We further show the relevance of a division of MBC subsets based on CD21 expression in a model of TT booster immunization. Following booster immunization, a significant expansion of TT-specific MBC expressing the phenotype CD27+CD21lowCXCR5lowCD11chigh is observed. <p>We propose that HCMV manipulates the host humoral response by limiting the induction of gB-specific CD27+CD21low "effector" MBC. Our work also indicates that human MBC physiological responses should be studied according to their respective phenotype and functions.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’Ins(1,3,4,5)P4 produit par l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase de type B (Itpkb) est nécessaire au développement des thymocytes et lymphocytes T murins. Trois hypothèses sont admises quant à la fonction physiologique et au mécanisme d’action de cet inositol phosphorylé :la première postule que l’Ins(1,3,4,5)P4 module la réponse calcique intracellulaire ;la seconde, que cet inositolphosphate est un intermédiaire métabolique dans la synthèse d’inositols plus hautement phosphorylés ;la dernière, que l’Ins(1,3,4,5)P4 module la localisation subcellulaire et la fonction de protéines capables de la reconnaître par des domaines spécifiques de liaison. Afin d’investiguer cette dernière hypothèse, nous avons analysé la physiologie des lymphocytes B invalidés pour Itpkb et avons généré et analysé des souris transgéniques d’addition pour Rasa3, récepteur potentiel à l’Ins(1,3,4,5)P4.<p>Les lymphocytes B déficients en Itpkb présentent un défaut de survie car ils ne peuvent activer correctement les protéines kinases Erk1/2 suite à la stimulation du BCR de surface. Cela conduit à la surexpression anormale de la protéine pro-apoptotique Bim. La diminution de l’expression de Bim est suffisante dans ce modèle pour restaurer une fonction normale des lymphocytes B. In vitro, Nous avons montré que l’Ins(1,3,4,5)P4 est nécessaire à la translocation de Rasa3, protéine favorisant l’inactivation de la voie de Ras, de la membrane vers le cytoplasme. L’étude de lymphocytes invalidés pour Itpkb dans un modèle de BCR transgénique semble montrer que des anomalies de réponse calcique ne participent pas au phénotype.<p>En conclusion, nos résultats indiquent qu’une des voies de signalisation préférentielle de l’Ins(1,3,4,5)P4 passe par la modulation de la localisation subcellulaire de protéines possédant un domaine d’affinité pour l’Ins(1,3,4,5)P4 telle que Rasa3.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le nicotinamide est un des deux constituants de la vitamine B3. C’est aussi un agent pharmacologique qui a été testé dans le traitement du HIV chez l’homme, et comme traitement contre diverses pathologies. Il présente également des capacités cytoprotectrices dans plusieurs modèles de stress cellulaire et est considéré comme un agent pharmacologique prometteur dans le traitement des maladies de dégénérescence cérébrale d’origine vasculaire. Il module la réponse innée en inhibant notamment la synthèse de molécules pro-inflammatoires. Toutefois, son influence sur la réponse adaptative n’a pas encore été analysée. <p>Le nicotinamide intervient dans la biosynthèse du NAD comme précurseur dans la voie de « sauvetage ». Le rôle du NAD comme coenzyme dans de nombreuses réactions enzymatiques du métabolisme de la cellule est bien connu. De plus, le NAD peut être dégradé par différentes enzymes impliquées dans différentes modifications post-traductionnelles de protéines (PARPs, Sirtuines et MARTs). Le nicotinamide est un produit de la dégradation du NAD mais également un inhibiteur de ces enzymes et constitue donc un outil permettant d’étudier le rôle de ces enzymes dans la transduction de signaux intracellulaires. <p>Nous avons utilisé le nicotinamide comme un inhibiteur non toxique des différentes enzymes impliquées dans les réactions d’ADP-ribosylation et étudié son effet sur l’activation des lymphocytes B. Le nicotinamide inhibe la prolifération et la différentiation de ces cellules. Il ne module pas les étapes précoces du BCR mais inhibe l’activation des MAPKs et de la kinase Akt. L’inhibition des MAPKs Erk est corrélée avec une réduction de l’expression de la cycline D2 et du marqueur d’activation CD69. L’utilisation d’un inhibiteur des PARPs ne nous a pas permis de reproduire les effets du NAm sur la voie MAPK Erk et CD69. Par contre, le MIBG, un inhibiteur des MARTs inhibe bien la surexpression du CD69 ainsi que la phosphorylation des kinases Erk. Bien que le nicotinamide soit capable d’inhiber l’expression du CD69 in vivo, nos expériences ne nous ont pas permis de moduler la réponse immune adaptative in vivo. <p>Ceci suggère dès lors que l’utilisation de fortes doses de nicotinamide comme traitement pharmacologique de certaines affections chez l’homme ne devrait pas poser de problème au niveau de la réponse adaptative. De plus, notre mise en évidence des MARTs dans le contrôle de l’activation des lymphocytes B ouvre des perspectives encourageantes pour de nouveaux traitements modulant la réponse adaptative. Cette réponse étant particulièrement impliquée dans certaines maladies auto-immunes, il est potentiellement intéressant de trouver des inhibiteurs de ces enzymes plus puissants que le nicotinamide afin de moduler la réponse immune adaptative in vivo<p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est particulièrement associée aux cytopénies auto-immunes (AIC). L’expression de ZAP-70 dans la LLC est un facteur pronostique,due à une forte signalisation par le BCR. Nous décrivons une nouvelle population B normale (LyBn) qui exprime ZAP-70. Ces LyBn ZAP-70+ ne semble pas appartenir à une sous-population LyB particulière, et elles n’ont pas un phénotype activé. L’expression de ZAP-70 dans les LyB naïves suggère que ce phénomène est précoce. Il y a une bonne corrélation dans le niveau de ZAP-70 entre les LyBn et les LyB de LLC. Les LyBn ZAP-70+ ont été retrouvé dans tous les cas de AIC associée à la LLC.L’analyse des anticorps monoclonaux prévenant de LyB ZAP-70+ et des souris ZAP-70KI, réalisés pendant ce travail, définiront les conséquences de la surexpression de ZAP-70 dans les LyB dans la pathogénèse de l’auto-immunité et de la lymphoprolifération. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is particularly associated with autoimmune cytopenia (AIC). The expression of ZAP-70 in CLL cells is a prognostic factor, through increased BCR signaling. We described a novel normal B cell population (LyBn) that expresses ZAP-70. ZAP-70+ LyBn do not seem to belong to a certain subset of B cells, nor seem to have an activated phenotype. The presence of ZAP-70 in the naïve B cell subset suggests that this is an early process, which probably occurs before malignant transformation. There is a good correlation in the level of ZAP-70 expression, between normal B cells and CLL B cells. We found a significant percentage of ZAP-70+ LyBn in all AIC-associated CLLs. Analysis of monoclonal antibodies and of conditional ZAP-70KI mouse model synthesized in this work will clarify the consequences of aberrant ZAP-70 expression in B cells on autoimmunity and lymphoproliferation.

Le Lupus Erythémateux Systémique (LES) est une maladie autoimmune sévère dont laquelle les lymphocytes B (LB) jouent un rôle central. Afin de rechercher des anomalies génétiques propre à ces cellules, notre laboratoire a étudié l’expression des gènes dans les LB de patients atteints d’un LES, par rapport à des sujets témoins. Ce projet a pour but d’étudier un de ces gènes (FKBP11), surexprimé dans les LB au cours du LES. Pour cela nous avons créé, à l’aide de lentivirus, des souris transgéniques reproduisant de manière ubiquitaire la surexpression de ce gène. Ces souris développent une hyperplasie des organes lymphoïdes, une hyper gamma globulinémie de type IgG3, et présentent une réponse humorale augmentée après immunisation avec un antigène T-indépendant. Notre étude met en évidence que la surexpression de FKBP11 favorise le développement des plasmocytes dans leur phase initiale dépendante de l’expression de Pax5, après induction de la différenciation plasmocytaire in vitro. Enfin, les souris développent des autoanticorps variés. De plus, le rôle d’une surexpression de FKBP11 dans la rupture de tolérance B a été montré chez des souris transgéniques anti-ADN 56R, croisées avec notre modèle lentigénique, qui voient leur production d’autoanticorps augmentée. La surexpression de FKBP11 dans le modèle C57BL/6lpr/lpr accentue le caractère lymphoprolifératif et l’hyper gamma globulinémie présents dans ces souris. Au cours de ce projet de thèse, j’ai également initié l’étude de deux autres gènes surexprimés dans les LB de patients lupiques (PRDX4, TRIB1), par le développement de modèles transgéniques murins. / Systemic Lupus Erythematosus (SLE) is a severe autoimmune disease where B cells play a central role and carry intrinsic genetic abnormalities.Today, only a few SLE genes have been validated in humans. Looking for these intrinsic B cell abnormalities in SLE, we have performed a microarray analysis of the human transcriptoma in B cells from quiescent SLE patients, in comparison to normal subjects. The project proposes to explore the consequences of overexpression of one of these genes: FKBP11. For this purpose, a lentiviral construct allowing the ubiquitous overexpression of FKBP11 was produced, and has been used to generate lentigenic mice. These mice develop a hyperplasia of lymphoid organs, an IgG3 hypergammaglobulinemia and an increase of humoral immune response after immunisation with a T-independent antigen. Our study points out that the overexpression of FKBP11 promotes the plasmocyte development, at the initial stage which is dependent on Pax5 expression, after in vitro induction of the plasmacytic differentiation. Finally, these mice produce various autoantibodies. The role of FKBP11 overexpression in B cell central tolerance breakdown has been demonstrated in anti-DNA 56R transgenic mice crossed with our lentigenic model. These mice have an increase of autoantibody production. The FKBP11 overexpression in C57BL/6lpr/lpr model increases the lymphoproliferative syndrome and the hypergammaglobulinemia in this model. During this thesis, I have also initiated the study of two others genes which were found overexpressed in B cells of lupus patients (PRDX4, TRIB1), by the development of transgenic murine models.

Une tumeur est un environnement complexe comprenant à la fois des composants immunitaires et non immunitaires. Dans notre équipe, nous avons démontré précédemment le rôle des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) dans les cancers du poumon, dans la génération de réponses anti-tumorales protectrices. Cependant, les tumeurs peuvent se développer en utilisant des mécanismes d’immunosuppression tels que l’infiltration des cellules T régulatrices (Tregs) dans le microenvironnement tumoral. Cette thèse a étudié le mécanisme présumé des Tregs dans la régulation des réponses immunitaires dans le cancer du poumon. Cette étude démontre la présence de Tregs FoxP3+ dans les TLS aussi bien que dans les autres régions tumorales. Les Tregs infiltrant la tumeur (Ti-Tregs) présentent un phénotype de lymphocytes T à mémoire centrale, et effecteur mémoire. Ces cellules expriment un vaste répertoire de molécules d’activation et de « chekpoints » immunologiques. L’analyse de l’expression des gènes et des résultats de cytométrie en flux a montré que les Tregs expriment des marqueurs de co-stimulation et de co-inhibition. Une forte densité de Ti-Tregs dans les TLS ou les autres régions tumorales, est associée à une faible survie des patients. Lorsqu’on combine ce résultat avec la densité de DC matures ou lymphocytes B associés aux TLS ou CD8+, un groupe de patients présentant de faible densités de ces cellules mais de fortes densités en Tregs a le pronostic le moins favorable avec le plus grand risque de décès. Les Tregs créent un environnement immunosuppresseur dans les cancers pulmonaires. Ce mécanisme pourrait être une explication de la réduction observée de la survie de ces patients. / Tumor comprise complex niche of the immune and non-immune components. The complex interaction between the tumor cells with its environment turns into either eradication or the growth and metastasis of the tumors. We have previously demonstrated the role of TLS (tertiary lymphoid structures) in lung tumors, in protective anti-tumor responses. Despite of this, tumors do develop via exploiting the regulatory mechanisms, particularly includes, infiltration of the Tregs (regulatory T cells). The aim of thesis was to study the putative role of Tregs in regulating the immune responses in lung cancer. This study strongly demonstrates the presence of FoxP3+ Tregs in the TLS as well as non-TLS areas of the lung tumors. Tregs mainly exhibit central and effector memory phenotype expressing vast repertoire of the activation and immune checkpoint molecules. The gene expression and flow cytometry data showed that Tregs express the co-stimulatory and inhibitory markers which are known to be involved in the their activation and immune suppression. The high density of the Ti-Tregs either in TLS or in nonTLS areas is associated with the poor survival of the NSCLC patients. When combined with the density of TLS mature DC or B cells or CD8+ T cells, a group of patients with the low DC, B cells and CD8+ T cells but high Tregs densities, had the worst clinical outcome. This allowed, to identify the NSCLC patients with highest risk of death. Thus, it be concluded that the Tregs create the immunosuppressive environment in the lung tumors by acting in both TLS and nonTLS areas of the tumors and thus could be possible reason for the reduced survival of the lung cancer patients.

L'objectif de cette thèse a été d'étudier le mécanisme de la coopération entre les voies de signalisation du TCR et de l'interféron de type I qui est responsable de l'augmentation d'expression de la cytokine anti-inflammatoire IL-10 dans les lymphocytes T CD45RA+CD4+ humains. En utilisant une approche transcriptomique et d'interférence d'ARNm, j'ai observé que les voies IFN et TCR contrôlent différemment l'expression des STATs et que les BATFs sont induits par l'IFN et augmentés par la costimulation TCR/IFN. STAT3 a été identifié comme régulateur majeur de l'IL-10 et il est recruté à proximité d'un site de liaison pour BATF au locus IL-10. Sur la base d'essais de co-silencing des trois BATFs, nous avons proposé que les BATFs contrôlent l'amplitude de la réponse IFN en agissant comme facteurs de transcription " pionniers ". D'autres résultats obtenus par une étude transcriptomique d'environ 200 gènes, montrent des contributions uniques et combinées des voies TCR et de l'IFN dans le programme d'expression de gènes des lymphocytes CD45RA+CD4+ activés et indiquent que d'autres facteurs de transcription pourraient réguler l'IL-10. Cette étude est susceptible d'apporter une connaissance plus large de mécanismes impliqués dans la régulation croisée entre les voies TCR et IFN. / In CD4 T cells several transcription factors (TFs) regulate expression of the anti-inflammatory cytokine IL-10. I investigated how type I interferon (IFN) cytokines and T cell receptor (TCR) pathways cooperate toward early upregulation of IL-10 in human CD45RA+ CD4+ T cells. I interrogated the role of the STAT and BATF family by transciptomics and RNAi-mediated gene-silencing. IFN and TCR induced STAT2 and STAT3 expression, respectively, while the BATFs were induced early by IFN and further enhanced by TCR/IFN together. STAT3 was the major regulator of TCR- and TCR/IFN-mediated IL-10 while STAT2 contributed to the latter. STAT3 was recruited adjacent to a BATF-binding site at the IL-10 locus early in response to TCR/IFN. Co-silencing of the three BATFs led to a marked decrease in TCR- and TCR/IFN-mediated IL-10. We propose that the BATFs control the magnitude of the IFN response as pioneer factors. Additional results of transcriptional profiling of ± 200 genes, including TFs downstream of TCR and IFN and TFs involved in IL-10 regulation, revealed that TCR and IFN provide unique and combined contributions to the early CD45RA+CD4+ T cell gene activation program and identified other potential TFs involved in TCR/IFN-mediated IL-10 transcription. This study may provide broad mechanistic bases for crosstalk between the TCR- and IFN-pathways.