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Estudos funcionais de uma possível cisteíno protease de Xanthomonas axonopodis pv. citri.

Santos, Guilherme Rodrigo Reis Monteiro dos 27 February 2007 (has links)
Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissGRRMS.pdf: 1511728 bytes, checksum: 7d61e2ac2b83bcccf28d5a1ace492dca (MD5) Previous issue date: 2007-02-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / Cysteine proteases are enzymes found in many organisms and are characterized by the presence of cysteine residue in their active site. These proteases play an important role in the organism metabolism. In pathogenic organisms, for example, cysteine proteases may be involved in the pathogenicity process by unbalancing of the biological functions of the host (biochemical and physiological regulation). Since they are involved in several diseases, these enzymes have been considered of great interest for many researchers. The current work aims to express in E. coli a recombinant form of an ORF XAC2853 predicted to be a cysteine protease by annotation of the genome of Xanthomonas axonopodis pv citri. This bacterium is responsible for citrus canker, an infection affecting citrus species which can be evidenced by superficial lesions and early fall of leaves and fruits, thus resulting in significant losses to world agriculture. After expression, the protein was purified by nickel column affinity chromatography and inclusion body solubilization, inasmuch as this protein is almost fully insoluble. The purified protein was used to investigate the activity against such synthetic substrates as Z-FR-MCA and Z-RR-MCA, and no proteolytic activity was found. However, studies in vivo using clones of E. coli expressing the recombinant protein evidenced proteolytic activity against casein. In an attempt to demonstrate the involvement of this probable protease in the pathogenicity of Xac, the knockout of the cromossomal gene in Xac was performed. A mutant having the disrupted gene was obtained and characterized. The assays of the mutant growth, when compared with the wild strain, indicate that the cysteine protease may be involved in the pathogenicity of Xac, since the inactivation of its gene by the transposon insertion resulted in a less virulent strain. In this sense, this protein may be a promising target for the combat of citrus canker. / As cisteíno proteases são enzimas presentes nos diferentes organismos e são caracterizadas pela presença de um resíduo de cisteína em seu sítio ativo. Essas proteases apresentam relevante papel no metabolismo desses organismos. No caso de organismos patogênicos, por exemplo, podem estar envolvidas no processo de patogenicidade por gerar o desequilíbrio das funções biológicas do hospedeiro (regulação bioquímica e fisiológica). Por esta razão, essas enzimas tem sido alvo de grande interesse por parte dos pesquisadores, uma vez que se encontram envolvidas em diversas doenças. Neste trabalho visamos à expressão em E. coli da forma recombinante de uma ORF XAC2853 predita como uma cisteíno protease na anotação do genoma de Xanthomonas axonopodis pv citri. Esta bactéria é responsável pelo cancro cítrico, uma infecção que afeta citros, caracterizando-se pelo aparecimento de lesões superficiais e queda precoce de folhas e frutos, resultando em grandes perdas para a agricultura mundial. Uma vez expressa a proteína, a mesma foi purificada por afinidade em coluna de níquel assim como pela solubilização dos corpos de inclusão, pois esta proteína encontra-se quase que exclusivamente insolúvel. A proteína purificada foi utilizada nos estudos de atividade contra os substratos sintéticos Z-FR-MCA e Z-RR-MCA não sendo verificada atividade proteolítica. No entanto, estudos de atividade realizados in vivo, com clones de E. coli expressando a proteína recombinante, demonstraram atividade proteolítica contra a caseína. Na busca de demonstrar o envolvimento desta provável protease na patogenicidade de Xac, foi realizado o nocaute do gene cromossomal que a codifica na bactéria. Um mutante com o gene inativado pela inserção de um transposon foi obtido e caracterizado, e os ensaios de crescimento desse mutante, comparado com o crescimento da linhagem selvagem, permitem concluir que a cisteíno protease estudada pode estar envolvida na patogenicidade de Xac, uma vez que a inativação do seu gene pela inserção do transposon gerou uma linhagem menos virulenta. Desta forma, esta proteína pode ser um alvo promissor para o combate ao cancro cítrico.
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Influência de alterações genéticas, do fluconazol e de enzimas hidrolíticas na matriz extracelular de biofilmes de candida susceptível e resistente a fluconazol /

Panariello, Beatriz Helena Dias. January 2017 (has links)
Orientador: Ana Cláudia Pavarina / Abstract: Biofilmes formados por Candida estão relacionados a infecções bucais, como a candidíase. Embora a resistência do biofilme seja multifatorial, a proteção exercida por sua matriz extracelular (MEC) é importante para os altos níveis de resistência a drogas antifúngicas. O conhecimento dos princípios estruturais da MEC possibilita maior compreensão de como atuar para desorganizá-la e melhorar a difusão de agentes antifúngicos para que atinjam mais eficientemente o biofilme, além de, futuramente, possibilitar o desenvolvimento de terapias mais eficazes para o controle da formação de biofilmes. Sendo assim, os objetivos principais deste estudo foram: (1) verificar a influência da inativação de genes envolvidos na filamentação (EFG1 e TEC1) em características estruturais dos biofilmes e na produção de componentes da MEC; (2) verificar a influência do fluconazol (FLZ) na MEC de biofilmes de Candida albicans ATCC 90028 (susceptível a fluconazol- CaS), C. albicans ATCC 96901 (resistente a fluconazol- CaR), Candida glabrata ATCC 2001 (susceptível a fluconazol- CgS) e C. glabrata ATCC 200918 (resistente a fluconazol- CgR) e (3) estudar a ação de enzimas hidrolíticas (DNase, Dextranase e β-glucanase individualmente ou em diferentes combinações) sobre a MEC de biofilmes de CaS e CaR. Biofilmes maduros (48 horas) foram analisados através de contagem de unidades formadoras de colônia (ufc/mL), peso seco total, peso seco insolúvel e proteínas insolúveis. Os componentes da MEC- polissacarídeos... (Complete abstract click electronic access below) / Resumo: Biofilms formed by Candida are related to bucal infections, such as candidiasis. Although the biofilm resistance is multifactorial, the protection exerted by its extracellular matrix (ECM) is essential for its high levels of resistance to antifungals. The knowledge of the structural principles of the ECM permits a better understanding of how to disorganize the ECM and improve the diffusion of antifungal drugs to reach the biofilm. Moreover, the study of the ECM may enable the development of more effective therapies to control biofilm formation. Thus, the main objectives of this study were: (1) to verify the influence of the inactivation of genes involved in filamentation and structural characteristics of the biofilms (EFG1 and TEC1) on the production of ECM components; (2) to verify the influence of fluconazole (FLZ) on the biofilms' ECM of Candida albicans ATCC 90028 (fluconazole-susceptible: CaS), C. albicans ATCC 96901 (fluconazole-resistant: CaR), Candida glabrata ATCC 2001 (fluconazolesusceptible: CgS) and C. glabrata ATCC 200918 (fluconazole-resistant: CgR) and (3) to study the action of hydrolytic enzymes (DNase, Dextranase and β-glucanase individually or in different combinations) on the ECM of CaS and CaR biofilms. Mature biofilms (48 hours) were analyzed by colony counting forming units (cfu/mL), total dry weight, insoluble dry-weight and total proteins. ECM components- alkali-soluble polysaccharides (ASPs), water-soluble polysaccharides (WSPs), extracellular DNA (e... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor
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Frequência alélica do polimorfismo de nucleotídeo único c.2032g>a no gene plod1, responsável pela síndrome da fragilidade cutânea equina

Dias, Natalia Moraes. January 2018 (has links)
Orientador: Alexandre Secorun Borges / Resumo: A síndrome da fragilidade cutânea equina, conhecida como warmblood fragile foal syndrome (WFFS), é uma enfermidade do tecido conjuntivo de caráter autossômico recessivo e é caracterizada clinicamente por lesões cutâneas e mucosa da cavidade oral, articulações hiperextensíveis e abortamento. Tais características são incompatíveis com o desenvolvimento dos animais afetados. O polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) c.2032G>A no gene PLOD1 (procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1) em homozigose é responsável pela enfermidade em equinos de raças com aptidão para esportes equestres olímpicos. Existe apenas um caso publicado de um potro afetado com a confirmação da mutação, na Suíça, e apenas dois estudos de prevalência do SNP causador da doença, na Alemanha e nos Estados Unidos. Casos descritos com sinais clínicos compatíveis com a enfermidade e descritos antes da mutação ser descoberta estão presentes na literatura. Atualmente as associações de equinos na Europa tem dado grande atenção para esta enfermidade em equinos warmblood. A escassez de estudos e de informações sobre a existência da enfermidade no Brasil e no mundo leva-nos a acreditar que a mesma possa ser subdiagnosticada em nosso e nos outros países. O objetivo desse estudo foi estimar a frequência alélica do SNP c.2032G>A no gene PLOD1 em equinos da raça BH no Brasil, utilizando a reação em cadeia de polimerase e o sequenciamento direto da região do SNP como metodologia diagnóstica. Foram coletadas amostras d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Warmblood fragile foal syndrome (WFFS), is a connective tissue disease that presents an autosomal recessive character and is clinically characterized by cutaneous lesions, lesions in the gums and mucosa of the oral cavity, hyperextensible joints and abortions. Such characteristics are incompatible with the development of the affected animals. The single nucleotide polymorphism (SNP) c.2032G> A in the PLOD1 gene (procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5- dioxygenase 1) in homozygosis is responsible for the disease. There is only one report, describing an affected foal and the mutation in Switzerland and there are two studies of prevalence of the causative SNP of the disease (one in Germany and the other in the United States). Cases report presenting clinical signs compatible with the disease and described before the mutation was discovered are present in the literature. Currently the equine associations in Europe are giving great attention to this disease in warmblood horses. The scarcity of studies and information about the existence of the disease in Brazil and in the world leads us to believe that it can be underdiagnosed in our and in other countries. The objective of this study was to estimate the allelic frequency of c.2032G>A SNP in the PLOD1 gene in Brazilian Sport Horses in Brazil, using the polymerase chain reaction and the direct sequencing of the SNP region as a diagnostic tool. Blood and hair bulb samples were collected from 374 animals for DNA extraction, subsequent ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre
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Mutações no gene DNMT3A em pacientes com leucemia mielóide aguda no Rio Grande do Sul, Brasil

Silva, Annelise Martins Pezzi da January 2012 (has links)
Introdução: A Leucemia Mielóide Aguda (LMA) é uma neoplasia complexa e heterogênea do tecido hematopoético, causada por mutações, desregulação da expressão gênica e modificações epigenéticas. Vários marcadores moleculares têm sido descritos para LMA, auxiliando a estratificação dos pacientes em grupos de risco. Recentemente, mutações em DNMT3A foram identificadas em 22.1% dos pacientes com LMA, estando independentemente associadas com pior prognóstico. Objetivos: Determinar a freqüência de mutações somáticas no gene DNMT3A e principais translocações cromossômicas em uma amostra de pacientes com LMA, correlacionando com dados clínicos Métodos: Foram pesquisadas, em 82 amostras de medula óssea de portadores de LMA atendidos no Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS, Brasil, para mutações somáticas no gene DNMT3A por seqüenciamento e principais transcritos de fusão por RT-PCR. Resultados: A freqüência de mutações no gene DNMT3A foi de 8%(6) sendo 3 do tipo R882H. A freqüência relativa dos transcritos de fusão oriundos das translocações t(8;21), t(15;17), t(9;11) e inv16, respectivamente foram: 6,1%(5), 14,6% (12), 0%(0) e 2,4%(2). Conclusão: A descoberta de mutações recorrentes no gene DNMT3A e sua possível implicação prognóstica pode ser um instrumento valioso para a tomada de decisões terapêuticas. Que nos conste, este é o primeiro estudo sobre a presença de mutações somáticas do gene DNMT3A em portadores de LMA no Brasil. Embora em uma amostra relativamente pequena, a freqüência encontrada destas mutações foi inferior à relatada para pacientes caucasianos, sugerindo uma possível variação etnico-geográfica. / Introduction: Acute Myeloid Leukemia (AML) is a complex and heterogeneous neoplasm hematopoietic tissue, caused by mutations, dysregulation of gene expression and epigenetic modifications. Several molecular markers have been described for AML, helping to classify patients into risk groups. Recently, mutations in DNMT3A were identified in 22.1% of patients with AML and these independently associated with poor prognosis. Aims: Determine the frequency of somatic mutations in the gene DNMT3A and major chromosomal translocations in a sample of patients with AML, correlating with clinical data. Methods: We investigated in 82 samples of bone marrow or peripheral blood of patients with AML treated at the Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Brazil, for somatic mutations in DNMT3A gene by sequencing and major fusion transcripts by RT-PCR. Results: The frequency of mutations in the DNMT3A gene was 8%(6) 3 being type R882H. The relative frequency of fusion transcripts arising from translocation t(8;21), t(15;17), t(9;11) and inv16, respectively were: 6,1%(5), 14,6% (12), 0%(0) and 2,4%(2). Conclusion: The discovery of recurrent mutations in the DNMT3A gene and its possible prognostic implications can be a valuable tool for making treatment decisions. From what we have recorded, this is the first study on the presence of somatic mutations of the DNMT3A gene in patients with AML in Brazil. Although in a relatively small sample, the frequency of these mutations was found lower than that reported for Caucasian patients and similar to that observed in Asian patients, suggesting a possible ethno-geographic variation.
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Avaliação de marcadores de prognóstico e da mutação JAK2V617F na evolução de pacientes com leucemia linfóide aguda da infância no estado da Bahia- Brasil

Cézar, Rodrigo Silva 15 April 2011 (has links)
Submitted by Pós graduação Farmácia (ppgfar@ufba.br) on 2017-05-25T20:18:39Z No. of bitstreams: 1 Rodrigo Cézar.pdf: 1114560 bytes, checksum: 3cd09c1374e1f274c1ea9cf3d557f3a6 (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barroso (pbarroso@ufba.br) on 2017-06-01T17:35:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Rodrigo Cézar.pdf: 1114560 bytes, checksum: 3cd09c1374e1f274c1ea9cf3d557f3a6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-01T17:35:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigo Cézar.pdf: 1114560 bytes, checksum: 3cd09c1374e1f274c1ea9cf3d557f3a6 (MD5) / FAPESB e CNPq / Avaliação de marcadores de prognóstico e da mutação JAK2V617F na evolução de pacientes com leucemia linfóide aguda da infância no estado da Bahia Brasil. Rodrigo Silva Cezar. A leucemia linfóide aguda (LLA) da infância é uma neoplasia do sistema hematopoiético, de natureza clonal, com incidência elevada entre dois (2) e cinco (5) anos de idade. No Brasil estima-se a ocorrência de 9540 casos de leucemias por ano, sendo 450 no estado da Bahia. O diagnóstico é realizado pela análise morfológica e imunofenotipagem da medula, visando classificar a linhagem celular envolvida. O tratamento da LLA evoluiu muito nos últimos anos e, a taxa de cura está acima de 80%. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os dados hematológicos, imunofenotípicos e da pesquisa da mutação JAK2V617F correlacionando-os aos aspectos clínico-laboratoriais apresentados na evolução entre o diagnóstico e tratamento de pacientes com LLA da infância provenientes da Bahia. A casuística foi composta por 37 pacientes com idade entre nove meses e 14 anos, sendo 15 (40,5%) do sexo feminino e 22 (59,5%) do masculino, tratados pelo protocolo 93 do Grupo Brasileiro para o Tratamento de Leucemia na Infância. O perfil hematológico e imunofenotípico dos pacientes foram realizados ao diagnóstico e durante o tratamento, além da pesquisa da mutação JAK2V617F pela técnica de PCR; os dados clínico-laboratoriais foram obtidos dos prontuários médicos. Trinta e três (89,2%) pacientes foram classificados como LLA-B e 4 (10,8%) como LLA-T. Sete (18,9%) pacientes apresentaram aberrações fenotípicas com expressão de marcadores mielóides (CD13 e CD33); dois (5,4%) pacientes foram estadiados como Risco Básico Verdadeiro; 14(37,8%) como Risco Básico e, 21(56,8%) como Risco Alto. Os sinais e sintomas mais frequentes ao diagnóstico foram anemia, hepatomegalia, esplenomegalia, linfonodomegalia, sendo que o tempo entre o surgimento dos sintomas até a ida ao serviço médico de referência foi de sete a 180 dias. Seis pacientes (cinco LLA-B e um LLA-T) apresentaram infiltração do sistema nervoso central (SNC) ao diagnóstico. A mediana de leucócitos ao diagnóstico foi de 7.010 e 47.515/mm3 no grupo LLA-B e T, respectivamente. Os pacientes com marcação positiva para CD20 (18%) apresentaram aumento de leucócitos, e diminuição de plaquetas ao diagnóstico (p= 0,018 e 0,017, respectivamente). A co-expressão do CD10 e CD19 foi encontrada em 60,5% dos pacientes e foi relacionada à contagem elevada de leucócitos e blastos (MO) e diminuída de plaquetas ao diagnóstico (p = 0,033; 0,029 e 0,028, respectivamente). A presença da hepatomegalia (60,6%) foi associada a contagem diminuída de plaquetas ao diagnóstico (p= 0,020) e no 7o (p= 0,010) e 14o (p=0,010) dia do tratamento. A mutação JAK2V617F não foi encontrada na casuística do estudo, mas 60% dos pacientes investigados apresentaram a deleção de uma timina em heterozigose no gene JAK2. Seis pacientes evoluíram a óbito durante o estudo, sendo os mesmos que apresentaram recaídas da doença, com mediana de tempo até a recaída de 28,5 meses A sobrevida global em seis anos do grupo foi de 66,9% + 3,25, sem diferença significativa entre os grupos de LLA- B e T. Neste estudo, o CD20 foi expresso em apenas 18,2% dos pacientes, diferente de outros estudos; além disso, a presença do CD20 foi associada ao aumento de leucócitos ao diagnóstico, considerado como marcador de risco e preditor de recaída. A co-expressão do CD10 e CD19 foi associada ao perfil desfavorável dos pacientes ao diagnóstico. Os perfis imunofenotípico e hematológico apresentados pelos pacientes com LLA mostraram diversidade de marcadores, com descrição de fenótipos aberrantes, sugerindo o papel importante desses marcadores na classificação de risco e no prognóstico da doença e não somente na caracterização da linhagem celular envolvida. A presença da deleção no gene JAK2 requer estudos adicionais que comprovem o provável envolvimento no mecanismo de patogênese da LLA. / Evaluation of prognosis marker and the mutation JAK2V617F in evolution of Childhood Acute lymphoblastic leukemia patients from the state of Bahia, Brazil. Rodrigo Silva Cézar. Childhood Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is hematopoietic neoplasia of clonal origin, with a high incidence between 2 and 5 years of age. In Brazil the occurrence of leukemia is estimated as a 9540 cases per year, with 450 in the state of Bahia. The diagnosis is developed by morphologic and immunophenotypic analysis of bone marrow in order to classify the cell lineage involved. The treatment of ALL has been greatly evolved over the last years and the current protocols are achieving a cure rate under 80%. The aims of this study was characterize hematologic and immunophenotypic finding and search the JAK2V617F mutation among children with ALL in Bahia, correlating those with clinical and laboratory aspect presented during the clinical evolution at diagnosis and treatment. A total of 37 patients was studied, aging between nine months and 14 years; 15 (40.5%) were female and 22 (59.5%) male, that have been treated by the 93 protocol of the Brazilian Group for Treatment of Childhood Leukemia. Blood and immunophenotypic patient’s profiles were investigated at diagnosis and during treatment, beyond the search of the JAK2V617F mutation by PCR; clinical and laboratorial data were obtained from medical records. Thirty-three (89.2%) patients were classified as B-ALL and 4 (10.8%) as T-ALL. Seven (18.9%) patients showed phenotypic aberrations with expression of myeloid markers such as CD13 and CD33; two (5.4%) patients were staged as True Basic Risk; 14 (37.8%) as Basic Risk and 21 (56.8%) as High Risk. The most common signs and symptoms at diagnosis were anemia, hepatomegaly, splenomegaly, lymphadenopaty, and the time between the onset of symptoms and the search of a reference medical service was from seven to 180 days. Six patients (five B-ALL and one T-ALL) showed central nervous system (CNS) infiltration at diagnosis. The median value of White blood cells (WBC) at diagnosis was 7010 and 47515/mm3 in B-ALL and T-ALL groups respectively. CD20+ patients (18%) had a high WBC and low platelet counts at diagnosis (p = 0.018 and 0.017 respectively). Co-expression of CD10 and CD19 was found in 60.5% of patients and was associated with a high count of WBC and bone marrow blasts and low platelets at diagnosis (p = 0.033, 0.029 and 0.028 respectively). The presence of hepatomegaly (60.6%) was associated with a low platelet count at diagnosis (p = 0.020) and at 7th (p = 0.010) and 14th (p = 0.010) days of treatment. The JAK2V617F mutation was not found among studied patients, but 60% exhibited a heterozygous deletion of a thymine in JAK2 gene. Six patients died during the study and were the same who had relapse of disease, with median relapse time of 28.5 months. A six year’s overall survival tax was 66.9% + 3.25, and had no statistically significant difference between groups with B and T-ALL. The CD20 was expressed in only 18.2% of ALL patients unlikely other studies. In addition, the CD20 presence was associated with a high WBC counts at diagnosis, which has been considered as a risk marker and predictor of relapse. Co-expression of CD10 and CD19 was associated with an unfavorable clinical profile at diagnosis. Hematologic and immunophenotypic profiles of childhood ALL patients showed great diversity of markers, with description of aberrant phenotypes, suggesting an important role of those for risk and prognosis stratification of the disease and not only for the lineage characterization. The description of the JAK2 deletion requires additional studies showing a possible involvement of this genetic alteration at the ALL pathogenesis.
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Obtenção de mutantes de bactérias psicrotróficas isoladas de leite deficientes na produção de molécula sinal de quorum sensing / Production of psychotrophic bacteria mutants isolated from milk lacking the signal molecule de quorum sensing

Campos, Maria Emilene Martino 30 July 2008 (has links)
Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-06-28T09:33:23Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1338198 bytes, checksum: 5403979ea8250d61a6a0c78ac9f2e904 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-28T09:33:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1338198 bytes, checksum: 5403979ea8250d61a6a0c78ac9f2e904 (MD5) Previous issue date: 2008-07-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Quando em alta densidade populacional, muitas bactérias são capazes de coordenar a expressão de genes via produção e recepção de sinais químicos, por meio de mecanismo denominado quorum sensing. O objetivo deste trabalho foi obter mutantes HalI - das estirpes psicrotróficas isoladas do leite cru refrigerado, 068 e 071 de Hafnia alvei e 067 de Enterobacter cloacae. O gene halI codifica a sintase responsável pela produção de acil homoserina lactonas (AHLs) que são as moléculas sinalizadoras de quorum sensing em H. alvei e E. cloacae. Para obtenção dos mutantes, foi utilizado o vetor suicida pGP704, onde foi clonado o gene halI. Em seguida este gene foi interrompido com o gene que codifica a proteína gentamicina- 3-acetiltransferase, que confere resistência ao antibiótico gentamicina e o plasmídeo foi denominado pGP704halI068::Gm. A transformação das estirpes psicrotróficas com esse vetor resultou em transformantes resistentes a 25 μg mL -1 de gentamicina, mas que ainda produziam AHL, constatada por meio da indução da estirpe monitora de AHL, Chromobacterium violaceum CV 026. A inativação da expressão do gene halI no DNA cromossômico foi obtida após nova transformação desses transformantes com o vetor pUT::Tn5, pertencente ao mesmo grupo de compatibilidade de pGP704. O uso deste sistema de incompatibilidade propiciou a seleção de estirpes onde ocorreu a recombinação homóloga entre o gene halI interrompido pelo gene que confere resistência a gentamicina com o gene halI presente no DNA cromossômico. A confirmação da recombinação do gene halI inativado e clonado no plasmideo com o gene halI cromossômico, foi feita selecionando-se os transformantes em ágar Luria Bertani contendo 50 μg mL -1 de canamicina e gentamicina. Por ensaio de indução de C. violaceum CV026, foi confirmado que os transformantes resistentes a canamicina e gentamicina não induziram a produção do pigmento violaceína pela estirpe monitora. A inativação do gene halI no cromossoma torna essas estirpes ferramentas importantes para elucidação da regulação da expressão de genes pelo mecanismo de quorum sensing. / When population density is high, several bacteria are able to coordinate gene expression by production and reception of chemical signals by means of a mechanism called quorum sensing. The scope of this work was to produce HalI - mutants from psychotrophic bacterias found in fresh cooled milk, 068 and 071 of Hafnia alvei and 067 of Enterobacter cloacae. The halI gene encondes the synthase responsible for the production of acyl-homoserine lactones (AHLs) which are the signaling molecules of quorum sensing for H. alvei and E. cloacae. In order to produce the mutants, it was used the suicide vector pGP704, where the halI gene was cloned. After that, this gene was interrupted with a gene that encodes the protein gentamicin 3-acetyltransferase, responsible for giving resistance to the gentamicin antibiotic. This vector was called pGP704halI068::Gm. The transformation of psychotrophic strain with such vector resulted in transformants cells resistant to 25 μg mL -1 of gentamicin, but they would still produce AHL. AHL production was confirmed by the induction of the monitored strain of AHL, Chromobacterium violaceum CV 026. Expression inactivation of the hall gene in the chromosomic DNA was achieved after new transformation of former transformants with the pUT::Tn5 vector, which belong to the same compatible group of pGP704. The use of this system of incompatibility provided the selection of strain that showed homologous recombination between the hall gene interrupted by the gene that affords resistance to gentamicin and the hall gene of the present chromosomal DNA. Recombination assurance of the halI gene inactivated and cloned in the plasmidium with the halI chromosomic gene was done by selecting the transformants in Luria- Bertani agar containing 50 μg mL -1 of kanamicyn and gentamicin. By means of an induction trial of C. violaceum CV026, it was confirmed that the transformants resistant to kanamicyn and gentamicin did not induced the production of the violacein pigment by the strain being monitored. Inactivation of the halI gene in the chromosome makes these strains important tools for elucidating gene expression regulation by the quorum sensing mechanism. / Dissertação antiga
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Caracterização molecular do genoma completo e parcial do Vírus da Hepatite B em pacientes com infecção crônica

Silva, Luiz Claudio Santana da [UNIFESP] January 2013 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2015-12-06T23:45:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Introdução: São Paulo e uma das cidades com maior diversidade populacional do mundo. Por causa disso, ela pode apresentar um perfil molecular do HBV diferente do restante do Brasil. Objetivos: Avaliar os genotipos e possiveis recombinantes; mutacoes relacionadas a resistencia aos antivirais, progressao da doenca hepatica e de escape vacinal em pacientes infectados na cidade de São Paulo. Pacientes e Metodos: Foram selecionadas amostras de plasma de 60 pacientes tratados e nao tratados infectados pelo HBV. Foi realizada a amplificacao e sequenciamento do genoma completo, mapeamento de mutacoes, analises filogeneticas para determinacao dos genotipos e deteccao de recombinantes. Resultados: Foram analisados 28 genomas completos e tambem 11 genomas parciais (HBsAg e o dominio de RT). A distribuicao de genotipos foi: A (51,3%), D (25,6%), F (15,4%) e C (7,7%). Mutacoes de resistencia primaria nao foram encontradas, no entanto, mutacoes compensatorias foram encontradas em 43% dos pacientes tratados e 12,5% nos pacientes nao tratados. Foram encontradas mutacoes relacionadas ao escape vacinal e alteracoes na antigenicidade do HBsAg (82%); mutacoes no gene C relacionadas com a progressao da doenca hepatica (85,7%) e delecoes na regiao Pre-S (14%). Conclusoes: A distribuicao de genotipos reflete o contexto historico e social da populacao da cidade de São Paulo, que e composta por imigrantes da Africa, Europa e Asia, e da migracao brasileira, em sua maioria procedente da Regiao Nordeste e Norte do Brasil. A maioria das mutacoes no gene S, que levam a alteracoes da antigenicidade do HBsAg, sao caracteristicas que distinguem os diferentes genotipos, o que poderia explicar a diferencia de antigenicidade entre eles. As Mutacoes A1762T/G1764A e G1896A em pacientes HBeAg positivos e delecoes nos codons de iniciacao na regiao Pre-S podem estar relacionados com populacoes virais nao majoritarias e necessita de mais estudos com as novas tecnologias de sequenciamento / BV UNIFESP: Teses e dissertações
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A resistência aos anti-retrovirais e a diversidade genética do HIV-1 no Brasil / Antiretrovirais resistance and HIV-1 genotypic diversity in Brazil

Munerato, Patricia [UNIFESP] 30 January 2008 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-01-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:50Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10912.pdf: 489538 bytes, checksum: a31cdbf32d17c5739e275f6c404f998e (MD5) / Item withdrawn by Andrea Hayashi (deachan@gmail.com) on 2016-01-22T14:04:18Z Item was in collections: Em verificação - Dissertações e teses (ID: 50) No. of bitstreams: 2 Publico-10912.pdf: 489538 bytes, checksum: a31cdbf32d17c5739e275f6c404f998e (MD5) Publico-10912.pdf.txt: 99064 bytes, checksum: 19968453e528a64deb0c57251df53017 (MD5) / Item reinstated by Andrea Hayashi (deachan@gmail.com) on 2016-01-22T14:06:22Z Item was in collections: Em verificação - Dissertações e teses (ID: 50) No. of bitstreams: 2 Publico-10912.pdf: 489538 bytes, checksum: a31cdbf32d17c5739e275f6c404f998e (MD5) Publico-10912.pdf.txt: 99064 bytes, checksum: 19968453e528a64deb0c57251df53017 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações
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Avaliação da resposta à teriparida em pacientes portadores de osteoporose pseudoglioma / Evaluation of response to teriparida in patients with osteoporosis pseudogliom

Arantes, Henrique Pierotti [UNIFESP] 24 November 2011 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-11-24 / INTRODUÇÃO: Osteoporose Pseudoglioma (OPPG) é uma doença rara, caracterizada por osteoporose grave de início juvenil, associada a múltiplas fraturas e anormalidades oculares. É causada por uma mutação inativadora no gene da “low–density lipoprotein receptor-related protein 5” (LRP5), que está envolvido na formação óssea. O papel inicialmente proposto para o LRP5 seria sua participação na formação de um complexo receptor, juntamente com as proteínas Frizzled e Wnt na membrana dos osteoblastos, que, quando ativados, promoveriam a estabilização da beta-catenina no citoplasma destas células e induziram a formação óssea. A teriparatida, por sua vez, é um medicamento anabólico que, portanto, atua sobre a formação óssea. Seu mecanismo de ação, entretanto, ainda não está completamente esclarecido. Em camundongos com mutação inativadora do LRP5 -/- o tratamento com teriparatida induziu a um incremento da BMD, semelhante ao obtido em camundongos (LRP5 +/+), sugerindo que o efeito anabólico do PTH não utilize a via de sinalização do LRP5. Esta constatação nos incentivou a tratar com teriparatida um de nossos pacientes portador de OPPG. Ao longo deste tratamento, entretanto, uma nova teoria sobre o papel do LRP5 surgiu, associando-o à produção de serotonina intestinal. OBJETIVOS: Avaliar eficácia terapêutica da teriparatida em um paciente adulto jovem com OPPG sobre DMO e marcadores de remodelação óssea, além de dosar serotonina sérica neste paciente, em seu irmão também afetado e em controles saudáveis. PACIENTE E MÉTODOS: Paciente masculino, 19 anos com amaurose congênita e fraturas não traumáticas desde a infância. Após 3 anos de infusões periódicas de pamidronato com resposta insatisfatória, foi iniciado a teriparatida 20 mcg/dia por via subcutânea uma vez ao dia, durante 24 meses. Amostras sanguíneas e urinárias foram coletadas em jejum pela manhã nos tempos basal e a cada 3 meses até o final do tratamento. Foram determinadas a relação do cálcio/creatinina em amostra isolada de urina e as dosagens séricas de Telopeptideo Carboxiterminal do colágeno Tipo I (CTX), Peptídeo Aminoterminal do Procolágeno Tipo I (P1NP), cálcio total e ionizado, fósforo, ácido úrico, hemograma, função hepática e renal. Densitometria óssea foi realizada por Dual energy X-ray absorptiometry (DXA) a cada 12 meses. Serotonina sérica foi dosado por ELISA (kit Fitzgerald Cat# 55R- RE59121) em um único momento, logo após o término do tratamento. RESULTADOS: Os parâmetros sanguíneos e urinários estavam normais no basal e durante o tratamento. Com relação aos marcadores bioquímicos do metabolismo ósseo, notamos aumento inicial nos valores do CTX, atingindo pico no terceiro mês. O P1NP começou a aumentar no sexto mês, com pico tardio no nono mês. Apesar deste padrão não usual de resposta dos marcadores, houve aumento de 9,7% na densidade mineral óssea (DMO) em coluna lombar comparado ao basal e de 10,2% em fêmur total. As concentrações de serotonina foram duas vezes e meia maior no paciente, comparado aos valores obtidos em indivíduos normais. CONCLUSÃO: Em um paciente com OPPG previamente tratado com pamidronato, teriparatida mostrou-se segura e capaz de induzir aumento substancial da DMO de coluna lombar e fêmur proximal. Os valores elevados de serotonina plasmática concordam com os relatos descritos na literatura em outros pacientes com OPPG, mas seu papel no controle da formação óssea ainda precisa ser melhor estabelecido. / INTRODUCTION: Osteoporosis Pseudoglioma (OPPG) is characterized by severe juvenile-onset osteoporosis and ocular abnormalities. It is caused by one of several inactivating mutations in LRP5, a gene importantly involved in bone formation. OBJECTIVE: The objective of this study was to evaluate the efficacy of teriparatide in a young man with OPPG. PATIENT AND METHOD: The subject of this case report is a 19-year-old man with congenital blindness and low trauma fractures due to OPPG. A 2-year course of teriparatide, 20 mcg/day, was initiated after a 6-year course of intravenous pamidronate infusions, the latter 3 years of which had minimal effects on bone mineral density (BMD). Measurements in serum were made of C-terminal telopeptide of type I collagen (CTX), N-terminal propeptide of type I collagen (P1NP), total and ionized calcium, phosphate, uric acid, complete blood count, renal and liver function tests. Urinary calcium/creatinine ratio was determined. BMD was measured by DXA yearly. RESULTS: BMD increased by 9.7% in lumbar BMD and 10.2% in right femur hip. CTX rose early, peaking in month 3, followed by an increase in P1NP, peaking in month 9. Both indices returned to baseline by month 24. The increase in CTX followed by P1NP is an unusual time course when teriparatide is used to treat osteoporosis but may be typical of low bone turnover states. There were no adverse events. CONCLUSION: In a patient with OPPG, teriparatide markedly increased BMD in the lumbar spine and femur hip. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações
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Caracterização clínica e molecular de pacientes com hipotireodismo congênito de Monte Santo-Bahia-Brasil / Caracterização clínica e molecular de pacientes com hipotireodismo congênito de Monte Santo-Bahia-Brasil

Oliveira, Taíse Lima de January 2010 (has links)
Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-08-30T20:27:31Z No. of bitstreams: 1 Taise Lima de Oliveira Caracterização clínica e molecular de pacientes com hipertireodismo....pdf: 583769 bytes, checksum: 1d1d8e16ece954c3ead88d0648b4eeea (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-30T20:27:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Taise Lima de Oliveira Caracterização clínica e molecular de pacientes com hipertireodismo....pdf: 583769 bytes, checksum: 1d1d8e16ece954c3ead88d0648b4eeea (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / O hipotireoidismo congênito (HC) é uma das doenças metabólicas mais comuns na infância, com incidência de HC é de 1:3.000 a 1:5.000 nascidos-vivos. Quando primário, o HC caracteriza-se por altos níveis de TSH podendo ser originado por disormonogênese, deficiente produção hormonal ou decorre de disgenesia tireoidiana, defeito embriológico que leva a agenesia, hemiagenesia ou ectopia. Na ausência do tratamento hormonal, o HC leva a grave retardo mental, além de outras alterações clínicas. A interação do hormônio TSH com o seu receptor (TSHR) tem importante função biológica estimulando o crescimento, diferenciação e função tireoidiana. Mutações no gene do TSHR têm sido identificadas como causa de HC hereditário ou congênito, mas parecem ser raras. Objetivos: 1) Obter genealogia das famílias afetadas para determinação do padrão de herança, identificação de afetados e possíveis portadores; 2) Descrever as características clínica-demográficas dos pacientes com HC; 3) Determinar a distribuição mutacional no gene do receptor do hormônio estimulante da tireoide (TSHR) nos afetados; 4) Sugerir ações de saúde pública e de otimização do aconselhamento genético. Material e Métodos: Foram estudados 12 pacientes provenientes de Monte Santo-BA, sendo oito diagnosticados pela triagem neonatal e quatro diagnosticados tardiamente durante expedição à cidade. Estes últimos foram identificados durante a coleta dos dados genealógicos das famílias dos afetados. Todos foram investigados para mutações no gene do TSHR. Toda a região codificadora do gene foi amplificada através do DNA genômico, seguido de SSCP e sequenciamento. Resultados: À época da primeira avaliação, os pacientes apresentaram níveis elevados de TSH, confirmando o caráter primário da doença, associados a sinais e sintomas do HC. Observou-se grande heterogeneidade clínica entre os pacientes mesmo aqueles com grau de parentesco muito próximo. Nenhuma mutação patogênica foi encontrada no gene TSHR. Conclusão: a análise das genealogias permitiu observar a heterogeneidade clínica e genética da doença. Não foi encontrada nenhuma mutação no gene TSHR. O estudo de outros genes poderá ajudar no esclarecimento do HC na região. / Congenital hypothyroidism (CH) is one of the most common metabolic disease in childhood, with an incidence of HC is 1:3,000 to 1:5,000 live births. When primary, CH is characterized by high levels of TSH and may be caused by dyshormonogenesis deficient hormone production, or due to thyroid dysgenesis, embryological defect that leads to agenesis, ectopic or hypoplastic. In the absence of hormonal treatment leads to the CH severe mental retardation and other clinical manifestations. The interaction of stimulanting thyroid growth, differentiation and function. Mutations in the TSHR gene have been identified as a cause of hereditary or congenital CH, but appear to be rare. Objectives: 1) Get genealogy of the affected families to detemine the pattern of inheritance, and possible identification of affected patients; 2) Describe the clinical and demographic characteristics of patients witc CH; 3) Determine the mutational distribution in the TSHR gene in the affected individuals; 4) Suggest public health actions and for genetic counseling optimization. Methods: We studied 12 patients from Monte Santo-Bahia, eight were diagnosed by newborn screening and four diagnosed late during an expedition to the city. The latter were identified during the collection of genealogical data of families those affected. All were investigated for mutations in the TSHR. The entire coding region of the gene was amplified using genomic DNA followed by SSCP and sequencing. Results: At first evaluation, all patients had elevated TSH levels, confirming the primary nature of the disease, associated with signs and/or symptoms of CH. As there was a familial recurrence of the disease, we noticed a large clinical heterogeneity among patients, even those with close family relationship. No pathogenic mutation was found in the TSHR gene. Conclusion: The analysis of pedigrees allowed to observe the clinical and genetic heterogeneity of the disease. We not found mutation in the TSHR. The study of other genes may help in clarifying the CH i the region.

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