O Transplante de Células Tronco Hematopoiéticas (TCTH) baseia-se no princípio de infusão de Células Tronco Hematopoiéticas (CTH) CD34 + num receptor condicionado. Sabe-se que tais células são capazes de gerar uma nova hematopoiese bem como que o benefício do aumento de dose de CD34 + estende-se de aproximadamente 2 x 106 CD34/Kg a 5 x 106 CD34/Kg do receptor. A determinação do número de CD34 baseia-se no número total de CD34, porém sabe-se que apenas uma pequena porção celular do grupo de CD34 está associada à recuperação medular. Uma maneira de refinar a detecção desse grupo de células quando comparado com a quantificação do CD34 total, é a análise citométrica dos padrões de tamanho e granularidade citoplasmática. No contexto do TCTH autólogo e algumas vezes no TCTH alogênico, onde a infusão das células precursoras é feita com intervalo superior a três dias após a sua coleta, o congelamento das CTH CD34 +as faz-se necessário para que as células permaneçam viáveis. O agente crioprotetor mais comumente usado é o Dimetilsulfóxido (DMSO), que em temperaturas extremamente baixas protege as CTH da morte celular, porém em temperatura ambiente torna-se tóxico. As reações adversas do receptor no momento da infusão são atribuídas, em geral, ao DMSO. Portanto existem diferentes protocolos de congelamento de CTH que usam diferentes concentrações desse agente, com o intuito de reduzir as reações adversas e, ao mesmo tempo, evitar a morte celular decorrente de temperaturas baixas. Alguns estudos concluem que a viabilidade das CTH congeladas pode ser mantida com concentrações baixas de DMSO ou com celularidade elevada nos produtos congelados. Além do DMSO, a albumina e o Hidroxetilamido (HES) são usados como adjuvantes na proteção celular ao frio. Alguns protocolos de criopreservação usam apenas o DMSO enquanto outros indicam a necessidade do uso dos três agentes juntos. Não há consenso a respeito do protocolo de criopreservação ideal. Um expressivo número de trabalhos sugere o uso do DMSO 5 a 10% juntamente com a albumina 20% e HES 6% em enxertos com celularidade até 3 x 108 células nucleadas/ml, porém existem sugestões de protocolos diferentes desse padrão que usam o DMSO como agente único assim como concentrações menores de DMSO. Com relação ao efeito tóxico do DMSO, os eventos adversos do paciente no momento da infusão são atribuídos diretamente a ele. Porém evidências recentes apontam outras possíveis causas: citocinas liberadas durante o período de armazenamento e infundidas com o enxerto e micro-agregados leucocitários decorrentes da elevada celularidade do enxerto. O presente estudo pretendeu verificar a viabilidade das CTH através da medida da Anexina-V e 7-AAD pela técnica de citometria de fluxo usando-se diferentes concentrações de DMSO, bem como comparou tal desfecho entre amostras que foram congeladas apenas com DMSO e amostras congeladas com DMSO, HES e albumina. Além disso, foram verificados os níveis de citocinas inflamatórias nos enxertos e sua relação com a concentração de DMSO. / Bone Marrow Transplantation (BMT) is based on the principle of hematopoietic CD34 stem cells infusion in a conditioned recipient. It is known that such cells are capable of generating a new hematopoiesis, as well as known that the benefit of the increase of CD34 dose is goes best when it is between from 2 and to 5 x 106 CD34 by patient’s body weight. The CD34 determination is based on the total CD34 number. However it is known that only a small portion of the CD34 population is related to the marrow repopulating capacity. An alternative way of detecting such cells when compared to total CD34 dose is the cytometric analysis of citoplasmatic granularity and size patterns. In the autologous BMT context and, sometimes in the allogeneic type where the graft infusion occurs more than three days after the graft harvest, the CD34 cells freezing is necessary to keep their viability. The crioprotective agent most commonly used is the DMSO, which at extremely low temperatures this agent protects the CD34 cells from dying. However at temperatures above 30°C it became toxic and causing adverse events in the patient receiving them. The adverse reactions at the infusion moment in general are linked to DMSO, thus there are some different cryopreservative protocols using different DMSO concentrations aiming to reduce the incidence of collateral damage and at the same time avoid the CD34 from dying at low temperatures. Some studies conclude that CD34 viability can be maintained with the use of high mononuclear cellularity in the graft or with low DMSO concentrations. Besides DMSO, albumin and Hydroxietilstarch (HES) are cryoprotectants adjuvants. Some Cryopreservation protocols only use DMSO as cryoprotective agent, while others indicate the three agents together. There is no consensus about the ideal cryopreservation protocol. An important number of studies suggests the use of DMSO 5 to 10% with albumin 20% and HES 6% in grafts with cellularity number of no more than 3 x 108 cells/ml, however there are some new different protocols that use DMSO alone and at lower concentrations. As to adverse events during the infusion moment, it is known that DMSO causes the effects. However, there are evidences that other causes could cause these events: cytokines released during the storage freezing time and infused with the graft and leukocyte micro-clots caused by the high cellularity in the graft. The present study aimed to study the viability of CD34 cells using the Annexin-V and 7-AAD apoptosis reagents through the flow cytometry technique in different DMSO concentrations as well as compared such outcome among the samples only frozen with DMSO and samples frozen with DMSO, HES and albumin. Besides, it was verified the inflammatory cytokine levels and their relationship with the DMSO concentration.

Introdução: Células tronco mesenquimais (CTM) são uma população residente nos tecidos adultos de origem mesodérmica, com funções regenerativas de manutenção da integridade tecidual, com destaque no desempenho imunomodulador. Esse aspecto levou as CTM a tornarem-se ferramentas terapêuticas valiosas da pesquisa à assistência ao paciente em doenças autoimunes e de cunho inflamatório. Além disso, CTM podem ser isoladas de materiais tidos como descarte de procedimentos, como dentes decíduos, filtros de transplante de medula óssea e gordura. Nesse panorama, torna-se necessário estabelecer o efeito que a origem tecidual tem na eficiência imunoreguladora e na possível aplicabilidade clínica destas células. Objetivo: Comparar o potencial imunomodulador de células mesenquimais isoladas a partir de filtros descartados após a infusão de medula óssea, de lipoaspirado e de polpa de dentes decíduos. Métodos: Foi realizada a comparação da capacidade proliferativa de CTMs, cultivadas na presença de lisado plaquetário, das diversas fontes através do cálculo de population doubling das CTM em co-cultura com linfócitos T isolados em coluna magnética e com células mononucleares de sangue periférico, estimuladas com fitohemaglutinina; e determinado por citometria de fluxo o efeito das CTM das diversas fontes sobre as subpopulações linfocitárias. Resultados: CTM das três fontes foram capazes de inibir a proliferação de linfócitos e CTM de tecido adiposo foram mais eficientes em induzir o fenótipo de células T reguladoras e na diminuição de células T citotóxicas. Conclusão: comparadas à CTM isoladas de medula óssea e de polpa dentária, as CTM originadas de tecido adiposo exibem efeito imunomodulador mais acentuado. / Background: Mesenchymla stromal cells (MSC) reside in most adult tissue of mesenchymal origen, with a broad functions envolving cell repopulation and maintenence of tissue homeostasis, trough immunemmodulatory action. MSC are valuable terapêutic instruments applied from research to autoimune and inflamatory diseases. MSC can be isolated from diverse discarted biological matherials, like lipoaspirate, exfoliated deciduous teeeth and boné marrow ransplant filters. There so it´s necessary to stablish how source can impact MSC efficiency and possible clinical aplications. Objective: Compare immunomodulatory potential of adipose MSC and dental pulp MSC to boné marrow MSC. Methods: MSC from three selected sources were cocultured with phytohemaglutinin stimulated and magnetically isolated T cells and peripheral blood mononuclear cells; immunephenotype of cocultivated lymphocytes were also conducted. Results: MSC from all analyzed sources were capable to inhibit lymphocyte proliferation. Adipose MSC were capable to induce Treg phenotype and decrease T CD8+ limphocytes. Conclusion: Cell culture and therapy with MSC present many paradigms and we address to some of those to elucidate the possible most efficient source.

A desnutrição acomete 925 milhões de pessoas em todo o mundo, independentemente da idade e classe social, os mais acometidos são indivíduos hospitalizados, crianças e idosos. A desnutrição causa alterações fisiológicas em diversos tecidos. O tecido hematopoiético é afetado na desnutrição protéica, por ser um tecido de elevada e constante necessidade de proteínas, levando a alterações hematológicas como anemia e leucopenia. Estudos do nosso laboratório têm demonstrado in vivo, alterações do microambiente hematopoiético, em camundongos submetidos à desnutrição protéica, bem como hipoplasia medular, mudanças quantitativas da matriz extracelular (MEC) como o aumento do deposito de fibronectina na região subendosteal (local da fixação das células tronco/ progenitoras hematopoiéticas), alterações do ciclo celular das células tronco/ progenitoras hematopoiéticas e alteração na expressão de VLA5; principal integrina na interação das células a fibronectina. Sendo assim propõe-se neste projeto avaliar possíveis isoformas da molécula de fibronectina, para melhor compreender o seu papel biológico no ciclo celular as células tronco/ progenitoras hematopoiéticas em um modelo de desnutrição protéica. Para isso foram utilizados camundongos C57BLI/6J machos, adultos, mantidos em gaioleiros metabólicos, separados em dois grupos. O grupo controle recebeu uma ração normoproteíca com 12% de proteína e o grupo desnutrido, uma ração hipoprotéica com 2% de proteína, num período de 5 semanas. Após este período os animais foram sacrificados para avaliação hematológica, celularidade da medula óssea, quantificação e pesquisa de isoformas da fibronectina, análise do perfil protéico no estroma medular em culturas de longa duração bem como a análise do estabelecimento do estroma medular em culturas de longa duração. Os animais desnutridos apresentaram uma menor celularidade e uma diminuição significativa de células jovens na medula óssea. O estroma medular estabelecido em culturas de longa duração dos animais do grupo desnutrido apresentaram uma menor confluência em relação ao grupo controle. Também foi observado nas culturas de longa duração um aumento significativo da fibronectina no 28° dia de cultura, mas com uma diminuição da fibronectina no 35° dia, porém com uma menor quantidade de região EDA nos dois períodos analisados (sítio de ligação das integrinas a fibronectina) quando comparados aos animais do grupo controle. A pesquisa de isoformas de fibronectina no estroma medular, por meio de RT-PCR, revelou que tanto os animais do grupo controle quanto os animais do grupo desnutrido apresentaram diferentes isoformas de fibronectina, porém não foi possível fazer uma análise quantitativa das regiões de splicing alternativo. O perfil protéico das culturas de longa duração analisado por meio de eletroforese bidimensional demonstrou que os animais do grupo desnutrido possuem um perfil protéico diferente dos animais do grupo controle, também foi observado uma diferença do perfil protéico entre os 28° e 35° dias de cultura. Portanto a alteração quantitativa da molécula de fibronectina e da região EDA, bem como a presença de diferentes isoformas de fibronectina, juntamente com as alterações do perfil protéico podem ser devido a um aumento e ou degradação das proteínas de matriz extracelular. E estas alterações podem ser responsáveis pela hipoplasia medular e alteração do ciclo celular das células tronco/ progenitoras hematopoiéticas e estromais, talvez pela menor interação com as integrinas, sendo esta interação fundamental para a modulação de diversas funções celulares tais como proliferação e diferenciação e para a regulação do remodelamento da matriz extracelular. Mas ainda se faz necessário a quantificação das regiões de splicing alternativo, seqüênciamento das proteínas da matriz extracelular e a identificação das possíveis metalaproteinases presentes no estroma medular para melhor elucidar as funções da fibronectina e outras proteínas da matriz extracelular na manutenção da hemopoese. / Malnutrition affects 925 million people worldwide, regardless of age and social class, the most affected individuals are hospitalized, children and elderly.Malnutrition causes physiological changes in various tissues.The hematopoietic tissue is affected in protein malnutrition, because it is a tissue of high and constant need of proteins, leading to hematological abnormalities such as anemia and leucopenia. Studies from our laboratory have demonstrated in vivo changes in the hematopoietic microenvironment in mice submitted to protein malnutrition, and bone marrow hypoplasia, quantitative changes of the extracellular matrix (ECM) as the increase in deposit fibronectin in the region subendosteal (site of attachment of the cells stem / progenitor), changes in cell cycle of stem cells / progenitor and changes in the expression of VLA5; main integrin interaction of cells to fibronectin. Therefore this project proposes to evaluate possible isoforms of fibronectin molecule, to better understand its biological role in cell cycle stem cells / progenitor in a model of protein malnutrition. Mice were used for this C57BLI/6J male adults were kept in metabolic gaioleiros, separated into two groups. The control group received a ration normoproteíca with 12% protein and the malnourished group, a low protein diet with 2% protein over a period of 5 weeks. After this period the animals were sacrificed for hematological evaluation, bone marrow cellularity, and quantification of fibronectin isoforms research, analysis of protein profiles in marrow stroma in long-term cultures and analysis of the establishment of bone marrow stroma in long-term cultures. The malnourished animals showed a lower cellularity and a significant decrease of young cells in the bone marrow.The bone marrow stromal cultures established in long-term animal malnourished group had a lower convergence in the control group. It was also observed in cultures long term a significant increase in fibronectin on the 28th day of culture, but with a decrease in fibronectin 35 th day, but with a smaller amount of EDA region in both periods analyzed (binding site of integrins to fibronectin) compared to the control group.The survey of isoforms of fibronectin in bone marrow stroma, by RT-PCR revealed that both control animals and animals in the malnourished group presented different isoforms of fibronectin, but it was not possible to make a quantitative analysis of the regions of alternative splicing.The protein profile of long-term cultures analyzed using two-dimensional electrophoresis showed that animals of the malnourished group have a protein profile different from the control group was also observed a difference in protein profile between 28° and 35° day of culture. Therefore, the quantitative change of the molecule fibronectin and the region of EDA, as well as the presence of different isoforms of fibronectin, together with changes in protein profile may be due to an increase, or degradation of extracellular matrix proteins. And these changes may be responsible for bone marrow hypoplasia and alteration of the cell cycle of stem cells / progenitor and stromal cells; perhaps because of less interaction with integrins, this interaction is essential for the modulation of various cellular functions such as proliferation and differentiation and to regulation of extracellular matrix remodeling. But it is still necessary to quantify the areas of alternative splicing, sequencing of the extracellular matrix proteins and identification of possible metalaproteinases present in bone marrow stroma to better elucidate the roles of fibronectin and other extracellular matrix proteins in maintaining hemopoese.

Orientador: Jose Andres Yunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T05:42:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Laranjeira_AngeloBrunelliAlbertoni_M.pdf: 2767287 bytes, checksum: 8b66a1e06cad088fa256103c24e955a7 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A resistência intrínseca ou adquirida aos compostos quimioterápicos é uma das mais importantes causas dos insucessos no tratamento das LLAs pediátricas. A interação da LLA com o microambiente da medula óssea contribui para a proliferação e resistência ao regime quimioterápico das células leucêmicas através de uma grande variedade de mecanismos celulares que provavelmente incluem: aumento da expressão de transportadores celulares, aumento no processo de reparo do DNA, diminuição na regulação dos alvos das drogas, mudanças na regulação do ciclo celular e alteração nas vias apoptóticas. No presente estudo observou-se que a interação estabelecida entre células estromais e células de LLA-B, promoveu a ativação destas como avaliado pela análise das moléculas de superfície das células leucêmicas ao longo dos períodos de cultivo, além da sobrevivência e/ou proliferação em mais de 60% dos casos in vitro. A comunicação entre os dois tipos celulares também mostrou a influência do estroma na modulação da expressão transcricional de 17 genes relacionados com a resistência e sensibilidade a quimioterápicos em células de LLA-B. A modulação teve como conseqüência o aumento nos níveis de expressão da maioria dos genes de resistência e a queda de expressão da maioria dos genes de sensibilidade. Sendo assim, a LLA, pela interação com as células estromais, apresentaram uma alteração que as levou a um fenótipo característico de células resistentes. Essa alteração de expressão mediada pelo contato com o estroma foi confirmada por estudos funcionais de dois genes relacionados com a resistência. O gene KCNN4 em linhagens celulares, que quando submetidas à ação do clotrimazol apresentaram maior viabilidade na presença do que na ausência do estroma; e a adição da proteína recombinante IGFBP-7 no sistema de co-cultura promoveu a resistência e até mesmo proliferação na presença da L-asparaginase. Esta proteína também se mostrou atuante na proliferação das células estromais. Estes resultados mostram dois genes de LLA, que quando modulados pelo contato com o estroma podem contribuir com a maior resistência ao regime quimioterápico, podendo vir a ser usados como alvo para posteriores terapias / Abstract: The intrinsic or acquired chemotherapy resistance composites one of the most important causes of failures in the treatment of pediatric ALL. The ALL and bone marrow microenvironment nteraction contributes for the proliferation and resistance to the chemotherapy regimen of leukemic cells probably through a great variety of cellular mechanisms, including increase of the expression of cellular transporters, increase in the process of DNA repair, downregulation of drugs targets, changes in the regulation of cellular cycle and alteration in the apoptotic ways. In the present study it was observed that the interaction established between stromal cells and pre-B ALL, evaluated through analysis of surface molecules in leukemic cells throughout the periods of culture, were important for the survival and/or proliferation in more than 50% of the cases in vitro. This interaction also showed the influence of stroma in the transcriptional profile of 17 genes related with the resistance and sensitivity to chemotherapeutic agents in pre-B ALL cells. The modulation had as consequence the increase in the levels of expression of the majority of the resistance genes and the decrease of expression of the majority of the sensitivity genes. Being thus, these cellular types, for the interaction with the stromal cells, had presented an alteration that took them to one phenotype characteristic of resistant cells. This stroma-mediated alteration was confirmed by functional studies of two genes related with the resistance. Gene KCNN4 three leukemic cell lines, that when submitted to the action of clotrimazole they had presented greater viability in the presence than in the absence of stroma; and the addition of recombinant protein IGFBP-7 in the co-culture system promoted the resistance and proliferation of primary ALL cells in the presence of the L-asparaginase. This protein also induced proliferation of stromal cells. These results show two genes of ALL, that when modulated for the contact with stroma, can contribute with a resistance to the chemotherapic regimen, becoming possible targets for posterior therapies / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

INTRODUÇÃO: O fenótipo de resistência a drogas é caracterizado pela superexpressão das proteínas da família ABC (ATP-Binding Cassette). A Pglicoproteína (P-gp), codificada pelo gene ABCB1, é uma das bombas de efluxo mais estudadas, como agente interferente no tratamento de diversos tipos de câncer, seguida pela proteína MRP1 (Multidrug Resistance-related Protein 1), transcrita pelo gene ABCC1. Estudos recentes relacionaram a atuação da proteína LRP (Lung Resistance Protein) a estas bombas, devido sua alta expressão em tumores com fenótipo resistente. Em contrapartida, estes transportadores também exercem funções fisiológicas contra metabólitos, compostos citotóxicos e teratogênicos, em diversos tecidos normais como rins, fígado, intestino e célulastronco. As proteínas ABC são consideradas marcadores específicos das célulastronco hematopoiéticas, porém, ainda são pouco descritas nas células-tronco mesenquimais (CTM). A medula óssea (MO) é a fonte mais bem descrita de CTM adultas, cujas propriedades são conhecidas e utilizadas na aplicação clínica. Entretanto, recentemente células-tronco de origem fetal têm criado expectativas e o líquido amniótico (LA) apontado como fonte promissora deste tipo celular, que por sua vez, é pouco estudada acerca da atuação das bombas ABC. Sendo assim, o presente estudo visou caracterizar a expressão da P-gp, MRP1 e LRP em célulastronco mesenquimais humanas do líquido amniótico e medula óssea. MÉTODOS: Foram isoladas CTM de amostras do LA e MO, caracterizadas através de citometria de fluxo, ensaios de diferenciação em tecidos mesenquimais in vitro e expressão dos genes de indiferenciação Oct-4 e Nanog por RT-PCR. Verificou-se também a presença da P-gp através da técnica de imunocitoquímica e a sua resistência frente a diferentes concentrações de doxorrubicina (DOX) através do ensaio de MTT, foram utilizadas como controles as células MES-SA e MES-DX (sarcoma uterino respectivamente sensível e sua variante resistente à DOX). Para avaliar o funcionamento da P-gp, foi feito ensaio de exclusão do corante Rhodamina 123 (Rh 123) por meio de citometria de fluxo, com ou sem bloqueio da P-gp utilizando verapamil. E por fim, foi verificada a expressão dos genes ABCB1/ABCC1/LRP por meio de PCR em tempo real, nas amostras pré e pós-diferenciações adipogênica, osteogênica e condrogênica. RESULTADOS: As CTM, tanto da MO quanto do LA, exibiram respostas semelhantes às células resistentes MES-DX e expressam a Pgp de forma homogênea nas suas populações. O ensaio de exclusão da Rh 123 demonstrou dinâmicas de efluxo do corante semelhantes entre as células-tronco do LA e as MES-DX, com e sem a presença de verapamil. No entanto, as células da MO apresentaram efluxo crescente e não responderam ao bloqueador verapamil como as outras linhagens. A distribuição da expressão gênica, o ABCB1 se mostrou menor que a do LRP nas amostras de LA indiferenciadas. No entanto a expressão do ABCB1 nas amostras de LA foi maior em comparação às amostras de MO indiferenciadas. Não houve seignificância estatística na comparação da expressão gênica antes e depois das diferenciações adipogênica e osteogênica. CONCLUSÃO: As CTM são resistentes ao quimioterápico doxorrubicina, mas, possuem baixa expressão do ABCB1. Portanto, as CTM podem possuir outro mecanismo, como a MRP1 e LRP, atuando no mecanismo de resistência à DOX, além da P-gp / BACKGROUND: The drug resistance phenotype is characterized by ABC (ATPBinding Cassette) family proteins overexpression. The P-glycoprotein (P-gp) codified by ABCB1 gene is one of the most studied efflux pumps such as interfering agent in cancer treatment followed by MRP1 (Multidrug Resistance-related protein 1) transcribed by ABCC1 gene. Recent studies have linked the LRP (Lung Resistance Protein) to these pumps activities because of its high expression in resistant cancers. Though these transporters also have physiological functions against metabolites, cytotoxic and teratogenic compounds in normal tissues as kidneys, liver, intestine and stem cells. ABC proteins are considered hematopoietic stem cells specific markers but are poorly described in mesenchymal stem cells (MSC). Bone marrow (BM) is the best characterized adult MSC source its properties are well known and used in clinical application. However recently fetal stem cells has raised expectations and amniotic fluid (AF) is a promising source of this cell type which in turn is scarce regarding about presence and activity of the ABC pumps. The aim of this study was characterize the P-gp, MRP1 and LRP expression in human mesenchymal stem cells from amniotic fluid and bone marrow. METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated from AF and BM and characterized by flow cytometry, in vitro mesenchymal differentiation assays, Oct-4 and Nanog genes expression by RT-PCR. The P-gp presence were found over immunocytochemical technique and its activity against different concentrations of doxorubicin (DOX) by MTT assay which were used as control cells MES-DX and MES-SA (uterine sarcoma respectively resistant and susceptible to DOX). The P-gp was evaluated in Rhodamine 123 (Rh 123) dye exclusion through flow cytometry with or without blocking P-gp from verapamil. Finally was observed ABCB1/ABCC1/LRP genes expression by real time PCR after and before adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation. RESULTS: BM and AF MSC showed the same response of the DOX resistant cells MES-DX and express P-gp homogeneously though their populations. The Rh 123 dye exclusion assay demonstrated that the AF stem cells efflux dynamics are similar to the MES-DX with and without the presence of verapamil. However BM MSC showed crescent efflux and no response to verapamil as the other cells. The ABCB1 gene was less expressed than LRP in undifferentiated AF MSC. No difference was found in gene expression before osteogenic and adipogenic differentiation. CONCLUSION: MSC have low expression of ABCB1 although are resistant to doxorubicin so other mechanisms such as MRP1 or LRP may be acting to these cells defense in addition to P-gp

Pacientes com linfoma difuso de grande célula B (LDGCB) do mesmo grupo de risco pelos critérios do Índice de Prognóstico Internacional (IPI), tratados com quimioterapia convencional à base de antraciclina, podem ter resposta terapêutica não esperada para seu grupo de risco. Isso pode ser explicado pelo fato do prognóstico dos LDGCB, que têm origem no centro germinativo (CG), ser superior aos originados após o CG (NCG). No intuito de aprimorar a avaliação de prognóstico e a abordagem terapêutica em LDGCB de IPI ajustado para a idade (IPIa) de risco intermediário alto e alto, elaboramos projeto de pesquisa, para verificar o papel dos marcadores imuno-histoquímicos (IH) e do transplante de medula óssea autólogo (ATMO), em primeira remissão completa (RC), neste grupo de pacientes. Avaliamos o impacto da expressão dos marcadores CD10, Bcl-6, MUM-1, Bcl-2 e p63 na obtenção de RC, sobrevida livre de doença (SLD) e sobrevida global (SG), isoladamente e de acordo com a origem em CG e NCG. Avaliamos 82 pacientes abaixo dos 60 anos, dos quais 16 (19,5%) receberam ATMO em primeira RC, além de serem comparados com os pacientes tratados com quimioterapia convencional e mantidos em observação após RC. A IH foi avaliável em 73 casos, 24 (32,9%) tiveram origem no CG e 49 (67,1%) NCG, sem diferença de sobrevida entre os grupos. A proteína Bcl-2 foi positiva em 27 (37%) pacientes e foi o único fator preditivo independente para SG à análise multivariada, com tendência de significância para RC. As SG e SLD em cinco anos para os 16 pacientes que receberam ATMO foi de 75% e 85,2%, respectivamente, a taxa de recidiva de 6,5% e diferença estatisticamente significativa para SLD (p = 0,015) em comparação aos pacientes apenas observados. Concluímos que o ATMO foi seguro e capaz de melhorar a sobrevida em LDGCB de risco intermediário alto e alto, e que a expressão de Bcl-2 pode ser utilizada na programação terapêutica inicial desses pacientes. / Diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) patients from the same risk group according to the International Prognostic Index (IPI) treated with conventional anthracycline-based chemotherapy may show an unexpected therapeutic response. This can be explained by the fact that the prognosis of DLBCL originating in germinal center (GC) cells is superior than that originating out of germinal center (NGC). In order to improve the prognostic evaluation and the therapeutic approach to DLBCL patients with high intermediate to high age-adjusted IPI (aIPI), a research project was designed for the analysis of immunohistochemical markers and the role of autologous stem cell transplantation (ASCT) in first complete remission (CR) for this group of patients. The impact of the expression of CD10, Bcl-6, MUM-1, Bcl-2 and p63 markers on complete remission (CR), disease-free survival (DFS) and overall survival (OS), either individually and according to cell origin was evaluated by means of immunohistochemistry. Eighty-two patients aged under 60 years old were assessed, of which 16 (19.5%) underwent ASCT in first CR and were compared to patients receiving conventional chemotherapy and being monitored after CR. Immunohistochemistry was assessable in 73 cases, 24 (32.9%) being classified as GC-type and 49 (67.1%) as NGC-type, with no survival difference between the two groups. Bcl-2 expression was found in 37% (27) of the patients and was the single independent predicting factor of OS prognosis according to multivariate analysis. A significant tendency of expression of this protein was also observed for achieving CR, which was essential for longer survival, as shown by multivariate analysis. OS and DFS within 5 years were of 75% and 85.2% respectively for the group of 16 patients treated with ASCT, which resulted in lower relapse rates (6.5%) with statistically significant difference for DFS (p=0.015) when compared to the group of patients who achieved CR and was kept under monitoring. In this study ASCT was found to be a safe procedure for improving survival rates of DLBCL patients with high intermediate to high aIPI risk. Also, the expression of Bcl-2 protein was found to be useful as one of the variables to be analysed in the therapeutic approach to these patients

O principal fator de risco para tuberculose (TB) em receptores de transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH) é viver em regiões de alta endemicidade da doença, uma vez que a imunossupressão favorece a reativação da tuberculose latente (TBL). O diagnóstico da TBL pela prova tuberculínica (PT) tem limitações nos imunocomprometidos e testes de detecção de interferon gama podem ser vantajosos. Os objetivos do presente estudo foram comparar a PT com o QuantiFERON® TB-Gold In-Tube (QFT-GIT) no diagnóstico da TBL e determinar a incidência de TB em duas coortes de pacientes submetidos ao TCTH. Duas coortes foram analisadas prospectivamente. Coorte1: receptores de TCTH incluídos desde o período pré-transplante. Coorte 2: receptores de TCTH com doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH) crônica em atividade. A PT e o QFT-GIT foram realizados imediatamente após a inclusão em ambas as coortes. Pacientes na coorte 1 com diagnóstico de TBL receberam profilaxia com isoniazida (INH) por nove meses. Na coorte 2, os pacientes foram acompanhados clinicamente, sem receber profilaxia. TB ativa foi investigada prospectivamente de acordo com definição de caso e por coletas periódicas de escarro. Entre os candidatos ao TCTH, a prevalência de TBL detectada pela PT foi de 4,7% e de 7,1% pelo QFT-GIT. Entre os receptores com DECH crônica a prevalência de TBL detectada pela PT foi de 5,3% e de 12,5% pelo QFT-GIT. A comparação entre as técnicas revelou boa concordância (kappa=0.60). Não houve casos de TB na coorte 1. A incidência cumulativa de TB na coorte 2 foi de 3%. Em comparação com alguns estudos, nossos resultados apresentaram menor prevalência de TB, com menos resultados indeterminados pelo QFT-GIT e melhor concordância entre ambos os testes. É provável que a introdução de profilaxia com INH seja benéfica também para os pacientes com DECH crônica. / The main risk factor for tuberculosis (TB) in hematopoietic stem cell transplant recipients (HSCT) is to live in regions of high endemicity of the disease, since immunosuppression favors the reactivation of latent tuberculosis infection (LTBI). The diagnosis of LTBI by the tuberculin test (TT) has limitations in the immunocompromised hosts and the interferon gamma release assays (IGRAs) may be advantageous. The objectives of the present study were to compare the TT with QuantiFERON® TB-Gold In-Tube (QFT-GIT) in the diagnosis of LTBI and to determine the incidence of TB in two cohorts of patients undergoing HSCT. Two cohorts were analyzed prospectively. Cohort 1: HSCT recipients included since the pre-transplant period. Cohort 2: TCTH recipients with active chronic graft versus host disease (GVHD). TT and QFT-GIT were performed immediately after inclusion in both cohorts. Patients in cohort 1 with diagnosis of LTBI received prophylaxis with isoniazid (INH) for 9 months. In cohort 2, the patients were followed up clinically, without receiving prophylaxis. Active TB was investigated prospectively according to a case definition criteria and periodic sputum sampling. Among the HSCT candidates, the prevalence of LTBI detected by TT was 4.7% and 7.1% by QFT-GIT. Among the recipients with chronic GVHD, the prevalence of LTBI detected by TT was 5.3% and 12.5% by QFT-GIT. The comparison between the techniques showed good agreement (kappa = 0.60). There were no cases of TB in cohort 1. The cumulative incidence of TB in cohort 2 was 3%. Compared with some studies, our results showed a lower prevalence of LTBI, with less indeterminate results by QFT-GIT and better agreement between both tests. It is likely that prophylaxis with INH is also beneficial for patients with chronic GVHD.

Introdução: Células tronco mesenquimais (CTM) são uma população residente nos tecidos adultos de origem mesodérmica, com funções regenerativas de manutenção da integridade tecidual, com destaque no desempenho imunomodulador. Esse aspecto levou as CTM a tornarem-se ferramentas terapêuticas valiosas da pesquisa à assistência ao paciente em doenças autoimunes e de cunho inflamatório. Além disso, CTM podem ser isoladas de materiais tidos como descarte de procedimentos, como dentes decíduos, filtros de transplante de medula óssea e gordura. Nesse panorama, torna-se necessário estabelecer o efeito que a origem tecidual tem na eficiência imunoreguladora e na possível aplicabilidade clínica destas células. Objetivo: Comparar o potencial imunomodulador de células mesenquimais isoladas a partir de filtros descartados após a infusão de medula óssea, de lipoaspirado e de polpa de dentes decíduos. Métodos: Foi realizada a comparação da capacidade proliferativa de CTMs, cultivadas na presença de lisado plaquetário, das diversas fontes através do cálculo de population doubling das CTM em co-cultura com linfócitos T isolados em coluna magnética e com células mononucleares de sangue periférico, estimuladas com fitohemaglutinina; e determinado por citometria de fluxo o efeito das CTM das diversas fontes sobre as subpopulações linfocitárias. Resultados: CTM das três fontes foram capazes de inibir a proliferação de linfócitos e CTM de tecido adiposo foram mais eficientes em induzir o fenótipo de células T reguladoras e na diminuição de células T citotóxicas. Conclusão: comparadas à CTM isoladas de medula óssea e de polpa dentária, as CTM originadas de tecido adiposo exibem efeito imunomodulador mais acentuado. / Background: Mesenchymla stromal cells (MSC) reside in most adult tissue of mesenchymal origen, with a broad functions envolving cell repopulation and maintenence of tissue homeostasis, trough immunemmodulatory action. MSC are valuable terapêutic instruments applied from research to autoimune and inflamatory diseases. MSC can be isolated from diverse discarted biological matherials, like lipoaspirate, exfoliated deciduous teeeth and boné marrow ransplant filters. There so it´s necessary to stablish how source can impact MSC efficiency and possible clinical aplications. Objective: Compare immunomodulatory potential of adipose MSC and dental pulp MSC to boné marrow MSC. Methods: MSC from three selected sources were cocultured with phytohemaglutinin stimulated and magnetically isolated T cells and peripheral blood mononuclear cells; immunephenotype of cocultivated lymphocytes were also conducted. Results: MSC from all analyzed sources were capable to inhibit lymphocyte proliferation. Adipose MSC were capable to induce Treg phenotype and decrease T CD8+ limphocytes. Conclusion: Cell culture and therapy with MSC present many paradigms and we address to some of those to elucidate the possible most efficient source.

O Transplante de Células Tronco Hematopoiéticas (TCTH) baseia-se no princípio de infusão de Células Tronco Hematopoiéticas (CTH) CD34 + num receptor condicionado. Sabe-se que tais células são capazes de gerar uma nova hematopoiese bem como que o benefício do aumento de dose de CD34 + estende-se de aproximadamente 2 x 106 CD34/Kg a 5 x 106 CD34/Kg do receptor. A determinação do número de CD34 baseia-se no número total de CD34, porém sabe-se que apenas uma pequena porção celular do grupo de CD34 está associada à recuperação medular. Uma maneira de refinar a detecção desse grupo de células quando comparado com a quantificação do CD34 total, é a análise citométrica dos padrões de tamanho e granularidade citoplasmática. No contexto do TCTH autólogo e algumas vezes no TCTH alogênico, onde a infusão das células precursoras é feita com intervalo superior a três dias após a sua coleta, o congelamento das CTH CD34 +as faz-se necessário para que as células permaneçam viáveis. O agente crioprotetor mais comumente usado é o Dimetilsulfóxido (DMSO), que em temperaturas extremamente baixas protege as CTH da morte celular, porém em temperatura ambiente torna-se tóxico. As reações adversas do receptor no momento da infusão são atribuídas, em geral, ao DMSO. Portanto existem diferentes protocolos de congelamento de CTH que usam diferentes concentrações desse agente, com o intuito de reduzir as reações adversas e, ao mesmo tempo, evitar a morte celular decorrente de temperaturas baixas. Alguns estudos concluem que a viabilidade das CTH congeladas pode ser mantida com concentrações baixas de DMSO ou com celularidade elevada nos produtos congelados. Além do DMSO, a albumina e o Hidroxetilamido (HES) são usados como adjuvantes na proteção celular ao frio. Alguns protocolos de criopreservação usam apenas o DMSO enquanto outros indicam a necessidade do uso dos três agentes juntos. Não há consenso a respeito do protocolo de criopreservação ideal. Um expressivo número de trabalhos sugere o uso do DMSO 5 a 10% juntamente com a albumina 20% e HES 6% em enxertos com celularidade até 3 x 108 células nucleadas/ml, porém existem sugestões de protocolos diferentes desse padrão que usam o DMSO como agente único assim como concentrações menores de DMSO. Com relação ao efeito tóxico do DMSO, os eventos adversos do paciente no momento da infusão são atribuídos diretamente a ele. Porém evidências recentes apontam outras possíveis causas: citocinas liberadas durante o período de armazenamento e infundidas com o enxerto e micro-agregados leucocitários decorrentes da elevada celularidade do enxerto. O presente estudo pretendeu verificar a viabilidade das CTH através da medida da Anexina-V e 7-AAD pela técnica de citometria de fluxo usando-se diferentes concentrações de DMSO, bem como comparou tal desfecho entre amostras que foram congeladas apenas com DMSO e amostras congeladas com DMSO, HES e albumina. Além disso, foram verificados os níveis de citocinas inflamatórias nos enxertos e sua relação com a concentração de DMSO. / Bone Marrow Transplantation (BMT) is based on the principle of hematopoietic CD34 stem cells infusion in a conditioned recipient. It is known that such cells are capable of generating a new hematopoiesis, as well as known that the benefit of the increase of CD34 dose is goes best when it is between from 2 and to 5 x 106 CD34 by patient’s body weight. The CD34 determination is based on the total CD34 number. However it is known that only a small portion of the CD34 population is related to the marrow repopulating capacity. An alternative way of detecting such cells when compared to total CD34 dose is the cytometric analysis of citoplasmatic granularity and size patterns. In the autologous BMT context and, sometimes in the allogeneic type where the graft infusion occurs more than three days after the graft harvest, the CD34 cells freezing is necessary to keep their viability. The crioprotective agent most commonly used is the DMSO, which at extremely low temperatures this agent protects the CD34 cells from dying. However at temperatures above 30°C it became toxic and causing adverse events in the patient receiving them. The adverse reactions at the infusion moment in general are linked to DMSO, thus there are some different cryopreservative protocols using different DMSO concentrations aiming to reduce the incidence of collateral damage and at the same time avoid the CD34 from dying at low temperatures. Some studies conclude that CD34 viability can be maintained with the use of high mononuclear cellularity in the graft or with low DMSO concentrations. Besides DMSO, albumin and Hydroxietilstarch (HES) are cryoprotectants adjuvants. Some Cryopreservation protocols only use DMSO as cryoprotective agent, while others indicate the three agents together. There is no consensus about the ideal cryopreservation protocol. An important number of studies suggests the use of DMSO 5 to 10% with albumin 20% and HES 6% in grafts with cellularity number of no more than 3 x 108 cells/ml, however there are some new different protocols that use DMSO alone and at lower concentrations. As to adverse events during the infusion moment, it is known that DMSO causes the effects. However, there are evidences that other causes could cause these events: cytokines released during the storage freezing time and infused with the graft and leukocyte micro-clots caused by the high cellularity in the graft. The present study aimed to study the viability of CD34 cells using the Annexin-V and 7-AAD apoptosis reagents through the flow cytometry technique in different DMSO concentrations as well as compared such outcome among the samples only frozen with DMSO and samples frozen with DMSO, HES and albumin. Besides, it was verified the inflammatory cytokine levels and their relationship with the DMSO concentration.

Orientador: Sandra Cecilia Botelho Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-09T12:05:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Parola_DanielaCorte_M.pdf: 2987280 bytes, checksum: 06dcaf150379c56fac854a42d4bc3453 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O membro protótipo da subfamília dos betaherpesvírus, o citomegalovírus humano (HCMV), é o patógeno mais importante em pacientes transplantados, incluindo aqueles que receberam células de medula óssea ou enxerto de células tronco. Testes diagnósticos para identificar precocemente a infecção ativa pelo HCMV e uma terapia antiviral pré-clínica são medidas significantes para o controle desse vírus. Dois betaherpesvírus descobertos recentemente, o herpesvírus humano 6 (HHV-6) e o herpesvírus humano 7 (HHV-7) são geneticamente mais próximos um ao outro do que ao HCMV. Ambos têm alta prevalência na população em geral. Esses vírus não são tão patogênicos quanto o HCMV, porém o HHV-6 pode causar doenças como encefalite, hepatite e supressão da medula óssea. O objetivo do presente estudo foi avaliar o impacto clínico desses três vírus em transplantados de medula óssea. A monitorização pela N-PCR é importante método precoce para o controle da infecção ativa ou da doença pelo HCMV. A reação em cadeia da polimerase tipo nested (N-PCR) foi utilizada prospectivamente na monitorização de 43 pacientes para identificar as infecções ativas e a doença causada pelo HCMV, HHV-6 e HHV-7 por um período superior a 150 dias pós-transplante. Quarenta e um pacientes receptores adultos de células de medula óssea ou células tronco, com doença maligna e dois pacientes com doença não-maligna foram incluídos nesse estudo. Aciclovir foi administrado em baixas doses, como terapia profilática para infecção por herpesvírus tipo 1. Pacientes com infecção ativa por HCMV receberam terapia pré-clínica com ganciclovir. As incidências de positividade para infecção ativa por HCMV no sangue periférico, HHV-6 e HHV-7 no soro detectadas por N-PCR foram de 72%, 4,6% e 13,9%, respectivamente. A doença por HCMV ocorreu em 8 dos 43 pacientes (18,9%), no trato gastrintestinal e todos apresentaram N-PCR positiva para infecção por HCMV e um apresentou N-PCR positiva para HHV-6 no soro. Nenhum dos pacientes com doença por HCMV apresentou infecção ativa por HHV-7. A infecção ativa foi por HHV-6 e HHV-7 foi baixa em nossa casuística. A doença por HCMV permanece a mais a causa mais importante de impacto clínico após o transplante de medula óssea. Estudos adicionais necessitam serem feitos para uma melhor compreensão da relação entre os herpesvírus HCMV, HHV-6 e HHV-7 nos pacientes transplantados de medula óssea e células tronco periféricas / Abstract: The prototype member of the Betaherpesvirus subfamily, human cytomegalovirus (HCMV), is the most important infectious pathogen in transplant recipients, including those receiving bone marrow (BM) or stem cell (SC) grafts. Rapid diagnostic tests to identify active CMV infection, and pre-emptive therapy are significant improvements in the management of CMV. Two newly identified betaherpesviruses, human herpesvirus-6 (HHV-6) and human betaherpesvirus-7 (HHV-7), are genetically more closely related to each other than to CMV. Both are highly prevalent in the general population. These viruses are not as pathogenic as CMV but HHV-6 can cause disease such as encephalitis, hepatitis and bone marrow suppression. The aim of this study was to evaluate the clinical impact of these three viruses in bone marrow and stem cell transplantation patients. Monitorization with Nested-PCR is important in the control of active CMV infection or disease. Nested polymerase chain reaction (N-PCR) was used prospectively to monitor 43 patients for evidence of active infections and diseases caused by HCMV, HHV-6 and HHV-7 for up to 150 days after transplant. Forty-one adult recipients of BM or SC graft with malignant diseases and two patients with non-malignant diseases, and with a risk for CMV disease (D+/R+; D+/R-) were enrolled in this study. Aciclovir was used before the transplant at low doses, as prophylactic therapy for HHV-1. Patients with active CMV infections received pre-emptive therapy with ganciclovir. The incidence of positive active HCMV in blood, HHV-6 and HHV-7 in serum detected by Nested-PCR was 72%, 4.6% and 13.9%, respectively. HCMV disease occurred in 8/43 patients (18.6%), in the gastrointestinal tract and all presented positive N-PCR for active HCMV infection and one presented active infection by HHV-6 detected in serum. None of the patients presented active HHV-7 infection. Co-infection by HHV-6 and HHV-7 was low. CMV disease remains the most important disease after BMT. Future studies can be made to a better understanding in relationship between HCMV, HHV-6 and HHV-7 in BM or SC transplantation recipients / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica