Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The application and adaptation of pre-selection techniques to select individuals with traits of interest is of high importance with the breeding programs, as well as the gain selection in the populations studied. In populations that survived the pre-selection and middle selection, study the dissimilarities in genotypes is of high importance in order to identify and select superior individuals. The aim of this work is to study the effect of chemical induction of mutation with respect to the emergence of genetic variability in apomictic Brachiaria Brizantha genotypes, with the applying pre-selection for cold tolerance by calculating the estimated gain of selection within and among populations, also to behave studies on the dissimilarity of the mutants and commercial subjects after passing the scrutiny of environmental selection in two years of cultivation. The study was conducted in the city of Frederico Westphalen-RS, at the Laboratory of Genetic Breeding and Plant Production, UFSM. The study was behaved in a population of genotypes formed after chemical induction of Methyl Methane Sulfonate 0.5% in 50.000 seeds of commercial genotypes, that after soaking mutagen initiated germination and development process at low temperatures, which result in transplanted to field conditions for exposure selection, depending on the environmental conditions present in the environment in question. Survivors to scrutiny selective formed population of 35 individuals, which seeds were collected in his descendants for studies in M2 and M3 generations. Under conditions of controlled chamber was applied pre-selection of individual levels of cold 1 ° C, 0 ° C, 1 ° C and 2 ° C and 3 ° C in the same associations at 5 ° C to verify the response of genotypes, calculating the estimated gain selection within and among populations. Proceeded to study the genetic dissimilarity of accesses according to 21 variables by averaging Euclidian distance to verify genetic variability generated after chemical induction of mutation and selection of the medium on the genotypes. The pre-selection may be induced to select individuals with predisposition to tolerance at all levels of cold, however the selection gain was higher in the levels of cold 0 ° C and 1 ° C in association with extreme cold, so among populations the M2 generation had greater gain selection to the M3 generation due to higher this selection. There was high dissimilarity among genotypes studied, the 38 subjects studied was formed 18 groups. Of the 35 mutant genotypes, only one clustered together with the three commercial witness, indicating that the mutation induced genotypes better adaptation to growth at low temperatures and inflorescence production. / A aplicação e adequação de técnicas de pré-seleção para identificar indivíduos com caracteres de interesse possui elevada importância junto a programas de melhoramento genético, assim como o ganho de seleção nas populações estudadas. Em populações que sobreviveram a pré-seleção e seleção do ambiente, o estudo da dissimilaridade nos genótipos é de elevada importância, buscando identificar e selecionar indivíduos superiores. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito da indução de mutação química com o surgimento da variabilidade genética em genótipos apomíticos de Brachiaria brizantha, com aplicação de pré-seleção para tolerância ao frio calculando-se o ganho de seleção estimado dentro e entre populações, também proceder de estudos relativos a dissimilaridade dos indivíduos mutantes e comerciais, após passarem por seleção ambiental em dois anos de cultivo. O trabalho foi realizado, no município de Frederico Westphalen-RS, junto ao Laboratório de Melhoramento Genético e Produção de Plantas, UFSM. O estudo foi realizado com uma população de genótipos obtidos por indução química de Metil Metano Sulfonado a 0,5% em 50.000 sementes de genótipos comercias, após embebição do agente mutagênico iniciaram processo de germinação e desenvolvimento em baixas temperaturas, as quais em sequência transplantados em condições de campo para exposição a seleção, em função das condições edafoclimáticas presentes no clima em questão. Sobreviventes aos crivos seletivos formaram população de 35 indivíduos, que foram coletadas as sementes em seus descendentes para estudos nas gerações M2 e M3. Em condições de câmara controlada aplicou-se pré-seleção dos indivíduos nos níveis de frio a 1 °C, 0 °C, 1 °C, 2 °C e 3 °C e os mesmos em associações a 5°C para verificar a resposta dos genótipos, calculando-se o ganho de seleção estimado dentre e entre população. Procedeu-se do estudo da dissimilaridade genética dos acessos em função de 21 variáveis através da distância euclediana média para verificação da variabilidade genética gerada após indução de mutação química e seleção do meio sobre os genótipos. A pré-seleção pode ser induzidas para selecionar indivíduos com pré-disposição a tolerância em todos os níveis de frio, entretanto o ganho de seleção foi maior nos níveis de frio 0 °C e 1 °C em associação a frio extremo, assim entre populações a geração M2 teve maior ganho de seleção que a geração M3 em função da maior seleção presente. Houve elevada dissimilaridade entre genótipos estudados, dos 38 indivíduos estudados formou-se 18 grupos. Dos 35 genótipos mutantes, apenas um agrupou conjuntamente com as três testemunhas comerciais, indicando que a mutação induziu os genótipos a maior aclimatação para crescimento em baixas temperaturas e produção de inflorescências.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-03-07Bitstream added on 2014-06-13T18:19:52Z : No. of bitstreams: 1 fernandes_sc_me_jabo.pdf: 542693 bytes, checksum: f141575a6f8b47f554e2e0bf4870259f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Visando à contribuição ao estudo da oncologia e ao aumento da sobrevida de cadelas com neoplasias mamárias, o objetivo deste trabalho é investigar as possíveis alterações no gene supressor de tumor p53 em tumores de mama relacionando-as com a idade, raça, tipo histológico, número e localização da neoplasia, tempo de progressão e característica macroscópica do tumor (tamanho e presença de úlcera). Foram avaliadas 30 amostras de neoplasias de mama de cadelas. Este material foi distribuído em cinco grupos, de acordo com a classificação histopatológica do tumor (adenoma, tumor misto benigno, carcinoma, tumor misto maligno e sarcoma). O Grupo Controle compreendeu cinco amostras de tecido mamário sem alterações patológicas. As possíveis mutações existentes nos exons 5 a 8 do gene p53 foi analisado por meio da técnica de PCR (reação em cadeia de polimerase) e seqüenciamento. Foram observadas cinco mutações em neoplasias malignas e uma mutação em neoplasia benigna. Dessas mutações, todas eram “missense” e três delas eram do tipo “frameshift”. Comparando as mutações com os outros parâmetros clínicos, concluiu-se que alterações em p53 devem ser originadas em um estágio inicial na carcinogênese mamária canina e mutações em p53 podem estar relacionadas com a malignidade do tumor. / Aiming at the contribution for oncology’s study and the improvement of survival time of bitches with mammary neoplasm, the purpose of this research is investigate the possible alterations in tumor suppressor gene p53 in mammary neoplasm, relating then with age, breed, tumor histologic classification, neoplasm location (which mammary gland and if they are unique or multiples), progression time and neoplasm macroscopic characteristic (size and ulceration presence). Thirty canine mammary neoplasm patterns were evaluated. This material was distributed in five groups according to histologic classification of the tumor (adenoma, benign mixed tumor, carcinoma, malignant mixed tumor and sarcoma). The Control Group included five mammary tissue patterns with no pathological alterations. Possible mutations at 5 to 8 exons within p53 gene was analyzed by the PCR technique (“Polymerase Chain Reaction”) and sequencing. Five mutations were observed in malignant mammary neoplasm and one mutation in benign neoplasm. About these mutations, all were missense and three of them were frameshift. Comparing the mutations with the other clinical parameters, it was concluded that p53 alterations must be started in an initial stage in canine mammary carcinogenesis and p53 mutations can be related with the tumor malignancy.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Different forms of isolated GH deficiency (IGHD) have an autosomal recessive mode of inheritance. The most common one (type IB) is often caused by bi-allelic mutations in the GHRH receptor (GHRHR) gene (GHRHR). Although heterozygous carriers of GHRHR mutations appear normal, the small size of most of the families and the fact that stature is a complex and polygenic trait prevented so far a careful analysis of their phenotype. To test the hypothesis that heterozygosity for a GHRHR mutation may be associated with a mild phenotype, we studied large Brazilian kindred with familial IGHD (Itabaianinha cohort). In this population, GHD is caused by a homozygous null mutation of the GHRHR. Adults and children with GHD have severe short stature, reduced lean mass, increased % fat mass, increased waist to hip (W/H) ratio, increased total and LDL-cholesterol and C-reactive protein (CRPus), increased systolic blood pressure, and increased insulin sensitivity. We studied 77 adult subjects (age 25-75) heterozygous for the mutation (WT/MT) and compared them with age and sex-matched controls homozygous for the wild-type allele (WT/WT) from the same population. Genotyping was performed by denaturing gradient gel electrophoresis from genomic DNA. We found no difference in adult height; blood pressure and standard deviation score for serum IGF-I between the two groups. Body weight, body mass index, skin folds, waist, hip, lean and fat mass were all reduced in WT/MT subjects. %FM and W/P ratio were similar in the two groups. Fasting insulin and in HOMAIR were lower in WT/M than in WT/WT. The other biochemical parameters (total and fractionated cholesterol, triglycerides, Lp (a), CRPus) were not different between the two groups. Our data shows that heterozygosity for a null GHRHR mutation is not associated with reduction in adult stature or reduction in serum IGF-I, but it causes a parallel decline in fat and lean mass, and an increase in insulin sensitivity. Heterozygosis for a null GHRHR mutation is not associated with reduction in adult stature or in serum IGF-I, but is causes changes in body composition and increase in HOMAIR. These effects do not seem to be modulated by changes circulating IGF-I. / Diferentes formas de Deficiência Isolada do Hormônio do Crescimento (DIGH) são de herança autossômica recessiva. A mais comum (tipo IB) é freqüentemente causada por mutações bi-alélicas no gene do receptor de GHRH (GHRHR). Embora portadores heterozigotos da mutação do gene do GHRHR pareçam normais, o tamanho pequeno da maior parte das famílias e o fato que a estatura é um complexo determinado por características poligênicas levaram-nos a analisar cuidadosamente a hipótese de um fenótipo para a heterozigose. Para testar a hipótese de que a heterozigose para uma mutação do GHRHR poderia estar associado a um fenótipo intermediário foi estudada uma extensa família com DIGH familial (Coorte de Itabaianinha/Sergipe). Nesta população a DIGH é causada por uma mutação nula em homozigose do gene do receptor do GHRHR. Os adultos e crianças com DIGH têm severa baixa estatura, massa magra reduzida e aumento de: percentagem (%) de massa gorda (% MG), cintura, relação cintura/quadril, Colesterol total, LDL Colesterol, Proteína C Reativa alta sensibilidade (PCRas) e a diminuição do Modelo Homeostático do Índice de Resistência à Insulina (HOMAIR). Nós estudamos 76 indivíduos adultos entre 25 e 75 anos de idade heterozigotos (WT/MT) para esta mutação e comparamos pareados para a idade e sexo com 77 indivíduos controles homozigotos para o alelo normal (WT/WT) da mesma população. O DNA genômico foi genotipado através da técnica de Eletroforese em gel com gradiente de desnaturação (DGGE). Não foi encontrada nenhuma diferença entre os indivíduos na altura dos adultos e níveis séricos de IGF-I entre os dois grupos. O peso, o índice de massa corpórea (IMC), dobras cutâneas, circunferência da cintura e quadril e massa magra (MM) estavam reduzidos no grupo de indivíduos WT/MT. A % de MG e a relação cintura/quadril foram semelhantes entre os dois grupos. A insulina e o HOMAIR foram mais baixos no grupo WT/MT. Os outros parâmetros bioquímicos (colesterol total e frações, Triglicérides, Lipoproteína (a) (LP (a)), Proteína C Reativa alta sensibilidade (PCRas) não foram diferentes entre os dois grupos. Em conclusão, a heterozigose para uma mutação nula no gene do receptor do GHRH não é associada com redução da estatura final nem nos níveis séricos de IGF-I, mas, causa alterações na composição corporal e aumento do HOMAIR. Estes efeitos parecem não ser modulados por alterações nas concentrações séricas de IGF-I).

Orientador: Rejane Maria T. Grotto / Coorientador: Maria Inês M. C. Pardini / Banca: Giovanni Faria Silva / Banca: Andre Martins / Resumo: A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) constitui um grave problema de saúde pública mundial, sendo responsável por doenças hepáticas agudas, crônicas, cirrose e hepatocarcinoma. Com o intuito de diminuir a replicação viral e a progressão da infecção pelo VHB, foram aprovadas sete drogas para o tratamento da hepatite B crônica nos últimos 20 anos, sendo que no Brasil, o protocolo de tratamento baseia-se no uso dos fármacos: Interferon-alfa, Inteferon-alfa peguilado, Lamivudina, Tenofovir, Entecavir e Adefovir. No entanto, um obstáculo à utilização das drogas que atuam inibindo enzimas virais é a emergência de variantes resistentes. Desta maneira, sabendo-se que o estudo da variabilidade genética das regiões genômicas do VHB é importante não somente para analisar o perfil de resistência do vírus aos antivirais, mas também para avaliar as variantes virais circulantes no Brasil, a finalidade deste trabalho foi determinar o perfil de mutações de resistência e polimorfismos genéticos em variantes do Vírus da Hepatite B circulantes na região de Botucatu. A região genômica pol do VHB foi amplificada e sequenciada a partir de metodologia in-house, para avaliar o perfil de mutações de resistência e de polimorfismos genéticos. Dados clínicos e laboratoriais foram coletados do prontuário médico dos pacientes. Os resultados obtidos demonstraram a presença das mutações de resistência rtM204V, rtM204I e rtL180M, que conferem resistência cruzada à Lamivudina e Telbivudina e, podem ocasionar resistência cruzada ao Entecavir quando na presença de mutação adicional. Em relação aos polimorfismos, 37 substituições foram encontradas, das quais várias já foram associadas à resistência primária ou secundária ao tratamento antiviral pelo VHB, sendo que 4 ainda não foram relatadas pela literatura, sendo elas Q262E, Q139H, W79C e W257H, o que demonstra que estas subststituições ... / Abstract: Hepatitis B virus (HBV) infection is a serious global public health problem, being responsible for acute and chronic liver diseases, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. In order to reduce viral replication and progression of HBV infection, seven drugs for the treatment of chronic hepatitis B have been approved in the past 20 years, and in Brazil, the treatment protocol is based on the use of the drugs: Interferon-alpha, pegylated Interferon-alfa, Lamivudine, Tenofovir, Entecavir and Adefovir. However, an obstacle to the use of drugs that act by inhibiting viral enzymes is the emergence of resistant variants. Therefore, the study of the variability of HBV genome is important not only to assess the resistance profile of the virus to antivirals, but also to evaluate the circulating viral variants in Brazil. Thus, the purpose of this study was to evaluate the profile of resistance mutations and genetic polymorphisms in Hepatitis B virus variants circulating in Botucatu. HBV pol genomic region was amplified and sequenced by in-house methodology, to evaluate the profile of resistance mutations and genetic polymorphisms. Additional clinical and laboratory parameters were collected from the medical records of patients. The results showed the presence of rtM204V, rtM204I and rtL180M resistance mutations, which confer cross-resistance to Lamivudine and Telbivudine and, may cause cross-resistance to Entecavir in the presence of additional mutation. Regarding polymorphisms, 37 substitutions were found, including those associated to primary and secondary resistance to HBV treatment, and of these four substitutions have not been reported in the literature, which were Q262E, Q139H, W79C and W257H, demonstrating that these substitutions may be characteristic of HBV viral variants found in our region / Mestre

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A infecção pulmonar é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em pacientes com Fibrose Cística (FC). O prognóstico destes pacientes é influenciado pelo número de exacerbações anuais e a carga microbiana nas secreções respiratórias. Pseudomonas aeruginosa é o principal patógeno, tanto em importância quanto em prevalência. Recentemente, foi demonstrada a ocorrência de cepas de P. aeruginosa altamente transmissíveis em centros de atendimento a pacientes com FC. A persistência de P. aeruginosa no pulmão de pacientes com FC está associada, em parte, à presença de cepas com hipermutabilidade (HPM), um fenômeno decorrente, principalmente, de defeitos em genes envolvidos no sistema de reparo do DNA. Tivemos como objetivo investigar a ocorrência de cepas HPM em P. aeruginosa, associadas às infecções pulmonares crônicas em pacientes com FC, bem como, avaliar a associação entre HPM, resistência a antimicrobianos e expressão de fatores de virulência. Das 179 amostras bacterianas estudadas, isoladas de 17 (85%) dos 20 pacientes incluídos no estudo, 43 (24%) apresentaram HPM seguindo os critérios estabelecidos por Maciá e colaboradores. Essas subpopulações apresentaram maiores taxas de resistência a antimicrobianos. As amostras estudadas apresentaram grande variabilidade genética (49 perfis definidos com a utilização da técnica de RADP), embora tenha sido observada, também, a incidência de clones compartilhados por diferentes pacientes. Não encontramos similaridade entre os clones estudados e as cepas epidêmicas circulantes em outros países. Das amostras classificadas como HPM pelos critérios de Macia e colaboradores, apenas 3 delas apresentaram frequência de mutação que permitisse sua classificação como HPM. Com o sequenciamento do DNA encontramos mutações que levaram a mudança de aminoácidos nas proteínas codificadas pelos genes mutS, mutD e urvD. Não observamos mutações nos genes mutM, mutT e mutY que pudessem alterar os aminoácidos sintetizados. Como são escassos estudos sobre a influência da HPM em alterações fenotípicas outras que a resistência a antimicrobianos, comparamos a expressão de atributos de virulência nas populações selvagens e subpopulações. Não observamos alterações nos estados nutricionais, mobilidade e capacidade de formação de biofilme dos microrganismos estudados. Ao contrário, as subpopulaçãoes apresentaram uma menor atividade de LasA e um aumento na produção de piocianina, o que reforça nossa hipótese de que células mutantes teriam uma vantagem no ambiente pulmonar de pacientes com FC. Devido à diferença nos testes propostos para caracterização de HPM, sugerimos que o teste de difusão em agar modificado seja adotado como uma metodologia de triagem a ser utilizada em laboratório de microbiologia clinica. / Pulmonary infection is a major cause of morbidity and mortality in patients with Cystic Fibrosis (CF). The prognosis of these patients is influenced by the number of annual exacerbations of the infectious processes and the microbial load in their respiratory secretions. Pseudomonas aeruginosa is the main CF pathogen, both in importance and predominance. Recently, highly transmissible P. aeruginosa strains were reported among CF patients from different CF Health Care centers. The persistence of P. aeruginosa in the lung of CF patients is associated, at leat in part, with the presence of strains with hipermutability (HPM), a phenomenon caused mainly by defects in genes involved in the DNA repair system. In this report, 43 (24%) out of 179 P. aeruginosa isolates recovered from 17 (85%) out of 20 CF patients included in the study were characterized as HPM, according to the criteria established by Maciá and collegues. The HPM subpopulations exhibited higher rates of antimicrobial resistance. By using the RAPD technique, bacteria included in our study were shown to exhibit high genetic variability and could be grouped in 49 different clones. However, a few clones were shared by different patients. No similarity was detected among these clones and epidemic strains from others countries. Of the 43 isolates classified as HPM by Maciás criteria, only 3 exhibited mutation frequencies allowing their inclusion in the HPM group. By sequencing the DNA from these bacteria we found mutations in the genes mutS, mutD and urvD that resulted in changes in the aminoacids sequences. We did not observe mutations in the genes mutM, mutt and mutY that could have altered the aminoacid sequence from synthesized protein. Since there are only a few report in the literature on the influence of HPM on bacterial phenotypic alterations other than antimicrobial resistance, we also compared 81 bacterial isolates from the wild populations and HPM subpopulations in their virulence properties No difference among the microorganisms were detected considering their nutricional variations, mobility and ability of biofilm formation. In contrast, HPM subpopulations exhibited decreased LasA activity and increased production of pyocianyn. These results reinforced our hypothesis that bacterial mutants may have some advantage in the pulmonary environment of CF patients. Due to the difference in the results of the two sorts of test used to identify HPM, we propose the test of diffusion in modified agar as a trial test to be included in laboratories of clinical microbiology.

Klebsiella pneumoniae (KP) pertence à família Enterobacteriaceae e é frequentemente isolada em infecções nosocomiais, reportada globalmente como uma das mais importantes causas de bacteremias. O seu tratamento usual com β-lactâmicos foi posto a prova na década de 80, com o surgimento de cepas produtoras de β-lactamases de espectro estendido (ESBLs), e posteriormente com as carbapenemases, como sua principal representante Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC), capazes de hidrolisar todos os β-lactâmicos. Apesar das limitadas opções, em geral as Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC (KP-KPC) apresentam susceptibilidade às polimixinas, aminoglicosídeos e tigeciclina, que são comumente aplicadas em regimes terapêuticos combinados, dependente dos perfis de sensibilidade ou resistência a estas drogas, mas dos quais ainda não há informações suficientes para a definição do tratamento mais adequado. A escassez de opções terapêuticas é um dos fatores que contribuem para os altos índices de mortalidade das infecções por K. pneumoniae, de cerca de 40%. Assim, se fazem necessárias avaliações dos perfis fenotípicos de isolados de KP-KPC e a caracterização da disseminação deste mecanismo de resistência, avaliando a presença de perfis clonais relacionados dentro da população. A partir deste cenário, os objetivos deste trabalho foram determinar as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) frente à polimixina B (PMB), meropenem (MEM) e tigeciclina (TGC), os perfis de sensibilidade frente a outras drogas comumente utilizadas no tratamento destas infecções, assim como caracterizar molecularmente as amostras resistentes à PMB. Para a determinação das CIMs e dos perfis de susceptibilidade foram utilizadas as técnicas de microdiluição em caldo e disco-difusão, respectivamente, e o perfil molecular foi analisado através de técnica de macrorestrição de DNA seguida por PFGE. Foram incluídas neste estudo 158 amostras isoladas de corrente sanguínea, de quatro hospitais terciários de Porto Alegre. Destas 158 amostras, nenhuma foi sensível a MEM de acordo com o Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI), 118 (74,7%) a PMB utilizando a recomendação do European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), e 94 (59.5%) à TGC considerando EUCAST ou 137 (86.7%) de acordo com o Food and Drug Administration (FDA). Um total de 48 (30.4%), 28 (17.7%) e 16 (10.1%) isolados foram considerados sensíveis à amicacina (AMK) de acordo com CLSI, EUCAST e USCAST, respectivamente, e 11 (7.0%), 9 (5.7%) e 9 (5.7%) reportados como sensíveis à gentamicina (GEN) de acordo com CLSI, EUCAST e USCAST, respectivamente. Doxiciclina foi o antimicrobiano mais ativo (24, 60.0%) frente aos 40 (25,3%) isolados resistentes a PMB. Destes 40 isolados, 29(72.5%) foram caracterizados molecularmente sendo encontrados 18 clones, dos quais cinco perfis clonais foram identificados em mais de um hospital. Neste estudo, pudemos demonstrar um importante aumento nos níveis de resistência às polimixinas, acompanhado por um desafiador perfil de susceptibilidade frente as outras opções terapêuticas disponíveis, ainda que os índices de sensibilidade destas drogas variem de acordo com os pontos de corte de cada comitê. Quanto à caracterização molecular, a detecção de dezoito clones diferentes e a presença do mesmo perfil em mais de um hospital provavelmente estão associadas à emergência de resistência mediada por mutações, assim como a um processo de disseminação horizontal. / Klebsiella pneumoniae (KP) belongs to the family Enterobacteriaceae and is frequently isolated in nosocomial infections, reported globally as one of the most important causes of bacteremia. Its usual β-lactam treatment was challenged in the 1980s with the emergence of extended-spectrum β-lactamase producing (ESBLs) strains, and later with carbapenemases, as its main representative Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC), capable of hydrolyze all β-lactam. Despite the limited options, KPC-producing Klebsiella pneumoniae (KPC-KP) are generally susceptible to polymyxins, aminoglycosides and tigecycline, which are commonly applied in combination therapy regimens depending on levels of sensitivity or resistance to these drugs, but of which there is still insufficient information to define the most appropriate treatment. The scarcity of therapeutic options is one of the factors that contribute to the high mortality rates of K. pneumoniae infections, of around 40%. Thus, it is necessary to evaluate the phenotypic profiles of KPC-KP isolates and the characterization of the dissemination of this resistance mechanism, evaluating the presence of related clonal profiles within the population. From this scenario, the objectives of this study were to determine the minimum inhibitory concentrations (MICs) against polymyxin B (PMB), meropenem (MEM) and tigecycline (TGC) by broth microdilution and the susceptibility profiles to aminoglycosides and other drugs by disk-diffusion method, as well as to evaluate the molecular profile of KPC-KP isolates from four tertiary hospitals in Porto Alegre. A total of 158 samples were included in this study, where none were sensitive to MEM according to the Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI), 118 (74.7%) to PMB using the recommendation of the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), and 94 (59.5%) to TGC considering EUCAST or 137 (86.7% %) according to Food and Drug Administration (FDA). A total of 48 (30.4%), 28 (17.7%) and 16 (10.1%) isolates were considered susceptible to amikacin (AMK) according to CLSI, EUCAST and USCAST, respectively, and 11 (7.0%), 9 %) and 9 (5.7%) reported as sensitive to gentamicin (GEN) according to CLSI, EUCAST and USCAST, respectively. Doxycycline was also the most active antimicrobial (24, 60.0%) against 40 (25.3%) PMB resistant isolates. Of these 40 isolates, 29 (72.5%) were clonally related, resulting in 18 clones, where five profiles were identified in more than one hospital. In this study, we could demonstrate an important increase in the levels of resistance to polymyxins, accompanied by a challenging profile of susceptibility to other drugs, although the sensitivity indexes of the latter vary significantly according to the breakpoints of each committee. As for molecular characterization, the detection of eighteen different clones and the presence of the same profile in more than one hospital are probably associated with the emergence of resistance mediated by mutations, as well as a process of horizontal dissemination.

Resumo não disponível

Introdução: A Leucemia Mielóide Aguda (LMA) é uma neoplasia complexa e heterogênea do tecido hematopoético, causada por mutações, desregulação da expressão gênica e modificações epigenéticas. Vários marcadores moleculares têm sido descritos para LMA, auxiliando a estratificação dos pacientes em grupos de risco. Recentemente, mutações em DNMT3A foram identificadas em 22.1% dos pacientes com LMA, estando independentemente associadas com pior prognóstico. Objetivos: Determinar a freqüência de mutações somáticas no gene DNMT3A e principais translocações cromossômicas em uma amostra de pacientes com LMA, correlacionando com dados clínicos Métodos: Foram pesquisadas, em 82 amostras de medula óssea de portadores de LMA atendidos no Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS, Brasil, para mutações somáticas no gene DNMT3A por seqüenciamento e principais transcritos de fusão por RT-PCR. Resultados: A freqüência de mutações no gene DNMT3A foi de 8%(6) sendo 3 do tipo R882H. A freqüência relativa dos transcritos de fusão oriundos das translocações t(8;21), t(15;17), t(9;11) e inv16, respectivamente foram: 6,1%(5), 14,6% (12), 0%(0) e 2,4%(2). Conclusão: A descoberta de mutações recorrentes no gene DNMT3A e sua possível implicação prognóstica pode ser um instrumento valioso para a tomada de decisões terapêuticas. Que nos conste, este é o primeiro estudo sobre a presença de mutações somáticas do gene DNMT3A em portadores de LMA no Brasil. Embora em uma amostra relativamente pequena, a freqüência encontrada destas mutações foi inferior à relatada para pacientes caucasianos, sugerindo uma possível variação etnico-geográfica. / Introduction: Acute Myeloid Leukemia (AML) is a complex and heterogeneous neoplasm hematopoietic tissue, caused by mutations, dysregulation of gene expression and epigenetic modifications. Several molecular markers have been described for AML, helping to classify patients into risk groups. Recently, mutations in DNMT3A were identified in 22.1% of patients with AML and these independently associated with poor prognosis. Aims: Determine the frequency of somatic mutations in the gene DNMT3A and major chromosomal translocations in a sample of patients with AML, correlating with clinical data. Methods: We investigated in 82 samples of bone marrow or peripheral blood of patients with AML treated at the Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Brazil, for somatic mutations in DNMT3A gene by sequencing and major fusion transcripts by RT-PCR. Results: The frequency of mutations in the DNMT3A gene was 8%(6) 3 being type R882H. The relative frequency of fusion transcripts arising from translocation t(8;21), t(15;17), t(9;11) and inv16, respectively were: 6,1%(5), 14,6% (12), 0%(0) and 2,4%(2). Conclusion: The discovery of recurrent mutations in the DNMT3A gene and its possible prognostic implications can be a valuable tool for making treatment decisions. From what we have recorded, this is the first study on the presence of somatic mutations of the DNMT3A gene in patients with AML in Brazil. Although in a relatively small sample, the frequency of these mutations was found lower than that reported for Caucasian patients and similar to that observed in Asian patients, suggesting a possible ethno-geographic variation.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, 2011. / Submitted by Suelen Silva dos Santos (suelenunb@yahoo.com.br) on 2011-06-28T17:49:21Z No. of bitstreams: 1 2011_RafaelaCesareParmezanToledo.pdf: 689527 bytes, checksum: 94da9c149705926f4a0b862b4232701a (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-07-06T22:36:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_RafaelaCesareParmezanToledo.pdf: 689527 bytes, checksum: 94da9c149705926f4a0b862b4232701a (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-06T22:36:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_RafaelaCesareParmezanToledo.pdf: 689527 bytes, checksum: 94da9c149705926f4a0b862b4232701a (MD5) / Kimura propôs que o principal fator evolutivo na evolução humana foi a deriva genética. Porem, nos últimos anos diversos trabalhos tem indicado que a seleção natural também pode ter tido um papel importante na evolução da espécie. Nesse trabalho foi avaliado se há forças evolutivas atuando sobre a região 3´UTR do HLA-G em duas populações do Centro-Oeste brasileiro, Distrito Federal e Kalunga, cujas histórias demográficas são bem conhecidas. O Distrito Federal apresenta uma população que foi recentemente formada pela migração de pessoas advindas de várias regiões do Brasil, tornando-se uma região urbana geneticamente representativa do país. Kalunga é uma população semi-isolada rural formada basicamente por escravos fugidos e abandonados. O HLA G apresenta baixo nível de polimorfismo, distribuição e expressão restrita a tecidos/órgãos específicos e propriedades biológicas que levam a tolerância imunológica. O maior conhecimento atual sobre o HLA-G em comparação aos demais genes de classe Ib deve-se à observação de associação de alelos e padrões de expressão com abortos espontâneos recorrentes e diversas doenças. Devido à associação do gene HLA-G com várias doenças e por ele produzir respostas diferentes a cada doença, é possível pensar que esteja sob direta influência da seleção natural, sendo que no caso da região 3´UTR do HLA-G, acredita-se que esteja sob seleção balanceadora. A hipótese desse trabalho é que a região 3´UTR do gene HLA-G deve apresentar uma série de mutações, várias ainda desconhecidas, e que essa região genômica possa estar sob pressão seletiva. Para testar essa hipótese novas mutações foram buscadas e oito SNPs (single nucleotide polymorphisms) foram avaliados na região 3´UTR do gene HLA-G a partir do seqüenciamento total do éxon 8 de 61 indivíduos de Kalunga e 72 do Distrito Federal. Com os dados levantados foram avaliados parâmetros de genética de populações e a ocorrência de seleção utilizando os Teste D de Tajima, Teste F de Fu & Li e Teste D de Fu & Li, utilizando o DNASP v5.10.01 e o teste de neutralidade de Ewens–Watterson com o Pypop v0.7.0. Como resultado, uma mutação nova foi identificada na população Kalunga. As populações não mostraram diferenças significativas, para os oito loci avaliados, quanto as freqüências gênicas e genotípicas. Ambas se adequaram ao equilíbrio de Hardy-Weinberg. Foi observado forte desequilíbrio de ligação. Foram observados 11 haplótipos diferentes no Distrito Federal e na população Kalunga oito. As populações não diferiram quanto as freqüências haplotípicas. O teste F de Fu & Li e o teste de Ewens-Watterson foram significativos para ambas as populações, o teste D de Tajima foi significativo para o Distrito Federal e o teste D de Fu & Li não foi significativo para nenhuma das populações. É possível perceber que apesar de todas as diferenças contidas na história demográfica das duas populações, para a região 3´UTR do HLA-G há forças evolutivas mantendo essa região semelhante nas duas populações. Pelo teste F de Fu & Li e pelo teste de Ewens- Watterson é visto que provavelmente houve atuação de seleção balanceadora desde muito tempo até hoje. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Kimura proposed that the main evolutionary factor in human evolution is genetic drift. However, in recent years several studies have shown that natural selection may also have played an important role in the evolution of species. In this study, we assessed whether there are evolutionary forces acting on the 3'UTR region of the HLA-G in two populations of the Brazilian Center-West, Federal District and Kalunga, whose demographic histories are well known. The Federal District has a population that was recently formed by the migration of people from many different regions of Brazil, becoming an urban region genetically representative of the country. Kalunga is a semiisolated rural population basically formed by runaway and abandoned slaves. HLA G shows a low level of polymorphism, distribution and expression restricted to tissues / organs and specific biological properties that lead to immunological tolerance. The most current knowledge on the HLA-G in comparison with other class Ib genes is due to the observation of association of alleles and patterns of expression with recurrent miscarriages and various diseases. Due to the association of HLA-G gene with various diseases and for him to produce different answers to different disease it is possible to think that this region is under the direct influence of natural selection. The case of the 3'UTR of the HLA-G, it is believed that is under balancing selection. The hypothesis of this study is that the 3'UTR of the gene HLA-G should present a series of mutations, several still unknown, and that this genomic region may be under selective pressure. To test this hypothesis were sought new mutations, one InDel and seven SNPs (single nucleotide polymorphisms) were evaluated in the 3'UTR of the HLA-G gene from the total sequencing of exon 8 of 61 individuals and 72 Kalunga of the Federal District. With the data collected were evaluated parameters of population genetics and the occurrence of selection using the Tajima D test, Fu &Li F test, and Fu & Li D test, using the DNASP v5.10.01 and the test of neutrality of Ewens-Watterson with Pypop v0.7.0. As a result, a new mutation was identified in the population Kalunga. The populations showed no significant differences for the eight markers examined for allele frequency and genotype. Both fitted the Hardy-Weinberg. We observed strong linkage disequilibrium. We observed 11 different haplotypes in the Federal District and the population Kalunga eight. The populations did not differ in haplotype frequencies. The Fu &Li F test and Ewens-Watterson test were significant for both populations, the test was significant Tajima D for the Federal District and the Fu & Li D test was not significant for any population. It is possible to verify that despite all the differences included in demographic history between populations, to the 3'UTR of the HLA-G is evolutionary forces maintaining this region similar in both populations. The Fu & Li F test and the Ewens-Watterson test is seen that there was likely action of balancing selection for a long time until today.

Introdução: O hipotireoidismo congênito é a causa mais comum de retardo mental evitável em crianças, sua incidência varia de 1:2000 a 1:3000 nascidos vivos. É estimado que 15-20% dos casos de HC são conseqüentes de falhas na síntese dos hormônios tireoidianos. Entre as alterações genéticas mais freqüentes destaca-se o defeito na atividade da tireoperoxidase. Objetivos: rastrear mutações em duas pacientes com HC, com defeito parcial de incorporação de iodeto e verificar o efeito funcional de alterações do gene da tireperoxidase. Casuística e métodos: duas pacientes com HC, bócio e diagnóstico molecular não conhecido. Amostras de sangue periférico e de tecido tireoidiano das pacientes e amostras de DNA de indivíduos controles. Sequenciamento dos genes TPO, DUOX2 e DUOXA2. Análise da expressão gênica de TPO, TG, NKX2.1, PDS, PAX8, NIS e rTSH por PCR bem tempo real. Avaliação da expressão de luciferase sob controle do promotor da TPO e avaliação da atividaede da TPO do tecido as pacientes. Resultados: Nas pacientes foi identificada a alteração -95G>T, em homozigose, na região promotora da TPO. Verificamos diminuição da atividade enzimática da TPO no tecido tireoideano das pacientes e diminuição da expressão do RNAm desse gene. Também se encontrou diminuída a expressão dos genes NKX2.1 e PAX8. Já os genes TG, rTSH, PDS, NIS, a expressão do RNAm apresentou-se aumentada. A análise funcional da alteração -95G>C não mostrou diminuição da expressão do gene repórter. Conclusão: O HC das pacientes deve-se a diminuição da atividade enzimática da TPO, contudo alterações de sequência não foram encontradas no gene da TPO que expliquem a diminuição da atividade. Alterações epigenéticas ou nos introns no gene da TPO poderiam explicar o HC das pacientes. / Introduction: Congenital hypothyroidism is the most common cause of preventable mental retardation in children, its incidence varies from 1:2000 to 1:3000 live births. It is estimated that 15-20% of cases of CH are consistent failures in the synthesis of thyroid hormones. Among the most frequent genetic changes highlight the defect in the activity of thyroid peroxidase. Objectives: Identify mutations in two patients with CH and partial defect in iodide incorporation and verify the functional effect of changes in gene tireperoxidase. Methods: Two patients with CH, goiter and molecular diagnosis unknown. Samples of peripheral blood and thyroid tissue of patients and DNA samples from control subjects. Sequencing of the TPO gene, DUOX2 and DUOXA2. Analysis of gene expression of TPO, TG, NKX2.1, PDS, PAX8, NIS and TSHr by real time. Evaluation of the expression of luciferase under control of the promoter of TPO and TPO activity evaluation of the patients tissue. Results: The patients were identified change-95G> T homozygous, in the promoter region of TPO. We observed decrease in enzymatic activity of TPO in thyroid tissues of patients and decreased RNAm expression of this gene. Also found decreased expression of genes NKX2.1 and PAX8. Since the genes TG, TSHr, PDS, NIS mRNA expression presented increased. Functional analysis of the change -95G>T showed no descrease in reporter gene expression. Conclusion: The CH of patients due to decreased enzymatic activity of TPO, but changes were not found in the sequence of TPO gene to explain the decrease in activity. Epigenetic alterations in introns or in the TPO gene could explain the HC patients