Le cancer du sein représente un problème de santé publique. Les efforts déployés pour définir de nouvelles stratégies thérapeutiques ont mis en lumière les mécanismes développés par la tumeur pour inhiber l'instauration d'une réponse immune adaptative efficace. La tumeur favorise la mise en place d'une immunosubversion, caractériisée par la fort infiltration d'une sous-population de lymphocytes T CD4 régulateurs (Treg). Les Treg jouent un rôle central dans les mécanismes de contrôle de réactions pro-inflammatoires et protègent contre le développement de pathologies auto-immunes. Nous avons observé que le Treg sont recrutés spécéfiquement dans l'environnement tumoral via l'axe de chimiotactisme CCR4/CCL22 suite à la détetion des cellules transformées par les NK et les macrophages. D'autre part, plusieurs publications récentes démontrent un rôle des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) dans l'indcution de Treg chez l'homme et la souris. Nos observations montrent que des facteurs solubles sécrétés dans l'environnement tumoral inhibent la fonction clef des pDC, ce qui favorise fortement leur capacité à induire l'expansion de Treg et de T CD4 prodcuteur d'IL-10. Ces cellules T immunosuppressives expriment fortement le récepteur de co-simulation ICOS, prolifèrent in situ, exercent un important pouvoir supresseur sur les autres popuylations T et leur présence est associées à un impact péjoratif sur la survie des patientes. Par l'utilisation de l'Ac bloquant anti-COS 314.8 nous avons démontré le rôle essentiel d'ICOS dans la prolifération des Treg et l'induction de T CD4 sécréteurs d'IL-10 par les pDC dasn les tumeurs, offrant la perspective d'une nouvelle immunothérapie visant à éradqiuer les Treg intra-tumoraux. / Tumor immunosbversion favors disease progression and is mediated by increased IL-10 secretion, reduced type-I IFN production and regulatory T cell (Treg) accumulation among CD4+ T cell in breast tumor. We showed that the presence of high number of both Treg and/or plasmacytoid DC (pDC) a subpopulation of antigen presenting celles correlates with poor prognosis in breast carcinoma. We previoously demonstrated that CCR4+ Treg are recruited from the periphery trough CCL22 production by breast tumor cells. Tumor-asssociated Treg (Ta-Treg) are highly activated (GITRhighHDLA-DRhighCD39high), show a selective expression of high levels of ICOS and proliferate in situ (Ki-67+). Tumor associated (Ta-) pDC express a partially activated phenotype but their type-1 interferon (IFN) production is strongly impaired in human tumors. pDc secretion of type-I IFN is linked to their capacity to induce anti-viral and anti-tumor immunity in mice models. We shown that 1) Ta-Treg and Ta-pDC colocalize in breast tumor section and 2) TapDC favor Ta-Treg proliferation and IL-10 secretion by CD4+ T cells in absence of type-I IFN. Ogf importance, targeting ICOS with a neutralizing antibody suppresses Ta-Treg proliferation as well as IL-10 secretion inpDC/CD4+ T cell co-culture, demonstrationg a riole of ICOS-ICOS-L interaction in Ta-Treg proliferation mediated by Ta-pDC. At the end, we report that high ICOS expression in breast tumor sections is associated with reduced patient's overall and disease free survival. Altogether these observations suggest that ICOS in breat cancer may represent a therapeutic target to restore anti-tumor immunity

La nature des cellules dendritiques (DC) engagées lors d'une vaccination conditionne la qualité de la réponse immunitaire adaptative. L'immunisation par la peau est particulièrement efficace car elle cible de nombreuses sous-populations de DC cutanées telles que les cellules de Langerhans (LC). Cependant, les relations entre ces DC et les cellules effectrices associées à la réponse humorale ne sont pas connues. L'objectif de ma thèse est d'identifier les mécanismes cellulaires précoces impliqués dans l'initiation de la réponse humorale, dans un contexte de vaccination intradermique (i.d.) avec un antigène particulaire. En étudiant la distribution spatiale et temporelle des particules synthétiques de PLA adsorbées par la protéine p24 du VIH, nous avons observé leur prise en charge par les DC cutanées mais également par les DC résidentes des ganglions drainant de la peau. Cependant, l'étude de la réponse immunitaire a démontré que seules les cellules cutanées, et en particulier les LC, induisent la polarisation des lymphocytes T CD4+ folliculaires (TFH) et le développement des lymphocytes B sécrétant des IgA. L'immunisation i.d. a également généré l'infiltration de cellules inflammatoires au niveau du site d'injection et du ganglion. En utilisant un modèle murin Ccr2-/-, nous avons démontré que les cellules dépendantes de CCR2+ interfèrent avec la formation des TFH. Enfin, l'étude du micro-environnement ganglionnaire suggère que TNF est favorable à la polarisation des TFH. En conclusion, ces résultats soulignent l'importance de cibler les DC cutanées lors de la vaccination afin de proposer de nouvelles stratégies vaccinales. / The quality of the adaptive immune response to a vaccine is driven by the nature of dendritic cells (DCs) engaged during vaccination. Skin immunization is particularly efficient as it targets the numerous cutaneous DCs, including Langerhans cells (LCs). However, the relationship between DCs and effector cells associated with humoral immunity has not been elucidated. The main objective of my thesis was to identify cellular mechanisms implicated in the initialization of the humoral immune response, in the context of intradermal (i.d.) vaccination with particle-based antigens. In examining the spatial and temporal distribution of synthetic PLA particles adsorbed with the HIV-p24 protein, we observed their uptake by both cutaneous DCs and also skin-draining lymph node (dLNs) resident DCs. However, our immune response study highlighted that only skin cells, and in particular LCs, were able to stimulate polarization of follicular helper T cells (TFH) and the development of IgA-secreting B lymphocytes. I.d. vaccination also induced an inflammatory cell infiltration at both the injection site and in dLNs. Using a Ccr2-/- mouse model, we have shown the CCR2+ dependant cells can interfere in TFH polarization. Finally, the study of the dLN micro-environment suggested TNF can promote TFH formation. In conclusion, these findings highlight the importance of targeting skin DC in vaccination to propose new vaccine strategies.

Chez les mammifères, les lymphocytes T CD4 sont essentiels à la défense de l’organisme contre des infections par des pathogènes ou le développement de tumeurs. Après activation, les lymphocytes T CD4 naïfs ont la capacité de se différencier en divers lymphocytes T helper (Th1, Th2, Th17…) en fonction des signaux reçus. Le choix du lignage permet d’adapter le phénotype et la fonction des cellules au type de danger détecté. Le processus de différenciation des lymphocytes T helper implique l’établissement de programmes d’expression des gènes distincts. La dynamique et la stabilité de ces programmes sont notamment régulées par l’activité d’éléments cis-régulateurs. Le but de ma thèse était de comprendre les mécanismes épigénétiques qui contrôlent la programmation des lymphocytes T CD4. Dans cet objectif, nous avons étudié le rôle de la H3K9 méthyl-transférase SETDB1 dans la différenciation des lymphocytes T CD4 en Th1 et Th2, deux lignages T helper fortement antagonistes. Nous avons découvert que SETDB1 réprime de manière critique le programme d’expression des gènes Th1. En effet, en l’absence d’expression de Setdb1, la différenciation Th1 est exacerbée. De plus, lorsqu’elles sont exposées à un signal pro-Th1, les cellules Th2 franchissent les barrières de lignage et se transdifférencient en Th1. De manière surprenante, SETDB1 ne cible pas directement les enhancers Th1. Au contraire, l’enzyme dépose de manière type cellulaire spécifique la marque répressive H3K9me3 au niveau d’un set restreint de rétrovirus endogènes (ERVs). Des analyses bio-informatiques ont indiqué que les rétrotransposons ciblés sont fortement associés à des gènes impliqués dans les processus immunitaires. La suite de ces analyses a indiqué que ces ERVs flanquent et répriment l’activité d’éléments cis-régulateurs des gènes Th1, ou agissent eux même comme des enhancers du lignage. En conclusion, la déposition de H3K9me3 par SETDB1 garantit l’intégrité des lymphocytes T helper en réprimant un panel d’ERVs qui ont été exaptés en modules cis-régulateurs pour façonner et contrôler le réseau de gènes Th1. / CD4 T lymphocytes play a central role in the defense of mammal organisms against infections by pathogens and the development of tumors. Upon activation, naïve CD4 T cells differentiate into distinct helper cell subsets depending on environmental cues. T helper cells are key players of the immune system as they finely orchestrate immune responses in a danger-adapted manner. The process of T helper differentiation relies on the establishment of complex and lineage-specific gene expression programs. The dynamics and stability of these programs are regulated at the chromatin level through epigenetic control of cis-regulatory elements. My thesis objective was to investigate the epigenetic pathways involved in the regulation of enhancer activity in CD4 T cells. In this purpose, we studied the role of the H3K9 specific methyltransferase SETDB1 in the differentiation of Th1 and Th2 cells, which are strongly antagonistic. We report that SETDB1 critically represses the Th1 gene expression program. Indeed, Setdb1-deficient naïve T cells show exacerbated Th1 priming. Moreover, when exposed to a Th1-instructive signal, SETDB1-deficient Th2 cells cross lineage boundaries and transdifferentiate into Th1 cells. Surprisingly, SETDB1 does not directly target Th1 enhancers to heterochromatin. Instead, SETDB1 deposits the repressive H3K9me3 mark at a restricted and cell type specific set of endogenous retroviruses, strongly associated with genes involved in immune processes. Further bioinformatic analyses indicated that these retrotransposons flank and repress Th1 gene cis-regulatory elements or behave themselves as Th1 gene enhancers. Thus, H3K9me3 deposition by SETDB1 ensures T cell lineage integrity by repressing a repertoire of ERVs that have been exapted into cis-regulatory modules to shape and control the Th1 gene network.

Les lymphocytes T CD4 naïfs sont des cellules plastiques, capables de moduler finement leur programmation selon les signaux environnementaux qu'ils intègrent. Ils adaptent ainsi leur phénotype et leur fonction au type de danger Lors d'une infection par un agent pathogène intracellulaire par exemple, ils acquièrent un phénotype Th1 sous l'influence de médiateurs solubles tels que l'IL-12 et l' IFN-γ. Ces signaux mobilisent un set restreint de facteurs de transcription, coordonné par Tbet, qui programment la cellule afin qu'elle induise l'élimination du danger par des mécanismes impliquant une production massive d'IFN-γ. En réponse à des allergènes ou à des parasites extracellulaires, les lymphocytes T peuvent aussi acquérir un phénotype Th2, caractérisé par l'expression du facteur de transcription Gata-3 et par la production d'IL-4, d'IL-5 et d'IL-13. Afin de garantir la stabilité des lignages, ces processus de différenciation peuvent s'accompagner d'une perte de potentialité. Contrairement aux cellules T naïves, les cellules Th1 sont par exemple incapables d'allumer le programme d'expression génique Th2 en présence d'IL-4, et les lymphocytes Th2 verrouillent le programme Th1. Si nous savons aujourd'hui que l'acquisition des fonctions effectrices, comme l'équilibre entre détermination cellulaire et plasticité, sont régulés par des mécanismes épigénétiques, la plupart des acteurs moléculaires qui contrôlent la programmation des lymphocytes T au niveau de la chromatine reste encore à identifier. Durant ma thèse, j'ai étudié le rôle de la lysine méthyltransférase SETDB1, qui catalyse la di- ou tri-méthylation de la lysine 9 de l'histone 3 (H3K9me3), dans la différenciation des lymphocytes T CD4. Il avait déjà été proposé qu'H3K9me3 ait un impact sur la programmation de ces cellules en réponse aux signaux de l'environnement, mais personne n'avait encore étudié le rôle de SETDB1 dans ces processus lorsque j'ai commencé ma thèse. A l'aide d'une lignée murine déficiente pour SETDB1 spécifiquement dans les lymphocytes T, nous avons montré in vitro et in vivo que la balance Th1/Th2 est fortement augmentée en l'absence de l'enzyme, et que cette dérégulation résulte d'une perte de répression du réseau génique Th1. [...] / Upon activation, naïve CD4 T cells differentiate into distinct helper or regulatory T cell subsets depending on environmental signals received. This process relies on complex and lineage-specific gene expression programs whose dynamics and stability are regulated at the level of the chromatin. The epigenetic pathways involved, however, remain largely unknown. Here, we report that the histone methyltransferase SETDB1 critically controls the Th1 gene expression program. SETDB1-deficient naïve CD4 T cells show exacerbated Th1 priming, and when exposed to a Th1-instructive signal, SETDB1-deficient Th2 cells cross lineage boundaries and transdifferentiate into Th1 cells. Surprisingly, SETDB1 does not appear to control Th1 gene promoter activity. Instead, it deposits the repressive H3K9me3 mark at a restricted and cell-type specific set of endogenous retroviruses (ERVs) strongly associated with genes involved in immune processes. Refined bioinformatic analyses indicated that these retrotransposons either flank and repress Th1 gene cis-regulatory elements or behave themselves as Th1 gene enhancers. In conclusion, H3K9me3 deposition by SETDB1 ensures T cell lineage integrity by repressing a repertoire of ERVs that have been exapted into cis-regulatory modules to shape and control the Th1 gene network.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le cancer du sein représente un problème de santé publique. Les efforts déployés pour définir de nouvelles stratégies thérapeutiques ont mis en lumière les mécanismes développés par la tumeur pour inhiber l'instauration d'une réponse immune adaptative efficace. La tumeur favorise la mise en place d'une immunosubversion, caractériisée par la fort infiltration d'une sous-population de lymphocytes T CD4 régulateurs (Treg). Les Treg jouent un rôle central dans les mécanismes de contrôle de réactions pro-inflammatoires et protègent contre le développement de pathologies auto-immunes. Nous avons observé que le Treg sont recrutés spécéfiquement dans l'environnement tumoral via l'axe de chimiotactisme CCR4/CCL22 suite à la détetion des cellules transformées par les NK et les macrophages. D'autre part, plusieurs publications récentes démontrent un rôle des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) dans l'indcution de Treg chez l'homme et la souris. Nos observations montrent que des facteurs solubles sécrétés dans l'environnement tumoral inhibent la fonction clef des pDC, ce qui favorise fortement leur capacité à induire l'expansion de Treg et de T CD4 prodcuteur d'IL-10. Ces cellules T immunosuppressives expriment fortement le récepteur de co-simulation ICOS, prolifèrent in situ, exercent un important pouvoir supresseur sur les autres popuylations T et leur présence est associées à un impact péjoratif sur la survie des patientes. Par l'utilisation de l'Ac bloquant anti-COS 314.8 nous avons démontré le rôle essentiel d'ICOS dans la prolifération des Treg et l'induction de T CD4 sécréteurs d'IL-10 par les pDC dasn les tumeurs, offrant la perspective d'une nouvelle immunothérapie visant à éradqiuer les Treg intra-tumoraux.

L'objectif de cette thèse était de caractériser phénotypiquement et fonctionnellement les cellules NK activées par l'IL-21 et d'étudier leur interaction avec les lymphocytes T CD4*. Les lymphocytes Natural Killer (NK) sont essentiels pour la protection exercée par l'immunité innée. Les cellules NK, en plus de leurs fonctions cytotoxiques, peuvent orienter la réponse immunitaire adaptative vers un profile TH1 grâce à leur production d'IFN-y. Dans cette étude, nous avons montré que l'IL-21, une cytokine produite in vivo au cours de l'inflammation chronique ou de maladies infectieuses, induit la différenciation d'une sous-population spécifique de cellules NK co-exprimant ÇD86 et HLA-DR. Les cellules NK HLA-DR* induites par l'IL-21 sont capables d'apprêter et de présenter des antigènes aux lymphocytes T CD4*. De plus, ces cellules produisent MIF (Macrophage Migration Inhibitory Factor) et apportent un signal de costimulation durant le priming des lymphocytes T CD4 naïfs en induisant leur différenciation vers un profile central mémoire (Tcm) peu différencié. Les Tcm activés en présence des cellules NK HLA-DR" sont CXCR3' CCR4' CCR6' CXCR5' et produisent de PIL-2 et du TNF-a. La costimulation des lymphocytes T ÇD4 par les cellules NK HLA-DR" prévient l'acquisition d'un phénotype effecteur mémoire induit par l'IL-2. Ainsi, ces résultats montrent une nouvelle fonction pour l'IL-21 qui peut moduler l'interaction NK/CD4 et favoriser l'expansion des lymphocytes centraux mémoires. / Natural Killer lymphocytes are critical for innate immunity-mediated protection. Main roles of NK cell rely on their cytotoxic functions or depend on the tuning of TH1 adaptive immunity by IFN-y. Here, we provide evidence that 1L-21, a cytokine produced in vivo during chronic inflammation or infectious diseases, promotes the differentiation of a specifie subset of NK co-expressing CD86 and HLA-DR. IL-21-propagated HLA-DR' NK were able to process and present antigens to CD4' T lymphocytes. More importantly, IL-21-propagated HLA-DR' NK produced macrophage migration inhibitory factor and provided a co-stimulatory signaling during naive CD4* T cell priming inducing the differentiation of uncommitted central memory (Tcm) lymphocytes. Tcm expanded in the presence of HLA-DR* NK were CXCR3 CCR4" CCR6' CXCR5' and produced IL-2, as well as low levels of TNF-a. Co-stimulation of CD4* T cells by HLA-DR' NK prevented the acquisition of effector memory phenotype induced by IL-2. Altogether, these results demonstrate a novel function for IL-21 in tuning NK and CD4~ T cell interactions promoting a specifie expansion of central memory lymphocytes.

L’histoire naturelle du cancer implique des interactions entre la tumeur et les mécanismes de défense de l’hôte, tout particulièrement avec le système immunitaire adaptatif. Ainsi la transformation de cellules normales en cellules malignes peut engendrer l’expression d’antigènes tumoraux reconnus par les lymphocytes T. Plusieurs sous-populations de lymphocytes T (LT) CD4 contrôlent les réponses antitumorales, parmi elles, les LT CD4 helper de type-1 (Th1) jouent un rôle activateur majeur de l’immunité à médiation cellulaire antitumorale. Ils deviennent actifs grâce à la reconnaissance des peptides de 15 à 20 acides aminés dérivés d’antigènes tumoraux et présentés par les molécules HLA de classe II. Ils sont nécessaires à l’induction et la fonction des cellules effectrices dirigées contre les tumeurs notamment les lymphocytes T CD8 cytotoxiques (CTL). De plus la présence de lymphocytes CD4 Th1 infiltrant les tumeurs est souvent associée à un bon pronostic chez les patients. A l’aide d’un modèle in vitro chez l’homme et in vivo chez des souris transgéniques HLA, nous avons identifié quatre nouveaux peptides CD4 dérivés de la télomérase (TERT) un antigène de tumeur exprimé dans la majorité des cancers humains. Ces peptides appelés «Universal Cancer Peptide, UCP» se lient à la majorité des allèles HLA-DR et sont capables d’activer spécifiquement les LT CD4 de type-1. Des LT CD4 circulants spécifiques des UCP sont naturellement détectables dans plusieurs cancers humains mais absents chez des individus sains. Des clones T CD4 spécifiques des UCP générés à partir des lymphocytes de patients, produisent de forts taux d’IFN, TNF, et d’IL-2, cytokines associées à la polarisation Th1. L’analyse par ELISPOT IFN, de LT CD4 anti-UCP circulants au sein d’une cohorte de 84 patients atteints de cancers bronchiques métastatiques a montré la présence naturelle de ces lymphocytes chez 38 % des patients. De plus un effet bénéfique de la présence de cette réponse sur la survie globale a été observé chez les patients ayant une réponse clinique objective après chimiothérapie (13 vs 10 mois, P< 003). In vivo, l’immunisation de souris transgéniques HLA-A2/HLA-DR1 (Tg A2/DR1) avec les peptides UCP stimule des réponses T CD4 spécifiques caractérisées par une polarisation Th1. Nous avons montré que la présence in vivo de LT CD4 anti-UCP est nécessaire pour l’induction de réponses CTL antitumorales efficaces. Ainsi chez des souris co-immunisées en présence d’un peptide UCP, on observe un accroissement en nombre et de la qualité des réponses CTL proportionnellement à l’aide délivrée par les LT CD4 anti-UCP. L’induction de LT CD4 anti-UCP s’accompagne également d’une activation des cellules dendritiques in vivo via un mécanisme impliquant CD40L, IFN et GM-CSF. Dans un modèle de mélanome transplantable chez les souris Tg A2/DR1 nos résultats ont montré qu’une vaccination thérapeutique comportant un peptide UCP favorise un meilleur recrutement de CTL fonctionnels dans les tumeurs et améliore ainsi l’efficacité antitumorale du vaccin. Ces résultats confirment le rôle antitumoral majeur des lymphocytes CD4 Th1 et soulignent l’intérêt clinique de stimuler des réponses T CD4 spécifiques d’antigènes tumoraux de relevance clinique comme TERT. / Recent advances in immunology have now validated the concept of cancer immunosurveillance and the leading role of adaptative T cell immunity. Until a few years ago, antitumor CD8 T cell responses have been the most studied due to their direct cytotoxic activity on tumor cells. On the other hand, study of antitumor CD4 T cell responses are even more challenging because of the heterogeneity and plasticity of the various CD4 T cells subpopulations described. Among them, CD4 T helper type-1 cells (Th1), mainly characterized by the production of IFN, control the activation of antitumor cellular immunity. Thus, stimulation of specific CD4 Th1 cells may have a major interest for the development of anticancer immunotherapies. During this research thesis, we characterized novel HLA class II epitopes derived from a relevant tumor antigen, telomerase (TERT), and studied their capacities to stimulate specific CD4 Th1 cell responses. Using a method based on predictive immunology, we identified 4 peptides derived from TERT, referred as « Universal Cancer Peptides » (UCPs), enable to bind the most commonly found HLA-DR alleles in human. Using HLA-A2/HLA-DR1 transgenic mouse model, we first evaluated the in vivo immunogenicity of these peptides. Immunization of mice with UCPs induces high avidity specific CD4 T cells. The study of their polarization showed that UCP-specific CD4 T cells do not produce IL-4, -5, -10 or -17 cytokines, excluding a Th1, Treg or Th17 differentiation. In contrast, we measured high amount of IFN and IL-2 which characterize a Th1 pattern. The study of helper role allow us to demonstrate that CD8 peptide-based vaccinations in presence of UCPs enhance the efficacy of tumor specific CTL responses. Indeed, the intensity of these responses is strongly correlated with that of UCP-specific CD4 T cells induced in vivo. Furthermore, the stimulation of UCP-specific CD4 T cells promotes activation and IL-12 release by dendritic cells through a mechanism that involves IFN, GM-CSF and CD40L. We also demonstrated the antitumor efficacy of UCPs during a therapeutic vaccination in mice, as well as their capacity to foster the recruitment of specific CD8 T cells at the tumor site. In addition, the presence of naturally occurring UCP-specific CD4 T cell responses was found in different types of cancers such as leukemia, lung, colorectal or renal cancers. A study conducted in a cohort of 84 metastatic lung cancer patients revealed a synergistic effect of spontaneous UCP-specific CD4 Th1 and chemotherapy-treatment. Altogether, this study provides further evidences that stimulation of antitumor CD4 Th1 cells is a powerful method to improve cancer vaccines and also highlights the interest of TERT-derived UCPs for the innovative monitoring of antitumor CD4 T cell responses