Barley (Hordeum vulgare L.) is the fourth largest produced cereal worldwide. About two thirds of barley production is used to animal feed. When used to feed monogastric animals, the main shortcoming of barley grains is the deficiency of essential amino acids, especially lysine, threonine and methionine. The unbalanced amino acid composition is due to the main storage protein, the hordeins, which account for about 50% of total grain protein content. The nitrogen fertilization promotes C-hordein expression and accumulation, the hordein subgroup with the lowest content of essential amino acids, and the highest content of non-essential amino acids. Due to the importance of grain protein content and composition in the end use grain quality the key objective of the present study was to obtain a detailed insight into synthesis and accumulation of barley grain proteins and their relation to improved nutritional quality. An integrated proteomic and transcriptomic analysis have been undertaken in a set of transgenic antisense barley lines with the grain protein profile altered in comparison to the non-transgenic line cv. Golden Promise. The results were presented in three manuscripts in the thesis (chapters 2, 3 and 4). The first manuscript (chapter 2) reported a new grain protein extraction method combined with multi-method protein evaluation, including biochemical quantification, amino acid composition, sodium dodecyl-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) couple with mass spectrometry (MS) identification and a gel free shotgun MS identification and relative quantification. The results showed the changeability of proteins between protein groups and the importance of choosing an adequate proteomic-based method for protein identification according to the complexity of protein mixtures. In the second manuscript (chapter 3) a differential protein profile of non-transgenic barley cv. Golden Promise and the transgenic antisense C-hordein barley lines was achieved by two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) for salt soluble proteins and the differentially expressed proteins were identified by MS. The key results showed that the suppression of C-hordeins, the poor nutritional hordein subgroup, does not exclusively affects hordein synthesis and accumulation, and that the more balanced amino acid composition of these lines may be a consequence of distinct protein sources among different transgenic events, though a stable lysine-rich proteins upregulation occurs in all lines. In the third manuscript (chapter 4) the effects of nitrogen fertilization on hordein family at transcriptional and proteome level were assessed. The main results showed differential responses to N nutrition between non-transgenic and transgenic lines. In relation to C-hordein, specific C-hordein downregulation effect and in particular different responses to N were verified among subgroups of C-hordein multigene family in the transgenic line at transcriptional and proteomic level. In summary, the multi-method strategy used in the present work was successfully applied to obtain comprehensive information about barley grain proteins synthesis and accumulation and explain, at least in part, their relation to improved nutritional quality. These results can be useful in barley breeding programs aiming selective alterations of specific alleles/homologues to change amino acid composition by changing the relative proportions of the grain proteins in order to improve the barley grains nutritional quality. / A cevada (Hordeum vulgare L.) é o quarto cereal mais produzido no mundo. Cerca de dois terços desta produção é utilizada na alimentação animal. A principal desvantagem dos grãos de cevada na alimentação de animais monogástricos é a deficiência de aminoácidos essenciais, principalmente lisina, treonina e metionina. Esta composição desfavorável ocorre devido à principal proteína de reserva dos grãos, as hordeínas, que representam cerca de 50% do teor total de proteína no grão. O nitrogênio promove a expressão e o acúmulo de C-hordeínas, o subgrupo com o menor teor de aminoácidos essenciais e o maior teor de aminoácidos não essenciais. Devido à importância do teor e composição de proteínas nos grãos na determinação de sua qualidade no uso final, o principal objetivo do presente trabalho foi obter uma visão detalhada sobre a síntese e acúmulo de proteínas de grãos de cevada e sua relação com a melhoria da qualidade nutricional. Análises proteômicas e transcriptômicas integradas foram realizadas em um conjunto de linhagens transgênicas de cevada com o perfil de proteínas de reserva alterados em comparação à linhagem não transgênica cv. Golden Promise. Os resultados foram apresentados na forma de três manuscritos (capítulos 2, 3 e 4). O primeiro (capítulo 2) descreveu um novo método de extração de proteínas dos grãos em combinação com métodos de estudo de proteínas diversos, incluindo a quantificação bioquímica, composição de aminoácidos, eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) seguido de identificação por espectrometria de massas (MS) e estratégia shotgun para identificação e quantificação relativa das proteínas. Os resultados mostram a mutabilidade das proteínas entre os diferentes grupos e a importância da escolha de um método adequado para a sua identificação de acordo com a complexidade das misturas proteicas. No segundo manuscrito (capítulo 3) o perfil proteico diferencial da linhagem não transgênica e transgênica foi obtido por eletroforese bidimensional (2-DE) para proteínas solúveis, e aquelas expressas diferencialmente foram identificadas por MS. Os resultados demonstram que a supressão das C-hordeínas não afeta exclusivamente a síntese e o acúmulo de hordeínas, e que a composição de aminoácidos mais equilibrada destas linhagens pode ser uma consequência de fontes de proteína distintas entre os diferentes eventos de transgenia, embora a regulação positiva de proteínas ricas em lisina foi estável. No terceiro manuscrito (capítulo 4) foram avaliados os efeitos da adubação nitrogenada sobre a família das hordeínas. Os resultados mostraram que as respostas foram diferentes entre as linhagens não transgênica e transgênica. Um efeito específico de supressão e respostas particulares foi verificado entre os subgrupos da família multigênica das C-hordeínas na linhagem transgênica. Em resumo, a estratégia de pesquisa multimétodo foi aplicada com sucesso na obtenção de informações abrangentes sobre a síntese e o acúmulo de proteínas nos grãos de cevada, e pelo menos em parte, explicou sua relação com a melhoria da qualidade nutricional. Esses resultados podem ser úteis em programas de melhoramento de cevada que visam alterações seletivas de alelos/homólogos específicos para alterar a composição de aminoácidos, através de mudanças nas proporções relativas das proteínas dos grãos.

A atividade biológica de aldeídos α,Β-insaturados tem sido associada a diversos processos incluindo regulação gênica, envelhecimento Alzheimer e disfunções mitocondriais. Neste trabalho investigamos a formação de adutos do trans,trans-2,4-decadienal (DDE), um aldeído produzido endogenamente e presente como contaminante em alimentos e água, em lisina, histidina e citocromo c. Avaliamos também alterações na função de mitocôndrias de fígado de rato expostas ao aldeído. As análises por espectrometria de massas, LC-ESI/MS, indicaram a formação de diversos tipos de adutos de DDE nos aminoácidos lisina e histidina, entre eles bases de Schiff e enaminas. Os resultados obtidos por espectrometria de massas, MALDI-Tof, indicaram a formação de adutos de DDE formados via base de Schiff de maneira concentração do aldeído, tempo e pH dependentes. As análises da proteína digerida por ESI-Q-ToF, indicaram que os adutos foram formados nos resíduos H-33, K-39, 72 e 100, localizados em regiões ricas em resíduos básicos, cuja interação com membranas e citocromo e oxidase tem sido postulada. Observamos também o deslocamento da banda Soret (λ = 409 nm) e o desaparecimento da banda em λ = 695 nm, relativa a coordenação do sexto ligante do grupo heme (M-80). Este fenômeno está associado a abertura da cavidade do grupo heme e o deslocamento do ligante, indicando alterações nas estruturas secundária e terciária da proteína. Os experimentos realizados com mitocôndrias isoladas indicaram que DDE promove danos à membrana interna mitocondrial, demonstrando i pelo aumento no consumo de O2 em mitocôndrias em estado 4. Em decorrência destas lesões observamos também o intenso inchamento mitocondrial, indicado por experimentos de espalhamento de luz e microscopia eletrônica de transmissão. O inchamento não foi bloqueado por ciclosporina A, um inibidor do poro de transição mitocondrial. DDE também induziu a perda do potencial de membrana da organela, demonstrado pelo monitoramento do indicador fluorescente safranina O e aumento da peroxidação lipídica atestado pela quantificação de malondialdeido (MDA). Estes resultados indicam que DDE promove alterações estruturais no citocromo e podendo levar ao comprometimento da atividade da proteína, além de promover alterações em parâmetros mitocondriais, indicando um possível envolvimento na disfunção mitocondrial promovida por estresse oxidativo. / Lipid hydroperoxide-derived α,β-unsaturated aldehydes are involved in several cellular processes such as gene expression, aging, Alzheimer disease and mitochondrial dysfunction. In this work we have investigated adduct formation in lysine, histidine and cytochrome c by trans,trans-2,4-decadienal (DDE), an endogenously lipoperoxidation product. DDE is also a widespread environment aldehyde found, for example, in food and as a contaminant in water. Alterations in rat liver mitochondrial parameters such as oxygen consumption, membrane potentials, swelling and lipoperoxidation were also investigated. LC-ESI/MS experiments indicated that DDE react with aminoacids lysine and histidine producing adducts. In addition, MALDI-TOF experiments indicated increases in the molecular weight of cytochrome c consistent with the formation of DDE adducts via the Schiff base mechanism. Our data shows that the protein modification was time, pH and DDE-concentration dependent, leading to the formation of at least six adducts after 2 h incubation at pH 7.4. ESI-Q-TOF MS analysis of tryptic digests indicated that H-33, K-39, K-72 and K-100 were modified by DDE. These adducts are present in clusters of basic amino acid residues, which are believed to participate in the interaction of cytochrome c with mitochondrial membrane and cytochrome c oxidase. A blue shift in the Soret band from 409 to 406 nm was also observed, indicating heme crevice opening and displacement of heme sixth ligand (Met-80) coordination in modified protein. DDE (180 µM) treatment increases the rate of mitochondrial oxygen consumption, suggesting a partial mitochondrial uncoupling. Moreover, extensive mitochondrial swelling upon treatment with DDE (900 nM-162 &#181M) was observed by light scattering and transmission electron microscopy experiments. These effects were not prevented by the mitochondrial permeability transition inhibitor cyclosporin A. A DDE concentration-dependent loss in the inner mitocondrial membrane potential, monitored by safranin O fluorescence and an increase in lipoperoxidation were also observed. All together, these results suggest that reactive aldehydes can induce inner mitochondrial membrane damage playing a role in mitochondrial dysfunction associated with oxidative stress.

Made available in DSpace on 2017-07-21T14:13:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Daiane Cristine Mirante.pdf: 2726451 bytes, checksum: 032734e58cd5a2dc0e010068ceda3d38 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The development of antimicrobial agents is one of the most important advances in the therapeutic area due to microbial resistance, causing problems to public health, with serious economic, social and political implications. Thus, this study aimed to the technological development of microparticles of biopolymer poly-L-lysine (PLL) and polymeric nanocapsules containing essential oil of Melaleuca alternifolia Cheel uncoated or coated with PLL. The microparticles were obtained by the spray drying technique with a yield of 42.4%. The nanocapsules were prepared by interfacial deposition technique of a preformed polymer. The nanocapsules showed average nanometer diameter (160-200 nm), polydispersity index of less than 0.25 and negative zeta potential for nanocapsules poly(caprolactone) (PCL) (-39.8 mV) and positive for the nanocapsules of PLL (+17, 75 mV), indicating that there was an electrostatic adsorption interaction between PCL and PLL. An analytical method was developed and validated by UV-vis pectrophotometry in order to enable a reliable determination of encapsulation efficiency (EE). This method showed specificity, linearity, precision, detection and quantification satisfactory limits according to current recommendations. The EE was 99.86%. The antimicrobial activity of micro systems and nanocapsules was evaluated, containing PLL against the microorganisms, E. coli S. aureus, S. pyogenes, P. aeruginosa and C. albicans. The results demonstrate that the incorporation of the essential oil of M. alternifolia in the nanostructured system developed has been able to increase their antibacterial activity. The microparticles and nanocapsules, can, in the future, be promising antimicrobial agents, promoting the development of an effective therapeutic alternative and more effective at lower doses. / O desenvolvimento de agentes antimicrobianos representa um dos mais importantes avanços na área terapêutica, devido à resistência microbiana acarretar problemas para a saúde pública, com sérias implicações econômicas, sociais e políticas. Visto isso, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento tecnológico de micropartículas do biopolímero -poli-L-Lisina (PLL) e de nanocápsulas poliméricas contendo óleo essencial de Melaleuca alternifolia Cheel, revestidas ou não -PLL. As micropartículas foram obtidas pela técnica de secagem por aspersão com rendimento de 42,4 %. As nanocápsulas foram preparadas pela técnica de deposição interfacial de um polímero pré-formado. As nanocápsulas apresentaram diâmetro médio nanométrico (160-200 nm), índice de polidispersão inferior a 0,25 e potencial zeta negativo para as nanocápsulas de poli(-caprolactona) (PCL) (-39,8 mV) e positivo para as nanocápsulas de PLL (+17,75 mV), demonstrando que houve o processo de adsorção por interação eletrostática entre a PCL e a PLL. Foi desenvolvido e validado um método analítico por espectrofotometria de UV-Vis com a finalidade de permitir uma determinação confiável da eficiência de encapsulação (EE). Este método apresentou especificidade, linearidade, precisão, limites de detecção e quantificação satisfatórios de acordo com as recomendações vigentes. A EE foi de 99,86%. Foi avaliada a atividade antimicrobiana dos sistemas micro e nanoencapsulados contendo PLL contra os micro-organismos E. coli, S. aureus, S. pyogenes, P. aeruginosa e C.albicans. Os resultados demonstram que a incorporação do óleo essencial de M. alternifolia no sistema nanoestruturado desenvolvido foi capaz de aumentar a sua atividade antibacteriana. As micropartículas e as nanocápsulas, podem futuramente ser agentes antimicrobianos promissores, promovendo o desenvolvimento de uma alternativa terapêutica eficaz com doses menores e mais efetivas.

O arroz está entre os cereais mais consumidos do mundo. A desnutrição por micronutrientes como zinco (Zn) e ferro (Fe) é generalizada, especialmente em populações pobres, cujas calorias diárias são obtidas principalmente pelo consumo de cereais. Apesar de o arroz ser diferenciado por possuir maior quantidade de lisina em seus grãos em comparação ao trigo, milho ou cevada, a sua quantidade de proteínas representa somente de 8-9% do grão. Sendo o Zn é um micronutriente correlacionado com o funcionamento vital de plantas e animais, e estando relacionado direta e indiretamente com a síntese e funcionamento de várias proteínas, a proposta deste trabalho foi analisar a possível correlação da quantidade de Zn encontrado no grão com o perfil das proteínas de reserva, aminoácidos solúveis, enzimas envolvidas no metabolismo do ácido aspártico e do fator antinutricional ácido fítico, nos grãos de diferentes genótipos de arroz, avaliando primordialmente as diferenças inerentes de cada material genético a fim de agregar conhecimentos que possam ser utilizados como ferramenta para o melhoramento dessa espécie, visando ganho nutricional em seu grão. Para tanto, foram executados dois experimentos distintos. No primeiro foram avaliados três genótipos, os quais foram expostos à adubação foliar com sulfato de zinco, nas concentrações 0, 2 e 4 kg.ha-1 de ZnSO4.7H2O, buscando aumentar-se o nível de Zn nos grãos. No entanto não se verificou incremento significativo do metal na porção de interesse alimentar, sendo a variação encontrada nas concentrações de Zn em grãos integrais e polidos foram inerentes aos genótipos. Ainda assim, foram verificados os outros aspectos nutricionais, para os quais os resultados apontaram diferenças significativas entre os tipos de grãos analisados, sendo indicado o consumo de grão integral ao polido, destacando-se o genótipo Primavera, que apresentou maior concentração de proteínas e menor quantidade de fitato. Esse experimento ainda confirmou que o catabolismo da lisina é a principal via de modulação para o acréscimo desse aminoácido no grão. Para a execução do segundo experimento foram utilizados 16 genótipos cultivados no Brasil, buscando caracterizar a diversidade genética em relação às principais propriedades do grão relacionadas à qualidade nutricional humana. Os dados mostraram que apesar do Zn estar correlacionado positivamente com fitato, não há relação direta entre a concentração desse elemento com a síntese e concentração de aminoácidos e nem com a concentração total de proteínas de reserva. No entanto, com os resultados obtidos para grão integral em relação às características nutricionais, permite apresentar os genótipos Carolino e Goiano como os de melhor desempenho, além de ressaltar a importância da camada da aleurona do grão, já que está relacionada com todas as características nutricionais importantes para um projeto de bioforticação, indicando que estudos devem ser intensificados para entender o transporte de nutrientes até o interior do endosperma, ou ainda, que o consumo de arroz integral deve ser mais reforçado. / Human malnutrition due to low intake of the micronutrients zinc (Zn) and iron (Fe) is relatively common in poor population, who uses cereals as main sources of calories. Currently, rice is one of the most consumed cereals worldwide but, despite its high lysine concentration in comparison to other cereal crops, rice grains have low protein contents (8-9%). Therefore, the current work aimed to evaluate the influence of additional Zn supply on amino acid profile, storage proteins, macro- and micronutrients, as well as on phytate concentration, and on activity of enzymes from lysine metabolism in grains of different rice genotypes, primarily evaluating the inherent differences of each genetic material in order to aggregate knowledge like a tool for the improvement of this species, aiming nutritional gain in its grain. For this purpose, two different experiments were performed. First of all, three genotypes were evaluated and exposed to foliar fertilization with zinc sulfate, in the concentrations 0, 2 and 4 kg.ha-1 of ZnSO4.7H2O, seeking to increase the level of Zn in the grains. However, there was no significant increase of the metal in the grain, and the variation found in Zn concentrations in brown and polished grains was according to the genotypes. Nevertheless, the other nutritional aspects were verified, for which the results indicated significant differences between the types of grains analyzed, being indicated the consumption of brown grain to instead polished one, and the genotype \'Primavera\' stood out with higher concentration of proteins and smaller amount of phytate. This experiment also confirmed that lysine catabolism is the main modulation pathway to increase this amino acid in the grain. For the second experiment 16 genotypes cultivated in Brazil were used to characterize the genetic diversity in relation to the major grain properties related to human nutritional quality. Zinc concentration was positively correlated to phytate, but no direct association between Zn and synthesis and concentration of amino acids or storage proteins was detected. Based on results, \'Carolino\' and \'Goiano\' rice cultivars presented the best performance. Moreover, due to the relevance of aleurone layer in retaining important nutritional features in rice grains, biofortification programs should investigate nutrient transportation from this region to endosperm in order to achieve better results.

Orientador: Dirlei Antônio Berto / Coorientador: Messias Alves da Trindade Neto / Banca: Ana Silvia Alves Meira Tavares Moura / Banca : José Roberto Sartori / Banca: Maria Cristina Thomaz / Banca: Alexandre de Oliveira Teixeira / Resumo: Objetivou-se estimar o melhor nível de lisina digestível e sua relação com a energia metabolizável em dietas de suínos dos 50 aos 70 kg de peso vivo. Para tanto, foram realizados dois ensaios de desempenho, um com 72 machos castrados e outro com 72 fêmeas, com pesos médios iniciais de 49,75±0,41 kg e de 46,05±0,38 kg, respectivamente. O delineamento experimental usado nestes experimentos foi em blocos ao acaso com seis tratamentos, seis repetições e dois animais por unidade experimental (baia). No final dos experimentos mediu-se área de olho de lombo e espessura de toucinho na 10ª costela, por meio de ultrassonografia, em todos os animais. Também colheu-se sangue para leucograma de quatro animais dentro de cada tratamento, de forma aleatória, totalizando 24 machos castrados e 24 fêmeas, considerando delineamento inteiramente ao acaso, com quatro repetições por sexo e o animal era a unidade experimental. Os tratamentos foram 7,00; 8,00; 9,00; 10,00; 11,00 e 12,00 g de lisina digestível/kg de ração que continham 14,25 MJ de energia metabolizável/kg de ração e, em média, 160,92 g de proteína bruta/kg de ração. Realizou-se também um ensaio de digestibilidade e metabolismo, com 12 machos castrados e 12 fêmeas, em que foram avaliadas quatro dietas (7,00; 9,00; 10,00 e 12,00 g de lisina digestível/kg de ração), com três repetições e um animal por unidade experimental (gaiola). No ensaio de desempenho das fêmeas observou-se aumento linear na conversão alimentar, no consumo de proteína bruta (g/dia) e na eficiência de proteína bruta no período experimental de 0 a 16 dias. No período experimental de 0 a 32 dias observou-se aumento linear no consumo de proteína bruta (g/dia) e na eficiência de proteína bruta, bem como efeito quadrático no ganho de peso relativo (%) e na... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This study aimed to estimate the optimum level of lysine and its relation to metabolizable energy in diets for pigs from 70 to 100 kg live weight. For this, were two performance tests, one with 72 barrows and other with 72 females, with average initial weight 76.86 ± 0.90 kg and 76.92 ± 0.96 kg, respectively, the experimental design was a randomized block with six treatments and six replicates of two animals per experimental unit (pen). At the end the experiments was measured loin eye area and backfat thickness at the 10th rib by means of ultrasound in all animals. Also picked up blood WBC to four animals in each treatment, totaling 24 males castrated and 24 female maturation, being considered the completely randomized design, with four replications for sex and the animal was the experimental unit. After fasting for 12 hours, were chosen at random, 24 castrated males and 24 females (four per treatment), which were sent to slaughter in the abattoir for commercial Ratings and carcass boning. The treatments were 7.00, 8.00, 9.00, 10.00, 11.00 and 12.00 g of lysine per kg diet containing 14.25 MJ of ME per kg feed and on average 155.20 g crude protein per kg feed. In assay digestibility and metabolism were used 12 castrated males and 12 females, with evaluation of four diets (7.00, 8.00, 11.00 and 12.00 g of lysine / kg) with three replicates and one animal per experimental unit (cage). In the performance test females observed linear... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2017-03-22T12:24:42Z No. of bitstreams: 1 Ana Paula da Silva Ferreira Santos.pdf: 254127 bytes, checksum: f61bc4123a4a165a0b7cc4f2fc276b83 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-22T12:24:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Paula da Silva Ferreira Santos.pdf: 254127 bytes, checksum: f61bc4123a4a165a0b7cc4f2fc276b83 (MD5) Previous issue date: 2006-02-23 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The objective of this study was to evaluate the effect of substitution of soybean meal protein by cottonseed meal protein (FA) on the performance of broiler chickens. The treatments consisted of a reference diet containing corn and soy meal and four experimental diets, substituting 10%, 20%, 30% and 40% of soybean meal crude protein of reference diet. The results obtained were analyzed through the SAS mixed procedure. The performance results had been correlatedwith the diets cost for bioeconomic analysis. The study showed that until the level of 40% of substitution did not have significant effect on the weight gain (GP) and feed intake (CR). However, linear increase in the feed conversion have occurred (CA). The rentability presented negative linear effect for diets containing cottonseed meal. The zootechnical performance of the broilers was not wronged, however the feed conversion reduced the yield of the production. / Este estudo objetivou avaliar o efeito da substituição da proteína do farelo de soja pela proteína do farelo de algodão (FA) sobre o desempenho de frangos de corte.Os tratamentos consistiram de uma ração referência à base de milho e farelo de soja e quatro dietas experimentais, substituindo 10%, 20%, 30% e 40% da proteína bruta do farelo de soja da ração referência. Os resultados obtidos foram analisados pelo mixed procedure do SAS. Os resultados de desempenho foram correlacionados com custo das dietas para análise bioeconômica. O estudo mostrou que até o nível de 40% de substituição não houve efeito significativo sobre o ganho de peso (GP) e consumo de ração (CR). Entretanto, ocorreu aumento linear na conversão alimentar (CA). A rentabilidade apresentou efeito linear negativo para dietas contendo farelo de algodão. O desempenho zootécnico das aves não foi prejudicado, contudo a conversão alimentar reduziu a rentabilidade da produção.

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-06-07T17:57:54Z No. of bitstreams: 1 JoseEdilsonSilva.pdf: 1819277 bytes, checksum: 391131ff8e28cc1636472453e9b94fd8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-07T17:57:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JoseEdilsonSilva.pdf: 1819277 bytes, checksum: 391131ff8e28cc1636472453e9b94fd8 (MD5) Previous issue date: 2009-11-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA) / In this work we studied the adsorption and the encapsulation of the amino acid lysine with the double wall carbon nanotube (DWCNT) (8,0)@(17,0). This study is of interest for applications technological, because it allows to analyze the carbon nanotubes in di erent atmospheres and also to give it the speci c functions with biological goals. To treat with details the properties structural and electronics of the considered system, we used one theoretical approach based on calculations of rst principles making use of the density functional theory with the approach of the generalized gradient to describe the exchange and correlation term. The calculations were accomplished using the program SIESTA. When the system reached the expected convergence, the analysis of electronic properties through the structure of the band and density of states showed signi cant changes in behavior of system. System (8,0)@(17,0) DWCNT with lysine interacting on the outer wall begins to show character metallic, while the system with the lysine encapsulated energy gap is 0.30 eV to 0.19 eV. Also the degenerate levels of the system pure lose the degeneration when amino acid lysine is adsorbed and also encapsulated in DWCNT. To check the stability of these systems, we calculate the binding energy, which has a value of -1.63 eV indicating that this system is highly stable, while the (8,0)@(17,0) DWCNT with lysine encapsulated has a binding energy of the order of 3.24 eV, indicating the low stability. / Neste trabalho estudamos a adsorção e o encapsulamento do aminoácido lisina com o nanotubo de carbono de camada dupla (DWCNT) (8,0)@(17,0). Este estudo é de interesse para aplicações tecnológicas, pois permite analisar os nanotubos de carbono em diferentes ambientes e também dar-lhe funções específicas com metas biológicas. Para tratar com detalhes as propriedades estruturais e eletrônica do sistema considerado, utilizamos uma abordagem teórica baseada em cálculos de primeiros princípios, fazendo uso da teoria do funcional da densidade com a aproximação do gradiente generalizado para o termo de troca e correlação. Os cálculos foram realizados usando o programa SIESTA. Quando o sistema atingiu a convergência esperada, a análise das propriedades eletrônicas através da estrutura de banda e da densidade de estado mostraram mudan ças significativas no comportamento do sistema. O sistema DWCNT (8,0)@(17,0) com a lisina interagindo na parede externa passa a apresentar caráter metálico, enquanto que o sistema com a lisina encapsulada a energia do gap passa de 0.30 eV para 0.19 eV. Também os níveis degenerados do sistema puro perdem a degenerescência quando o aminoácido lisina é adsorvido e também encapsulado ao DWCNT. Para veri ficar a estabilidade destes sistemas, calculamos a energia de ligação, a qual apresenta um valor de -1.63 eV indicando que este sistema é altamente estável, enquanto que o DWCNT (8,0)@(17,0) com a lisina encapsulada tem uma energia de ligação da ordem de 3.24 eV, indicando a baixa estabilidade.

Accelerated Adaptation through Stimulated Copy Number Variation in Saccharomyces cerevisiae Ryan Matthew Hull Repetitive regions of the genome, such as the centromeres, telomeres and ribosomal DNA account for a large proportion of the genetic variation between individuals. Differences in the number of repeat sequences between individuals is termed copy number variation (CNV) and is rife across eukaryotic genomes. CNV is of clinical importance as it has been implicated in many human disorders, in particularly cancers where is has been associated with tumour growth and drug resistance. The copper-resistance gene CUP1 in Saccharomyces cerevisiae is one such CNV gene. CUP1 is transcribed from a copper inducible promoter and encodes a protein involved in copper detoxification. In this work I show that yeast can regulate their repeat levels of the CUP1 gene through a transcriptionally stimulated CNV mechanism, as a direct adaptation response to a hostile environment. I characterise the requirement of the epigenetic mark Histone H3 Lysine 56 acetylation (H3K56ac) for stimulated CNV and its limitation of only working at actively transcribed genes. Based upon my findings, I propose a model for how stimulated CNV is regulated in yeast and show how we can pharmacologically manipulate this mechanism using drugs, like nicotinamide and rapamycin, to stimulate and repress a cell's ability to adapt to its environment. I further show that the model is not limited to high-copy CUP1 repeat arrays, but is also applicable to low-copy systems. Finally, I show that the model extends to other genetic loci in response to different challenging environments, such as formaldehyde stimulation of the formaldehyde-resistance gene SFA1. To the best of our knowledge, this is the first example of any eukaryotic cell undergoing genome optimisation as a novel means to accelerate its adaptation in direct response to its environment. If conserved in higher eukaryotes, such a mechanism could have major implications in how we consider and treat disorders associated with changes in CNV.

This thesis describes how the human Alpha class glutathione transferase (GST) A1-1 can be reprogrammed either to function as a multipurpose biosensor for detection of small molecule analytes, or as a handle providing for more efficient protein purification. A novel, user-friendly, and efficient method for site-specific introduction of functional groups into the active site of hGST A1-1 is the platform for these achievements. The designed thioester reagents are glutathione-based and they are able to label one single nucleophile (Y9) and leave the other 50 nucleophiles (in hGST A1-1) intact. The modification reaction was tested with five classes of GSTs (Alpha, Mu, Pi, Theta and Omega) and was found to be specific for the Alpha class isoenzymes. The reaction was further refined to target a single lysine residue, K216 in the hGST A1-1 mutant A216K, providing a stable amide bond between the protein and the labeling group. To further improve the labeling process, biotinylated reagents that could deliver the acyl group to Y9 (wt hGST A1-1) or K216 in the lysine mutant, while attached to streptavidin-coated agarose beads, were designed and synthesized. A focused library of eleven A216K/M208X mutants was made via random mutagenesis to provide an array of proteins with altered micro-environments in the hydrophobic binding site, where M208 is situated. Through the invented route for site-specific labeling, a fluorescent probe (coumarin) was introduced on K216 in all double mutants, with the purpose of developing a protein-based biosensor, akin to the olfactory system. The array of coumarin-labeled proteins responded differently to the addition of different analytes, and the responses were analyzed through pattern recognition of the fluorescence signals. The labeled proteins could also be site-specifically immobilized on a PEG-based biosensor chip via the single C112 on the surface of the protein, enabling development of surface-based biosensing systems. Also, a refined system for efficient detection and purification of GST-fusion proteins is presented. Through a screening process involving A216K and all produced A216K/M208X mutants, two candidates (A216K and A216K/M208F) were singled out as scaffolds for the next generation of fusion proteins. In addition to the features present in commercially available GST fusion constructs, the new mutants can be site-specifically labeled with a fluorophore in bacterial lysates providing quick and sensitive monitoring of expression and purification. Furthermore, the proteins could be labeled with a unique aldehyde moiety providing for a novel protein purification scheme.

In der heutigen Zeit sind ca. 4000 Verbindungen bekannt, denen die Fähigkeit nachgesagt wird, eine Kontaktallergie auslösen zu können. Die Entscheidung, ob ein Stoff hautsensibilisierende Eigenschaften besitzt, wird dabei meist auf der Grundlage von Beobachtungen am Menschen und/oder von tierexperimentellen Befunden getroffen. Bedingt durch den vermehrten Einsatz exotischer Pflanzen und neu entwickelter synthetischer Substanzen im Bereich der Kosmetikindustrie besteht der Bedarf an einer einfachen Methode zur Vorhersage des kontaktallergenen Potentials einer Verbindung. Als zentraler Schritt bei der Manifestierung einer Kontaktallergie wird die Bildung eines Hapten-Carrier-Komplexes aus dem niedermolekularen Kontaktallergen (Hapten) und Hautproteinen (Carrier) angesehen. Zur Abschätzung der Sensibilisierungsfähigkeit kann daher auch die Reaktivität der Substanz oder ihrer Metaboliten gegenüber Proteinen herangezogen werden. Im Rahmen dieser Arbeit werden neben dem bedeutenden Phytoekzematogen Tulipalin A die bisher wenig untersuchten kontaktallergenen Duftstoffe Geraniol, 7-Hydroxycitronellal, Benzaldehyd, Salicylaldehyd, Vanillin, Zimtaldehyd, a-Amyl-zimtaldehyd und Benzylcinnamat hinsichtlich ihrer Reaktivität gegenüber peptidgebundenen Aminosäuren untersucht. Verwendet werden für diese Modellversuche Hippuryl-Derivate und Acetyl-Derivate der Aminosäuren Lysin, Histidin, Arginin bzw. Cystein sowie zusätzlich Glutathion. Die dabei gewählten Bedingungen sollen eine Adaption an physiologische Gegebenheiten erlauben. Ziel ist es, zu klären, ob die mit diesen Modellversuchen zu gewinnenden Ergebnisse mit dem bekannten kontaktallergenen Potential der eingesetzten Haptene korrelieren und somit geeignet sind, die Sensibilisierungsfähigkeit einer Substanz vorherzusagen. Über Konjugationsprodukte von Kontaktallergenen mit Peptiden oder Proteinen ist in der Literatur sehr wenig bekannt. Daher ist es ein weiteres Ziel dieser Arbeit, individuelle Produkte der Reaktionen der kontaktallergenen Substanzen mit den nukleophilen Aminosäureseitenketten zu isolieren und zu charakterisieren, um so definierte Hapten-Carrier-Konjugate, die unter physiologisch relevanten Bedingungen entstehen können, zu beschreiben. Aufbauend auf den gefundenen Strukturen sollte es auch möglich sein, Hinweise auf eventuelle Reaktionsmechanismen zu erhalten.