Existem fortes evidências de que a importância dos intangíveis tem crescido. Na medida em que a importância dos intangíveis aumenta, torna-se crítico gerenciá-los para que o valor da empresa seja maximizado. A gestão dos intangíveis depende da valoração adequada desses ativos. O conceito de EVA e MVA, de Stewart III, parece ser apropriado para avaliar os intangíveis. Um importante componente do modelo do EVA é o custo de capital, ou custo médio ponderado de capital (WACC), utilizado para (1) remunerar o capital tangível e (2) descontar os EVA's a valor presente. No modelo de Stewart, o taxa de desconto parece ser igual nas duas situações. Entretanto, existem razões para crer que as taxas devam ser diferentes. Evidências teóricas e empíricas sugerem que (1) o risco dos intangíveis é maior que dos tangíveis e (2) os ativos intangíveis tendem a ser financiados por recursos próprios. Se essas suposições forem verdadeiras, o custo de capital dos intangíveis deveria ser maior que dos tangíveis. Essa tese examina empresas brasileiras e norte-americanas para responder a seguinte questão: Quais as diferenças de estrutura de capital e de risco entre as empresas tangível e intangível-intensivas? Os resultados da pesquisa mostram que a estrutura de capital parece ser o fator mais importante na diferenciação entre os dois tipos de empresas. / There are strong evidences that the importance of intangible assets are growing. As the importance of intangibles increases, it is critical to manage them in order to accomplish the most important financial goal: the maximization of wealth. Properly management of intangibles depends on its accurate valuation. Stewart’s EVA and MVA seems to be one of the appropriate techniques to value intangibles. An important component in the EVA model is the cost of capital, or the weighted average cost of capital (WACC), which is applied (1) to charge the tangible capital and (2) to discount the projected EVA's. In Stewart's model the rates seems to be equal. However, there are reasons to believe that these rates must be different. Theoretical and empirical evidences suggest that (1) the risk of intangibles are greater than the tangibles assets and (2) intangibles assets tend to be equity financed. If these assumptions are true, then the cost of capital of intangibles should be greater than the cost of tangibles. This thesis examines Brazilian and American companies in order to answer the following question: What are the differences between intangible and tangible-intensive companies regarding to their capital structure and risk? Results show that capital structure seems to be the most important factor in discriminating these two kind of companies.

Des aciers renforcés par dispersion de nano-particules d'oxide de titane et d'yttrium (Y-Ti-O ODS), irradiés et non irradiés, ont été éxaminés par microscopie électronique en transmission à balayage couplée à la spectroscopie de perte d'énergie des électrons (STEM-EELS) pour étudier leurs structures chimiques et les effets des radiations. Des méthodes analytiques telles que l'analyse statistique multivariée (MVA) et l'ajustement de courbes sur les spectres EELS sont utilisées afin de réaliser une quantification élémentaire ou d'étudier les structures fines des seuils (ELNES). Les traitements MVA permettent d'extraire les réponses spectrales indépendantes des spectre-images (SI) pour mieux comprendre la distribution spatiale des états de valence des différentes expèces. L'observation de poudres d'ODS après le broyage (MA) montre que les nano-particules (NPs) précipitent durant le traitement thermique qui suit, (consolidation). Pour les échantillons consolidés et non irradiés, les particules de taille moyenne (> 3-4 nm) adoptent une structure pyrochlore imparfaite (Y2Ti2O7-d) avec une structure coeur-coquille (Y-Ti-O)-Cr complétée par une couche de Ti réduit également dépourvue en Y. Une ségrégation de Cr est également observée aux joints de grains. Le ratio O/Ti de 3.2 et la non homogénéité de la distance entre plans (222) est due à des défauts dans la structure de la particule, confirmant ainsi qu'elles présentent de nombreux défauts et sont non stoechiométriques. L'ICA nous permet de générer des cartes d'état de valence mais aussi d'extraire une réponse interfaciale Ti-Cr; à l'interface, les atomes Ti et Cr diffusent sur une distance de quelques Å. Pour les plus petites particules, nos résultats montrent qu'elles peuvent consister soit en une structure pyrochlore hautement déficiente en oxygène (Y2Ti2O6+d) soit en une structure chimique inconnue YaTibOc. Le ratio O/Ti diminue de 3-3.5 vers des valeurs inférieures à 1 pour des tailles allant de 4 à 1.8 nm. Les plus grandes particules (de quelques dizaines à quelques centaines de nm), des oxides et/ou nitrures Ti-O, N-Ti, Y-Ti-O ne représentent qu'une faible proportion du nombre total des NPs (< 1%). Pour étudier les effects des irradiations aux neutrons, un certain nombre d'échantillons ODS furent implantés avec des ions He+ et irradiés avec des ions Fe+. Après l'irradiation et l'implantation, une distribution homogène de bulles d'He à haute pression est observée ainsi que des déplétions, ségrégations et précipitations de Cr induites par irradiation (RID, RIS et RIP). Les bulles sont fréquemment observées piégées à l'interface NP-matrice, cependant elles sont aussi observées piégées par des dislocations, libres dans la matrice et aux joints de grains. Le seuil He-K (21.218 eV pour les atomes libres) se déplace vers des énergies plus hautes (ΔE = 0.5 à 4 eV); nous montrons que ce déplacement est corrélé avec la densité d'He. La quantification de l'He est réalisée à l'aide de trois méthodes différentes: différence spatiale, ajustement de courbes, MVA. Les valeurs de la densité et de la pression atteignent 100 nm-3 et 8 GPa respectivement. Cependant, avec des barres d'erreur pouvant atteindre 30%, les mesures de la pression sont plutôt semi-quantitatives. La méthode d'ajustement de courbes permet une cartographie de la position et de l'intensité du pic He-K et donc une cartographie de la densité pour des bulles individuelles. Les réponses spectrales de bulles individuelles peuvent être extraites d'un SI contenant plusieurs bulles à différentes densités en utilisant l'ICA ou l'analyse de la composante vertex (VCA). Nos mesures montrent que les bulles plus grandes que 4 nm sont sous préssurisées ou à l'équilibre avec la matrice Fe-Cr. En dessous de 3.5 nm, la pression de l'He augmente rapidement, correspondant à un état surpressurisé. / Irradiated and non-irradiated (Y-Ti-O) oxide-dispersion-strengthened (ODS) steels are investigated by scanning transmission electron microscopy coupled with electron energy-loss spectroscopy (STEM-EELS) to study their chemical structure and the effects of radiation. Analytical methods such as multivariate statistical analysis (MVA) and EELS curve-fitting are carried out to achieve elemental quantification or study the edge fine structures (ELNES). Using MVA, the spectrum-images (SI) can be separated into independent spectral responses to gain insights into the valence state of various elements such as Ti or Cr. Investigations on post-mechanical-alloyed (MA) powders show that the nanoparticle (NP) precipitation occurs only after a further high-temperature treatment (consolidation). In non-irradiated consolidated samples, medium-sized NPs (> 3-4 nm) are found to adopt a Y2Ti2O7-d defective pyrochlore structure with a (Y-Ti-O)-Cr core-shell structure with a reduced-Ti layer also depleted in Y. Cr is also shown to segregate to the grain boundaries in non-irradiated samples. The measured O/Ti ratio of 3.2 found for medium-sized NPs and the observed non-homogeneity of the inter-reticular distance d222 through the particle is interpreted as being due to defects in the particles’ structure; it is indeed confirmed that Y2Ti2O7 medium-sized NPs in ODS steels present numerous defects and are non-stoichiometric. The Ti oxidation state is shown to vary from the centre of the NPs to their periphery from Ti4+ in distorted Oh symmetry to a valency often lower than 3+. Independent component analysis (ICA) allows us to generate bonding maps and extract a Ti-Cr interfacial response. An inter-diffusion of Ti and Cr atoms is observed at this interface. The smallest NPs present a different and ill-defined structure and interface with the Fe-Cr matrix. They either consist of a highly oxygen-deficient pyrochlore structure (Y2Ti2O6+d) or an unknown YaTibOc chemical structure. The O/Ti ratio decreases from 3-3.5 to below 1 for an NP size going from 4 to 1.8 nm. A few large particles (sized from tens to hundreds of nm) present a N-Ti-O or Ti-O chemistry but represent only a small percentage of all the NPs (< 1%). To study the neutron irradiation-induced changes, a number of ODS samples were implanted with He+ ions and irradiated with Fe+ ions. After irradiation, they display a homogeneous distribution of high-pressure He bubbles and radiation-induced Cr depletion, segregation and precipitation (RID, RIS and RIP). The He bubbles are frequently trapped at the NP-matrix interface, although bubbles can exist freely in the matrix, trapped by dislocations and at grain boundaries. The He-K line (21.218 eV for free atoms) shifts to higher energy in the bubbles (ΔE = 0.5 to 4 eV); this is shown to be correlated with the He density. He quantification is carried out with three different methods: spatial difference, curve-fitting and MVA. The density and pressure values are found to reach 100 nm-3 and 8 GPa respectively, although the pressure measurement is only semi-quantitative given that the error bars can reach 30%. The curve-fitting method allows us to map the He-K energy position and intensity, yielding the density, in individual bubbles. The spectral response of individual bubbles can be separated in an SI containing many bubbles at different densities using ICA or vertex component analysis (VCA). Bubbles larger than 4 nm are shown to be under-pressurized or at equilibrium with the Fe-Cr matrix. Below 3.5 nm, the He pressure is shown to increase markedly, passing into the over-pressurised regime.

La vaccination est considérée comme l’un des plus grandes découvertes de l’histoire des maladies infectieuses, ayant permis le déclin et l’éradication de plusieurs pathogènes. Cependant, nous ignorons encore tous les mécanismes impliqués dans la protection contre les pathogènes. Cette méconnaissance est la cause de notre incapacité à formuler des nouveaux vaccins contre le VIH, la tuberculose, le paludisme et les pathogènes émergents. Récemment, on note des efforts pour induire une réponse cellulaire efficace après une vaccination, qui joue un rôle crucial dans la clairance des pathogènes.Cette thèse s’appuie sur un modèle de vaccin vivant atténue issu du virus de la vaccine : le MVA (Modified Vaccinia Ankara) et sur le modèle de primate non-humain. Nous avons caractérisé la réponse cellulaire après une immunisation intradermique suivant un schéma en prime-boost homologue, avec un boost à 2, suivi d’un boost à 9 mois. Le MVA a induit une infiltration massive de Lymphocytes T CD8 au niveau du site d’injection, 7 jours après l’immunisation. La réponse cellulaire systémique était modérée et ne reflétait pas l’amplitude de la réponse locale. Les injections du prime et du boost ont orienté la réponse cellulaire de façon différente, ce qui a mené à une importante induction de cellules T CD4 et CD8, persistantes, spécifiques de l’antigène et polyfonctionnelles après l’injection du boost à 9 mois.Cette étude souligne la différence entre les réponses systémiques et locales, démontrant l’importance de se focaliser sur la réponse tissulaire. Elle a également mis en lumière l’impact du schéma d’immunisation sur la qualité de la réponse cellulaire. / Vaccination has been considered as one of the greatest discoveries in the history of infectious diseases by allowing pathogens decline or eradication. However, we still ignore all the mechanism that lead to protection and therefore, fail to elaborate new vaccines against HIV, tuberculosis, malaria and emergent pathogens. Recently, efforts have been made to elicit effective cellular response after vaccination, which is crucial for pathogen clearance.This thesis relied on live-attenuated vaccine model derived from the vaccinia virus: the MVA (Modified Vaccinia Ankara) and a non-human primate model. We characterized the cellular immune response triggered by a homologous prime-boost intradermal injection of MVA, with a 2 months and 9 months boost. The MVA induced a massive infiltration of CD8 T cells at the injection site 7 days post immunization. In comparison, the systemic cellular response was mild and did not reflect the magnitude of the local response. The prime and boost injections elicited distinct orientation of the systemic and local T cells, which led to an important induction of a persistent, antigen-specific and polyfunctional CD8 and CD4 T cell responses after the 9 months boost.This work emphasizes the difference between local and systemic response, demonstrating the importance of the focus on tissue immunity. It also highlights the impact of the immunization schedule on the quality of the cellular response.

Purpose: The study aims to show if there is a significant relationship between the CEOs recompense and the size of the company between the industries. The goal is to compare the size of a company with the variable that shows performance and which of them who has the strongest connection to the recompense. Method: The essay stands on a quantitative approach where secondary data has been gathered from the year of 2015 annual reports. The population includes all the Swedish companies in the real estate-, finance- and pharmaceutical industry that are listed on the stock exchange. Selection has been made on 30 of these companies, 10 in each industry. With the statistical analyses the methods that have been used are multiple regression model and correlation analysis. Results: The results show that the company that paid the highest recompense in the real estate industry was Kungsleden. The company in the finance industry was Kinnevik and in the pharmaceutical industry it was Pfizer. Conclusion: After analyzing the result the conclusion can be made that there is a significant relationship between the CEOs recompense and the size of the company only in the real estate industry. When comparing the variable that dictates the size of the company (net sales)  and the performance variable (MVA), the conclusion that can be made is that MVA has a stronger connection to the CEOs total recompense in the pharmaceutical industry in relation to the other industries. Within the finance industry there was no significant relationship with the CEOs recompense and the selected variables.

In dieser Arbeit wurden Vektorimpfstoffe auf der Basis rekombinanter Vacciniaviren hinsichtlich ihrer Eignung zur Immunisierung gegen Infektionen mit Respiratorischen Synzytialviren (RSV) untersucht. Hierfür standen genetisches Material und Viruspräparationen des Respiratorischen Synzytialvirus des Rindes (BRSV, Stamm Odijk) sowie des Respiratorischen Synzytialvirus des Menschen (HRSV, Subtyp A2) sowie rekombinante Vacciniaviren MVA-HRSV-F bzw. MVA-HRSV-G zur Verfügung. Rekombinante MVA-Viren, welche die Gene der BRSV-Oberflächenproteine G und F (MVA-BRSV-F, MVA-BRSV-G, MVA-BRSV-Gneu), sowie Viren in welchen die Fremdgensequenzen durch Deletion wieder entfernt sind (Revertante Viren MVA-∆BRSV-F und MVA-∆BRSV-G), wurden gentechnologisch hergestellt. Alle rekombinanten MVA-Viren wurden molekular-virologisch charakterisiert und dienten zur Gewinnung und Prüfung von Testimpfstoffen im Tiermodell. Die Untersuchungen zeigen: 1. Alle neu konstruierten rekombinanten MVA-BRSV-Viren produzierten nach Infektion von Zellkulturen die erwünschten Zielantigene, die BRSV-Glykoproteine F und G. Für das durch MVA-Expression hergestellte BRSV-F-Glykoprotein konnte außerdem die biologische Funktionalität in einem Fusionstest in infizierten HeLa-Zellen nachgewiesen werden. 2. Die Charakterisierung der Genome aller MVA-BRSV- sowie MVA-HRSV-Vektorviren bestätigte die exakte Insertion der Fremdgensequenzen im anvisierten Genombereich und zeigte die genetische Stabilität der Virusisolate nach Passagierung. 3. Bei der Untersuchung des Wachstumsverhaltens von MVA-BRSV-F und MVA-BRSV-G zeigte sich die eingeschränkte Vermehrungsfähigkeit des Virus MVA-BRSV-G. Die Konstruktion und Untersuchung der revertanten Viren MVA-∆BRSV-F und MVA-∆BRSV-G belegte die Koproduktion des G-Proteins als Ursache des verminderten Replikationsvermögens. Dieser für ein mögliches Impfvirus erhebliche Nachteil konnte durch die Verwendung eines moderateren Vacciniavirus-Promotors zur Fremdgenexpression (rekombinantes Virus MVA-BRSV-Gneu) behoben werden. 4. Die Prüfung von Testimpfstoffen auf der Grundlage der rekombinanten MVA-HRSV-Viren in einem Maus-HRSV-Infektionsmodell zeigte, dass MVA-HRSV-Impfstoffe, im Gegensatz zu Impfstoffen aus mit Formalin-inaktiviertem HRSV, Immunantworten mit einem ausgewogenen TH1/TH2-assoziierten Zytokinprofil induzierten. Eine infolge von Immunisierung verstärkte Einwanderung eosinophiler Zellen (Marker für Immunpathogenese) in die Lungen HRSV-infizierter Tiere, konnte nach MVA-Impfung nicht beziehungsweise in nur sehr geringem Ausmaß festgestellt werden (OLSZEWSKA et al. 2004). 5. Wichtige erste Daten hinsichtlich der Verträglichkeit, Immunogenität und Schutzwirkung rekombinanter Impfstoffe auf der Basis von MVA-BRSV-F und MVA-BRSV-G konnten in einem Kälber BRSV-Infektionsmodell erhoben werden. Die zweimalige Immunisierung mit MVA-Impfstoff verlief bei allen Tieren ohne feststellbare Nebenwirkungen und die Anregung Vaccinia- bzw. BRSV-F-spezifischer Antikörper bestätigte die Immunogenität der Vektorvakzinen. Schließlich belegten klinische Daten, insbesondere die fehlende Fieberreaktion bei Impflingen nach BRSV-Belastungsinfektion, die Schutzwirkung der MVA-BRSV-Impfstoffe. Insgesamt unterstützen die erzielten Ergebnisse dieser Arbeiten die weitere präklinische und klinische Untersuchung von MVA-Vektorimpfstoffen zur wirksameren und sichereren Bekämpfung von Infektionen mit Respiratorischen Synzytialviren. / This study investigated vector vaccines based on recombinant vaccinia virus MVA for their suitability to immunize against infections with respiratory syncytial viruses. Genetic material and virus stocks of bovine respiratory syncytial virus (BRSV, Strain Odijk) and human respiratory syncytial virus (HRSV, Strain A2) and recombinant vaccinia viruses MVA-HRSV-F and MVA-HRSV-G were provided and used in this study. The project work included the genetical engineering of recombinant MVA expressing gene sequences encoding the BRSV surface proteins G and F (MVA-BRSV-F, MVA-BRSV-G, MVA-BRSV-Gneu) and the secondary generation of mutant viruses in which recombinant gene sequences have been removed (revertant viruses MVA-∆BRSV-F, MVA-∆BRSV-G). All recombinant MVA were carefully characterized in in vitro experiments and served for generation of vaccine preparations being tested in animal model systems. The investigations demonstrate: 1. All recombinant MVA-BRSV viruses produced the target antigens (BRSV-F and -G proteins) upon tissue culture infections. Functional activity of BRSV-F protein was demonstrated in a cell fusion assay using virus-infected HeLa cells. 2. The characterization of the genomes of all MVA recombinant viruses confirmed the correct insertion of foreign gene sequences into the target site of the MVA genome and demonstrated the genetic stability of the vector viruses upon tissue culture passage. 3. In vitro studies on virus growth revealed a reduced replicative capacity of the recombinant virus MVA-BRSV-G. Construction and growth analysis of revertant viruses MVA-∆BRSV-F and MVA-∆BRSV-G demonstrated that over expression of BRSV-G protein caused this replication deficiency which could be avoided by using a more moderate vaccinia virus promoter for transcriptional control of recombinant gene expression (recombinant virus MVA-BRSV-Gneu). 4. Upon characterization in a mouse-HRSV challenge model candidate vaccines based on recombinant MVA-HRSV viruses, in contrast to formalin inactivated HRSV, and induced a well balanced TH1 and TH2 cytokine profile. In addition, none of the MVA-HRSV-F vaccinated animals and only two of the MVA-HRSV-G immunized mice showed low-level eosinophilia in the lungs after HRSV challenge infection (OLSZEWSKA et al. 2004). 5. Vaccination experiments in the calf-BRSV challenge model generated first relevant data on safety, immunogenicity and protective capacity of MVA-BRSV recombinant vaccines. The repeated application of MVA vaccine was well tolerated by all vaccinated animals and the induction of vaccinia- and BRSV-F-specific antibody responses confirmed the immunogenicity of the MVA vector vaccines. Moreover, clinical data (lack of fever response in vaccines) suggested the protective capacity of MVA-BRSV immunization upon BRSV challenge. The obtained results from these studies clearly support further preclinical and clinical evaluation of recombinant MVA candidate vaccines to immunize against disease caused by RSV infections in cattle and humans.

Dans l’approche expérimentale de l’immunothérapie des tumeurs solides, les modèles murins sont utilisés pour des raisons de rapidité et de reproductibilité. Le plus souvent, les modèles tumoraux murins sont ectopiques ce qui constitue un modèle artificiel qui ne reflète qu’une partie de la réalité biologique de tumeurs provenant de diverses origines.Mon projet de thèse a consisté à mettre au point de nouveaux modèles pré-cliniques murins permettant de mieux mimer les situations pathologiques des tumeurs solides chez l’homme. Pour cela, je me suis notamment intéressée à un modèle orthotopique de cancer du rein (implantation de cellules RenCa ou RenCa-MUC1 dans la capsule rénale) et à un modèle spontané de cancer du sein (souris MMTV-PyMT). Ces modèles ont ensuite permis l’évaluation de trois différentes approches d’immunothérapie à savoir la thérapie virale oncolytique, la vectorisation d’antigènes tumoraux au moyen d’un vecteur viral ainsi que la thérapie via un anticorps monoclonal. / In experimental approaches to immunotherapy of cancer, mouse tumor models are used for reasons of speed and reproducibility. Ectopic mouse tumor models are the most often used, but they constitute artificial models that reflect only a part of the biological reality of tumors from various origins.The aim of my thesis project was to develop new mouse preclinical tumor models to better mimic the pathological situations of solid tumors in humans. First, I developed an orthotopic model of kidney cancer (subcapsular kidney implantation of a renal carcinoma cell line which either expressed or did not express the human xeno-antigen, MUC1). In addition to this, I also studied a spontaneous model of breast cancer (MMTV-PyMT).These models enabled us to evaluate the efficacy of three different immunotherapy approaches namely oncolytic virus strategy, tumor antigen vectorization by using a viral vector, and monoclonal antibody.

Einleitung Die Kuhpockenvirusinfektion (CPXV-Infektion) ist eine sporadisch auftretende, meldepflichtige Erkrankung mit zoonotischem Potenzial. Sie wurde in den letzten sechs Jahrzehnten in vielen Säugetierspezies inkl. des Menschen beschrieben und erforscht. Sie äußert sich in zwei Verlaufsformen: mild, lokalisiert, selbstlimitierend oder generalisiert, dramatisch bis letal. Als Erregerreservoir dienen dem Virus wildlebende Nager (Wühlmäuse). Aktuell ist für diese Infektion keine kausale Therapie zugelassen, Prävention kann mittels prophylaktischer Impfung mit dem Modifizierten Vaccinia Virus Ankara (MVA)-Impfstoff erzielt werden. Für Neuweltkameliden wurde die CPXV-Infektion bisher nur dreimal beschrieben. Detaillierte Erkenntnisse zur Epidemiologie, klinischem Erscheinungsbild und Prävention dieser Infektion bei Neuweltkameliden fehlen. Vier unabhängige Cluster von CPXV-Infektion in ostdeutschen Alpakabeständen in nur fünf Jahren, bekannt geworden durch fünf Alpakas mit generalisierter CPXV-Infektion mit jeweils letalem Ausgang als Patienten der Klinik für Klauentiere Leipzig, gaben Anlass, die Infektion bei dieser Spezies genauer zu untersuchen. Ziele der Untersuchungen Ziel der Studie war, auf Basis einer Literaturrecherche einen Überblick über das Wesen der CPXV-Infektion und ihre Relevanz bei Neuweltkameliden zu gewinnen. Anhand von Bestandsuntersuchungen in vier Alpakabeständen sollten Informationen zur Epidemiologie der CPXV-Infektion mit Erregernachweis im Einzeltier, Erregerverbreitung in der Herde und Erregerreservoir gesammelt werden. Ebenso wurde in zwei der vier Alpakabestände eine Bestandsimpfung mit dem MVA-Impfstoff durchgeführt, um die Verträglichkeit und die Immunogenität dieses Impfstoffes beim Alpaka zu überprüfen. Tiere, Material und Methoden Vier Alpakabestände (107 Alpakas) wurden zweimal im Abstand von 19 – 54 Tagen besucht. Anhand der klinischen Untersuchung und verschiedener Proben (Blut, Tupferproben, Krusten von Hautläsionen, Kot) wurden CPXV-infizierte Tiere identifiziert. Wildlebende Nager als potenzielles Erregerreservoir wurden in der Umgebung der Bestände gefangen. Ein indirekter Immunfluoreszenztest (IFA) wurde zum Nachweis CPXV-spezifischer Antikörper aus dem Serum (Alpakas) bzw. Serum/Transsudat (Nager) eingesetzt, eine real-time PCR diente zum Nachweis von CPXV-spezifischer DNA aus Kot/Tupferproben/Krusten (Alpakas) bzw. Organproben (Nager). In zwei Alpakabeständen wurden 94 Tiere mit dem MVA-Impfstoff zweimal im Abstand von vier Wochen geimpft. Eine Ausnahmegenehmigung nach §17c Abs. 4 Nr. 2 Buchstabe a) des Tierseuchengesetzes vom 22. Juni 2004 (BGBl.I S. 1260) lag für beide Bestände vor. Vier Wochen nach jeder Impfung und 6 bzw. 12 Monate nach der 2. Impfung wurden von allen Tieren Serum (für IFA) und Tupferproben (für PCR) entnommen. Etwaige Impfreaktionen wurden vier Wochen nach jeder Impfung aufgezeichnet. Bei 14 Crias wurde 2 – 12 Wochen post partum eine Serumprobe auf spezifische maternale Antikörper untersucht. Ergebnisse Insgesamt wurden 28 von 107 Tieren mittels IFA und/oder PCR als CPXV-infiziert identifiziert. Die Seroprävalenz pro Bestand schwankte zwischen 16,1 % und 81,2 %. Auch beim Alpaka traten zwei klinische Verlaufsformen auf: mild, lokalisiert, selbstlimitierend vs. generalisiert, letal. In zwei Beständen wurden CPXV-spezifische Antikörper in den gefangenen Nagern gefunden. Im dritten Bestand konnte CPXV aus einer Feldmaus (Microtus arvalis) isoliert werden. Vollgenomsequenzierung dieses Isolates und der Vergleich mit dem Genom von CPXV aus einem Alpaka des gleichen Bestandes ergaben 99,997 % Übereinstimmung. In diesem Bestand wurde CPXV an einer Bürste zur Fellpflege nachgewiesen, die Erregerübertragung durch indirekten Tierkontakt und tierbezogene Utensilien erscheint bei Alpakas am wahrscheinlichsten. Die MVA-Impfung war auch bei Alpakas sicher und gut verträglich. Nach zweimaliger Grundimmunisierung konnte eine Antikörper-Seroprävalenz pro Bestand von 81,3 % bzw. 91,7 % nachgewiesen werden. Im Laufe eines Jahres sank diese auf 15,6 % bzw. 45,8 %, Neuerkrankungen wurden nicht detektiert. In 50,0 % der beprobten Crias wurden maternale Antikörper nachgewiesen. Schlussfolgerungen Das ubiquitäre Erregerreservoir Wühlmaus in Verbindung mit an Popularität zunehmenden Alpakas, als vollempfängliche Spezies für CPXV weisen auf ein gesteigertes Risiko für zukünftige zoonotische CPXV-Infektionen hin. Die MVA-Impfung schützt Alpakas erfolgreich vor einer generalisierten CPXV-Infektion. Die Dauer des Impfschutzes und geeignete Auffrischungs-Impfregime gilt es in Langzeitstudien zu erforschen.:Inhalt 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das Alpaka 2.1.1 Zoologische Einordnung, Herkunft, Nutzung 2.1.2 Haltung 2.1.3 Viruserkrankungen bei Neuweltkameliden in Europa 2.2 Die Kuhpockenvirusinfektion 2.2.1 Ätiologie 2.2.2 Wirtsspektrum und Erregerreservoir 2.2.3 Diagnostik 2.2.4 Klinisches Erscheinungsbild 2.2.5 Differentialdiagnosen 2.2.6 Therapie/Prophylaxe 2.3 Der MVA-Impfstoff 2.4 Schlussfolgerung aus der Literaturrecherche und Zielstellung 3 Publikation 1 4 Publikation 2 5 Publikation 3 6 Diskussion 7 Zusammenfassung 8 Summary 9 Literaturverzeichnis 10 Danksagung / Introduction Cowpox virus (CPXV) infection is a reportable and potentially zoonotic disease that occurs sporadically in a variety of animals and in humans. It has been extensively researched and described in both domestic and zoo animals as well as in humans. Although infected individuals generally have a mild form of disease, cases of fatal generalized CPXV infection have also been described. Prevention by prophylactic vaccination using modified vaccinia virus Ankara (MVA) vaccine is the only method of protecting animals against disease. CPXV infection has been described in South American camelids, but data on its epidemiology, clinical features and prevention are lacking. Four CPXV outbreaks occurred in unrelated alpaca herds in Eastern Germany in a five-year period. The diagnosis in those herds was based on five cases with severe, generalized and lethal CPXV infection referred to the Department for Ruminants and Swine in Leipzig. The outbreaks provided us with an opportunity to better understand CPXV-infection in this species. Aims of the study The first aim of the study was to conduct a literature review of the clinical features of CPXV infection in South American Camelids and to compare their clinical signs with those of other animal species. The second goal was to evaluate the epidemiology of CPXV infection in four alpaca herds by evaluating the mode of virus transmission and the occurrence of CPXV in individual alpacas and in putative reservoir hosts. The third goal was to determine the safety and immunogenicity of MVA vaccine in alpacas by using in a prime-boost MVA vaccination regimen in two alpaca herds. Material and methods Four alpaca herds (107 animals) were evaluated on two separate occasions, and samples (serum, swab samples, crusts of suspicious pox lesions, feces) were collected to identify CPXV-infected animals. Wild small mammals were trapped on the alpaca farms to investigate the potential source of infection. Serum (alpacas, rodents) and/or transudate (rodents) samples were used to detect CPXV-specific antibodies using an indirect immunofluorescence assay (IFA). Swab samples, crusts and feces (alpacas) or organ tissue (rodents) were used for the detection of CPXV-specific DNA in a real-time PCR. A total of 94 animals from two alpaca herds were vaccinated twice with MVA vaccine. A special exemption was obtained from the relevant Ministries of the Federal States under German law. Blood samples (serum, IFA) and swab samples (PCR) were collected 4 weeks after prime and boost vaccination as well as 6 and 12 months after boost vaccination. In 14 crias, 1 blood sample was collected 2 – 12 weeks after birth to determine the presence of specific maternal antibodies (serum, IFA). Results A total of 28 of 107 animals were diagnosed with CPXV using IFA and/or PCR. Herd seroprevalence ranged from 16.1% to 81.2%. The clinical signs in infected animals were mostly mild, localized and self-limiting, but 5 animals had generalized signs and died. In two herds, CPXV-specific antibodies were found in the local rodent population. In the third herd, CPXV was isolated from a common vole (Microtus arvalis); full genome sequencing and comparison with the genome of CPXV from an alpaca on the same farm revealed a 99.997% match. Virus transmission through indirect contact seems likely because CPXV-specific DNA was detected on a brush used for grooming. MVA vaccine was well tolerated and safe in vaccinated alpacas. Seroprevalence after booster vaccination was 81.3% in one herd and 91.7% in the other. Detectable antibody titers declined to 15.6% and 45.8% over a 12-month period after booster vaccination. New CPXV infections were not detected in this period. Specific maternal antibodies were detected in 50.0% of newborn crias. Conclusions With the recent increase in their popularity, alpacas may pose an increased risk of zoonotic disease spread because of their susceptibility to CPXV infection and their relatively close proximity to reservoir hosts such as rodents. Prevention of generalized CPXV infection in alpacas using MVA vaccine appears feasible. The duration of immunity and appropriate booster vaccination regimens need to be verified in long-term studies.:Inhalt 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das Alpaka 2.1.1 Zoologische Einordnung, Herkunft, Nutzung 2.1.2 Haltung 2.1.3 Viruserkrankungen bei Neuweltkameliden in Europa 2.2 Die Kuhpockenvirusinfektion 2.2.1 Ätiologie 2.2.2 Wirtsspektrum und Erregerreservoir 2.2.3 Diagnostik 2.2.4 Klinisches Erscheinungsbild 2.2.5 Differentialdiagnosen 2.2.6 Therapie/Prophylaxe 2.3 Der MVA-Impfstoff 2.4 Schlussfolgerung aus der Literaturrecherche und Zielstellung 3 Publikation 1 4 Publikation 2 5 Publikation 3 6 Diskussion 7 Zusammenfassung 8 Summary 9 Literaturverzeichnis 10 Danksagung

La vaccination est considérée aujourd’hui comme une des méthodes les plus efficaces de se prémunir des maladies infectieuses. Cependant notre incapacité à produire un vaccin protégeant contre certaines maladies comme le SIDA ou l’hépatite C trahissent notre manque de compréhension des processus immuns. Cette thèse s’appuie sur une modèle primate non-humain associé à un vaccin vivant attenué dérivé du virus de la vaccine, le MVA (Modified Vaccinia virus Ankara) pour y décortiquer en détails la réponse immunitaire innée, mais aussi adaptative. Le MVA induit une importante réaction inflammatoire au niveau du site d’injection et dans le compartiment systémique par voie intramusculaire, sous-cutanée, et intradermique. Pourtant, l’amplitude de cette réaction immunitaire ainsi que les effecteurs cellulaires et moléculaires engagés varie selon la voie d’administration. Les conséquences en sont importantes, puisque cela est à l’origine d’une réponse adaptative plus orientée Th2 après voie sous cutanées, et plutôt Th1 après voies intramusculaires et intradermiques. Ainsi, nous mettons en évidence certaines signatures cellulaires et moléculaires susceptible d’orienter la réponse immunitaire dans notre modèle. / Vaccination is considered as one of the best therapeutic intervention to fight against infectious diseases. However, we still fail to develop protective vaccines for diseases such as AIDS or B hepatitis, which highlights our lack of knowledge of immune processes.For this thesis, we relied on a non-human primate model associated wih a vaccinia virus living attenuated vaccine derived called MVA (Modified Vaccinia virus Ankara). We deciphered innate, but also adaptive immune response using this model. MVA induces an important inflammatory reaction at the injection site and in the blood after intramuscular, subcutaneous, and intradermal administration. However, the magnitude of this immune reaction, as well as cellular and molecular effectorsin varies depending on the administration route. The consequences are important and lead to different adaptive immune profiles, with Th2 oriented response after subcutaneous route, and Th1 oriented response after intramuscular and intradermal route. It allowed us to highlight several cellular and molecular signatures that might modulate immune response in our model.

La tuberculose (TB), maladie pulmonaire causée par le Mycobacterium tuberculosis (Mtb), reste la première cause de mortalité par un agent infectieux. La TB est responsable de près de 1,7 million de morts et de 10,4 millions de nouveaux cas par an dans le monde. L’émergence et la propagation de souches bactériennes multi-résistantes aux antibiotiques (MDR) représentent une menace majeure grandissante et reflètent l’efficacité partielle des thérapies actuelles. Le traitement des patients atteints de TB-MDR est constitué actuellement de combinaisons d’antibiotiques, souvent toxiques, administrés pendant une longue durée, avec une efficacité limitée. Il existe donc un besoin urgent de développer de nouveaux traitements antituberculeux. L’immunothérapie, dont l’objectif est d’améliorer la réponse immunitaire de l’hôte contre le Mtb, représente une approche complémentaire intéressante dans le but de diminuer la durée et d’augmenter l’efficacité des traitements actuels de la TB-MDR. Le premier objectif de cette thèse a été de caractériser un nouveau vaccin thérapeutique, basé sur le virus de la vaccine modifié d’Ankara (Modified Vaccinia virus Ankara, MVA), le MVATG18598, qui exprime dix antigènes représentatifs des trois phases de l’infection par Mtb. En utilisant différentes lignées de souris, nous avons montré que la vaccination par MVATG18598 entraîne l'induction de réponses spécifiques cellulaires et humorales. Les cellules T produisent plusieurs cytokines de type Th1 et présentent une activité cytolytique. Dans des modèles murins d’efficacité, le MVATG18598, associé à un traitement antibiotique, réduit significativement la charge bactérienne dans les animaux infectés ainsi que le taux de rechute de la maladie après l’arrêt du traitement. Le deuxième objectif de cette thèse a été d'analyser l'impact des antituberculeux sur l'immunogénicité du vaccin MVATG18598. Nous avons montré que les antibiotiques de première ligne, et principalement l’isoniazide, diminuent la réponse immunitaire Th1 induite par le MVATG18598. De plus, nous avons démontré que la réponse humorale induite par le candidat vaccin est modifiée et s’oriente vers une augmentation du rapport IgG1/IgG2a en présence d’antibiotiques. En conclusion, nous montrons qu'un vaccin immunothérapeutique, tel que le MVATG18598, a la capacité de contribuer au contrôle de la tuberculose en augmentant l'efficacité des traitements antituberculeux. De plus, nos résultats indiquent que les antibiotiques modulent la réponse immunitaire induite par le vaccin, données devant être prises en compte lors du développement des futures stratégies immunothérapeutiques / Tuberculosis (TB), a lung disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), remains the leading cause of death worldwide from an infectious disease. TB is responsible for an estimated 1,7 million of deaths and 10,4 million new cases annually. The emergence and spreading of multidrug resistance (MDR) Mtb strains represent a major global threat and reflect limitation of current treatments. Patients with MDR-TB are currently treated with multiple drug regimens, often toxic, given for long durations, with a limited efficacy. Therefore, developing novel TB therapies is urgently needed. Immunotherapy aiming at triggering specific immune response against Mtb represents an attractive approach to shorten the duration and increase the efficacy of current MDR-TB treatment. The first aim of this PhD project was to characterize a novel therapeutic vaccine, based on the Modified Vaccinia virus Ankara (MVA), MVATG18598, expressing ten antigens representative of the three phases of Mtb infection. Using different strains of mouse, we showed that MVATG18598 vaccination is able to trigger Mtb antigens-specific humoral and cellular responses. Both CD4 and CD8 T cells display the capacity to produce multiple Th1-cytokines together with cytolytic activity. In post-exposure mouse models, MVATG18598 combined with an antibiotic regimen decreases significantly the bacterial burden in lungs of infected mice as well as the disease relapse rate after treatment completion. The second aim of this project was to analyze the impact of TB antibiotics on the immunogenicity of the MVATG18598 vaccine. We showed that first-line antibiotic regimen, mostly isoniazid, decreases antigen-specific Th1 immune response triggered by MVATG18598 vaccination in mice. Moreover, we demonstrated that Mtb-specific antibody response induced by the vaccine candidate is modified and shifted towards an increase of IgG1/IgG2a ratio in presence of drugs. Altogether, these results illustrate that immunotherapeutic vaccine such as MVATG18598 has the capacity to contribute to the control of TB by improving efficiency of anti-TB drugs treatment. In addition, our results indicate that antibiotics are able to modulate vaccine-induced immune response, a feature to consider for the future development of immunotherapies

Tuberculosis, caused by infection with Mycobacterium tuberculosis (M.tb), remains a global health problem. Drug resistance and high rates of HIV infection have fuelled the pandemic and, although a vaccine exists, its ability to protect from pulmonary tuberculosis varies between 0 and 80%. Bacille Calmette Guerin (BCG) has been administered to billions worldwide yet its protective mechanisms remain unknown, as do the reasons for its failure to protect in many parts of the world. Modified Vaccinia virus Ankara expressing antigen 85A (MVA85A) is a novel candidate vaccine designed to boost immune responses to BCG and improve protection. An aim of this thesis has been to characterise the innate immune response to an MVA85A boosting vaccination in both UK adults and South African infants. In the former, volunteers develop a strong innate response following vaccination however this does not always translate into a robust adaptive response to antigen 85A (Ag85A), which is determined in part by Treg expansion and the nuclear protein HMGB1 signaling through the TLR1-2-6 axis. By contrast, not all South Africa infants mount a strong innate immune response to MVA85A yet this response is correlated with the magnitude of the adaptive response. The immune response to BCG in both populations is also characterised and an association found between increased production of IL-17, IL-22 and IFN-γ in response to BCG stimulation and control of mycobacterial growth. The results presented here further the knowledge on the links between innate and adaptive responses to vaccination with BCG and MVA85A and the variation in mechanisms involved in different populations.